Todas Las Diapos Fva

Teledetección
Teledetección
Teledetección (remote sensing):
Acción de obtener información sobre un objeto, área o

fenómeno a través del análisis de los datos adquiridos por
dispositivos que no están en contacto con el objeto, área o
fenómeno en estudio
Técnica de adquisición y posterior tratamiento de datos de la

superficie terrestre desde sensores instalados en plataformas a
distancia, en virtud de la interacción electromagnética existente
entre el objetivo y el sensor, siendo la fuente de radiación bien
proveniente del sol (teledetección pasiva) o del propio sensor
(teledetección activa)
Teledetección
Teledetección
1794
«Early flight 02562u (10)». Publicado bajo la licencia Dominio público vía Wikimedia Commons ‐

https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_flight_02562u_(10).jpg#/media/File:Early_flight_02562u_
(10).jpg.
Teledetección
Gaspard‐Félix Tournachon (NADAR, 1858)
Primeras fotografías desde un globo aerostático
Teledetección
Julius Neubronner (1914)
Teledetección
Sputnik, 1957
Teledetección
Plataformas:
© 2009 by StratXX Near Space Technology AG
IKONOS
LandSat
Aqua
EO‐1
Teledetección
Tipos de información:
Espacial, indicando la organización en el espacio de los elementos
Espectral, denotando la naturaleza de las superficies
Temporal, donde se observan los cambios en el tiempo de una determinada zona
Teledetección
Meteorología
Cartografía y Planeamiento Urbanístico
Geología
Recursos Hidrográficos
Oceanografía y Recursos Marítimos
Medio Ambiente
Agricultura y Bosques
Determinación del vigor de la vegetación
Discriminación de tipos de vegetación
Medición de extensión de cultivos
Clasificación de usos del suelo
Teledetección
Déficit de Nitrógeno en maíz. Fuente: SEOS Project
Teledetección
Melón afectado por Uncinula necator. Fuente: SEOS Project
Fisiología Vegetal Aplicada Curso 2017/2018
Teledetección
Pérdida de área foliar por herbívoros. Fuente: SEOS Project
Teledetección
Teledetección
Teledetección
Bandas destacables en teledetección:
• Espectro visible (0.4‐0.7 µm)
• Azul: 0.4‐0.5 µm
• Verde: 0.5‐0.6 µm
• Rojo: 0.6‐0.7 µm
• Infrarrojo próximo (0.7‐1.3 µm)
• Infrarrojo medio (1.3‐8 µm)
• Infrarrojo lejano o térmico (8‐14 µm)
• Microondas (a partir de 1 mm): atraviesan la cubierta de nubes, pero hay
muy poca energía, precisa ser un método activo (RADAR)
Teledetección
• Sensores:
Visible‐IR (dominio óptico)
Infrarrojo térmico
Microondas (activos)
• Pancromáticos: una sola banda ancha (PAN)‐IKONOS
• Multiespectral (MS, TM)‐LANDSAT
• Superespectral (MODIS)‐AQUA
• Hiperespectral (Hyperion)‐EO‐1
Teledetección
Resoluciones:
• Resolución espectral: se refiere al número de bandas y a la anchura espectral de

esas bandas que un sensor puede detectar. Por ejemplo la banda 1 del TM recoge
la energía entre 0.45 y 0.52 mm.
• Resolución espacial: es una medida del objeto más pequeño que puede ser
resuelto por el sensor, o el área en la superficie que recoge cada píxel.
• Resolución radiométrica: número de posibles valores que puede tomar cada

dato. Por ejemplo con 8 bits, el rango de valores va de 0 a 255.
• Resolución temporal: cada cuanto tiempo recoge el sensor una imagen de un

área particular. Por ejemplo el satélite Landsat puede ver el mismo área del globo
cada 16 días.
Teledetección
Dominio óptico
Especular o
Lambertiana
Factores que afectan a la reflexión
Ángulo de iluminación solar (depende de la fecha y hora)
Relieve (influencia de las pendientes)
Atmósfera (dispersa y absorbe)
Teledetección
Teledetección
Visible
IR‐Falso color
Teledetección
FIRMA ESPECTRAL
Comportamiento de la reflexión de una superficie a lo largo de las diferentes
longitudes de onda
Teledetección
FIRMA ESPECTRAL
longitudes de onda
¿Cómo sería en una hoja?
Teledetección
FIRMA ESPECTRAL
longitudes de onda
¿Cómo sería en una hoja?
Teledetección
FIRMA ESPECTRAL
Teledetección
Comportamiento en el dominio óptico:
Vegetación: baja reflectividad en el visible
(máximo en el verde, mínimo en el rojo).
Alta reflectividad en el infrarrojo cercano
Suelos: plano ligeramente ascendente,
depende de la composición y del contenido
en agua
Agua: muy bajo y de sentido descendente,
excepto nieve y nubes
Teledetección
Teledetección
Índices de vegetación
Ratio Vegetation Index (RVI)

RVI = NIR/Red
Normalised Difference Vegetation Index (NDVI)

NDVI = (NIR ‐ Red)/(NIR + Red)
Teledetección
Normalised Difference Vegetation Index (NDVI)

Teledetección
Índices de vegetación
Identification of stressed vegetation from AVIRIS data. Image classification showing the various crop types.

Source: U.S. Geological Survey Source: U.S. Geological Survey
Teledetección
Teledetección
Ley de Wien (µm): max= 2898/T
Credit: Jenny Mottar; Image Courtesy of SOHO/consortium.
Teledetección
Bandas destacables en teledetección:
• Espectro visible (0.4‐0.7 µm)
• Azul: 0.4‐0.5 µm
• Verde: 0.5‐0.6 µm
• Rojo: 0.6‐0.7 µm
• Infrarrojo próximo (0.7‐1.3 µm)
• Infrarrojo medio (1.3‐8 µm)
• Infrarrojo lejano o térmico (8‐14 µm)
• Microondas (a partir de 1 mm): atraviesan la cubierta de nubes, pero hay
muy poca energía, precisa ser un método activo (RADAR)
Teledetección
Teledetección
Infrarrojo térmico
Teledetección
Comportamiento en el infrarrojo térmico:
Vegetación: más fría que el entorno de dia y
más caliente de noche
Suelos: depende del agua contenida en él
Agua: presenta la mayor inercia térmica
Water content of crop fields with thermal imaging. Blue, green and red
pixels represent plants with sufficient, average and low water
concentration.
Source: Wikimedia Commons and US Agricultural Research Service
Teledetección
Agricultura de precisión
Combine with sensors for recording reflectance. Maps of harvest population and crop yield developed from

Source: Oklahoma State University combine‐mounted population sensor and yield monitor data
collected at 1‐second intervals (Missouri, 1996).
Source: Integrated Crop Management newsletter, Iowa State
University
Teledetección
Teledetección
Teledetección
Pattern of variable requirements for irrigation within one field (green is high,
yellow is average, red is low water content) as seen from the QuckBird satellite.
Source: Satellite Imaging Corporation and DigitalGlobe
Teledetección
Proyecto RHEA: Robot Fleets for Highly Effective Agriculture and
Forestry Management
Fig 2. The quadrocopter UAV, model md4‐1000, taking off in one of the studied fields (a) and the sensors used in this investigation: the
visible‐light camera (b) and the multispectral camera (c).
Torres-Sánchez J, López-Granados F, Serrano N, Arquero O, Peña JM (2015) High-Throughput 3-D Monitoring of Agricultural-Tree Plantations with Unmanned Aerial
Vehicle (UAV) Technology. PLoS ONE 10(6): e0130479. doi:10.1371/journal.pone.0130479
http://journals.plos.org/plosone/article?id=info:doi/10.1371/journal.pone.0130479
Fluorescencia de clorofilas
Autor: Dr. James I.L. Morison
http://redandr.ca/
Autor: M. Ray
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0179794.g002
Firma espectral y espectro de fluorescencia en hojas de vid excitadas con 355nm
www.ppcnz.co.nz
EFECTO KAUSTKY
QUENCHING o APAGAMIENTO
QUENCHING FOTOQUÍMICO
DISIPACIÓN POR CALOR‐QUENCHING NO
FOTOQUÍMICO
+ FR
PARAMETROS FOTOSINTÉTICOS
Rendimiento cuántico del PSII (proporción de la luz absorbida usada para fotoquímica)
PSII = Fq’/Fm’ = (Fm’‐ Ft)/ Fm’
Tasa de transferencia de electrones

The relation between quantum efficiency of PSII (Fq'/Fm') % para cada fotosistema % luz absorbida hoja
and quantum efficiency of CO2 fixation (ΦCO2) in maize
leaves grown in the field.
Fuente: http://www.kp.ethz.ch/ ETR= PSII x PAR x F x A

Fuente: http://www.kp.ethz.ch/ ETR= PSII x PAR x F x A
Intensidad luz (µmoles fotones m‐2 s‐1)

Fuente: http://www.kp.ethz.ch/ ETR= PSII x PAR x F x A (µmoles electrones m‐2 s‐1)
Intensidad luz (µmoles fotones m‐2 s‐1)
qP = (Fm’‐Ft)/(F’m‐F0’) = proporción de centros de reacción del PSII abiertos
FV/Fm = (Fm‐F0)/Fm = eficiencia máxima de los PSII, cuando todos los centros de reacción
están abiertos
NPQ = quenching no fotoquímico = (Fm0 – Fm’) / Fm’

NPQ
Journal of Experimental Botany, Vol. 56, No. 411, © Society for Experimental Biology 2004; all
rights reserved
High Light Low Light

(Left) In limiting light, the thylakoid lumen pH is greater than 6. Violaxanthin (Viola) is bound mainly to LHCII.
(Middle) In excess light, the thylakoid lumen pH drops below 6, driving protonation of carboxylate side chains in VDE and
PsbS. Protonation of VDE activates the enzyme and allows for its association with the membrane, where it converts
multiple Viola molecules to zeaxanthin (Zea). Protonation of glutamate residues E122 and E226 in PsbS activates
symmetrical binding sites for xanthophylls with a de-epoxidized β-ring endgroup (i.e. zeaxanthin).
(Right) Zea binding to protonated sites in PsbS results in the qE state in which singlet chlorophyll de-excitation is
facilitated. Other Zea molecules bind to sites in LHCII and other LHC proteins.
Niyogi K K et al. J. Exp. Bot. 2005;56:375-382
Journal of Experimental Botany, Vol. 56, No. 411, © Society for Experimental Biology 2004; all
rights reserved
APLICACIONES DE LA FLUORESCENCIA DE CLOROFILAS
Poner de manifiesto estados de estrés en las plantas:
Aumento de la radiación UV-capa de ozono
Sequía, estrés hídrico, salinidad
Metales pesados
Enfermedades y depredadores
Estudios ecológicos - productividad de ecosistemas
Valoración de cultivos – mejora genética clásica

METABOLITOS SECUNDARIOS – SALUD HUMANA
Metabolitos secundarios y salud humana
De materia medica
CO2
Fotosíntesis
Metabolismo primario del carbono
Eritrosa-4-P 3-Fosfoglicerato
Fosfoenolpiruvato Piruvato
Ciclo de los
ácidos
tricarboxílicos
Acetil-CoA
Aminoácidos alifáticos
Ruta del ac. siquímico Ruta del Ruta del metileritritol

Ruta del
ac. malónico fosfato
ac. mevalónico
Aminoácidos aromáticos
Compuestos
nitrogenados Terpenoides
Compuestos
fenólicos
Metabolismo secundario del carbono

ALCALOIDES
- Bencilisoquinolínicos
- Tropánicos
- Terpeno-indólicos
- Purínicos
ALCALOIDES BENCILISOQUINOLÍNICOS
Derivados de la tirosina
Papaveraceas Ranunculaceas Berberidaceas Menispermaceas
Papaver somniferum Thalictrum flavum Hydrastis canadiensis Chondronendron tomentosum
Morfina Berberina Tubocurarina

Inflamación Relajante muscular
Dolor menstrual
Contra candida
OPIACEOS-OPIOIDES
Morfina Codeína
Hidrocodona Diacetilmorfina
1883-1910
Opioides endógenos-endorfinas (polipéptidos)
ALCALOIDES TROPÁNICOS
Derivados de la ornitina
Solanaceas
Atropa belladona Datura stramonium Mandragora officinarum Nicotiana tabacum
Atropina Escopolamina Hiosciamina Nicotina

ALCALOIDES TROPÁNICOS
Eritroxilaceas
1886
Erythroxylum coca
Cocaína
ALCALOIDES TERPENO-INDÓLICOS
Derivados de la triptamina
Rubiaceas Apocinaceas
Chinchina pubescens Catharanthus roseus
Quinina Vincristina Vinblastina

ALCALOIDES PURÍNICOS
Cafeína Teofilina Teobromina
Coffea arabica Camellia sinensis Ilex paraguariensis Theobroma cacao

COMPUESTOS FENÓLICOS
COMPUESTOS ESTILBENOS
RESVERATROL
Protector de la
oxidación de las LDL
Anti- hiperoxidativo
Regulador de
triacilglicéridos Quimio-preventivo
Vasodilatador Anti-agregante plaquetario

COMPUESTOS FENÓLICOS-FLAVONOIDES
COMPUESTOS FENÓLICOS-FLAVONOIDES-ISOFLAVONAS
"enfermedad del trébol“ ovejas australianas

COMPUESTOS FENÓLICOS-FLAVONOIDES-ISOFLAVONAS
Efecto antagónico-
Cáncer de mama
Efecto agonista-Síntomas climatéricos-Osteoporosis
La testosterona favorece la aparición del cáncer de

próstata. Las isoflavonas reducen la síntesis de
testosterona
TERPENOS
TERPENOS
TERPENOS
sitostanol
https://www.cochrane.org/
https://www.vademecum.es/
Productos industriales de origen vegetal
- Cosmética
- Celulosas
- Madera
- Alimentaria…
- Gomas y polímeros
- Construcción
- Biocombustibles
Látex
COMPOSICIÓN DEL LÁTEX
Agua 30-40%
Gomas (cis-1,4-poliisopreno) 30-40%
Proteínas 2-3%
Glicósidos de esteroles 0,1-0,5 %
Resinas 3,5-1,5 %
Cenizas 0,5-1,0 %
Azúcares 1,0-2,0 %
Caucho
Hevea brasiliensis
Isómero cis
Caucho
Isómero cis
Vulcanización- Charles Goodyear

GUTAPERCHA
Palaquium gutta
Isómero trans
CHICLE
Manilkara zapota, Achras zapota
Acetato de polivinilo
Goma garrofín E-410 Goma guar E-411
Algarrobo Cyamopsis tetragonoloba
Galactomananos
Goma arábiga (E-414) y Tragacanto

Acacia senegal
Polisacáridos
Goma arábiga y Tragacanto

Polisacáridos
Astragalus tragacantha
PLA (Ácido poliláctico)



Linóleo
Linóleo
Composites
Composites
Biocombustibles
Biomasa
Bioetanol
Biogas
Biodiesel
Biogasolina
Biomasa
Bioetanol
Bioetanol: Alcohol etanol elaborado tras la fermentación de
azúcares por la acción de diferentes microorganismos. Estos
azúcares provienen de la degradación del almidón. Cultivos
adecuados: cereales, caña de azúcar, remolacha…
E5: 5% bioetanol 95% gasolina- Permitido en UE

E10: 10% bioetanol 90% gasolina- Permitido en USA
Biogas
Biogas: mezcla gaseosa producida por la descomposición de
materia orgánica en condiciones anaeróbicas por parte de un
microorganismo. Resultado de la misma se obtiene metano y CO2
Biodiesel
Biodiesel: Combustible elaborado a partir de aceites vegetales o
grasas animales, apto como sustituyente parcial o total del
petróleo en motores diesel, sin que resulten necesarias
modificaciones en el motor
B20: 20% biodiesel 80% diesel

B100: 100% biodiesel
Biodiesel
Biodiesel
Biodiesel
Biodiesel
Biodiesel
Ventajas:
- Materias primas renovables
- No contiene azufre
- Reduce la cantidad de hollín
- Se emite el mismo CO2 que había sido fijado
- No contiene benceno ni otros hidrocarburos aromáticos
- Es fácilmente degradable en caso de fuga
- No es una mercancía peligrosa (punto de inflamación > 110ºC)
- Alto poder lubricante, menor desgaste del motor
Inconvenientes:
- A bajas temperaturas cristaliza, puede provocar obstrucciones.
- Disuelve el caucho
- Alto coste
Fuente: biodieselspain.com
FISIOLOGÍA VEGETAL APLICADA
Tema 5. Introducción a los cultivos celulares vegetales. Metodología general
Tema 6. Cultivos in vitro de tejidos vegetales.
Tema 7. Aplicaciones actuales del cultivo de células y tejidos vegetales
ANGELES BERNAL PITA DA VEIGA

bernal@udc.es
Organización de la docencia
• Docencia expositiva
• Clases los martes a las 9,00h / jueves a las 10,00h
• Clases invertidas
• Cuestionarios de autoevaluación campus virtual
Introducción a los cultivos
vegetales in vitro
Tema 2. La célula vegetal. Características
generales de las células vegetales. Orgánulos
característicos: pared, cloroplastos y vacuola.
Plasmodesmos.
Tejidos
Protoplastos: célula vegetal sin pared

Habilidades de las plantas
• Totipotencia
• Potencial o capacidad inherente a las células de las plantas de desarrollarse como un
individuo completo sí se dan los estímulos adecuados
• Diferenciación
• Formación de células, tejidos y órganos con estructuras y funciones
especializadas y que acompaña al crecimiento
Célula individual
Totipotencia
(zigoto)
Embrión zigótico
Diferenciación
Plántula
Planta
Dediferenciación Callo Suspensión celular Célula individual

(somática)
Rediferenciación Embriones somáticos
Regeneración de raíces y vástagos

Regeneración
Plantas regeneradas
Secuencia de dediferenciación y diferenciación en cultivos de tejidos vegetales

Célula individual
Totipotencia
(zigoto)
Embrión zigótico
Diferenciación
Plántula
Planta

(somática)

Regeneración
Plantas regeneradas

¿Qué es la micropropagación?
• El arte y la ciencia de multiplicar plantas in vitro
• Cultivo de protoplastos, células, tejidos y órganos
• El factor común es su crecimiento libre de microorganismos
en un ambiente aséptico como puede ser un medio nutritivo
esterilizado
Protoplastos células tejidos y órganos

Habilidades de las plantas
• Totipotencia
• Potencial o capacidad inherente a las células de las plantas de desarrollarse como un
individuo completo sí se dan los estímulos adecuados
• Diferenciación
• Formación de células, tejidos y órganos con estructuras y funciones
especializadas y que acompaña al crecimiento
• Dediferenciación
• Capacidad de las células maduras de retornar a la condición meristemática y
desarrollarse desde un nuevo punto, seguido de la rediferenciación que es la
habilidad para reorganizarse en nuevos órganos
Célula individual
Totipotencia
(zigoto)
Embrión zigótico
Diferenciación
Plántula
Planta

(somática)

Regeneración
Plantas regeneradas

Suspensiones
Callos
Totipotencia Célula individual
(zigoto) celulares
Embrión zigótico
Diferenciación
Plántula
Planta

(somática)

Regeneración
Plantas regeneradas
Características del cultivo in vitro
• Microescala
• Optimización de las condiciones ambientales
• No se produce el patrón normal de desarrollo de una
planta
• Hace factible la manipulación de las células individuales
o tejidos. Fundamental para transformación genética
Ventajas del cultivo in vitro de plantas
• Uniformidad y reproducibilidad
• Obtención de un producto “superior”
• Mayor control sanitario
• Aplicable a un amplio espectro de especies
• Mejor planificación durante el año
• Conservar genotipos superiores que determinan características genéticas favorables (resistencia a
plagas y/o enfermedades, crecimiento, producción, calidad de frutos, tolerancia a condiciones
extremas de humedad o sequía, etc). Estas características se pueden “perder” por el cruzamiento
genético en la propagación sexual.
• Obtener plantaciones uniformes o la producción de un determinado número de individuos con
identidad genética
Técnicas de Propagación vegetativas: In vivo e In vitro

Antecedentes históricos de los cultivos “in vitro”
PIONEROS EN ESPAÑA
• Dr. Ernesto Vieitez y la Dra. Adelina
Vázquez
• Tesis Doctoral en 1963
• 3 trabajos en revistas nacionales
• 1º en completar su formación en el
extranjero
• Su 1º trabajo coincide con la
publicación de Murashige and Skoog Facultad de Farmacia 1960
• Revista más importante en España en
ese momento
LOS PREDECESORES – LOS AÑOS 70
• Dos escuelas
• Dr. White en USA 1934 publica cultivo indefinido de
raíz de tomate
• Dr. Gautheret en Francia 1939 publica el cultivo
indefinido de callos de zanahoria
• Ambos utilizan el cultivo in vitro como

HERRAMIENTA
• Metodología para resolver problemas reales
• Herramienta para el estudio de la histodiferenciación
celular
Equipamiento
• Fuentes de contaminación:
• Explanto
• Recipientes
• Medio
• Ambiente
• Instrumentos utilizados
Cabinas estériles o habitaciones para la
transferencia aséptica:
• Ideal una habitación separada aséptica.

• Orden, limpieza y con el material necesario.
• Tipos de recipientes de cultivo:
 Recipientes de plástico o cristal con distintas formas y
tamaños, por ejemplo:
- Placas petri.
- Viales.
- Matraces.
- Contenedores de plástico con tapas.
Cabinas estériles o habitaciones para la
transferencia aséptica:
• Para técnicas de asepsia uso de Cámaras de Flujo

Laminar:
- Algunas con lámparas UV.
• Alternativa: Habitación de inoculación:

- Menos eficiente.
Cabinas de flujo laminar
• Es un recinto que emplea un ventilador para forzar el
paso de aire a través de un filtro y proporcionar aire
limpio a la zona de trabajo libre de partículas de hasta
0.1 micras.
Cabinas de flujo laminar
• Las cabinas de este tipo existen tanto en
configuración vertical como en horizontal, según que
la posición del filtro esté en la parte superior o en la
parte trasera de la zona de trabajo sin embargo el
flujo de aire siempre va hacia el operador por lo cual
estos equipos ofrecen protección únicamente a la
muestra que se maneja en su interior, pero nunca al
operador
Cámara de flujo laminar
• Las cabinas de flujo laminar pueden tener una lámpara de rayos
ultravioleta con acción germicida para esterilizar el recinto y su
contenido, cuando no se utiliza.
• Es importante apagar la lámpara durante la utilización de la cabina, ya
que rápidamente se producirían quemaduras de sol en
la piel expuesta, y también puede causar cataratas oculares
• Autoclavado del medio y de la cristalería:
- Necesario para eliminar las potenciales fuentes
de contaminación.
- Esterilización por vapor en el autoclave.
- Proceso rápido y efectivo.
- No se debe colocar el autoclave en la
habitación de cultivo.
- Existen distintos tipos de autoclave con igual
fundamento de funcionamiento.
• Métodos para conocer el éxito del autoclavado:

- Los más modernos tienen sensores.
- Cintas para el autoclave.
- Tubos de esterilización.
Temperatura y requerimientos lumínicos para el
crecimiento:
• Principal requerimiento para mantenimiento y crecimiento:

temperatura constante ~ 25ºC
• Pequeña escala: incubador microbiológico con luz
• Gran escala: habitación de cultivo con:
- Termostato.
- Estantes.
- Fluorescentes.
• Tiempo luz- oscuridad controlado.
• Cultivos en suspensión: agitadores.
Componentes de los medios de cultivo
AGUA
Nutrientes minerales
Luz
CO 2
Composición del Medio:
• Los grupos de componentes mayoritarios son:

- Macronutrientes (mM)
- Micronutrientes (uM)
- Hierro en forma quelada.
- Vitaminas
Funcionan como coenzimas
- Fuentes de carbono (no realizan fotosíntesis).
- Nitrógeno orgánico.
- Reguladores del crecimiento.
- Agar.
• A veces es necesario añadirles otros componentes
nutritivos.
Auxin is an indispensable hormone
Regulator of cell length,

morphogen, developmental
trigger, transcriptional
regulator.....
© 2013 American Society of Plant Biologists

Auxin action in whole-plant processes
Auxin in Promote lateral organ
Responses to pathogens
initiation at the shoot
action! apical meristem Inhibit
branching in
Light responses the shoot
Cell elongation Integrate growth
signaling pathways
Control patterning
and vascular
development
Maintain stem- Promote
cell fate at the branching
Integrate growth root apical in the root
signaling pathways meristem Response to nutrient
Responses to symbionts – distribution and
nodule formation abundance
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Wolters, H., and Jürgens, G. (2009). Survival of the flexible:
Hormonal growth control and adaptation in plant development. Nat. Rev. Genet. 10: 305–317. Copyright 2009.

Cytokinins contribute to developmental
patterning and meristem functions
CK promotes
cell division and
stem cell fate at
the shoot apical
meristem
CK inhibits root
meristem size
and cell division
and promotes
cell differentiation
at the root apical
meristem
Reprinted by permission from Macmillan Publishers, Ltd: NATURE Wolters, H., and Jürgens, G. (2009). Survival of the flexible:
Hormonal growth control and adaptation in plant development. Nat. Rev. Genet. 10: 305–317. Copyright 2009.
Cytokinin and auxin regulate organogenesis in
tissue culture
+ CK
+ auxin + auxin
and CK
Tobacco leaf discs are placed

into sterile culture dishes on
medium containing various TIME
hormones
Images courtesy of Richard Amasino.

Etapas de la Micropropagación
Meristemos
Entrenudos
ETAPA 0 ETAPA I
ETAPA II ETAPA III ETAPA IV
Selección y Introducción de Proliferación Enraizamiento Aclimatación
preparación de material
la Planta Madre
MICROPROPAGACIÓN
Etapa 0: Planta Madre

Etapa I: Establecimiento de un cultivo
aséptico
 Etapa II: Proliferación.
 Etapa III: Enraizamiento
 Etapa IV: Aclimatación

MICROPROPAGACIÓN
Un poco de
Etapa 0: Planta Madre desinfección y
tendré muchos
He sido elegida descendientes
porque
soy la más hermosa y
 Éxito etapa I
la más fuerte
 Estado Fisiológico
 Estado Sanitario
 Crecimiento activo
 Crecimiento vigoroso
MICROPROPAGACIÓN
• Etapa 0: Planta Madre

• Etapa I: Establecimiento de un cultivo aséptico

MICROPROPAGACIÓN
Etapa I: Establecimiento de un cultivo aséptico
*Desinfección del material

 Contaminación bacteriana, fúngica, vírica
 Contaminación externa ó interna
 Desinfectantes // Antibióticos
(Hipoclorito Sódico)
*Componentes de los medios de cultivo
MICROPROPAGACIÓN
*Componentes de los medios de cultivo
 Componentes inorgánicos: Macro (NPSCaKMg) y
 Microelementos (FeCoCuBMnMoZn)(I/Cl)
 Componentes orgánicos
-Carbohidratos (sacarosa 2-3% fuente C y osmótico, 5% (cítricos) o %
menores que favorecen la aclimatación, mioinositol>nºbrotes/explanto)
-Vitaminas (Tiamina(B1),Acido Nicotínico, Piridoxina(B6)

-Agar 5-8 g/L: disponibilidad agua y nutrientes
sin agar: medios líquidos, hiperhidratación
-Reguladores del crecimiento

MICROPROPAGACIÓN
Etapa I: Establecimiento de un cultivo aséptico
*Introducción del material en el medio de cultivo
Segmentos nodales/yemas apicales de material en

crecimiento activo
 Meristemos de segmentos nodales de material en

reposo vegetativo
Etapa I: Establecimiento
MATERIAL EN CRECIMIENTO ACTIVO
MATERIAL EN REPOSO VEGETATIVO

MICROPROPAGACIÓN

MICROPROPAGACIÓN
Etapa II: Proliferación
*Condiciones de cultivo
 pH (5.6-5.8), 5.2-5.3
 Iluminación (40-60 µmol/sm2)
 Fotoperiodo (16 h)
 Temperatura (20-27 ºC)
 Subcultivos (3 semanas)
MICROPROPAGACIÓN
Etapa II: Proliferación

*Problemas en la iniciación y el mantenimiento
de los cultivos
 Producción de compuestos fenólicos:
 Clorosis - Fe
-Fe-EDDHA
 Necrosis Apical
 Hiperhidratación
MICROPROPAGACIÓN
 Etapa III: Enraizamiento in vitro

MICROPROPAGACIÓN
 Etapa III: Enraizamiento in vitro
*Problemas durante el enraizamiento
 Necrosis Apical:
Por ausencia de Citoquininas durante el enraizamiento,
Por ausencia de Ca2+añadir nitrato cálcico o gluconato
en melocotonero y almendro
 Formación callo base brote y raíces
anormales por exceso de auxinas.
MICROPROPAGACIÓN


Tema 6.
Cultivos in vitro de callos

y suspensiones.
1.2 Cultivo in vitro
Uso de medio de cultivo + Condiciones de asepsia controlada
Cultivo in vitro vs cultivo tradicional

 Independencia geográfica, estacional y ambiental
 Producción ininterrumpida
 Ni pesticidas ni herbicidas
 Ciclos de crecimiento más cortos
× Alto coste
Suspensiones
Callos
celulares
INICIACIÓN DEL CULTIVO
DE CALLOS.
Procedimiento:
• 1.- Elegir el explanto.

• 2.- Elegir el método de esterilización de superficie.
• 3.- Elegir la composición del medio.
Fuentes de explanto para los cultivos:
• Cualquier parte de la planta:

- Órganos.
- Tejidos específicos.
• Características:
- Con células vivas activamente en división.
- Jóvenes.
- Saludables.
- Libre de signos de decaimiento
- Libre de enfermedades y plagas.
- Que no entren en periodo de latencia
Métodos de Esterilización para Eliminar los
contaminantes de superficie:
• Objetivo:
- Eliminar la flora microbiológica de superficie.
- No destruir muchas células del explanto.
• SEMILLAS:
- Sencillas de esterilizar.
- Depende del tipo de semilla:
- La exposición y concentración pueden variar
en función de las especies y genotipos.
SEMILLAS
Sumergir en etanol al 70% 2 min

Sumergir en Hipoclorito Na 20% 20 min
INTERIOR CABINA DE FLUJO

LAMINAR
Lavados sucesivos en agua.
Dejar secar en asepsia.
Transferir a los medios
Inicio de una línea celular
Semillas Etanol Lejía Lavado

de 70% 20% Agua estéril
pimiento
• TEJIDOS VEGETATIVOS:
- Generalmente hojas y tallos.
- Problema por contaminantes endógenos.
- Procedimiento:
-Lavar para eliminar la tierra.
-Lavar con etanol al 70-100%.
-Superficie se esteriliza con lejía al 5-20%
-Lavar con agua.
Obtención de vitro plant
Iniciación de callos desde los explantos:
• Quitar las plántulas de los contenedores y llevar

a una placa estéril.
• Cortar las partes en tamaños uniformes y colocar
en recipientes con medio.
• Sellarlos e incubar a 25ºC, en luz- oscuridad
dependiendo del genotipo.
• Si no se inician dentro de 3-8 semanas hay que
reexaminar el método de esterilización y la
composición del medio.
Obtención de callos y repicado
Formación de
plantas in vitro
10-15 días
 Esterilización
 Medio de cultivo
CRECIMIENTO DE CALLOS Y
CULTIVO DE SUSPENSIONES
CELULARES
• MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE
LOS CALLOS:
- Cálculo del peso fresco y peso seco (se
envuelve el callo en papel de aluminio y se
mantiene en la estufa a 80ºC durante 2
días)
- Curva de crecimiento: fase lag inicial –
crecimiento exponencial – disminución del
crecimiento – fase estacionaria –
senescencia.
• CONTAMINACIÓN DE LOS CULTIVOS:
- Bacterias: aparecen en 1 semana. Anillo
blanquecino cerca del callo.
- Hongos: hifas a las 2 semanas de repicar.
- Levaduras: detección al microscopio.
- Consecuencias:
- disminución del crecimiento del callo
- pardeamiento
- Soluciones:
- eliminación de la placa contaminada
- tratamiento con antibióticos
Inoculación in vitro
27 de julio 2020
11 agosto 2020
Inicio de callo
7 septiembre 2020
1 repicado
Semana
16 nov
Obtención de suspensiones celulares
INICIO DE SUSPENSIONES CELULARES:
• Suspensiones:
- Pueden crecer en masa.
- Tasa de crecimiento muy rápida.
- Todas las células uniformemente expuestas
al medio.
• Usos:
-Protoplastos para fusión o manipulación
genética.
-Embriogénesis a mayor escala.
-Producción comercial de metabolitos
secundarios.
• Cultivo: medio agitado a 100 r.p.m. y 25ºC.

• La curva de crecimiento es similar a los
callos: fase lag inicial – fase exponencial –
fase estacionaria.
• El ciclo de crecimiento se completa más
rápido, se debe repicar a las 1 – 3
semanas.
• Se puede alterar la curva de crecimiento
alterando las condiciones del cultivo.
• Existe fuente de variación que proporciona
las bases de la selección celular in vitro.
• Si existen problemas al iniciar la
suspensión:
• 1. Seleccionar células que crecerán
en el medio líquido. Se cogen porciones
friables y no pardeadas, en un volumen
de 10 ml. Según crezcan las células se
añade un pequeño volumen de nuevo
medio.
• 2. Modificar el medio cambiando las
concentraciones de auxinas y
citoquininas basándose en un cuadro
latino. Al principio se elimina el medio
viejo y se cultivan en medio nuevo. Luego
se procede como en el caso anterior.
Obtención y caracterización de suspensiones
celulares
12
pH / con (mS. cm-1)

40 Parámetros de crecimiento
9 de suspensiones celulares
PCV (%)
30
de G. biloba
6
20
3
10
0 7 14 21 28
Días
PCV
pH
conductividad
Obtención y caracterización de suspensiones
celulares
50 12
pH / con (mS. cm-1)

Parámetros de crecimiento
40 9
de suspensiones celulares
PCV (%)
de B. pendula
30 6
20 3
0 3 6 9 12 15 18 21
PCV Días
pH
conductividad
• MEDIDA DEL CRECIMIENTO DE
SUSPENSIONES CELULARES:
Filtración al vacío de la suspensión

- Peso fresco: se raspan las células y se pesan
en papel de aluminio
- Peso seco: se mantienen 2 días en estufa a
80ºC.
- Volumen de empaquetamiento celular (PCV).
El volumen se suspensión se centrifuga (100
rpm, 10 min) y se expresa como % de
volumen. Crecimiento vigoroso: 40 – 50 %
PCV.
- Contaje del número de células. Problema:
dificultad en separar los agregados.
• CONTAMINACIÓN EN LOS CULTIVOS
CELULARES:
- Bacterias: se detecta por un color azulado del
medio; el menisco es azul.
- Hongos: aparecen como pelotas de micelio.
- Levaduras: suspensiones color crema.
- Descartar las suspensiones contaminadas.
Aplicaciones de los
cultivos celulares
vegetales.
Aplicaciones
 Producción de metabolitos secundarios
 Conservación de germoplasma
 Obtención de plantas libres de virus
 Producción de haploides
 Multiplicación de especies leñosas
 Obtención de plantas transgénicas
Producción de metabolitos secundarios por
los cultivos celulares:
 Incluyen: alcaloides, terpenoides, esteroides,
antocianinas, antraquinonas, y simple o
polifenoles.
 Históricamente:
- Considerados no esenciales.
- Sintetizados por ramificaciones de las rutas
metabólicas primarias.
- Sin función clara.
- Limitados en su distribución tanto en la
planta como en las distintas especies.
- Confieren ventaja selectiva a la planta.
Triosas Fosfato
Cultivo de células vegetales en
Biorreactores
 Los cultivos de células vegetales en biorreactores ofrecen un gran
potencial para la producción de metabolitos secundarios, con
importantes aplicaciones en la industria química, farmacéutica o
alimenticia.
 Los biorreactores para el cultivo de células vegetales pueden
clasificarse en tres grandes grupos dependiendo del tipo de cultivo:
células en suspensión,
células inmovilizadas
reactores de biopelícula
Técnicas de Propagación vegetativas: In vivo e

In vitro
Estrategias para incrementar la productividad en
sistemas de cultivo in vitro
Nutrientes
Condiciones de cultivo
pH
•Optimización del medio de cultivo y parámetros físico-químicos Tª,luz,HR,
aireación y
agitación
•Adición de precursores o intermediarios biosintéticos
•Adición de elicitores
•Extracción continua del producto (biorreactores)
Selección líneas celulares productivas y adaptadas a cultivo en biorreactores:

Elevado nivel de producción/biomasa/día
Elicitación
“Inducción o aumento de la biosíntesis de metabolitos
debido a la adición de pequeñas cantidades de
elicitores”
Elicitor: factores o moléculas de diverso origen que

introducidas en pequeñas concentraciones en un
sistema celular vivo, son capaces de perturbar el
metabolismo, incrementando la producción de un
metabolito en particular
USO COMBINADO DE CICLODEXTRINAS Y JASMONATO DE
METILO PARA INCREMENTAR LA PRODUCCIÓN DE ALCALOIDES
INDÓLICOS: P2008-02437
METHYLJASMO
NATE
β-
CD
INDOLALCALOIDES
Secondary Extracellular
metabolites proteins
production analysis
Fucosterol Peroxidases
Taraxasterol PRs
Β-sitosterol Endochitinases
Xyloglucan-specific fungal
endoglucanase inhibitor protein
WO2010/049563
Resveratrol
callo Biorreactores Piloto

20-50L y producción
>500L
Biorreactor 2L
Suspensión
celular
Producción de metabolitos secundarios por
los cultivos celulares:
 Importancia biotécnológica:
- Químicos.
Aplicación como químicos: drogas,
sabores, perfumes, pigmentos y agroquímicos.
- Toxicidad.
- Agentes protectores.
 Problemas: acumulación en bajos niveles.
 Factores importantes:
- Heterogeneicidad e inestabilidad de
expresión génica.
- Producción de metabolitos inversamente
proporcional a la tasa de células en división.
Aplicaciones de los metabolitos secundarios
PRODUCTO USO PLANTA REFERENCIA
Acido Ind. química Coleus blumei Rosevear, (1984)
rosmarínico
Ajmalicina Antihipertensivo Catharanthus roseus Asada and Shuler, (1989)
Sikonina Antibacterino Lithospermum erythrorhizon Tabata and Fujita, (1985)
Berberina Analgésico intestinal Coptis japonica Matsubara et al., (1989)
Piretrina Insecticida Chrysanthemum cinerariasfolium Uchio et al., (1981)
Codeína Sedante P. somniferum Furuya et al., (1972)
Escopolamina Antihipertensivo Datura stramonium Evans and Partridge, (1953)
Mentol Aromatizante Mentha spp. Leung and Foster, (1996)
Digitoxina Estimulante cardíaco Digitalis lanata and purpurea Alfermann et al., (1980)
Vainilla Aditivo alimenticio Vanilla planifolia Dornenburg and Knorr, (1996)
Diosgenina Precursor esteroidal Dioscorea deltoidea Sahai and Knuth, (1985)
Sanguinarina Antiplaquetario Sanguinaria canadensis

Papaver somniferum
Duke, (1985)
Morfina Sedante Spirulina platensis Ramachandra Rao and Ravinshakar, (1999)
Taxol Anticancerígeno Taxus baccata Cusidó et al., (1999)
Capsicina Insecticida y Capsicum frutescens

Capsicum annuum
Lindsey and Yeoman, (1984)
Johnson et al., (1990)
saborizante
Aplicaciones
Técnicas de propagación vegetativa in vitro
 Conservación de germoplasma in vitro

 La conservación de germoplasma mediante el cultivo de
tejidos se basa en la limitación del crecimiento del material
vegetal.
OBJETIVO:
Conservar, con la mayor integridad posible, la variabilidad
genética de las poblaciones seleccionadas
Técnicas de propagación vegetativa in vitro
 i) El almacenamiento a baja temperatura sin congelación (1-

9°C), en nevera, lo cual ralentiza su crecimiento al tiempo que
no compromete su viabilidad.
 ii) La criopreservación para mantener a largo plazo
suspensiones celulares, ápices caulinares, embriones
asexuales e incluso plántulas jóvenes. Para ello hay que tratar
primero el explante con un agente crioprotector, y después
congelarlas y almacenarlas a la temperatura del nitrógeno
líquido (-196°C).
 iii) El mantenimiento de explantes en cultivo in vitro a los que
se les puede añadir compuestos que retrasan el crecimiento,
como por ejemplo la hidracida maleica, el B995 o el ácido
abscísico
Aplicaciones
Eliminación de virus y patógenos:
 Sencillo eliminar la mayoría de patógenos menos
los virus.
 Los virus son patógenos intracelulares por lo que su
erradicación se dificulta, existiendo diferentes
metodologías para combatirlos:
 Termoterapia, quimioterapia y electroterapia (seguido o no de cultivo
de meristemos)
 Microinjerto
 Cultivo celular
 Cultivo de meristemos
 Los virus pueden propagarse desde las plantas,

clones y semillas.
 La distribución es irregular pocos en los
meristemos.
Cultivo celular
 Callos y protoplastos.
 Tras una serie de subcultivos, los

callos pueden quedar libres de
patógenos (las células
meristemáticas son más resistentes
y tienen una tasa de división muy
alta).
 Limitaciones a gran escala

(individuos clónicos, grandes
alteraciones,etc.).
Papel de los mCeurlisttiv
eo
modseem
n elrcisutletim
vooisn vitro
 Razones por las que los meristemos

suelen tener pocos o ningún virus:
- sistema vascular poco diferenciado
- elevada actividad metabólica
- elevadas concentraciones de auxinas

Aplicaciones
 Producción de haploides (ver vídeo)
Producción de haploides por cultivo de
anteras y ovarios:
 Usados para la producción de plantas.
- Producción rápida de líneas
homozigóticas que duplican los cromosomas.
- Detección y selección de mutantes
recesivos.
 Ocurre naturalmente en algunas especies.
 Regeneración de plantas desde anteras,
granos de polen inmaduro y óvulos.
 Mejor el uso de microesporas que de óvulos.
Aplicaciones
Recombinant DNA (or
GM) allows a single
gene to be introduced
into a genome. This
method can be faster
than conventional
breeding
Elite tomato Disease resistant

plant (need not be
same species)
Elite, disease resistant tomato

Transgénicos en el mundo:
Agrobacterium tumefaciens
• Bacteria Gram - presentes en el suelo.
• Infecta a dicotiledóneas y gimnospermas (y alguna
monocotiledónea).
• Se une al tallo o a la raíz y da lugar a la formación de
tumores (agallas de la corona).
1947: Cultivo de tumores in vitro carente de

hormonas.
La bacteria introducía el principio tumorígeno.
1965: 1ª Visión de la síntesis de intermediarios
metabólicos por las células tumorígenas. Se
denominaron opinas.
1974: Se observa la transferencia de plásmidos por
conjugación.
Cepas virulentas  No virulentas
Crown gall disease and the tumor-inducing
principle
The first written record of
crown gall disease, on
grape, dates from 1853
Fridiano Cavara
(1897) found that a
bacterium causes
crown gall in grape
Crown gall induces growths at

wound sites and severely limits
crop yields and growth vigor
Edward L. Barnard, Florida Department of Agriculture and Consumer Services, Bugwood.org; Mike Ellis, Ohio State University; University
of Georgia Plant Pathology Archive, University of Georgia, Bugwood.org; Wikimedia commons
“A 1907:
plantCrown
tumorgallof
is bacterial
caused by a
origin” bacterium
1907 - Erwin Smith and C.O.
Townsend isolated a bacterium
from galls on daisy. When
inoculated onto other plants,
galls were produced
gall
gall
Smith, E.F. and Townsend, C.O. (1907). A plant-tumor of bacterial origin. Science. 25: 671-673.
Agrobacterium-induced galls do not
require bacterial persistence
Gall tissues without any bacteria

can persist indefinitely in culture,
in contrast with most other
pathogen-induced neoplastic
growths that require the presence
of the pathogen
Braun made fundamental

discoveries about how
Agrobacterium
transforms plant cells Armin C. Braun
1911 - 1986
White, P.R. and Braun, A.C. (1941). Crown gall production by bacteria-free tumor tissues. Science. 94: 239-241; Photo from Wood, H.N., and Kelman, A. (1987) Phytopathology 77: 991.
Gall tissues can grow indefinitely
without exogenous phytohormones
Auxin
CK
1930s – 1950s,
numerous studies High levels of auxin
and cytokinin are found
in gall tissues
“It is possible for a cell to

acquire the capacity for
Normal plant Normal plant tissue autonomous growth as a result
Crown gall tissue of the permanent activation of
tissue cannot live grows and survives
grows well growth-substance-synthesizing
indefinitely in when auxin and
without added systems”
hormone-free cytokinin (CK) are
hormones
medium added to medium
-AC Braun, 1958
Braun, A.C. (1958) A physiological basis for autonomous growth of the crown-gall tumor cell. Proc Natl Acad Sci U S A. 44: 344–349.
Unusual compounds called opines are
found in many crown galls
The type of opine is determined by the bacterium, not the plant!
Questions raised:
• What are these compounds?
• Do they cause the tumors?
• How and why do the
Octopine-
Octopine bacteria cause the plants to
utilizing
strain make opines?
Nopaline- Nopaline
utilizing
strain 1960s – 1970s,
numerous studies
A few days after inoculation, tumors
become independent of bacteria
When the tissue was
incubated at room
temperature for one
day before heat-
killing the bacteria, no
tumors were formed
Periwinkle (Catharanthus roseus)
stems were inoculated with
When the tissue was
Agrobacterium tumefaciens, and
incubated at room
then incubated at room
temperature for four
temperature for various times,
days before heat-killing
followed by 5 days at 47°C to
the bacteria, many
kill the bacteria
tumors were formed
Viable bacteria are no longer necessary beyond two days post-inoculation. After this period,
tumors become independent of the bacteria, because the bacteria have altered the host
cells, by transferring some factors into them.
Braun, A.C. (1943) Studies on tumor inception in the crown-gall disease. Am. J. Bot. 30: 674-677
Braun called this factor the
tumor inducing principle
time
“The active principle …is responsible for the
conversion of normal cells to neoplastic cells”
“It may be
(1) a metabolic product of the crown-gall bacterium;
(2) a normal host constituent that is converted by the bacteria into a tumor-inducing
substance;
(3) a chemical fraction of the bacterial cell that is capable of initiating, as in the case of the
transforming substance (DNA) of the pneumococci, a specific alteration in the host cell;
or
(4) a virus or other agent which is present in association with the crown-gall organism”
Braun, A.C. (1947). Thermal studies on the factors responsible for tumor initiation in crown gall. Am. J. Bot. 34: 234-240.
Braun’s work shortly followed that of
Avery, MacLeod and McCarty
Avery, MacLeod and McCarty
showed in 1944 that non-
pathogenic bacteria were
transformed by the DNA from
heat-killed pathogenic bacteria.
The parallels to the
transformation of plant cells by
Agrobacterium were clear, but
it took many more years to
show conclusively that a similar
mechanism is involved.
Drawing courtesy of Madeline Price Ball: Avery, O., MacLeod, C., and McCarty, M. (1944), Studies on the chemical nature of the substance inducing transformation of pneumococcal types. J. Exp. Med. 79: 137-158.
Virulence can be transferred from one
Agrobacterium to another
Virulence can be transferred by transfer of isolated DNA or bacterial conjugation
A
+ B
DNA
Virulent
B
Agrobacterium Virulence transferred
A by naked DNA (Klein tumor
tumor and Klein, 1953)
A Virulence transferred
Avirulent + time in planta, later
Agrobacterium shown to be due to
B
conjugation of Ti
B plasmid (Kerr, 1969)
No
tumor Co-inoculation
of virulent and A B
avirulent strains
Klein, D.T. and Klein, R.M. (1953). Transmittance of tumor-inducing ability to avirulent crown-gall and related bacteria. J. Bacteriol. 66: 220-228.;
Kerr, A. (1969). transfer of virulence between isolates of Agrobacterium. Nature. 223: 1175-1176.
A large plasmid in gall-inducing
Agrobacterium transfers virulence
Virulent A very large
plasmid was Heat treatment tumor
identified that is removes plasmid heat
present in virulent and makes bacteria
Avirulent
but absent from non-pathogenic
avirulent strains No
tumor
A plasmid Virulent
carrying a genetic + time
tumor
marker (antibiotic
resistance) was Avirulent
shown to be
transferred along tumor
with virulence
Zaenen, I., van Larebeke, N., Teuchy, H., van Montagu, M. and Schell, J. (1974). Supercoiled circular DNA in crown-gall inducing Agrobacterium strains. Journal of Molecular Biology. 86: 109-127. Larebeke, N.V., Engler, G.,
Holsters, M., Den Elsacker, S.V., Zaenen, I., Schilperoort, R.A. and Schell, J. (1974). Large plasmid in Agrobacterium tumefaciens essential for crown gall-inducing ability. Nature. 252: 169-170. Van Larebeke, N., Genetello, C.H.,
Schell, J., Schilperoort, R.A., Hermans, A.K., Hernalsteens, J.P. and Van Montagu, M. (1975). Acquisition of tumour-inducing ability by non-oncogenic agrobacteria as a result of plasmid transfer. Nature. 255: 742-743.
Some DNA from the Ti plasmid is
transferred into the plant cells (1977)
Renaturation kinetics of
Restriction labeled plasmid DNA
enzyme fragments with various
Ti plasmid digestion
unlabeled DNA samples
The key finding
was that Ti Neg. control
(untransformed
plasmid DNA plant DNA)
anneals with DNA from
DNA isolated crown gall
from the crown
gall, meaning Pos. controls
(Ti plasmid)
that the gall
contains Ti DNA
“Our results suggest that the tumor- Increasing amounts of
inducing principle first proposed by Braun labeled Ti plasmid DNA
(1947) is indeed DNA, as many
investigators have long suspected.”
Reprinted from Chilton, M.-D., Drummond, M.H., Merlo, D.J., Sciaky, D., Montoya, A.L., Gordon, M.P. and Nester, E.W. (1977). Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: the molecular basis of crown gall tumorigenesis.
Cell. 11: 263-271. with permission from Elsevier. See also Yadav, N.S., Postle, K., Saiki, R.K., Thomashow, M.F. and Chilton, M.D. (1980). T-DNA of a crown gall teratoma is covalently joined to host plant DNA. Nature. 287: 458-461.
Structure and function analysis of the Ti
plasmid
Transfer DNA (T-DNA) moves
T-DNA into the plant cell nucleus. It is
flanked by two direct 25-bp
repeat border sequences,
shown as yellow triangles
pTi
The virulence (vir)
genes are required
for T-DNA
movement into the
plant cell (more on The organization of Ti plasmids
them later) varies between isolates, but all
carry one or more T-DNA region
and one vir region
The T-DNA region: tumor-inducing
genes and opine synthesis genes
Plant cell
Opine synthesis
T4SS to “feed”
T-DNA Agrobacterium
pTi Auxin
synthesis Cytokinin
synthesis
Autonomous
growth
T4SS = Type IV Secretion System

Oncogenes: síntesis de
hormonas que afectan al
Bordes flanqueantes: necesarias crecimiento tumoral de
para la transferencia del material células de la planta, y su Genes op: síntesis opinas.
genético y su inserción en el regulación. Actúan como fuente de carbono
genoma vegetal. y nitrógeno para el crecimiento
Región T- de la propia bacteria.
DNA
Uso: el DNA entre ambos bordes
se transfiere por completo Auxinas
Citoquininas Opinas
generalmente. Uso: cuando se lleva a cabo
Borde Borde
derecho la modificación genética la
izquierdo
propia bacteria crea su
propio medio para poder
Genes vir: implicados en el crecer.
reconocimiento y unión a la célula Plásmido Ti
vegetal. Son activados gracias a
Catabolismo Catabolismo de
unas sustancias que producen las opinas
células vegetales dañadas. opinas: genes que
Genes vir codifican enzimas para
Uso: formación del pili sexual ori el catabolismo de las
que favorece la transformacióonr.i: punto inicial para la replicación del opinas que se
DNA del plásmido, habilitándolo para sintetizan y que le
ser duplicado independientemente del sirven de alimento a la
bacteria.
DNA cromosomal.
Opine from the plant is a nutrient
source for the bacteria
Plant cell
Opine Opine synthesis
catabolism to “feed”
T-DNA
Agrobacterium
ATP
Opine
permease
Opine
synthases
bacterium
Opines induce expression of genes

required for opine uptake and
catabolism
The 1980’s model
T4SS
A bit of Ti plasmid DNA moves from

Agrobacterium to the plant, which transforms
it and induces proliferative growth.
Outstanding questions:
• How does it work?
• Can it be harnessed to
introduce genes into plants?
The development of Agrobacterium as
a vector for plant transformation
• Modifications to the Ti
plasmid
• Regeneration of
transgenic plants from
transformed cells
Untransformed, primary transformant, and progeny
Reprinted from Barton, K.A., Binns, A.N., Matzke, A.J.M. and Chilton, M.-D. (1983). Regeneration of intact tobacco plants containing full
length copies of genetically engineered T-DNA, and transmission of T-DNA to R1 progeny. Cell. 32: 1033-1043, with permission from Elsevier.
The Ti plasmid can be used to introduce
any gene into plants
The discovery that T-DNA was inserted into
the plant genome raised the possibility that
T-DNA “any gene” could be transferred into plants
Gene of Selectable
pTi interest marker
Tumor-inducing and opine

synthesis genes on T-DNA can
be replaced by a “gene of
interest” and selectable marker
Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoort, R.A. (1983). A binary plant vector strategy based
on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature. 303: 179-180.
Development of binary vectors that
separate T-DNA and vir genes
T-DNA and the vir genes can be located on separate
plasmids or replicons, making cloning easier Agrobacterium
tumefaciens
T-DNA
Because the Ti The smaller Helper
plasmid is so plasmid is
plasmid
large, a binary introduced into
Binary system was Agrobacterium
vector developed to allow carrying a helper
gene cloning into a plasmid with the
smaller plasmid vir genes
Manipulated in E. coli
Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoort, R.A. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature. 303: 179-180.
Transformación genética
Las enzimas de restricción
cortan el gen deseado
El DNA vector se toma de la

El DNA con el gen de interés se bacteria y se corta con la misma
retira de la célula enzima de restricción
Se inserta el gen dentro del

DNA vector mediante ligasas
(plásmido recombinante)
1
* La bacteria se reproduce, generando
muchas bacterias con la nueva
característica
Vector intermediario
Plásmido con muchos
hospedadores
1
* Secuencia Gen
Promotor
Gen de
Terminador
Gen
reguladora marcador interés informador
Célula con vector
intermediario
Inserción e integración Plásmido de expulsión
Plásmido Ti silvestre Plásmido Ti MG
2
*
A. tumefaciens Doble entrecruzamiento
Planta de tabaco
*
transgénica
Plántula
Solución A. tumefaciens MG
Cultivo de células
Callo Explanto
2 Célula transformada Célula planta tabaco Planta de tabaco
3
*Borde izquierdo Oncogenes Gen de opinas Borde derecho
* Borde Secuencia Gen Gen de Gen Borde
Promotor Terminador
izquierdo reguladora marcador interés informador derecho
Regeneration of transgenic plants from
transformed cells
Methods Regenerating plants
had been expressing resistance to the
developed antibiotic kanamycin plated on Negative
earlier to selective medium control
regenerate
whole
plants from
single cells
Reprinted from Vasil, V. and Hildebrandt, A.C. (1965). Differentiation of tobacco plants from single, isolated cells in microcultures. Science. 150: 889-892 and Horsch, R.B., Fry, J.E., Hoffmann, N.L., Eichholtz, D., Rogers, S.G., and Fraley, R.T.
(1985). A simple and general method for transferring genes into plants. Science. 227: 1229-1231. Reprinted with permission from AAAS. See also Sussex, I.M. (2008). The scientific roots of modern plant biotechnology. Plant Cell. 20: 1189-1198.
Applications of Agrobacterium-
mediated transformation
Basic research – plant transformation
allows in vivo study of plant genes
Expression pattern of an
Lobed-leaf phenotype of
auxin-inducible promoter
plants overexpressing
fused to GUS reporter gene
KNAT1 gene
Wild type Overexpression
Population
segregating for short-
hypocotyl phenotype
conferred by PHYB
overexpression
Wagner, D., Tepperman, J.M. and Quail, P.H. (1991). Overexpression of phytochrome B induces a short hypocotyl phenotype in transgenic Arabidopsis. Plant Cell. 3: 1275-1288; Chuck, G., Lincoln, C.
and Hake, S. (1996). KNAT1 induces lobed leaves with ectopic meristems when overexpressed in Arabidopsis. Plant Cell. 8: 1277-1289. Casimiro, I., Marchant, A., Bhalerao, R.P., Beeckman, T., Dhooge,
S., Swarup, R., Graham, N., Inzé, D., Sandberg, G., Casero, P.J. and Bennett, M. (2001). Auxin transport promotes Arabidopsis lateral Root Initiation. Plant Cell. 13: 843-852.
Agrobacterium enables novel or
modified genes to be introduced
Transgenic plant Golden rice is a
expressing nutritionally
Bacillus
thuringiensis insecticidal Bt gene enhanced plant
expressing Bt
toxin
Plant cell
expressing Bt
toxin
Wild-type Peanut plant

peanut plant expressing the
Bt gene
Photo credits: Herb Pilcher, Goldenrice.org
Transgenic crops continue to be
developed and adopted
Cotton - Bt cotton (2011: 62
million acres worldwide; 69%
of total cotton area)
Rice - Resistant to pest,
drought and salinity
Maize - Resistant to
herbicide and pests
Pulses - Pest tolerant
chickpea, pigeon pea
Peanut - Resistant to peanut
clump virus
Potato - High protein content
Tomato - Fungal resistance;
prolonged shelf-life fruit
Sugarcane - Resistant to the
fungal disease red rot
Source: Clive James, ISAAA

Principales especies y modificaciones llevadas a cabo:
OMG Finalidad de la modificación OMG Finalidad de la modificación
Resistencia a virus e insectos Melón Resistencia a factores adversos de

Patata
Mayor valor nutritivo suelo y clima
Resistencia a infecciones
Resistencia a pesticidas microbianas
Maíz Mayor valor nutritivo
Resistencia a herbicidas Papaya Resistencia a factores adversos de
suelo y clima
Pepino Mejora de la calidad de los frutos
Resistencia a virus y herbicidas
Calabaza Resistencia a virus
Cítricos Resistencia a infecciones
Colza Mejora de la calidad del aceite microbianas y a herbicidas
Resistencia pesticidas y herbicidas
Soja Resistencia a pesticidas
Cacao Resistencia a hongos
Caña azúcar Resistencia a pesticidas
Mejora de la calidad de los frutos
Fresa Retraso maduración
Resistencia a factores adversos de Piña
suelo y clima Clavel
Tomate Resistencia a infecciones microbianas Pimiento
plátano
Resistencia a insectos y herbicidas
Arroz, algodón, Resistencia a herbicidas
Retardo de maduración lino, tabaco
Vehículo para suministrar vacunas

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Tasa de transferencia de electrones

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Tasa de transferencia de electrones

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Atropa belladona Datura stramonium Mandragora officinarum Nicotiana tabacum

Atropina Escopolamina Hiosciamina Nicotina

Chinchina pubescens Catharanthus roseus

Quinina Vincristina Vinblastina

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