TECNOLÓGICO DE ESTUDIOS SUPERIORES DE HUIXQUILUCAN

LICENCIATURA EN BIOLOGÍA

TALLER DE INVESTIGACION II

ACTIVIDAD: PROTOCOLO

TÍTULO DEL PROYECTO

LOS CULTIVOS CELULARES IPS, GENERANDO (CITOQUINAS)

PARA LA ACTUACION DE LA RESPUESTA INMUNE EN

PADECIMIENTOS RESPIRATORIOS.

MARTINEZ NUÑEZ DELIA.

MIER LUNA CARLOS MAURICIO

MONZALVO DORANTES JOSE ANGEL

OLIVA RAMIREZ LUIS GERARDO

INDICE

I. RESUMEN

II. INTRODUCCION

III. OBJETIVO GENERAL

IV. OBJETIVOS PARTICULARES

V. HIPOTESIS

VI. JUSTIFICACION…

VII. ANTECEDENTES

VIII. MARCO TEORICO

IX. METODOLOGIA

X. METODOLOGIA PARTE 1…

XI. METODOLOGIA PARTE 2…

XII. REFERENCIAS
RESUMEN
Cuando algún patógeno ataca a nuestros sistemas, la respuesta innata y adaptativa para una
buena comunicación en las células del sistema inmunológico la activación es por los
mediadores llamados citoquinas, el utilizar cultivos celulares de estas proteínas
activadoras del sistema inmunológico, y el generar de líneas de células pluripotentes
inducidas iPS para la secreción de citoquinas puede ser una opción para el sistema
inmunológico

INTRODUCCIÓN
La inmunología como ciencia surgió en 1798, todo surgió por la vacuna de Edgard Jenner
(1749-1823), quien observó que aquellos pacientes que se curaban después de alguna
infección con la viruela de la vaca, quedaban protegidos contra la viruela humana.
Convencido por sus observaciones, en mayo de 1796 inoculó a James Phipps, un niño de
ocho años, la viruela de vaca y unos meses después la viruela humana. El niño sobrevivió
porque se había hecho inmune a la enfermedad. Jenner envió el artículo con estos datos a
la Royal Society para su publicación, pero se lo rechazaron, por miedo a que dañara la
reputación de tal Sociedad. En 1949 Burnet argumentó que las bacterias, virus y células
genéticamente distintas, que ingresan en el organismo durante la vida embrionaria, pueden
ser tolerados indefinidamente. El científico británico Peter Medawar y su equipo apoyaron
el argumento de Burnet. Esto contribuyó a redefinir la inmunología como la ciencia de
reconocimiento entre lo propio y lo extraño y generó un concepto innovador que vinculó
la ciencia básica con la clínica en el tratamiento de enfermedades autoinmunes, cáncer,
alergias y síndromes de inmunodeficiencia. los constantes avances científicos alcanzados
por la tecnología que ha impulsado el desarrollo del cultivo celular, la biología molecular,
la ingeniería genética y la bioquímica de las proteínas, lo cual ha permitido conocer en
términos estructurales y bioquímicos, muchos fenómenos que acontecen en la respuesta
inmune. (Consuelo Boticario Boticario, 2013)
Las células del sistema inmune adaptativo, específico y en sistema innato inespecífico, el
especifico es donde se reconocen antígeno
Los cultivos celulares. Es un cultivo in vitro constituido por células que pueden crecer y
mantenerse en suspensión o en monocapa en condiciones controladas, pueden ser
obtenidos a partir de biopsias (fragmento de un órgano o tejido etc), por disgregación de
tejidos o a partir de fluidos orgánicos como la sangre produciendo estas en una manera
rápida.

MARCO TEORICO
Las inmunodeficiencias en el sistema inmunológico, pueden ser causadas por un déficit de
la comunicación ¨la activación¨ entre las células, y de este trabajo se encargan las
citoquinas. ¿Pero cómo saber que es una inmunodeficiencia? Y que es por un déficit de la
comunicación entre las células inmunológicas, en este caso la activación del sistema
innato y adaptativo.
Hay muchas inmunodeficiencias en el sistema inmunológico del hombre, por ello hay una
serie de infecciones recurrentes en algunos individuos, hay ocasiones donde ya es tan
grave la complicación, que ni antibióticos ni antivirales ayudan de una manera eficaz,
produciendo enfermedades crónicas.
En México no hay un registro de las inmunodeficiencias ya que muchas veces no se saben
diagnosticar, pero lo que es seguro, es de cada año estas cifras aumentan sin tener un
valor, y cuando a un paciente se le detecta ya cuando causaron complicaciones y dejando
al paciente con una mala calidad de vida. (Erika Coria Ramírez, 2010).
La sospecha o diagnóstico de estas puede ser por el seguimiento de infecciones recurrentes
de infecciones respiratorias continuas, desde el catarro común, pasando por la otitis,
amigdalitis, sinusitis, bronquitis aguda, laringotraqueitis, bronquiolitis y laringitis, hasta la
neumonía, y muchas veces los padres, o el mismo paciente no saben identificar
sintomatologías y no van con su médico. (Ferreira-Guerrero E, 2013)
SISTEMA INMUNE INNATO Y ADAPTATIVO
El sistema inmune, con sus dos líneas de defensa, la innata y la adaptativa, es la encargada
de reconocer esta invasión y de reaccionar para su eliminación. La inmunidad en su
conjunto, es consecuencia de una compleja interrelación entre el sistema inmune innato,
inespecífico frente a los antígenos, y el sistema inmune adaptativo, específico del
antígeno. Las células del sistema inmune innato usan receptores de reconocimiento no
clonal, mientras que las del sistema inmune adaptativo, linfocitos T y B usan receptores
clonales que reconocen antígenos o los péptidos derivados de dichos antígenos, de una
manera altamente específica. (Consuelo Boticario Boticario, 2013)

SISTEMA INMUNE
El sistema inmune está compuesto de distintos tipos de células y proteínas. Cada
componente tiene una misión especial enfocada a reconocer y reaccionar frente al material
extraño (antígenos). Los órganos del sistema inmune están distribuidos por todo el
organismo y se denominan órganos linfoides. (Consuelo Boticario Boticario, 2013)
Estos se dividen en primarios y secundarios; los primarios o entrales (medula ósea y el
timo) y secundarios o periféricos (bazo, ganglios linfáticos, amígdalas, placas de Pleyer y
MALT o tejido linfoide asociado a mucosa) (Arnaiz, Regueiro, & López, 1995)
ÓRGANOS LINFOIDES.

Los órganos linfoides se compone por adenoides, dos glándulas localizadas detrás de la
vía nasal; amígdalas, dos masas ovales situadas en la garanta; apéndice, pequeño tubo
conectado al intestino grueso; bazo, órgano localizado en la cavidad abdominal; medula
ósea, tejido adiposo blando en las cavidades de los huesos; nódulos linfáticos, pequeños
órganos de forma de habichuela localizados a través de todo el cuerpo y conectados a los
vasos linfáticos; placas de Peyer, tejido linfoide en el intestino delgado; timo, dos lóbulos
que se unen en el frente de la tráquea detrás del esternón; vasos linfáticos, red de canales
que atraviesa todo el cuerpo que conduce los linfocitos a los órganos linfoides y al torrente
sanguíneo; vasos sanguíneos, son las arterias, venas y capilares a través de las que fluye la
sangre. (Consuelo Boticario Boticario, 2013)

¿DE DONDE PROCEDE EL SISTEMA INMUNE?

Como sabemos las células del sistema inmune proceden de células madre pluripotenciales
de la médula ósea, la medula ósea proviene del hígado embrionario donde las células
madre dan origen las células sanguíneas; las células madre de la médula ósea tienen una
variedad de funciones en el sistema inmune tales como la fagocitosis, la secreción de
citoquinas y la presentación de antígenos. (Consuelo Boticario Boticario, 2013)
LAS CÉLULAS MADRE.
Una célula madre o troncal es aquella que es capaz de dividirse indefinidamente y
diferenciarse a distintos tipos de células especializadas, no sólo morfológicamente sino
también de forma funcional. (Prósper, 2003)

Las células madre o progenitoras se han clasificado según su lecho natural de derivación,
su aptitud y su función diferencial, en tres tipos: totipotenciales, pluripotenciales y
multipotenciales; las primeras, llamadas células madre embrionarias, derivadas del cigoto
en estadio de mórula; las segundas, provenientes de la masa celular interna (MCI) del
blastocisto; las terceras, denominadas células madre somáticas, se encuentran en algunos
tejidos adultos. (Morale, 2012)
Las células madre se han clasificado de acuerdo con diferentes criterios: De acuerdo con
una organización jerárquica de la diferenciación celular, la cual determina su potencial de
desarrollo, se clasifican como totipotentes, aquellas con capacidad para dar origen a un
organismo completo incluyendo el tejido germinal y las envolturas extraembrionarias;
pluripotentes, las células que son capaces de dar origen a células de las tres capas
germinales y multipotentes, u órgano específico, las que dan origen a células de un tejido u
órgano particular. Las células madre pueden también clasificarse de acuerdo con su origen
en células madre embrionarias (escs: Embryonic Stem Cells), células pluripotentes que se
obtienen de la masa celular interna del blastocisto, células madre germinales embrionarias
(gscs: Germinal Stem Cells), células pluripotentes que se obtienen de la cresta gonadal del
feto y células madre adultas (ascs: Adult Stem Cells), células multipotentes que se
originan de tejidos adultos maduros. (Orlando Chaparro, 2009)
Las dificultades éticas y legales con respecto al uso de embriones humanos para la
obtención de células madre embrionarios, la generación directa de células pluripotentes.
La implementación de nuevas estrategias de reprogramación nuclear en células somáticas
para la producción de células madre pluripotentes inducidas (iPS) (Beltrán, 2013); y estas
secretar a las citoquinas que son moléculas producidas por células del sistema inmune,
encargadas de la comunicación intercelular, y en consecuencia afectan las funciones de
muchas células distintas. (Consuelo Boticario Boticario, 2013)

ANTECEDENTES.
LAS hESCs
Las células madre embrionarias humanas o células stem embrionarias humanas (hESCs:
human Embryonic Stem cells) El aislamiento de las hESCs a partir de la masa celular
interna del blastocisto, implica necesariamente la destrucción del embrión, convirtiéndose
por lo tanto en un procedimiento éticamente cuestionable. El aspecto ético sigue estando
en el centro del debate y la pregunta fundamental sigue siendo, si ¿es moralmente
aceptable?
En el documento, el Consejo proporciona una breve descripción de cuatro métodos
propuestos para obtener células madre pluripotentes humanas sin destruir embriones
humanos.
En el primer método, sugerido al Consejo por Donald Laundry y Howard Zucker del
Colegio de Médicos y Cirujanos de la Universidad de Columbia, se extraerían células
madre sanas individuales de embriones de 4 u 8 células que no pudieron generar
embriones viables para in vitro fertilización (FIV). En la segunda opción, una o dos
células se eliminarían de los embriones vivos de 4 u 8 células y se desarrollarían por
separado en cultivo. El tercer método, sugerido por el miembro del consejo William
Hurlbut de la Universidad de Stanford, propone la creación de artefactos biológicos
similares a los embriones capaces de convertirse en células madre pluripotentes viables,
pero nunca en humanos. (Philbrick, 2005)
La cuarta propuesta implica la reprogramación de las células somáticas humanas, quizás
con la ayuda de factores citoplasmáticos especiales obtenidos de los ovocitos (o de las
células madre embrionarias

pluripotentes), a fin de "des diferenciarlas" de nuevo en células madre pluripotentes. Es

crucial para este enfoque descubrir una forma de revertir la diferenciación celular hasta la
pluripotencia, pero no (como en la clonación) aún más atrás a la totipotencia.
Propuesta IV. Esta propuesta no involucra embriones, sino células diferenciadas. El
objetivo es desdiferenciar estas células. Al menos algunos de los supuestos éxitos con esta
estrategia han tenido fallas cuando se examinan cuidadosamente. Esta propuesta debe
presentarse a los Institutos Nacionales de Salud y si pasa la revisión por pares con una
puntuación suficientemente alta para ser financiada, la investigación continuará. (Bioética,
2005)
Mi preocupación con muchas de estas propuestas es que utilizarán recursos financieros
que estarían mejor dedicados a propuestas que probablemente sean más productivas. Me
parece desconcertante la noción de que es éticamente correcto dejar morir embriones
sanos en lugar de usarlos para tratar de desarrollar líneas celulares que podrían beneficiar a
pacientes enfermos y moribundos. Hablamos de proteger la dignidad humana. Debemos
esforzarnos por ayudar a los pacientes con enfermedades graves que podrían ser tratadas
con células madre embrionarias para que vivan una vida tan satisfactoria y digna como sea
humanamente posible. La investigación propuesta en este Libro Blanco en gran medida no
logra este bien, y por lo tanto no puedo apoyar las propuestas I, II y III.
Janet D. Rowley (Bioética, 2005)
“Células Madre Pluripotentes Inducidas”, o células iPS, por su denominación en inglés
“induced pluripotent stem cells”. Más recientemente, usando una metodología similar,
varios estudios han reportado la obtención de iPS humanas (8,9). De esta manera, la
obtención de células pluripotentes humanas, semejantes a las hESCs, no requiere la
utilización de embriones, ni de cigotos humanos y permite a la comunidad científica
desarrollar una fuente de células pluripotentes, viable técnicamente y socialmente
aceptable. (Orlando Chaparro, 2009)
CITOQUINAS/ O CITOCINAS
En la respuesta inmune las citoquinas pueden actuar en el desarrollo de la respuesta
inmune inmediata y no especifica, conocida como respuesta innata y que está presente en
todas las plantas y animales, y en el desarrollo de la respuesta inmune específica, capaz de
reconocer al antígeno y por lo tanto de crear una memoria inmunológica que perdura aun
cuando el agente patógeno es eliminado, conocida como respuesta inmune adaptativa, y
que tan solo está presente en los vertebrados. (OTERO*, 2011)
Shinya Yamanaka ha propuesto recientemente dos modelos de generación de células
pluripotentes a partir de células somáticas: el modelo “Élite” y el modelo “Estocástico”.
El modelo élite asume que solo una pequeña fracción de la población de células somáticas
es susceptible de ser reprogramada. Este modelo a su vez podría subdividirse en un
modelo “élite predeterminado” y un modelo “élite inducido”. En el modelo élite
predeterminado las células competentes para la reprogramación serían células madre y/o
células progenitoras presentes en la población de células somáticas y que se encuentran
normalmente formando parte de los tejidos adultos. (Orlando Chaparro, 2009)
Nuestras técnicas de obtención y cultivo de las células provenientes de la medula ósea se
basarán en las técnicas utilizadas en el trabajo (Estandarización de la técnica para la

obtención de células mesenquimatosas de médula ósea de rata para su aplicación

en el manejo de lesiones medulares).

OBJETIVOS.
OBJETIVO GENERAL.
Utilizar los cultivos celulares de Ips (Citoquinas) para ayudar, a activar al sistema
inmunológico.
OBJETIVOS PARTICULAR.
Explorar las reacciones, secundarias de Ips que podrían tener y buscar cómo controlarlas.
Aporte de los cultivos celulares en el sistema inmune.

HIPOTESIS.

Utilizar este tipo de cultivos de proteínas activadoras, para el sistema inmunológico.

La generación de líneas de células pluripotentes inducidas iPS los cuales segregan células
como los macrófagos y estos son de las células más productoras de citoquinas, y las
citoquinas realizaran su función en el sistema inmunológico tanto en el sistema innato y en
el adaptativo de pacientes con inmunodeficiencias respiratorias.

JUSTIFICACION.
El beneficio que aportara esta investigación es mejorar la respuesta inmunológica hacia
alguna enfermedad que sea inmunodepresora en vías respiratorias ¨pulmones¨ ya que los
cultivos las células pluripotentes iPS las cuales segregarían los macrófagos y estas a las
proteínas citoquinas las cuales son las proteínas activadoras y comunicadoras en el sistema
inmunológico innato y adaptativo.
Los beneficios son el poder mejorar el sistema inmunológico por células las
correspondientes y no solo atacar con medicamentos arriesgándonos a hacernos más
susceptibles a otras enfermedades, ya que las infecciones hacen resistencia al
medicamento día a día en la mayoría de la población que se auto medican, o que no lleva
un control adecuado de los medicamentos o simplemente no tienen el sistema
inmunológico activado para dar respuesta a alguna infección a causa de no producir
adecuadamente estas proteínas.
Los beneficiarios como lo he mencionado seria toda la población con el sistema
inmunológico comprometido como comúnmente se le conoce “con bajas defensas”.

MÉTODO PARTE 1
El estudio está basado en revisión de artículos relacionados con el tema para explorar si se
ha hecho o se puede realizar. – El análisis de los diferentes cultivos celulares para activar y
mejorar el sistema inmune. Identificar el tipo de iPS se pueden utilizar para sistema
inmunológico. Se revisarán los métodos específicos de cultivo de proteínas, y los métodos
propuestos para obtener células madre pluripotentes aceptadas viable técnicamente y
socialmente aceptables.
La búsqueda bibliográfica se hará por subtema.
Los artículos tendrán máximo 10 años de antigüedad es decir del 2010 a 2020. La
búsqueda será en redalyc y en pub med, con su respectivo Doi, ya sean de revisión o no,
Sistema inmune y sus células activadoras, Tipos de anticuerpos, Que son las Ips y como
obtenerlas, Los cultivos de células (proteínas). Método de cultivos y su efectividad puede
aquí coloque valores para dar un poco de estadística de la efectividad según la revisión,
Como aplicar el trasplante de proteínas. ¿Qué consecuencias podríamos provocar? Como
disminuir o eliminar las afectaciones secundarias con el tema para explorar si se ha hecho
o se puede realizar. - Análisis de los diferentes cultivos celulares para activar y mejorar el
sistema inmune. - identificar el tipo de iPS se pueden utilizar para sistema inmunológico.

PASOS Y MATERIALES RECOMENDADOS PARA DE TECNICAS PARA EL

CULTIVO DE CELULAS PLURIPOTENTES INDUCIDAS (iPSC)
  Reprogramación
 Cultivo celular
 Ingeniería
 Diferenciación
 Caracterización

Reprogramación: La reprogramación de células somáticas para la generación de células

madre pluripotentes inducidas (células iPS) puede lograrse mediante diferentes
tecnologías. Como lo son las tradiciones y las no integradoras para generación de iPSC a
partir de diferentes tipos de células somáticas.
Materiales recomendados:
Herramientas:
 Kit de reprogramación Sendai CytoTune™-iPS
 Vectores episomales de reprogramación de iPSC
 Kit de detección de Sendai IPSC TaqMan
Medios:
 Medio Essential 6
Confirmación de identidad celular:
 Kit de amplificación PCR AuthentiFiler

Cultivo celular: La investigación con células madre pluripotentes inducidas (iPSC)

requiere una cuidadosa atención a las condiciones de cultivo.

Herramientas:
 Sustitutivo de suero KnockOut
 Medio Esencial 8
 Vitronectina (VTN-N)
 Kit ESC/iPSC KnockOut CTS XenoFree libre de componentes animales

Medios:
 Comparar todos los medios de congelación celular para usar el que más favorezca
Otros productos:
  Fibroblastos embrionarios de ratón Gibco

Ingeniería: Realizar la ingeniería de sus células madre inducidas para analizar la

expresión génica y de proteínas, y estudiar la diferenciación y las vías de la enfermedad.
Elija entre productos de transfección basados en electroporación y lípidos, y entre una
gama de tecnologías de clonación, incluida la clonación Gateway y Topo.

Sistemas recomendados:
 Sistema de transfección Neon
 Tecnología de clonación de recombinación Gateway
 Examine nuestra completa gama de productos de transfección
 Lipofectamine 3000

Diferenciación: Ofrece varios factores de crecimiento y citoquinas de alta calidad para la

diferenciación selectiva de las células madre pluripotentes inducidas (células iPS). Estas
proteínas son sometidas a pruebas exhaustivas para asegurar una alta actividad biológica,
alta pureza, estabilidad a la congelación-descongelación y homogeneidad estructural.

Además, de una amplia gama de reactivos y medios de cultivo celular, permiten un

crecimiento, una expansión y un almacenamiento óptimos de células diferenciadas.
Factores de crecimiento:
 Factores de crecimiento Gibco
Reactivo y medios:
 Medio de inducción neuronal de células madre pluripotentes (PSC)
 Medio de diferenciación de cardiomiocitos de PSC
 Kit de medio de inducción de endodermo definitivo de PSC
 Suplemento B-27
 Medio Neurobasal A
 Suplemento N-2
 Suplemento G-5
 Medio Essential 6

Caracterización: La validación de células iPS para asegurarse de que son pluripotentes o

que se han diferenciado en el linaje celular deseado es un paso fundamental para su
investigación.

Los kits de detección de fosfatasa Invitrogen y los anticuerpos de superficie de las células
se pueden utilizar para los ensayos de pluripotencia. Tarjetas de la pluripotencia de células
madre de la matriz TaqMan de Applied Biosystems analizan simultáneamente 96 niveles
de expresión génica mediante PCR cuantitativa y los ensayos de proteínas TaqMan
permiten la cuantificación de proteínas relativa de marcadores proteínicos de células
madre a partir de cantidades limitadas de células madre.

Caracterización de PSC:
 Factores de crecimiento Gibco
 Kits de tinción en vivo e inmunocitoquímica
 Tinción en vivo de fosfatasa alcalina
 Kit de detección de Sendai IPSC TaqMan

Matrices de ensayos TaqMan:

 Panel Scorecard™ de hPSC (célula madre pluripotente humana) TaqMan
 Matriz de la pluripotencia de células madre
 Kits de análisis de expresión de proteínas

METODOLOGIA
Obtención in vivo de médula ósea/sangre de tibia de rata. Se anestesiarán ratas con una
mezcla de ketamina 65 mg/kg (Cheminova) y xilacina 10 mg/kg (Bayer) por vía
intraperitoneal. Con técnicas de asepsia y antisepsia se realizó una incisión de 5 mm de
longitud en el tercio superior y cara medial en tibia, dejando expuesta un área de tejido
óseo. Con soporte para broca manual y una broca con un diámetro de 1.6 mm (Triumph)
en posición perpendicular a la superficie de la tibia, se realizarán manualmente una
perforación en el tejido óseo, hasta llegar al canal medular. Enseguida, mediante una
jeringa de 3 mL con aguja de 22G x 32 mm (BD Plastipak) adaptada con una cánula de
polipropileno, enjuagadas con 200 µL de heparina (PISA, 1,000 UI/mL) y colocando la
punta de la cánula en la perforación, se aspirarán in vivo 500 µL de médula ósea/sangre.
Al término del procedimiento se cerró la herida quirúrgica en un solo plano con sutura de
nylon 3-0, se limpiará la herida con isodine espuma y se mantendrá en observación a la
rata hasta recuperarse de la anestesia.

Obtención de células adherentes a poliestireno a partir de la fracción de células

mononucleares de médula ósea/sangre. Ciento cincuenta microlitros de la suspensión de
células mononucleares libres de Ficoll se cultivaran en placas para cultivo de poliestireno
de alta calidad con 6 pozos de 9.5 cm2 de área de crecimiento (Sarstedt), en 1.5 mL de
medio de cultivo de Iscove, un medio de Dulbecco modificado con L-glutamina y rojo de
fenol (IMDM, Gibco), con 10% de suero fetal bovino (Gibco) y 10 mL/L de una solución
de antibióticos (10,000 U/µL de penicilina G sódica, 10,000 mg/mL de sulfato de
estreptomicina y 25 mg/µL de anfotericina B, Gibco). Las células se incubaron a 37°C con
5% CO2, en ambiente húmedo (National Weinicke Company) por 3 días. Se vigiló
diariamente la viabilidad de las células mediante el uso de un microscopio invertido
(Axiovert 25, Zeiss), así como el volumen del medio de cultivo en cada pozo. Al cuarto
día se realizara un cambio de medio de cultivo, se agitara la caja moderadamente y se
retirara el medio. Las células que permaneceran adheridas (células mesenquimatosas) se
lavaran con 500 µL de medio IMDM con agitación suave. Para su estudio de viabilidad y
caracterización inmunofenotípica, las células mesenquimatosas seran suspendidas en 2 mL
de medio IMDM con 10% de suero fetal bovino y 10 mL/L de la solución de antibióticos.
Viabilidad de las células mesenquimatosas con azul de tripano. En un tubo de vidrio con
400 µL de azul de tripano al 0.4% (Gibco) se añadiran 100 µL de la suspensión de células
mesenquimatosas (dilución 1:5). Se agitará la mezcla de manera moderada e
inmediatamente después se colocará en la cámara de Neubauer (American Optical
Company) para hacer la cuenta de células viables.
MÉTODO PARTE 2
La selección de candidatos con inmunodeficiencia primarias y secundarias (primero se
trabajaría con pacientes con infecciones respiratorias recurrentes, que incluso llegan a
causar neumonías) potencialmente a pacientes que consumen inmunodepresores después
de un trasplante de órganos
Se desarrollaría en un laboratorio de investigación en inmunología, para poder encontrar o
hacer un análisis en hospitales de paciente con inmunodeficiencias primarias ya detectadas
la localización de los pacientes debe de ser en el área de la CDMX y EDO de México con
una población de 50 personas como mínimo y máximo con 100. Cuantificación de IgA,
IgM, IgG. Determinación de linfocitos, citometria de flujo, la colocación de producto en
días específicos (cada 3 o 2 meses) justo después de la toma de revisión de muestras
sanguíneas, Checando estadísticamente la evolución en niveles de pruebas inmunológicas.

Diferenciación
La médula ósea es un tejido graso y suave que yace al interior del hueso trabecular, y son
en conjunto la trabécula y el estroma de la médula ósea los elementos que físicamente
soportan y fisiológicamente mantienen el tejido hematopoyético (Panoskaltsis N,
Mantalaris A, Wu D. 2005). Durante los dos primeros años de vida, la médula ósea activa
(médula roja) se localiza en todos los huesos y gradualmente es reemplazada por tejido
medular inactivo (médula amarilla o grasa). El microambiente hematopoyético de la
médula ósea contiene células de la estroma cuyo origen puede ser mesenquimal, como es
el caso de las células endoteliales, los fibroblastos, los adipocitos y los osteoblastos o
puede ser hematopoyético no-mesenquimal como los macrófagos y las células dendríticas.
Todas estas células de la estroma producen y depositan elementos en la matriz extracelular
(MEC), además de esto son capaces de producir y concentrar citoquinas locales
hematopoyéticas que pueden inducir o inhibir la proliferación y diferenciación de células
progenitoras, formando así el “nicho de la célula madre/ progenitora” (Quesenberry PJ,
Crittenden RB, Lowry P, Kittler EW, Rao S, Peters S, et al. 2000). Se cree que la
diferenciación hacia un linaje específico puede depender de interacciones especializadas
entre células del estroma y células progenitoras (Hoffman R, Benz EJ, Shattil SJ, Furie B,
Cohen HJ, Silberstein LE, McGlave P. 2000).

Durante el proceso de maduración, las CMHs expresan o dejan de expresar moléculas o

antígenos en la membrana celular, lo cual ha sido muy útil para la caracterización de los
linajes celulares. La detección de estos marcadores facilita la identificación y aislamiento
de grupos celulares particulares. A pesar del gran número de estudios realizados, aún no se
ha podido encontrar un único marcador específico de las CMHs, sin embargo, el uso de
combinaciones de marcadores permite agrupar en subgrupos mezclas de células
funcionalmente heterogéneas con algunas características en común. Las células
hematopoyéticas primitivas no expresan marcadores de linaje (lin) propios. Esta ausencia
permite distinguir las células inmaduras del resto de células diferenciadas, siendo éstas
últimas más abundantes (Wognum AW, Eaves AC, Thomas TE 2003). La selección y
aislamiento de células utilizando los marcadores de linaje puede proporcionar un
enriquecimiento típico de subpoblaciones de CMHs de 20 a 500 veces en una muestra,
dependiendo de la combinación de marcadores usados. A continuación se citan algunos
ejemplos de marcadores de diferentes linajes: del linaje eritroide la glicoforina A, el
antígeno leucocitario humano-DR (HLA-DR) y el TER-119; del linfoide CD45, CD2,
CD3, CD4, CD8, CD19, CD20 y del mieloide CD14, CD56 y CD33 (22). Las CMHs y
otras subpoblaciones de células madre se pueden obtener de diversas fuentes como por
ejemplo de la médula ósea, de la sangre periférica y de la SCU (Sangre de Cordón
Umbilical). Para identificar, aislar y cuantificar la población de CMHs con frecuencia se
utiliza el marcador de linaje conocido como antígeno CD34, el cual se ha identificado en
la mayoría de células iniciadoras de cultivo de largo término (CI- CLT), en gran parte de
las células formadoras de colonias (CFC) y en células progenitoras linfoides y mieloides.
Este marcador sin embargo no está presente en la mayoría de células terminalmente
diferenciadas (Szilvassy S. 2003). Las células que expresan este marcador de
diferenciación linfoncitaria se caracterizan por poseer un gran potencial de repoblación in
vivo y por tener la capacidad de generar progenie eritroide y mieloide a partir de células
formadoras de colonias. El antígeno CD34 es una proteína monomérica de peso molecular
entre 110 y 120 KDA con una región amino terminal extracelular que contiene un dominio
proximal de 66 aminoácidos conformado por seis residuos de cisteína y al parecer con una
forma globular. De manera significativa, de los 145 aminoácidos que componen el
dominio N-terminal, 35% son residuos serina o treonina; este dominio también incluye 7
de 9 sitios potenciales de glicosilación (Lanza F, Healy L, Sutherland DR. 2001). Esta
sialomucina, fue el primer marcador de diferenciación reconocido en las células
hematopoyéticas primitivas humanas y se continúa usando para aislar progenitores y
CMHs para uso clínico (Wognum AW, Eaves AC, Thomas TE 2003). Este marcador
también se expresa en células endoteliales de vasos pequeños y en fibroblastos
embrionarios. El antígeno CD34 es codificado por un gen ubicado en el cromosoma 1q32,
región que contiene a su vez varios genes codificadores para moléculas de adhesión
celular tales como la selectina L, selectina P, selectina E y laminina B2. Aunque su
función no está completamente dilucidada, se ha considerado que puede servir como
ligando de la selectina-L, dependiendo de su adecuada glicosilación y sulfatación.
También se cree que el antígeno CD34 juega un papel importante tanto en la adhesión
intercelular como en la de las células con la matriz extracelular, induciendo la
polimerización de actina. Así mismo, se ha demostrado que la regulación de la expresión
del antígeno CD34 está implicada en el mantenimiento de la actividad hematopoyética
normal gracias a la inhibición de la proliferación de células progenitoras, mediada por
contacto y agregación celular (Lanza F, Healy L, Sutherland DR. 2001). La expresión del
antígeno CD34 es mucho mayor en células progenitoras tempranas y disminuye
progresivamente a medida que las células maduran, hasta no detectarse en células
terminalmente diferenciadas (Sutherland DR, Keating A. 1992, Young PE, Baumhueter S,
Lasky LA. 1995). El antígeno CD34 se expresa entre el 1-4% de las células nucleadas
presentes en la médula ósea humana de individuos sanos . En sangre periférica,
aproximadamente un mililitro de sangre contiene en promedio 4 x 103 células/µl CD34+
las cuales corresponden al 0.06% de las células nucleadas totales; y conforman entre el
0.1-1% de células nucleadas de SCU (Wognum B. 2003).
La hematopoyesis es representada como una jerarquía, en la cual las CHM originan a los
progenitores y posteriormente a las células que serán precursores de múltiples linajes
hematopoyéticos. Como se mencionó en capítulos anteriores, la identificación de los
diversos tipos celulares se realiza de acuerdo a la expresión de marcadores de superficie.
En este sentido, se ha caracterizado la expresión de diversos factores de transcripción que
regulan el desarrollo y función de las CMH, así como la diferenciación de un linaje
específico (Orkin SH. 2000). Algunos de los factores de trascripción que se han descrito
recientemente son: El factor SCL/tal-1, que es clave en la programación del mesodermo
hacia un destino hematopoyético, este factor y sus proteínas asociadas son esenciales para
el desarrollo de la hematopoyesis primitiva (saco vitelino) y definitiva (en el adulto),
debido a que en su ausencia, no se generan células sanguíneas (Kim SI, Bresnick EH.
2007). El factor de unión central Runx1 y su cofactor de unión CBF-β, también son
necesarios para la hematopoyesis definitiva, en este caso, ensayos con modelos
transgénicos que carecen de la función, han demostrado que Runx1 es necesario para la
transición de las CMH, pues en su ausencia, no existe hematopoyesis (Sasaki K, Yagi H,
Bronson RT, Tominaga K, Matsunashi T, Deguchi K, et al. 1996, Chen MJ, Yokomizo T,
Zeigler BM, Dzierzak E, Speck NA 2009). Por otro lado, se ha demostrado recientemente
una interacción del domino C-terminal del factor Mll1 relacionado a Trithrorax (una
histona H3 lisina 3 -H3K4- metiltransferasa), con el dominio Runt de Runx1, el cual
recluta a Mll1 originando una superposición funcional de ambos reguladores
transcripcionales, sugiriendo que su interacción es necesaria para la hematopoyesis
(Huang G, Zhao X, Wang L, Elf S, Xu H, Sashida G, et al. 2011). Otro factor esencial es
GATA2, el cual se expresa antes de la aparición de la CMH y se ha propuesto como un
marcador específico de células hematopoyéticas, además, su disminución afecta el
compromiso de la CMH hacia los distintos linajes sanguíneos (Minegishi N, Ohta J,
Yamagiwa H, Suzuki N, Kawauchi S, Zhou Y, et al. 1999, Minegishi N, Suzuki N,
Yokomizo T, Pan X, Fujimoto T, Takahashi S, et al. 2003). Se ha sugerido que el factor
GATA2 interactúa con el Runx1 durante la hematopoyesis, debido a que los ratones
deficientes en la expresión de GATA2+/- y Runx1+/- no son viables y muestran daño
severo en el proceso hematopoyético durante la gestación (Wilson NK, Foster SD, Wang
X, Knezevic K, Schutte J, Kaimakis P, et al. 2010). La familia de factores de transcripción
pertenecientes a Notch, son los componentes principales de una vía de señalización
altamente conservada, su dominio Notch-IC se trasloca al núcleo donde participa en la
formación de complejos de unión a Acido Desoxirribonucleico (ADN) y regula la
transcripción de diversos genes (Pajcini KV, Speck NA, Pear WS. 2011). El Factor
Notch1 es necesario para la generación de la hematopoyesis, ya que embriones deficientes
de esta proteína son capaces de producir progenitores hematopoyéticos pero no CMH de
largo plazo. Otro factor importante es Meis1, esta es una proteína cofactor que modula la
unión y afinidad al ADN, se ha demostrado que embriones deficientes en Meis1, mueren
por hemorragia e hipoplasia de hígado debido a la incompleta hematopoyesis durante el
desarrollo (Azcoitia V, Aracil M, Martinez AC, Torres M. 2005, Hisa T, Spence SE,
Rachel RA, Fujita M, Nakamura T, Ward JM, et al. 2004). La expansión de las CMH
tempranas es crítica para mantener una gran población durante la hematopoyesis necesaria
para la vida del organismo, y la programación de esta expansión en diferentes etapas de la
vida está relacionada con la expresión de diversas moléculas. Sox17, es un factor de
trascripción de alta movilidad relacionado a Sry expresado en CMH fetales y neonatales
pero no en adultas, su deficiencia perjudica la hematopoyesis fetal y las CMH neonatales
pierden su capacidad de reconstitución y la generación de CMH definitivas (Kim I,
Saunders TL, Morrison SJ. 2007). Por otra parte, los factores de transcripción necesarios
para la especificación y formación de las CMH pueden no ser necesarios continuamente
durante la supervivencia posterior o autorenovación de las CMH. En este sentido, aunque
SCL/tal1 es un factor crucial para la especificación del destino hematopoyético durante el
desarrollo, su inactivación en CMH adultas, no afecta el mantenimiento y auto-renovación
(Mikkola HK, Klintman J, Yang H, Hock H, Schlaeger TM, Fujiwara Y, et al. 2003). Los
procesos intrínsecos celulares, en particular los factores de transcripción son esenciales
para definir el linaje de cada CMH. Por ejemplo GATA1 promueve la diferenciación hacia
un linaje megacariocítico/eritroide y PU.1 induce diferenciación mieloide (Kulessa H,
Frampton J, Graf T. 1995), estas proteínas interactúan de tal forma que cada uno inhibe la
trascripción del otro y este antagonismo favorece la elección del linaje de la CMH (Nerlov
C, Graf T. 1998). Por otra parte, asociaciones entre GATA y el cofactor FOG (Friend of
GATA), han demostrado ser importantes para el desarrollo del linaje megacariocítico y
eritroide. La elección del linaje mieloide y eritroide, también es controlada por un
antagonismo entre c-MafB, un factor altamente expresado en monocitos y Ets1. Las
asociaciones de estos 34 factores a través de sus respectivos dominios de unión a DNA
inhiben la transactivación mediada por Ets1 y en consecuencia, se bloquea la maduración
eritroide (Sieweke MH, Tekotte H, Frampton J, Graf T 1996).

Presupuesto.
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