Apuntes de Inmunologa. Curso 2005-06.

Tema 12

TEMA 12: TCNICAS INMUNOLGICAS III. Reacciones secundarias. Reacciones de Precipitacin y Aglutinacin. Inmunodifusin. Inmunnoelectroforesis Fijacin del complemento. Hemaglutinacin y su inhibicin. Neutralizacin y seroneutralizacin.
OBJETIVOS - Distinguir las reacciones Ag-Ac primarias y secundarias. - Conocer los factores que influyen en la interaccin Ag-Ac en las reacciones secundarias. - Comprender los fundamentos de las tcnicas inmunolgicas basadas en reacciones secundarias y su aplicacin en el diagnstico veterinario.

CONTENIDOS 12.1. REACCIONES SECUNDARIAS: Las reacciones Ag-Ac presentan dos estadios: 1.- Reconocimiento y unin Ag-Ac (la reaccin primaria). 2.- Interaccin Ag-Ac tras la formacin del inmunocomplejo (reaccin secundaria). Las reacciones secundarias miden los cambios fsicos de la interaccin AgAc tras la formacin del inmunocomplejo. Son independientes de la reaccin de unin del Ag y el Ac. Los factores que afectan a la medida de la reaccin secundaria: 1.- Afinidad. 2.- Avidez. 3.- Proporcin Ag/Ac. 4.- Forma fsica del Ag (Ej. aglutinacin o precipitacin). 5.- Tipo de Ig implicada. 1- PRECIPITACIN: Puede emplearse cuando el Ag es soluble, como ensayo cualitativo o semicuantitativo de la cantidad de Ac. Tipos: a. Inmunoprecipitacin en medio lquido. b. Inmunoprecipitacin en medio slido a. Inmunodifusin i. Difusin simple en tubo ii. Difusin doble b. Inmunoelectroforesis a. Inmunoprecipitacin en medio lquido: Figura 1 Efecto prozona: Ausencia de reaccin inmune a altas concentraciones de Ac.
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Zona de equivalencia: Todo el Ag y Ac se encuentran formando complejos macromoleculares insolubles (teora del retculo, Figura 1):

16

32

64

mg Ag

Efecto PROZONA

Exceso de Ac

Zona de equivalencia

Exceso de Ag

Figura 1: Curva de precipitacin cuantitativa.

b. Inmunoprecipitacin en medio slido: Utiliza un soporte slido gelificado en el que difunden el Ag y Ac. Se agrupan dentro de dos categoras: inmunodifusin y tcnicas inmunoelectroforticas. b.1. Inmunodifusin: Utiliza un soporte de agar noble en el que difunden el Ag y Ac. La difusin puede realizarse en una o dos dimensiones y adems en tubo y en placa: Difusin simple en tubo: Se establece un gradiente de concentracin slo para uno de los reactivos (Ej: Ac). Difusin doble: El gradiente de concentraciones es para el Ac y el Ag (Figura 2). Simple en tubo Doble en tubo

gar + Ac Ag gar gar + Ag

Agar +suero

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Doble en placa: Ac y Ag difunden en el gel. Pueden observarse 3 patrones: (Figura3). Anti- AB Anti-B

Anti- AB

Ag AB Identidad total

Ag AB

Ag AB no identidad

identidad parcial

Inmunodifusin radial: El Ac es incorporado en el gel de agar. El Ag de los pocillos difunde formando anillosde precipitacin (Figura 4):

b.2. Inmunoelectroforesis. Se utiliza para el anlisis cualitativo de mezclas complejas de Ag. Se utiliza para valorar los componentes protenicos del suero de acuerdo con el siguiente esquema (Figura 5):

2. AGLUTINACIN: Ms sensible que la precipitacin. Se utiliza cuando el Ag es particulado (ej. bacteria). En el caso concreto de Ag ligados a eritrocitos, se habla de hemoaglutinacin. Adems, algunos virus pueden aglutinar especficamente eritrocitos de mamferos y aves, lo que puede usarse para su identificacin. La aglutinacin puede utilizarse como ensayo cualitativo o semicuantitativo de la cantidad de Ac.

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a.-Test de aglutinacin cualitativa: Consiste en mezclar Ag y Ac y observar la aglutinacin (figura 6). Si la prueba es positiva es determinante pero el resultado negativo no. Ej Prueba de aglutinacin rpida para la brucelosis, test de determinacin de grupos sanguneos, test de Coombs para la anemia hemoltica autoinmune, etc... Figura 6: formacin del flculo de aglutinacin.

b. Test de aglutinacin cuantitativa: Para la titulacin de un suero: se diluye el suero y se enfrenta a una cantidad fija de Ag. TITULO: corresponde a la mxima dilucin del suero en el que la aglutinacin es positiva.

1/8 1/16 1/32 1/64 1/128

...(dilucin suero)

TITULO

Efecto prozona

Efecto Prozona: Por altas concentraciones de Ac. Puede tambin deberse a la presencia de Ac no aglutinantes. c. Aglutinacin pasiva: Conversin de una prueba de precipitacin en una de aglutinacin, uniendo qumicamente Ag solubles a partculas inertes como bacterias, ltex o eritrocitos (se habla de hemaglutinacin pasiva). d. Inhibicin de la hemaglutinacin: Para medir Ag solubles mediante su inhibicin por Ac especficos en la hemoaglutinacin. Se usa para tipificar virus, como los de la gripe o el de Newcastle. Tambin se puede emplear para titular sueros.

3. Pruebas de FIJACIN DEL COMPLEMENTO: Medida indirecta de Ac que no dan reacciones visibles. Se basan en que la unin Ag-Ac y formacin del inmunocomplejo ACTIVA EL COMPLEMENTO y produce complejos que lesionan membranas celulares (eritrocitos y otras clulas). Son

pruebas que se realizan en dos fases: 1 se incuba el suero problema con el Ag y el complemento, y 2, se aade un sistema indicador como eritrocitos de oveja
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recubiertos de Ac especficos (hemolisinas). Si se lisan los eritrocitos indica que hay complemento libre que no se fij en la 1 reaccin y por tanto, no hay Ac en el suero. Ej: diagnstico serolgico de brucelosis y perineumona contagiosa bovina (micoplasma), coccidioidomicosis, histoplasmosis, etc.

4. REACCIONES DE NEUTRALIZACION: Reacciones Ag-Ac que inactivan una exotoxina bacteriana o un microorganismo (generalmente un virus). Ej. -toxina de Clostridium perfringens o -toxina de Staphylococcus aureus. Se emplean frecuentemente para la Identificacin de virus desconocidos y medir el ttulo de Ac especficos en sueros (Seroneutralizacin vrica).

Ej : Figura 8: Titulacin de Ac para el virus de leucemia felina (FeLV)

1. Preparar diluciones de sueros problema

1:

1:1

1:3

1:6
2. Aadir 4x102 UFF FeLV-A a cada pocillo

3. Incubar y aadir a clulas indicadoras.

Anticuerpo neutralizante

virus

4. Incubar 5 das. El ttulo neutralizante es el 75% de reduccin de placas. clulas indicadoras

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PREGUNTAS:

1.- Crees que el resultado de las pruebas de aglutinacin rpida (o cualitativa) puede ser siempre determinante en el diagnstico de una enfermedad infecciosa? Razona tu respuesta. 2.- En base a qu factores elegiras una tcnica inmunolgica sobre otras, como test de diagnstico? 3.- Qu tipo de ensayo podras emplear en la valoracin de la eficacia de una vacuna frente a una bacteria toxignica? 4- Sabemos que un virus determinado aglutina hemates (hemaglutinacin) y queremos determinar el ttulo de Ac especficos frente a ese virus en un animal. Crees que podramos hacerlo mediante una tcnica de aglutinacin cuantitativa? Razona tu respuesta. 5- Por qu se necesita realizar la tcnica de fijacin de complemento en 2 fases?

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