TEMA 9: SISTEMÁTICA MICROBIANA

1. Taxonomía y sistemática.

• La taxonomía es la ciencia que estudia la clasificación de los seres vivos.

• La sistemática es la ciencia que estudia la diversidad y las relaciones existentes entre los seres
vivos.

Del desarrollo de la taxonomía y de los avances en los estudios en evolución, bioquímica y biología
molecular, se ha originado la sistemática.

La taxonomía y la clasificación es algo que resulta necesario para el ser humano. Se define taxonomía
como la ciencia de la clasificación biológica, entendiendo clasificar como analizar un conjunto de objetos
o fenómenos para establecer sus características y seleccionar aquellas que establezcan diferencias o
semejanzas para, de este modo, agruparlos en dos o más conjuntos.

La taxonomía comprende tres partes diferenciadas, pero que se relacionan entre sí:
• La clasificación, que es la ordenación de los seres vivos en grupos o taxones en función de
semejanzas o parentesco evolutivo.
• La nomenclatura, que se ocupa de asignar nombres a los grupos taxonómicos de acuerdo con
normas establecidas.
• La identificación, es el proceso para determinar que un aislamiento particular pertenece a un
taxón reconocido (es el lado práctico de la taxonomía).

Algunas características de la clasificación biológica son:

• Es una clasificación jerárquica, ya que los seres vivos se engloban en distintos niveles de
agrupamiento (especie, género, familia, orden…)
• Es una clasificación jerárquica inclusiva ya que un nivel de agrupamiento incluye los inferiores,
como es el caso del género que agrupa a un conjunto de especies, o del orden que agrupa a un
conjunto de familias.

Al preparar un sistema de clasificación, se ubican todos los microorganismos en grupos homogéneos,

que a su vez pertenecen a otro grupo más extenso siguiendo una estructura jerárquica sin
superposiciones. Una categoría de cualquier rango une grupos de nivel inferior en función de
propiedades comunes.

En la taxonomía bacteriana los niveles o rangos utilizados son los siguientes (en orden ascendente):

● ESPECIE
● GÉNERO
● FAMILIA
● ORDEN
● CLASE
● REINO
● DOMINIO

El grupo taxonómico básico es la especie.

Definición de especie referida a organismos superiores: es un grupo de poblaciones naturales que se

reproducen entre si y que están aisladas de otros grupos desde el punto de vista de la reproducción.

Definición de especie para los microbiólogos o ESPECIE BACTERIANA es una colección de cepas que
comparten numerosas propiedades estables y que difieren de forma significativa de otros grupos de
cepas; pudiendo existir reproducción entre las distintas especies.

Una CEPA es una población de microorganismos que desciende de un único organismo o de un

aislamiento en cultivo puro por tanto con idéntico genoma (por debajo de una especie).

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Un GÉNERO es un grupo bien definido de una o más especies que está claramente separado de otros
géneros, siendo el siguiente rango de la jerarquía taxonómica.

La nomenclatura es la aplicación de nombres científicos a los organismos y grupos, y en el caso de la

nomenclatura biológica lo que hacemos es situarlos dentro de la clasificación taxonómica.

La asignación de nombres a los microorganismos por parte de los microbiólogos se lleva a cabo
mediante el sistema de nomenclatura binomial ideado por Carl Von Linneo. El nombre se escribe en
latín y en cursiva y tiene dos componentes, el primer nombre es el nombre genérico que se escribe con
la primera letra en mayúscula; el segundo nombre es el epíteto de la especie y se escribe
completamente en minúscula. Ejemplo: Escherichia coli. El primer nombre, el nombre genérico, a
menudo se abrevia tan solo en una letra. Ejemplo: E.coli.
A la hora de nombrar, hay que tener en cuenta:
1. Solamente hay un nombre correcto para un microorganismo
2. Todos los nombres están escritos en latín
3. La primera palabra del género en mayúscula y la de la especie en minúscula, escribir en itálica
(o subrayado)
4. Debe tener el respaldo de una publicación y aparecer en International Journal of Systematic
Bacteriology (IJSB)
5. Género sin indicar especie sp (se refiere a una especie no especificada) o spp(todas las especies
de ese género).

Cada una de las categorías taxonómicas recibe el nombre de taxón y su plural es taxa. Normalmente
sobre el nombre de un género se construyen las categorías superiores con distintas terminaciones
establecidas por el Código. Las categorías taxonómicas en las que se clasifican los seres vivos son:
• Especie
• Género
• Familia: -aceae
• Orden: -ales
• Clase: -opsida
• División: phyta
• Dominio

SISTEMAS DE CLASIFICACIÓN

A la hora de clasificar a los microorganismos nos encontramos con dos tipos diferentes de sistemas de
clasificación: el sistema fenético y el sistema filogenético.
Estos están basados en las características taxonómicas de os microorganismos, de tal forma que el
sistema fenético se basa en las características fenotípicas de los microorganismos, sin embargo estas
en ocasiones pueden variar.
Los microorganismos se agruparán por lo tanto en función de las semejanzas en sus características
fenotípicas, y aquellos que compartan varias de estas características formarán un taxón.

Por otro lado, el sistema filogenético está basado en relaciones evolutivas mediante el análisis y
comparación del genoma. Los microorganismos se agruparán en función de probables relaciones
evolutivas. Sin embargo, este sistema es difícil de aplicar a las bacterias ya que hay ausencia de registros
fósiles.

En la taxonomía bacteriana, las características clásicas para clasificar las bacterias son variadas:
genéticas (posibilidad de recombinación por conjugación o transformación, presencia de plásmidos);
ecológicas (ciclo vital, patogenicidad, necesidad de oxígeno, temperatura, pH, etc); fisiológicas y
metabólicas (fuentes de carbono y nitrógeno, fuentes de energía, temperatura de crecimiento,
movilidad, pigmentos fotositéticos, luminiscencia); morfológicas (forma celular, tamaño de las células,
tinción, cilios y flagelos, mecanismo de movilidad, color)

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2. Métodos utilizados en la identificación y genotipado de bacterias.

En estos métodos, habrá aquellos que solo identifican, otros que genotipan (determinar si dos o más
microorganismos aislados pertenecen a la misma cepa, es decir, tienen genomas idénticos) y otros que
hagan ambas cosas.

Los principios clásicos para la identificación bacteriana son los cultivos, las pruebas bioquímicas y la
serología que analizan rasgos (principalmente morfológicas) y comportamientos de los microorganismos
fácilmente observables; pero tienen ciertos inconvenientes como es el hecho de que son laboriosos y
poco discriminantes a la hora de identificar a nivel de especie o género, son incapaces de mantener la
viabilidad del microorganismo durante el transporte de la muestra y de permitir el desarrollo de
microorganismos exigentes. También tienen el inconveniente de que no existen métodos fiables para
identificar ciertos microorganismos y la presencia de microorganismos viables no cultivables.

Como superación de los inconvenientes de las técnicas clásicas de identificación tenemos las técnicas de
biología molecular y las técnicas genéticas que no tienen las limitaciones de las clásicas solucionando los
problemas que éstas presentaban; y además, permite la detección de microorganismos en muestras por
identificación del genoma microbiano. Son técnicas universales, muy sensibles, con gran resolución y
poder discriminante, sin embargo, pueden resultar bastante caras.

Las técnicas de la microbiología clásica se centran en el estudio de rasgos fácilmente observables y

que son la expresión visible del genoma propio del microorganismo. Podemos distinguir entre métodos
fenotípicos, como son las pruebas bioquímicas y la antibiotipifación, y métodos físico-químicos, como
perfil electroforético y perfil cromatográfico.

- Métodos fenotípicos

La metodología clásica diferencia los microorganismos en base a variaciones bioquímicas detectadas

mediante pruebas metabólicas, tales como la producción de gas (con campanas durham, en las que se
observa la presencia de microorganismos si se rompe el agar o si hay producción de gas), reacciones
cromógenas y otros tipos de reacciones. Con esto, mediante la información obtenida a partir de las
distintas pruebas realizadas se puede identificar al microorganismo basándonos en las características
fenotípicas. Para ello, el microorganismo siempre tiene que crecer en un cultivo puro.

La diferenciación de dos especies en base a pruebas bioquímicas

exige realizar muchas reacciones de manera simultánea. Una
forma de hacerlo es mediante galerías comerciales con medios
liofilizados que permiten un fácil estudio de muchos caracteres
metabólicos al mismo tiempo. Estas galerías con medios
liofilizados (API) suponen un sistema miniaturizado de
identificación bacteriana. En cada uno de los pocillos de la
galería hay un azúcar determinado, de tal forma que se
introduce el mismo microorganismo en cada uno de los pocillos
y se observa su comportamiento en presencia de distintos
azúcares. Finalmente se hará el recuento de tubos positivos y
negativos, introduciendo los datos en un programa informático
que dirá el microorganismo más probable que sea. Sin embargo,
estas galerías permiten la identificación de especies, pero no
cepas; son poco discriminativas, ya que puede haber clones del
mismo microrganismo que comparten idéntico perfil pero no los
discrimina; y las galerías pueden presentar una mala
reproducibilidad, pudiendo llegar a mostrar como diferentes dos
cepas idénticas.

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Dentro de las pruebas clásicas tenemos:

• El serotipado que diferencia los microorganismos de una

misma especie detectando sus antígenos de superficie
mediante una colección de anticuerpos específicos. Su
principal utilidad es el diagnóstico de bacterias capsuladas
y Gram negativas. Su limitación es la existencia de cepas
que no expresan antígenos o cuyos antígenos son
desconocidos, por esto son cepas no identificables para las
cuales no se han desarrollado sistemas de serotipado. El
serotipado por tanto presenta una baja tipabilidad.
• El fagotipado diferencia los microorganismos de una misma especie basándose en el perfil de
sensibilidad de una cepa bacteriana a una colección de bacteriófagos de infectividad
restringida. Presenta problemas como la laboriosidad de la obtención de fagos, problemas de
reproducibilidad (dos cepas idénticas tienen fagotipos diferentes), dificultad para la
estandarización de reactivos, la naturaleza cambiante del fagotipo (hay un continuo incremento
en las colecciones de fagos) y una baja tipabilidad debido a cepas para las que no se posee
fagos válidos.
• El antibiotipado diferencia los microorganismos de una misma especie basándose en su patrón
de sensibilidad a los distintos antimicrobianos, pudiendo sistematizar su realización. Sus
limitaciones son que su poder discriminatorio depende del nivel de resistencia natural de una
especie concreta y del número de antibióticos empleado en ella, los genes de resistencia a los
antibióticos pueden variar (transmisión horizontal de plásmidos), además de esto, dos cepas
idénticas tienen antibiotipos diferentes.
La técnica consiste en realizar un antibiograma, en el que se utiliza un medio de cultivo mueller-
hinton y se siembran los microorganismos (bacterias) mediante un hisopo. A continuación se
colocan distintos discos de antibióticos sobre el cultivo y se coloca un papel especial. Se deja
incubar y al finalizar el cultivo, se observa dónde hay halos de inhibición, que serán zonas
señaladas en el papel donde no ha habido crecimiento por la presencia del antibiótico. Este
método se usa sobre todo para medir la eficacia del antibiótico mediante la medición del halo
de inhibición, de tal forma que a mayor diámetro mayor eficacia.

- Métodos físico-químicos

• Perfil electroforético diferencia los microorganismos de una misma especie basándose en el

perfil proteico o enzimático obtenido tras una separación electroforética. Se utiliza para
GENOTIPAR, comparando si los microorganismos tienen el mismo perfil proteico. Se trata de
una técnica analítica de separación en la que una partícula cargada se desplaza a través de un
soporte al que se le aplica un campo eléctrico, de tal forma que en función de la carga de las
partículas irán a un polo u otro. Normalmente se utiliza para
observar proteínas y ADN bacteriano. En el caso de las
proteínas se realiza un perfil proteico, en el que se extraen las
proteínas de una bacteria y se vierten en un gel de acrilamida
situado en la cubeta de electroforesis, en concreto, en el peine
donde se encuentran los distintos carriles o pocillos. A
continuación se aplica un campo eléctrico y se echa azul de

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 coomassie o sales de plata y se observan, de tal manera que cada banda es una proteína de la
bacteria. Esto permite comparar los perfiles de bacterias con un patrón de referencia para
determinar qué tipo de proteína es.
Tiene un inconveniente fundamental y es el gran número de bandas que se han de evaluar al
realizar el perfil electroforético en un gel de poliacrilamida.
• Perfil cromatográfico diferencia los microorganismos
de una misma especie basándose en los resultados de
la separación cromatográfica de algunos de sus
componentes como son los hidratos de carbono,
ácidos grasos, ácido micólicos y ácidos orgánicos.
Además, se distinguen el HPLC (cromografía de
líquidos) y la cromografía de gases.
Se basan en la identificación de los componentes de
una sustancia, de tal forma que se introduce la
muestra en el equipo y se separan sus componentes,
construyéndose una gráfica en la que cada pico
corresponde a un compuesto. Este método es complicado para identificar ya que habría que
separar todos los componentes de una bacteria. Por ello, generalmente se usa para distinguir
especies.

Los métodos moleculares se centran en el estudio directo del genoma del microorganismo que
queremos caracterizar atendiendo a determinadas diferencias o polimorfismos en su ADN. Como
ejemplos tenemos el análisis del ADN plasmídico, el % de guanina-citosina y el análisis del ADN
cromosómico. Tienen un gran poder discriminativo, por lo que es posible diferenciar cepas muy
próximas evolutivamente hablando; todas las cepas son tipificables ya que el ADN siempre puede ser
extraído; puede aplicarse sobre cualquier tipo de ADN, ya que se homogeinizan las técnicas para
cualquier microorganismo; y el ADN cromosómico es una característica estable, independiente de las
técnicas de cultivo y los métodos de preparación.

• Proporción guanina-citosina: consiste en cuantificar el contenido de bases guanina-citosina del

genoma del microorganismo estudiado. Esto nos sirve para conocer si la temperatura de
desnaturalización del ADN será alta o baja, ya que ésta aumenta cuanto mayor es el porcentaje
de guanina-citosina del genoma analizado debido a la fuerza de su enlace. Con esta técnica se
puede ubicar a una bacteria en el árbol filogenético, y no se suele usar para identificar.
• ADN plasmídico: estudia el número, tamaño y patrón de restricción de los plásmidos
contenidos en las cepas bacterianas que queremos tipificar. Tiene ventajas como son: es una
técnica sencilla e idéntica para todas las especies bacterianas, pero también inconvenientes
como son: tienen difícil interpretación, cabe la posibilidad de la incorporación de nuevos
plásmidos por conjugación, existen diferentes plásmidos con idéntico peso molecular, la
existencia de cepas emparentadas con perfiles diferentes y cepas que carecen de plásmidos.
Para poder observar y estudiar los plásmidos se realiza una electroforesis en agarosa
• ADN cromosómico: Estudia las diferencias (o polimorfismos) existentes en el ADN del
cromosoma contenido en la cepa que queremos tipificar. Las técnicas empleadas son:
1. Comparación de las diferencias (polimorfismos) de longitud de los
fragmentos de restricción.

Utilizado para GENOTIPAR. Consiste en extraer el ADN de un microorganismo

mediante la lisis microbiana y este es tratado con enzimas de restricción, de tal forma
que se obtienen varios fragmentos del ADN. A continuación, se realiza una
electroforesis especial con agarosa, llamada electroforesis en campo pulsado (PFGE),
vertiendo el ADN en una cubeta hexagonal en la que el campo eléctrico va cambiando
de dirección, de tal forma que los distintos fragmentos del ADN se van separando y
obteniendo un perfil de bandas. Si los perfiles de bandas de distintos microorganismos
coinciden, pertenecerán a la misma cepa; al igual que si se comparan los resultados
con una base de datos se puede identificar la bacteria.

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2. Comparación de polimorfismos en material cromosómico previamente
amplificado con PCR.

En estas técnicas es común el uso de la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para

amplificar fragmentos de ADN. Como ventajas presenta que es una técnica sencilla y
reproducible, pero se han de tener cebadores específicos para la especie que se quiere
identificar y no sirve para tipificar. Se trata de una síntesis enzimática “in vitro” con la
que se realizan múltiples copias de una secuencia de ADN, obteniendo muchas copias
en poco tiempo, y que se basa en el uso de termocicladores. Este método se diferencia
del anterior en que solo se trabaja con un fragmento del ADN, utilizando primers
específicos para dicha especie o género. En estos métodos, siempre hay que hacer un
control negativo en el cual se realiza la PCR sin molde de tal manera que no tendría
que haber ninguna banda ni contaminación; y un control positivo con el ADN de la
bacteria a analizar al cual se deben unir los cebadores y debe quedar amplificada. La
desventaja es la gran cantidad de primers que hay que utilizar para determinar qué
tipo de microorganismo es comparándolos con bacterias conocidas. En esta técnica
encontramos:
 RAPD-PCR o ADN polimórfico ampliado al azar : se estudia el polimorfismo en
distintas regiones elegidas al azar en el ADN, utilizado para GENOTIPAR. En lugar
de introducir dos cebadores, se usa solo uno de cadena corta, de tal forma que
este se pegará a muchos lugares del ADN, y al unirse a la distancia óptima para la
polimerasa ésta empieza a funcionar, obteniendo un perfil de muchas bandas de
tamaño desconocido. En esta técnica siempre habrá perfil, por lo que se podrán
determinar varios tipos de microorganismos. A pesar de que es una técnica
sencilla y aplicable a cualquier microorganismo, tiene una baja reproducibilidad (al
cambiar ligeramente las condiciones se obtendrán patrones distintos) y el bajo
poder discriminatorio. Al obtener el patrón de bandas, se calculan los coeficientes
de similitud existentes entre cada par de cepas tipificadas con la ayuda de
sistemas computerizados.
 16S-ASDRA: se basa en el análisis de fragmentos de restricción del fragmento
amplificado del gen ribosomal 16-S. Este fragmento está en todas las bacterias, de
tal manera que se amplifica y se corta con enzimas de restricción, obteniendo un
perfil de bandas que es característico de cada especie, por lo que sirve para
identificar. Para IDENTIFICAR, ya que no hay discriminación intraespecífica.

Además, encontramos otros métodos de identificación independientes de cultivo, los

cuales se basan en la extracción de todo el ADN de una muestra, amplificándose el
ADN de todas las bacterias mediante el uso de cebadores que se unen al ADN 16s y se
obtiene una banda propia de cada bacteria. A continuación, se separan los fragmentos
del ADN mediante un equipo especial, basado en la electroforesis de proteínas y se
secuencian los fragmentos amplificados para determinar las distintas especies de
bacterias de la muestra, pudiéndose comparar los resultados con las bases de datos.

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 3. Comparación de polimorfismos en la secuencia nucleotídica de fragmentos del
genoma.

Para comparar los perfiles de las bandas obtenidas, el GelCompar normaliza los patrones de
bandas obtenidos en función de los patrones de peso molecular conocido. De esta forma, dos
bandas con ADN del mismo tamaño pueden tener distinta posición en el gel debido a ciertos
factores distorsionantes, y para ello se normalizan las bandas: se asigna la misma posición a
dichas bandas a pesar de sus diferencias.

Análisis cluster
mediante la construcción
deComo ayuda a la hora
un dendograma en el
de identificar distintos
que se ve el tanto por
tipos de bacterias
ciento de similitud de
tenemos el Bergey's
distintas proteínas o ADN
Manual of
observadas por
Determinative
electroforesis
Bacteriology, un libro
que se ha empleado en
numerosos laboratorios
de microbiología de todo el mundo para identificar bacterias
elaborado por David Bergey y otros colaboradores.
La primera edición del Bergey's Manual of Systematic Bacteriology está orientado
principalmente a la clasificación más que a la identificación, y se clasifican en función de distintas
características como la tinción de Gram, rasgos descriptivos, morfológicos y metabólicos.
En la actualidad se está trabajando en la segunda edición del Bergey's Manual of Systematic
Bacteriology debido a que el progreso considerable en el campo de la taxonomía hace que se hayan
duplicado el número de especies nombradas además de que han surgido nuevos géneros, que a
diferencia de la 1ª edición, que sólo agrupa las bacterias del Reino Procaryotae, la clasificación de la 2ª
edición se resume en dos dominios, Archaea y Bacteria que poseen en total 14 Reinos. Esta edición se
basa en la clasificación en función de características filogenéticas en lugar de fenotípicas, y contendrá
más información ecológica que clínica.

Sin embargo, a pesar de los cambios y avances en los criterios de clasificación, la identificación sigue
basándose en la distinción entre géneros y especies. Por ello, se puede seguir utilizando la novena
edición del primer volumen hasta que se complete el segundo volumen.