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1
INTRODUCCIÓN
SOLUCIONES
UNIDADES DE CONCENTRACIÓN
2
+ -
NaCl ⇒ Na + Cl
+ -
Por cada mol de NaCl sólido se formó 1 mol de Na y 1 mol de Cl .
Luego:
+
Concentración de Na = 1 mol
-
Concentración de Cl = 1 mol
Para ácidos y bases n = número de protones que puede ceder (el ácido) o captar
(la base) por molécula.
5. Porcentaje peso / peso ( % p/p): peso en gramos de soluto por 100 gramos de
solución. La concentración de la mayoría de los ácidos comerciales viene dada
en % p/p. Aquí la proporción de soluto puede ser mayor que la proporción de
solvente.
Ejemplo: H2 SO4 al 96%. Para transformar % p/p a concentración molar
o normal es necesario conocer la densidad de la solución.
Ejemplo: Calcular la molaridad de HCl comercial de 28 % densidad 1.15 (kg. /
L).
1. Calculamos cuanto pesa un litro de la solución:
1 L x 1.15 ( kg. / L) =1.15 kg. = 1.150 g.
2. Ahora calculamos el peso de HCl ( HCl puro ) contenido en este litro: 100 g
de solución contienen 28 g., 1.150 g. de solución contienen:
1.150 g. x 0.28 = 322 g.
Para preparar una solución de un soluto dado se puede usar el soluto puro
(generalmente sólido) o una solución concentrada de él en el mismo
solvente (solución stock). Este último caso constituye una dilución.
Para diluciones rige la relación:
V1 x C1 = V2 x C2 (balance de masa
Nuestro sentido común nos dice que la respuesta será 0.2 M, ya que la solución se
diluyó 10 veces. El cálculo según la relación dad sería:
C2 = V1 x C1 / V2 = 10 ml x 2M / 100
ml
10 ml x 2M = 100 ml x XM donde X = 0.2 M
II pH Y TAMPONES
ÁCIDOS Y BASES
HA + H2O ⇔ H3O + A-
Ejemplos de bases según Bronsted: los compuestos orgánicos básicos que deben
su basicidad al grupo funcional amino.
Ácidos fuertes: HCl, HNO3, HClO4, H2SO4 (ambos protones), H3PO4 (solamente el
primer protón que se disocia).
a. ÁCIDOS DÉBILES
Consideramos a modo de ejemplo el ácido acético, HOAC.
Este ácido débil posee un solo protón ácido. En solución acuosa coexisten
en equilibrio moléculas de la especie protonada con moléculas del anión
-
acetato (Oac ) y protones.
La relación entre la concentración de las especies nombradas a una temperatura
determinada está dada por la constante de equilibrio de la reacción de disociación,
llamada constante de acidez, Ka:
- +
HOAc ⇔ OAc + H (3) Ka
- +
= [ OAc ] [ H ] / [HOAc ] (4)
-5
Ka del ácido acético a 25° C: 1.78 x 10
pKa = - log Ka
Ka de HOAc (25° C) = 4.75
El valor numérico de Ka indica que HOAc estará poco disociado, por lo tanto es
lícito efectuar la siguiente aproximación:
[HOAc ] = 0.1
b. BASES DEBILES
Para Una base débil B se puede definir también una constante. En este caso, la
llamada constante de basicidad Kb
+ +
Kb = [ BH ] / [ B ] [H ] (5)
-
pH = pKa + log [ A ] / [ HA ] (6)
SOLUCIONES TAMPÓN
Cuando se titula una solución de HOAc con una solución de una base
fuerte (NaOH), midiendo el pH después de cada adición se obtiene el siguiente
gráfico, llamado curva de titulación :
14
zona
tamponante
7
0
punto de equivalencia ml NaOH
Para:
-
pH = pKa ocurre que HOAC = OAc (verifique esta aseveración)
Al titular una solución básica que contiene el anión acetato con un ácido fuerte se
observa el mismo fenómeno. Estaríamos recorriendo nuestra curva de derecha a
izquierda.
Glicina 2.45
SELECCIÓN DE UN TAMPÓN
-
pH = pKa + log [ OAc ] / [ HOAc ]
FOTOMETRIA : ABSORCIOMETRIA
La luz del espectro visible y del UV cercano (200 a 400 nm) posee la
energía necesaria para producir transiciones de electrones desde un orbital
molecular de menor energía a otro de mayor energía de ciertos
compuestos, llamados cromóforos. Las sustancias coloreadas absorben luz
visible, su color corresponde a la radiación no absorbida: la luz solar es blanca, ya
que contiene radiación de todo el espectro visible, además de otras radiaciones.
b
I0.: intensidad de haz incidente
I : intensidad de haz transmitido
b: camino óptico
- εbc
I = I0 x 10 (1)
Log I0 / I = ε bc
A = Log I0 / I (2)
Luego:
A = ε bc (3)
Ley de Lambert - Beer
A T -(cb
pendiente = 1 T = 10
C
C
Figura N ° 1
10
-1 –1
λ máx. ε ( M cm )
266 31.800
373 10.400
445 12.500
La riboflavina tiene color amarillo, debido a que su única banda en la región del
visible a 445 nm, corresponde a absorción de luz azul.
INSTRUMENTOS DE MEDICIÓN
− Fuente de luz
− Filtros o monocromador, que permite seleccionar la longitud de onda.
− Portador de muestra
− Detector
− Dispositivo que permite la lectura de la medida directamente o inscriptor
No existe una fuente de luz que proporcione radiación de todo el rango espectral
UV / visible de suficiente intensidad, por consiguiente, se usan fuentes diferentes:
FILTROS
No proporcionan luz realmente monocromatica, sino que permiten el paso de un
cierto rango de longitudes de onda alrededor de la longitud de onda
máxima transmitancia del filtro.
MONOCROMADORES
Poseen un elemento dispensor, que puede ser un prisma o una red de distracción.
El elemento dispensor separa los haces de luz de diferente longitud de onda. Un
sistema de espejo permite dirigir el haz de luz de la longitud de onda
deseada hacia la ranura de salida.
Al cerrar más la ranura aumentará la monocromaticidad de la luz, pero
siempre pasara un cierto rango de longitud de onda.
En la práctica se considera que un espectrofotómetro opera con luz prácticamente
monocromática. La calidad de un espectrofotómetro depende en parte importante
de esta característica.
PORTADOR DE MUESTRA
Allí se ubica la o las cubetas con las soluciones de muestra de referencia.
Las cubetas son de vidrio o plástico (para el visible) o cuarzo (para el UV).
DETECTOR
Los detectores son del tipo fotoeléctrico: al incidir luz producen corriente eléctrica,
de intensidad proporcional a la intensidad de la luz. Se distinguen celdas de capa
barrera (solamente para fotómetros de filtro). Fototubos y
tubos fotomultiplicadores.
LECTURA O REGISTRO
La mayor parte de los instrumentos indican o registran el valor de la absorbancia.
Si el instrumento informa la transmitancia se calcula A usando la ecuación (5). La
absorbancia se mide en 3 cifras después de la coma. El rango de A medible es de
0.000 hasta 1.500 o hasta 2.000 o 3.000 (dependiendo del instrumento).
APLICACIÓN DE LA ABSORCIOMETRÍA EN EL ANÁLISIS CUANTITATIVO
C (problema) = A (problema)
C (estándar) A (estándar)
A=kxC
BIBLIOGRAFÍA
INTRODUCCIÓN
Se han descrito un gran número de métodos para la cuantificación de proteínas.
Todos representan ventajas y desventajas, la selección de uno en particular va a
depender de la proteína que deseamos cuantificar, la sensibilidad deseada,
posibles interferencias y la sencillez del método.
En general, los métodos están basados en reacciones químicas, absorción
ultravioleta, reacciones de fluorescencia y determinación del nitrógeno.
METODO TURBIDIMÉTRICO
Las proteínas precipitan cuando se mezclan con soluciones diluidas de ácido
tricloroacético, sulfosalicílico o ferricianuro de potasio en ácido acético. Este
método tiene desventajas ya que no todas las proteínas precipitan en la
misma cantidad e interfieren otras sustancias precipitables por ácidos
nucleicos. La ventaja que presenta en uso es la rapidez de la
determinación. El rango útil de trabajo es entre 0.1 y 0.3 mg de proteínas
agregadas.
MÉTODOS COLORIMÉTRICOS
El método colorimétrico más difundido es el método de Löwry, en que el color final
de la reacción, es el resultado de la reacción de Biuret de la proteína con el ión
cobre en medio alcalino y la reducción del reactivo fosfomolíbdico – fosfotúngstico
por la serina y triptófano presentes en las proteínas.
Los métodos de Biuret y Bradford se discutirán más adelante en esta guía y son
los que se realizarán en el presente trabajo práctico.
MATERIALES
Reactivo Biuret: colocar 1.5 g, de CuSO 4 x H2O y 6 g. de tartrato de sodio
y potasio (NAKC4H4O6 x 4 H2O). Agregue alrededor de 500 ml de agua destilada y
agitar hasta dilución. Agregue lentamente y agitando constantemente, 300 ml
NaOH 2.5 N. Las dos soluciones deben estar a temperatura ambiente. Agregar 1.0
gr., de yoduro de potasio y agitar hasta que este totalmente disuelto. Llevar a un
volumen final de 1000 ml y guardar en un frasco de polietileno. Este reactivo es
estable indefinidamente.
Spectronic 20 (540 nm)
Muestra de albúmina: solución patrón de albúmina 10 mg / ml.
MATERIALES
Reactivo de Bradford: disolver 100 mg. de azul de Coomasie G –250 (sigma) en
50 ml de etanol 95 % (siempre queda un ligero residuo insoluble). Agregue
lentamente 100 ml de ácido fosfórico 85 % p /v y luego complete a 100 ml con
agua destilada. Dejar el reactivo en reposo todo un día y luego filtrar. El reactivo
debe filtrarse toda vez que presente residuo o que el blanco de reactivo
leído contra agua presente una absorbancia mayor a 0.5.
CURVA DE CALIBRACIÓN
1. Disponga de 7 tubos y coloque en cada uno volúmenes adecuados que
contengan 5; 10; 15; 20; 25; 30 µg de albúmina, el séptimo tubo úselo como
blanco y agregue 0.8 ml de agua destilada.
2. Complete todos los tubos a 0.8 ml con agua destilada.
3. Agregue 0.2 ml del reactivo de Bradford
4. Espere 10 min. y mida A 595 nm.
BIBLIOGRAFÍA
− Skoog & West. Análisis Instrumental
− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company 2° Edición Pág. 75 – 77.
− Bradford, M (1976) Analytical Biochemistry 72, Pág. 248 – 254.
II.- DETERMINACIÓN DE ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LA
FOSFATASA ÁCIDA DE GERMEN DE TRIGO
INTRODUCCIÓN
Reacción Enzimática
Una enzima es una proteína que cataliza una reacción química específica,
es decir, aumenta su velocidad de reacción. La figura 1 muestra la variación
de la
concentración de producto de una reacción enzimática en el tiempo (cinética), así
como también la desaparición de sustrato.
La pendiente de esta curva corresponde a la velocidad de la reacción . Se aprecia
que durante cierto tiempo (inicio) la velocidad se mantiene constante (la curva es
una recta) y posteriormente decae.
O
⎢⎢ ⎢⎢ Ez
-
R ⎯ O ⎯ P ⎯ O + H 2O → ROH + Pi
⏐
O
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Materiales
− Amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA 0.15 M pH 5.0
− Sustrato p–nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM
− Solución de p–nitrofenol 60 µM en NaOH 0.02 M
− Solución de 0.02 M NaOH
− Solución stock de enzima 5 mg / ml en BSA 0.1 % diluída 1:20
− Baño termoregulado a 37° C
EXPERIENCIA A
Curva de calibración para la formación de p–nitrofenol
Prepare 6 tubos que contengan 0; 1.00; 2.00; 3.00; 4.00; 5.00 ml de una solución
de p–nitrofenol 60 µM y enrase cada uno de los tubos con NaOH 0.02 M a 6.00 ml,
de volumen final. Mezcle bien, transfiera a la cubeta y lea absorbancia a 405 nm.
Como tubo blanco utilice el tubo que no contiene p–nitrofenol y calibre el equipo.
Grafique A405 versus los µmoles de p–nitrofenol en cada uno de los tubos.
Use esta curva estándar para analizar sus datos cinéticos.
EXPERIENCIA B
Determinación de la actividad de la fosfatasa ácida de Germen de trigo
Ya que el ensayo de la fosfatasa se realiza a tiempo fijo, es necesario determinar
la dilución correcta de enzima a usar ó el tiempo de ensayo con una
misma
dilución de enzima.
Prepare un tubo que contenga 2.0 ml de amortiguador citrato de sodio 0.1
M; EDTA 0.15 M, pH 5.0 y 2.0 ml de sustrato NPP 2.5 mM. A continuación,
preincube el tubo en un baño termoregulado a 37°C por un par de minutos y luego
agregue
1.0 ml de la dilución de la enzima (1:20). Mezcle e inmediatamente saque
una alícuota de 0.5 ml adiciónelo a un tubo que contenga 5.5 ml de una solución
de
NaOH 0.1 M. Este es un control denominado tiempo cero de la reacción, que le
permite calibrar el equipo de manera que solo mide la absorbancia del producto
liberado enzimaticamente. En paralelo prepare otros tubos que contengan la
misma mezcla de reacción que el tiempo cero, agregue 1.0 ml de enzima e incube
respectivamente 15 y 30 min., luego saque una alícuota de 0.5 ml de cada uno de
los tubos y adiciónela a los tubos que contengan 5.5 ml de NaOH 0.1 M.
Finalmente determine la absorbancia (405nm) de cada uno de los tubos utilizando
como blanco el tiempo cero. Recuerde que el ensayo se realiza en un
volumen
final de 5 ml y que cada una alícuota de 0.5 ml de cada uno de los ensayos es
diluída a 6 ml para medir absorbancia.
Velocidad (µmoles /
N° tubo A405 µ moles Pi
min.)
1 0.0 0.0 0.0
2
3
4
BIBLIOGRAFÍA
− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2° Edición Pág. 77 – 85; 105 – 108.
− Lehninger, A y col. Principios de Bioquímica.
− Stryer, A. Bioquímica.
III.- PROPIEDADES CINÉTICAS DE LA FOSFATASA ÁCIDA DEL GERMEN DE
TRIGO
EXPERIENCIA C: Determinación de la constante de Michaelis-Menten para
p - nitrofenilfosfato y Vmax
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
BIBLIOGRAFIA
MATERIALES
-Amortiguador citrato de sodio 0.1 M, EDTA 0.15 M, pH 5.0
-sustrato p – nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2.5 mM
-solución de 0.1 M NaOH
27
-solución stock de enzima 5 mg/ml en BSA 0.1% diluida 1:20
-baño termoregulado a 37ºc
27
IV.- CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IONICO
Materiales
− Columna de vidrio de 10 ml
− DEAE – celulosa (Dietilaminoetil celulosa)
− Muestra albúmina 20 mg / ml.
− Tampón fosfato de sodio 20 mM pH 7.0
− Soluciones NaCl 0.05 M; 0.1 M; 0.2 M; 0.5 M en tampón fosfato de sodio 20mM
pH 7.0
MONTAJE DE LA COLUMNA
Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una
bagueta. Mediante una pinza cierre la salida de la columna y llene ésta con
tampón fosfato 20 mM pH 7.0. Soltando la pinza, deje escurrir el tampón hasta la
mitad de la columna.
SEMBRADO DE LA MUESTRA
Una vez equilibrada la columna, deje escurrir el tampón, cuando esté a punto de
empezar a secarse la superficie del lecho de la columna, agregue 1 ml de
muestra. Una vez que la muestra ha entrado al lecho de la columna, agregue un
poco de tampón lavando las paredes y espere a que penetre. Luego lave
la columna con 12 –15 ml de tampón recolectando fracciones de aproximadamente
3 ml.
28
ELUCIÓN DE LA MUESTRA
Con el fin de eludir la muestra, agregue sucesivamente de 15 ml de las soluciones
NaCl en concentraciones crecientes. Colecte el eluído de la columna
en fracciones de 3 ml cada una.
CUESTIONARIO
1. Qué puede Ud. concluir del experimento realizado?
2. Qué resultado esperaría, si la columna se equilibrara con tampón fosfato
20 mM pH 7.0 u NaCl 500 mM ? (la muestra aplicada está disuelta en el mismo
tampón).
3. Qué resultado esperaría Ud. si la columna se equilibrara con tampón pH 5.0?
[pI (pto isoeléctrico) de albúmina es 5].
4. Si se realiza el mismo experimento utilizando leche como muestra, Qué
resultados esperaría? (Podría identificar las fracciones que contienen lacto
albúmina). Discuta.
5. Se tiene una solución que contiene una enzima más lacto albúmina. Si a Ud. le
interesa sólo la enzima y debe remover la lacto albúmina, como realizaría el
experimento si no posee columna?
BIBLIOGRAFÍA
− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2° Edición Pág. 16 – 20.
− Lehninger, A (1982). Biochemistry. 2° edición. Editores Word. Capitulo 6. Pág.
127 – 129.
− Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edición. Editores Freeman &
Company.
V.- CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
Es una técnica útil para separar compuestos de diferente peso molecular. La base
de la separación del método es la propiedad del gel (Sephadex) de
fraccionar solutos de acuerdo a su tamaño molecular.
Cuando se coloca una solución acuosa con macromoléculas que difieren en
tamaño y se pasa a través de una columna empacada con gel de dextrano
(Sephadex) las moléculas más grandes son incapaces de penetrar los poros del
gel (se excluyen) y se mueven más rápido a través de la columna (tienen menos
trayecto que recorrer) que las pequeñas. Estas últimas, difunden a través de los
poros según su tamaño. Las diferentes moléculas eluyen de la columna en
una secuencia decreciente en tamaño molecular.
MATERIALES
− Columna de vidrio 1.3 x 15 cm.
− Sephadex G – 75
− Muestra: azul dextrano 0.5% PM (x), y dicromato de potasio (K 2Cr2O7) al 0.5%.
MONTAJE DE LA COLUMNA
Ponga una mota de lana de vidrio en el fondo de la columna con la ayuda de una
bagueta. Mediante una pinza, cierre la salida de la columna y llénela con
agua destilada. Soltando la pinza deje escurrir el agua hasta la mitad de la
columna. Este procedimiento evita que queden burbujas a la salida de la
columna. Si hubiera quedado alguna burbuja de aire, repita el procedimiento de
nuevo.
SEMBRADO DE LA MUESTRA
Una vez equilibrada la columna, con ayuda de la pipeta pasteur retire el agua de
ella. Cuando está a punto de empezar a secarse la superficie del gel, agregue 0.2
ml de una muestra con una pipeta Pasteur. Una vez que la muestra ha entrado al
gel, agregue un poco de tampón lavando las paredes y espere que penetre. Luego
agregue más tampón.
ELUCIÓN DE LA MUESTRA
Eluya la muestra haciendo pasar tampón por la columna igual que cuando
la equilibró. Colecte fracciones de aproximadamente 1 ml.
30
CUESTIONARIO
1. Qué puede concluir de las distintas fracciones que ha colectado?
2. de acuerdo al resultado que Ud. Obtuvo ¿Qué podría decir, en
forma comparativa, del peso molecular de los compuestos?
3. Diseñe un método experimental que le permita cuantificar la muestra eluída.
BIBLIOGRAFÍA
− Clark, J y Switzer, R. (1977): Experimental Biochemistry. Ed. Freeman &
Company, NY. 2° Edición Pág. 20 – 27.
− Lehninger, A (1982). Principles Biochemistry. Capitulo 6. Pág. 127 – 129.
31
VI.-ELECTROFORESIS
Las proteínas son polielectrolitos y por lo tanto, son susceptibles de ser analizadas
electroforeticamente. Normalmente, las cadenas laterales de ciertos aminoácidos
son los sitios ionizables en la proteínas (arginina, pKa = 12; lisina; pKa = 9, 7 – 10,
7; cisteína, pKa = 8, 5 – 9, 5; tirosina, pKa = 8, 5 – 10, 0; histidina, pKa = 6, 0 – 7 ,
0; ácido aspartico y glutámico, pKa = 3, 9 – 5, 0) contribuyen a la carga neta de las
+
proteínas, como también algunos grupos prostéticos (ejemplo: NAD ). Otras
moléculas, además de proteínas, pueden ser separadas por
electroforesis después de formar complejos con los iones inorgánicos u otros
grupos cargados.
A bajo pH, las proteínas tienden a llevar más cadenas laterales positivas
que negativas, por lo tanto la carga neta será positiva y la migración en
una electroforesis será hacia el cátodo (electrodo negativo). A pH alto, las
cadena laterales negativas predominan y la proteína migra hacia el ánodo
(electrodo positivo). De lo anterior, se deduce que para cada proteína existirá un
pH en el cual el número de cargas positiva y negativas sea igual. Si la
electroforesis es realiza a este pH, no habrá migración, debido a que la
proteína no tiene carga neta. Valores de pH del solvente por encima del pI (punto
isoeléctrico) hacen que la carga neta de la proteína esa más negativa y su
movilidad electroforética hacia el cátodo aumenta. En cambio, valores de pH más
bajos que el pI hacen que la proteína sea más positiva, por ende, la movilidad
electroforética aumenta hacia el ánodo. Debido a que el pH influencia
marcadamente la movilidad electroforética, es importante mantener el pH
constante durante la electroforesis. Esto se lleva a cabo incluyendo tampones en
las soluciones electrolíticas.
La electroforesis en geles de poliacrilamida es quizás el sistema
electroforético mas útil y versátil en el análisis y separación de proteínas,
moléculas pequeñas de RNA y fragmentos de DNA.
Los principales usos de la electroforesis discontinua son por una parte, determinar
pureza de una proteína y en segundo termino para analizar los componentes de
una mezcla compleja. La pureza, es por supuesto, un termino relativo, ya que se
puede obtener una sola banda en el gel, debido a que las impurezas están
a concentraciones muy bajas para ser detectadas.
BIBLIOGRAFÍA
− Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry . 2a. Edición. Editores Freeman &
Company.
− Chrambach, A. & Robbard, D. (1971) Science, 172, 440.
− Laemmli, UK (1970) Nature (London) 277, 680 – 685.
− Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology Vol. I, T.S. Work
+ E: Work Editors A:H: Gordon, Pág. 1 –145 (parte I).
ELECTROFORESIS DISCONTINUA DE PROTEÍNAS SERICAS EN GELES DE
POLIACRILAMIDA EN CONDICIONES DESNATURANTES
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
A.- SOLUCIONES
A. Acrilamida – bisacrilamida: 45% - 1.2% ( 46.2 %T – 2.6 %C).
Precaución: la acrilamida es neurotóxica. EVITE EL CONTACTO
DIRECTO. Agregar a la solución una punta de espátula de carbón
activado agitar durante 2 horas, filtrar por papel whatman. Guardar a 4°C.
B. Tampón gel separador
1.5 M Tris – HCl pH 8.8, 0.4 % SDS (guardar a 4°C).
C. Tampón gel espaciador
0.5 M Tris – HCl pH 6.8, 0.4 % SDS (guardar a 4°C).0.5 M
D. Persulfato de amonio 1%
Preparar solución fresca; duración una semana (guardar a 4°C)
E. Temed ( N; N; N’; N’ – tetrametiletilendiamina)
F. Tampón de corrida 4X
0.1 M Tris, 0.768 M glicina, 0.4 % SDS. Diluir con agua antes de usar, no
es necesario ajustar pH. (guardar a 4°C).
G. SDS 20% P /V (guardar a temperatura ambiente)
H. Azul de Bromofenol:
0.2 % azul de Bromofenol en 0.1 M Tris – HCl pH 6.8
I. Tampón de muestra (5X)
0.125 M Tris – HCl pH 6.8, 5 % SDS, 25% glicerol, 0.05% azul de
Bromofenol (guardar a -20°C).
J. Fijador: 30% etanol, 10% ácido acético
K. Solución de teñido
0.3% azul de Coomasie R – 250 en 50% metanol y 10% ácido acético. Se
disuelve el azul de Coomasie en metanol (agitar 8 horas), se filtra,
se
agrega ácido acético y el agua.
L. Solución de desteñido: 7% ácido acético – 30% metanol
N. Gel espaciador
Acril – Bis 45 – 1.2&
Tris – HCl 0.5 M pH 6.8, 0.8 % SDS
Persulfato 1%
Agua
TEMED
PROCEDIMIENTO