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  • Microbiologi769a Industrial Prescott 7 Ed

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    ‘otros problemas, especialmente cuando el suelo adecuado no esté pre~ sente y el flujo de salida del tanque séptico de un sistema convencional mido : inversa cortado DNA velco Protenas vias con el gen VPY Piésmido ‘Virus de ta Fiebre Afiosa recombinante Figura 41.10 Produccién de vacunas recombinantes. Los genes que codiican productos deseados se pueden expresaren diferentes ‘organismos. Mediante las técricas de DNA recombinante, se produce la vacuna de la fiebre aftosa con la clonacion de los genes dela vacuna en Ecol 41.4 CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS EN AMBIENTES CONTROLADOS Para muchos procesos industrales, los microorganismos deben crecer ‘en medios espectficamente disefiados y bajo condiciones controladas cstrictamente, incluyendo temperatura, aireacién, y aporte de nutrien- tes. Los temas de esta seccién son el desarrollo de medios de cultivo apropiados y el crecimiento de los microorganismos en condiciones industries, DNA fordneo @ e.0 eo eo Protein VPt de bacteras recombinantes para l uso en la produccon de vacunas ‘Antes de proseguir, es necesario claifcar la terminologia El fermentacién, empleado en su sentido fisiolégico en las secciones riores del libro, se emplea de una forma mucho mis general ea reac la microbiologfa industrial y la biotecnologia. Como se indica en la 41.11, el término puede tener varios significados. Para los microbi industrials, fermentacin significa ef cultivo de microorganismos ‘masa (0 incluso de células vegetales 0 animales). La fermentacin i tral requiere el desarrollo de un medio de cutive adecuado y la rencia de ls teenologias de pequefia escala a una escala mucho | Escaneado con CamScanner noi jah ga albimina recombinante proton beterSlO8S yee sumenta? rit See Ty ee eee er Crecimiento de microorganismos en ambientes controlados 1065, Microorganismo reser Streptomy — ee olor conn etiolr Modena sie ee ects pene enn seen ea snc DNA ino Saccharomyces cerevisiae Aspergillus nidulans Corynebacterium usin a una proteina de elevada produccién Utlizacién del promotor hibrido fuerte inducible UASy/CYCI Sobreprodccin de Ia gliceraldehtdo-3-fsfato deshidrogenas Aslamiento de ls genes biosintéticos que conducen a actividades ‘nzimétcas sumechladas ola eliminacin de la regulaci6n por retroalimentacin Camp On Ni 38 Mea eg ——— « ves jot at: +e © HOw Ho» 4 a 3 ad Homd™ > Hom ts oT Be By Hon d= HO Ho 10 °. Ho. Ho ° Ho. Ke 4 Ho Médulo 2 Médulo 4 Médulo 6 ° Méot Modules woatos "=e __ j ® " 04 104 Msdutos Medio i mediog ——ME#OS sagas _ encima bloqueeda ° 4 Méduto 4 Moduo® Médulo 1 Mocha 2 Médulo 3 Médulo 5 ee aa x Enzima wloaveada " 8 séticos modificados. (a) Modelo para ses ciclos de elongacién (médulos) en la Fawra 1.11. Ingenieria metab’ ss normal de 6-deoxiertonilida B (OE! bl enima enol reductasa del ml lo Sesté bloqueada, Estas estructuras cambiadas (2s les mejoradas. a para crear antibi 8), un precutsor di lo 4 esta Bloque! Jel importante antibi sda. () Cambios en ‘reas resal iético eritromicina, (b) Cambios en la estructura que ocurren la estructura que ocurren cuando la enzima ceto reductasa del ticos modificados con Itadas) pueden conducira la sintesis de anti Escaneado con CamScanner 1066 Capitulo41 Microbiologia aplicada e industrial ‘Mecanismos de ingenieria genética Cambios mediados en el DNA ‘Mutagénesis SOS localizada ‘Sustituciones de bases, cambios de pauta Cambio de pauta adaptado Cambio de pauta ~1 ; , Escsion precisa de TaS, Ta9, TA10 Recombinacin refproa de as epticiones de 89 pb lanqueantes recupea la Secuencia original Formacién de deleciones,inversiones fusiones, Generalmente recombinacin reproca de repeticiones de secuencia corta; 1 duplicaciones in vivo ‘casionalmente no homéloga ‘Recombinacién por a topoisomerasa de tipo __Deleciones yfusiones por recombinacién no homéloga, a veces en repeticiones cortas Recombinacién espectfica de sitio Inseriones,esisionesdelciones, inversiones mediante reaciones coordinadaso sucesivas Gopoisomerasas de tipo 1) de roturaigaciGn en las repeticiones de secuencia corta;tolera emparejamientos incorrectos lementos transponibles (muchas especies) Inserciones, transposiciones,fusiones de replicones, deleciones/escisiones adyacentes, inversiones sdyacentes por la ligacin de los extremos 3/OH del transposcn de los grupos 5’PO, de Jos cortes cohesivos en os sitios diana no homélogos CCaptacign de DNA (competencia de ‘Captain de una cadena simple independiente de secuencia, ode un DNA de cadena ‘tansformacién) ble que lleva una secuencia identifcadora de especie ‘Aan 1 Shi 19 Nae ci epee mon abc elo Ea hal Ey of iain Da Rabe, ie, 9-8, Wingo DG! Amc ay estoy. Diode Ha? yp Some Método Comentarios Métodos empleados para conservar cultivos de interés para la microbiologia industrial y la biotecnolos ‘Transferencia periédica Las variables de la transferencia periédica a nuevos medios inelyen la frecuencia transferencia, el medio uilizado, y el mantenimiento de Ia temperatura; esto puede conduct aun ‘ncremento en las tasas de mutacin y la produccién de variantes ‘Tubo inclinado cubierto con aceite mineral Un cuttivo stock se hace erecer en un tubo inclinado y se eubre con aceite mineral esti el tubo ‘nclinado se puede almacenar a temperatura refrigerada Medio miimo, agua desilada,o agar-agua Los cultvos lavas se almacenan en refrigeraciGn; estos cutivos pueden ser viables durante 3 45 meses o més 'No es fiable; puede originar un dafo en las estructuras microbianas; para algunos : ‘microorganisms, sin embargo, puede ser un método til para el mantenimiento del cutivo ‘Los cultivos se deshidratan en un suelo estéril, en discos de papel de filtro estériles, o en ‘otas de gelatina; e pueden almacenar en un desecador en refrigeraciGn, o congelarse para q ‘mejorar Ia viabilidad El agua se climina por sublimacién, en presencia de un agente crioprotector; el ciere hemético en un al puede proporcionar una vablidad a largo plazo, se ha demostrado que basta durante 30 alos _ Se usa ntrégeno liquid a ~196 “C los culives de microorganisms dificiles de erect se han -conservado durante més de 15 afios t Congelacién en medio de crecimiento Deshidratacién Deshiratacin por congelacin(liofilizaciGn) Ultracongetacion Cualquier proceso que implique el cutivo masivo de microorganismos, sean aerobios como anaerobios| Cualquier proceso biol6gico que ocurra en aus Descomposicin de los alimentos La prodiuccién de bebidas aloo {Lautlizacin de un sustrato orgénico como donador y aceptor de electrones Tceazaién de un ssa rgnico como donador de elecuones,y también del mismo sutatoorpicopacilmente degradado como aceptor - Crecimiento dependiente de la fosforilacign a nivel de sustrato Fo Sy ie Escaneado con CamScanner jrollo de medios de cultivo jgemplendo par cl crecimiento de un in miro am organismo es extico Semaine on einen eco Pan mini nce ne om is bajo coste Como fuentes de eartong nates metas 8 . arbono, sft a1). Los hidrolizados vegetales no pus nitrégeno, y f6sforo ye fuentes compleas de cabono,nitogens oe eee , nitrigeno, y factors de ere. cosy mae ae int ees eect tiles incluyen las melazas Sy el suero de AE Nest sin | fabricacién det Cie een oe ture eae aereriet ers tes Materias primas Melazas fuente aibono y enersit Suero Granos Residvos agricolas (mazorca de mafz) Licor de mafz macerado Hlarina de soja Deshechos de matadero “Amonio y sales de amonio Nitratos Sustancias solubles de destiladores Preparaciones no purificadas de productos vegetales y animales Compuestos quimicos inorgénicos crudos ‘Yeso 0 carbonatos no purificados Fosfatos para fertilizacién ‘Alcoholes de alta graduacién Siliconas ‘steres naturales Manteca de cerdo y aceites vegetales igen imines erro, sales taza ‘mpones Ageates antiespumantes crecimiento de microorganitmos en ambientes controlados 1067 Los niveles y equilibrio de minerales (especialmente det hierro) ¥ Jos factores de crecimiento pueden ser eriicos en Ia formutacién de un medio, Por ejemplo, la biotina y fa tiamina,influenciando las reaccio~ nes biosintéticas, controlan la acumulacién del producto en muchas fermentaciones. El medio también se podrfa disefiar de forma que et ‘carbono, el nitrégeno, el f6sforo, el hier, o un factor de crecimiento topeelico sean limitants despues de un tiempo determinado durante Ta fermentacién, En estos casos fa TimitaciGn a menudo provoca un cambio que hace pasar de crecimiento a Ia produccidn de los metaho- litos deseados. Crecimiento de microorganismos en un marco industrial Unaverseha desarrollo e! medio, debe define el ambiente Fico pra ae ent mierobiano Gp en el sistema decotivo en masa Esto Saeco implica et eontrol preciso de a agit, temperatura. PH. adperacn Los tampnes de fxfatose pueden sar pra cota pH sets de propociona una fuente de Fsforo, Las liitaiones de ox eno pueden er rca para Tos process de crecimiento arbio ye spocntracion de Oz lata de lujodeben sr sufcientemente levadas como para que hayaexceso de On cl interior de as lua flames especialmente cierto cuando ests creciendo un cltivo mieo> Fa een, Cunndo se cultivan hongos filamentosesyactinomicetos dnjeacion puede ser ain més limitada dbido al crecimiento flamen- (aap Figura 4-12). Este crecimiento ilamentoso da bazar aun medio veewto'y plstco conacido como cal de cutive no Newtontana, ue ofree una ain mayor resistencia aT aireai6n. Er cxencial asegurarse que estos Factores fisicos no estn imitando el crsimiento microbiano, Esto ain més ertico durante el inere- sraato de escla (scaleup), donde un procedimiento favorable desarro- Malo en un pequetio matraz se modifica para usarlo en un gran ‘eneatador El mieroambiente del cutivo pequefio debe mantenerse 8 pesar del incremental yolumen el cultivo Sisebace una anscin een éxito a partir de un proceso disehiadooriginariamente en un matraz Erlenmeyer de 250 mL aun actor de 100000 itros etonces cl proceso ‘de incremento de escala se ha llevado a cabo con éxito. To microorganismas se pueden hacer crecer en tubos de cutivo, malraces en agitaci6n, y fermentadores con agitacion w otros sistemas ecultivo masivo. Los fermentadores con agitacion pueden tener un tematio que varia entre 3 64itrs a 100.000 litres o mis, depenendo Ue los requerimientos de produccién, En la Figura 41.136 se iustra la tipea unidad de fermentaci6n con agitacin industrial, No slo debe Figura 41.12. Crecimiento filamentoso durante la fermentacién. Los hongos filamentosos y los ‘actinomicetos pueden cambiar su forma de crecimiento durante el curso de una fermentacién. El desarrollo de ‘crecimiento sedimentado (pelleted) por los hongos tiene tfectos en la transferencia de oxigeno y en la energia rnecesatla para agitar el cultivo. (a) Cultivo inicial. (b) Después de 18 horas de crecimiento. Escaneado con CamScanner 1068 Capitulo41 Microbiologia aplicada e industrial Figura 41.13 Fermentadores agitados industriales. (a) Grandes fermentadores empleados en las empresas farmacéuticas para la produccion microbiana de antibisticos. (b)Detalle de una unidad de fermentador. Esta unidad puede funcionat en condiciones éxicas 0 an6xicas, y las adiciones de rutrientes,el muestreo,y el control dela fermentacién se pueden llevar a cabo en condiciones asépticas. Los biosensores y el control por infrarrojos puede proporcionarinformacién a tiempo real del ‘curso dela fermentacidn, Se pueden detectarsustratos especicos, intermediarios metabslicos, y productos finales esterilizarse el medio sino que la aireacién, el ajuste del pH, el mues- treo, ¥el proceso de monitorizacién deben Ilevarse a cabo bajo condi- cciones rigurosamente controladas. Cuando sea necesario, deben afadirse agentes de control de la formacién de espuma, especialmente en los medios ricos en proteinas. Se utilizan ordenadores para monito- rizar las slidas a partir de sondas que determinan labiomasa microbiana, los niveles de productos metabélicos exticos, el pH, la composicién el gas de entrada y de salida, y otros pardmetros. Las condiciones ambientales se pueden cambiar © mantener constantes en el tiempo, , —— eee to conce ce Scene — ‘tind ease meg Erie a vin a ee as woos ae de control refrigeracién niece biosensor Entrada coague retagerante Envada ere vata <— Unea de Frode are | recogida - © agitadores que pueden contaminarse con hongos filamentosos. Tambi std disponible la fermentaciGn en estado solido (Figura 41.146), en la {que un sustrato partculado se mantiene hiémedo para mantener una fina capa de agua superficial donde los microorganisms pueden erecer y el oxigen esté disponible. En varios tipos de reactores de lecho fijo (Fi= gura 4. 14c) y eactores de lech fluido (Figura 41.144), los microorga- nismos se asocian con superfciesinertes formando biofilms y e! medio fluye através de las particulasfijadas o en suspensién. ‘También se pueden emplear las unidades de cutivo en dislsis (Fi- gura 41.14e), Estas unidades permiten la difusiGn de los metabolitos residuales téxicas o los productos finales fuera de! cultivo microbiano ¥y permiten que los nuevos sustratos se difundan a través de la mem- brana hacia el cultivo, Las téenicas de cultivo continuo usando qui- rmiostatos (Figura 41.14f) pueden mejorar considerablemente la produccién celular y los rendimientos de utlizacién de sustratos por- {que los microorganisms se pueden mantener en una fase logaritmica continua Sin embargo, el mantenimiento continuo de un organism en su fase activa de crecimiento puede ser indeseable para muchos proce- sos industriles, Los productos microbianos a menudo se clasifican como metaboli- tos primarios o secundarios, Como se muestra en la Figura 41.18, os ‘metabolites primarios consisten en compuestos relacionados con Ia Escaneado con CamScanner y 14, métodos alternativos para el i adem de los fermentadores Boe eS yen sa tos Métodos para te icroorganisms en los procesos ftv Er rmuchos 250; estas se Mos altrnativastendran menos costes spay pueden proporconar condiciones de oe erotic * oF especializadas necesaras para la ‘ess de las células microbianas durante un crecimiento en equilibrio, Aqui se incluyen los aminoscidos, los nuclestidos, y los productos takes de fermentacién como el etanol y los éeidos orgénicos. Ademés, ‘us enzimas con finalidades industriales, ya sean en asociacién con las ‘éllas microbianas o como exoenzimas, a menudo los microonganis- ‘sla sintetizan durante el crecimiento. Los metabolites secundarios normalmente se acumulan durante el todo de limitacién de nutrientes 0 en Ia acumulacién de productos ‘idles que viene después de la fase de crecimiento activo. Estos ‘ompuestos tienen s6lo una relacién limitada con Ia sfntesis de los to normal, La mayorfa de a ©*y las micotoxinas se encuentran dentro de esta categoria. Lacurva Stiles celulares y el er ‘Sereiiemo (eccién 6.2) sntes controlados 1069 Crecmiento de micreorgansmas en ambient (6) Femortaor con spracin ° tall Soa elas bran soar cand sean ented prvece icin da hoo ada doa 0 Fermentacin on extado sto Great do eutre Sila pent es itreahae Ensayo) Nata (0 Restore eno te eal INouganarer ena supeele pon Seite ce opr ee } i posse se ans sba N => Sala se ap 4 or (Reactor de eto thido f => baie Mengaremos ens suse Sonar sponses | errsants enti ovat Ses | arn oe scartin Son horace aoe soar nade do jo (0 Unidad ecutive do tes presictos reins rormacién de metabottos Primarios Crecimiento jura 41.15 Metabolitos primarios y secundarios. Dependiendo del microorganismo en particular, el producto deseado se podria formar durante o después del crecimiento. Los metabolites primarios se forman durante la fase activa de crecimiento, mientras {ue los metabolites secundarios e forman una vez se ha completado el crecimiento, 41.5 PRINCIPALES PRODUCTOS DE LA MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL [La microbiologia industrial ha proporcionado productos que han cam- biado profundamente nuestras vidas y nuestro tiempo de vida media, Estos incluyen productos industriales y agricolas, aditivos alimenta- ios, productos para la salud humana y animal, y biocombustibles (Tabla 41.13). Los antibiéticos y ottos productos naturales utilizados cen la medicina y en la salud han hecho contribuciones importantes para a mejora del bienestar de las poblaciones animales y humanas. Aqut se discutiran s6lo los principales productos de cada categoria, Antibisticos Los microorganismos, predominantemente los actinomicetos del gé- ‘ero Streptomyces y los hongos filamentosos (véase Tabla 34.2), pro~ ducen antibidticos. Ahora se comentaré la sintesis de varios de los antibitcos més importantes para ilustrar ef papel ertico de la formu- Jacién del medio y el control ambiental en la producci6n de estos im pPortantes compuestos. Quinioerpi atimiroiana (capital 4) Penicilinay penicitinas semisintéticas ‘Aunque la penicilin se usa mens ampliamente debido a la resistencia antibistica, este ffemaco producido por Penicillium chirysogenum, es un ejemplo excelente de une fermentacién en la que el ajuste cuidadoso Minn aioe ae Cope eun Sustanclas Microorganismos Productos industriales tanol (a partir de glucosa) Btanol (a pati de lactosa) Saccharomyces cerevisiae ‘Kluyveromyces fragilis Acetona y butanol Clostridium acetobutylicum 2.3-butanodiol Enterobacter Serratia Enzimas Aspergillus, Bacillus, Mucor, Trichoderma Productos agricolas Giberclinas Gibberellafugjikurot Aaditivos alimentarios ‘Aminoécidos (p.¢j,lisina) Corynebacterium glutamicum Acidos orgénicos (éido citrico) Aspergillus niger Nuclestidos Corynebacterium glutamicum Vitaminas Ashbya, Eremotheciu, Blakeslea Polisacdridos Xanthomonas Productos médicos “Antibiicos Penicillium, Streptomyces, Bacillus Alcaloides (Claviceps purpurea ‘ransformaciones de esteroides Insulina, hormona de Rhizopus, Arthrobacter Escherichia colt, ‘crecimiento humana, Saccharomyces cerevisiae, somatostatina interferones Y otros (tecnologia del DNA recombinante) Biocombustibles Hidr6geno Microorganisms fotasinéticos Metano Methanobacterium Etanol Zymomonas, Thermoanaerobacter de Ia composicién del medio proporciona méximo rendimiento. La ‘administracin del disacérido lactosa que se hidroliza lentamente, en. ‘combinacién con Ia disponibilidad limitada de nitrégeno, estimula una, ‘mayor acumulacién de penicilina después de que se haya parado el crecimiento (Figura 41.16). EI mismo resultado se puede obtener usando una alimentacién continua lenta de glucosa. Si se necesita una Penicilina en particular, se aftade el precursor especificoen el medio. Por «ejemplo, el dcido fenitacético se afiade para maximizar la producciéa de Penicilina G, que tiene una cadena lateral bencfica (véase Figura 34.5). El pH de fermentacién se mantiene cerca la neutralidad mediante la aici de dlcali estéil, que asegura una méxima estabilidad de la peni- cilina acabada de sintetizar. Una vez se ha completado la fermentacién, ‘ormalmente en 6 6 7 dias, el caldo de cultivo se separa del micelio flingico y se procesa por absorcién, precipitacién, y cristalizacin para ar lugar al producto final. Este producto basico puede entonces modi ficarse por procedimientos quimicos para originar una variedad de pe- nicilinas semisintticas. Escaneado con CamScanner 100 + Aimentacién por gluccha 145 gftro-hora hy 3th 15m] ‘Aimentacién per nitrogen 18 mo 80 10) Blomasa (o/tro), carbohidratos, amonio, ‘penictina (giro x 107), 8 0 2 640 «6 80 100 120 140 Tiempo de fermentacién (horas) Figura 41.16 La fermentacién de la penicilina requiere un control preciso de los nutrientes. La sintesis de penicilina empleza cuando el nitrégeno del amonio se vuelve limitante. Después de que se haya degradado la mayorla de lactosa (un dsacirido de catabolizacin lenta, se afade glucosa (un monosacérido de répida utilizacién) junto con un nivel bajo de ritrogeno. Esto estimula la transformacién maxima de las fuentes de carbono en peniclina, El factor de escala se presenta usando la convencién recomendada por la ASM. Es decir, un ntimero en el eje

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