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 Agradecimientos
 

El proceso de realización de una Tesis Doctoral no es un ejercicio aislado en el que 
una  persona  desarrolla  un  trabajo  sin  ningún  contacto  exterior,  más  bien  sucede  al 
contrario. Así durante la ejecución de la labor investigadora el doctorando se nutre de los 
conocimientos, ayudas y apoyos de gran número de personas. Por eso, ante todo, quiero 
agradecer,  a  todos  y  todas,  la  ayuda  y  el  apoyo  prestado,  y  ofrecer  mis  disculpas  en  el 
caso de que, sin querer, no mencione a alguien en particular. 
En primer lugar, quisiera agradecer a mis directores de Tesis, Isabel de la Mata y 
José  Luís  García,  todo  el  esfuerzo  realizado  durante  estos  años  y  que  me  han  permitido 
llevar  este  barco,  que  es  la  Tesis,  a  buen  puerto.  Trabajar  con  ellos  ha  supuesto  un 
enriquecimiento tanto en el ámbito científico como en el personal. Gracias por todo. 
No  me  gustaría  continuar  sin  antes  mostrar  mi  más  profundo  agradecimiento  a 
María  Pilar  Castillón  y  Carmen  Acebal  por  abrirme  las  puertas  de  su  laboratorio  e 
introducirme en este maravilloso mundo que es la ciencia, donde tanto he aprendido de 
ellas.  No  me  gustaría  olvidarme  de  Miguel  Arroyo,  un  gran  compañero  y  un  apoyo 
constante en cualquier momento. 
Cómo  no  agradecer  a  mis  compañeros  del  grupo  Biotec  el  tiempo  que  hemos 
pasado  juntos,  trabajando  codo  con  codo,  y  que  nos  ha  permitido  desarrollarnos 
conjuntamente durante estos años. Gracias a vosotros Raquel, Maribel, Paula y Dani. 
Gracias también a todos los miembros del Departamento de Bioquímica y Biología 
Molecular  I,  tanto  pasados  como  presentes,  ya  que  habéis  estado  en  el  momento  justo 
siempre que han sido necesarios vuestra ayuda y consejo. 
Me  gustaría  agradecer  también  al  Dr.  José  Luís  Barredo,  al  Dr.  Miguel  Ángel 
Moreno y a la Dra. Marta Rodríguez de Antibióticos S.A. su inestimable colaboración en 
la  realización  de  la  genoteca,  sin  la  cual  no  podría  haberse  llevado  a  cabo  el  presente 
trabajo.  No  sin  olvidarme  de  la  empresa  Antibióticos  S.A.  y  de  su  inestimable 
colaboración económica 
También quisiera agradecer al Dr. José Antonio Salas de la Universidad de Oviedo 
quien  desinteresadamente  nos  ha  proporcionado  el  vector  pEM4,  fundamental  para  la 
consecución de los objetivos de este trabajo. Además, gracias a la recomendación del Dr. 
José Antonio Salas pude realizar una estancia de tres meses en el laboratorio del Profesor 
Keith Chater, en el John Innes Centre (Norwich, Inglaterra), al quien agradezco la acogida 
que  me  brindo  y  que  me  permitió  compartir  trabajo  con  Helen  Kieser  y  Bertolt  Gust.  A 
todos ellos quisiera dar las gracias por todo lo que aprendí sobre el fascinante mundo de 
la Biología Molecular de los Streptomyces. 
También  me  gustaría  recordar  en  este  momento  a  todos  mis  amig@s  que  con  su 
contribución personal han permitido mi constante desarrollo como persona durante todos 
estos años. A todos vosotros y vosotras, que muy bien sabéis quienes sois, muchas gracias 
por todo. 
Finalmente no  quisiera  terminar  sin  expresar  mi  más  profundo  agradecimiento  a 
mi familia, sin la cual no habría podido llevar a cabo mis sueños. Y a ti Almu, gracias por 
ser tú. 
Índice 

ÍNDICE 

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................... 1
1. LOS ANTIBIÓTICOS β‐LACTÁMICOS ............................................................................ 3
1.1 Las penicilinas semisintéticas ..................................................................................... 6
1.2 Obtención del ácido 6‐aminopenicilánico .................................................................... 8
2 LAS PENICILINA ACILASAS ....................................................................................... 10
2.1 Estructura y biosíntesis ............................................................................................ 12
2.2 Modo de acción de las penicilina acilasas .................................................................. 16
2.3 Aplicaciones de las penicilina acilasas ...................................................................... 16
3. LAS PENICILINA V ACILASAS .................................................................................... 18
3.1 Características de las penicilina V acilasas ................................................................. 18
3.2 La penicilina V acilasa de S. lavendulae ...................................................................... 19
4. LAS EQUINOCANDINAS ............................................................................................. 21
5. LAS EQUINOCANDINA ACILASAS ............................................................................. 25
5.1 La aculeacina A acilasa de A. utahensis ...................................................................... 26
OBJETIVOS ........................................................................................................................... 29
MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................... 33
1. REACTIVOS ................................................................................................................. 35
2. MICROORGANISMOS Y PLÁSMIDOS .......................................................................... 36
3. OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS ............................................................................ 37
4. MEDIOS DE CULTIVO ................................................................................................. 39
5. CUANTIFICACIÓN DEL CRECIMIENTO DE E. coli ....................................................... 41
6. OBTENCIÓN Y RECUENTO DE ESPORAS DE Streptomyces sp........................................ 41
7. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS DE E. coli .......................................... 41
7.1 Métodos de transformación ..................................................................................... 41
7.2 Métodos de selección en E. coli de los plásmidos recombinantes ................................. 42
8. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE S. lividans 1326 ..................................................... 43
8.1 Preparación de protoplastos de S. lividans 1326.......................................................... 43
8.2 Transformación de protoplastos de S. lividans 1326 .................................................... 44
8.3 Selección de los S. lividans 1326 transformantes ......................................................... 44
9. PURIFICACIÓN DEL ADN TOTAL DE S. lavendulae ATCC 13664 
 Y DE A. utahensis NRRL 12052 ....................................................................................... 45
10. PURIFICACIÓN DEL ADN PLASMÍDICO DE E. coli ...................................................... 46
11. PURIFICACIÓN DEL ADN PLASMÍDICO DE S. lividans ................................................ 46
12. TÉCNICA DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ...................... 46
12.1 Técnica de la PCR inversa ........................................................................................ 48
13. PURIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN ............................................................... 49
14. ELECTROFORESIS DE ADN ......................................................................................... 49
15. TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN DEL ADN (SOUTHERN BLOT)........................................ 49
16. SECUENCIACIÓN DEL ADN ....................................................................................... 51
17. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN pva DE S. lavendulae ATCC 13664 ....................... 51
17.1 Construcción de una genoteca de S. lavendulae ATCC 13664 en E. coli HB101 ............... 51
17.2 Obtención por PCR de fragmentos de ADN del gen pva ............................................. 52
17.3 Obtención por PCR inversa de fragmentos de ADN del gen pva ................................. 53
17.4 Construcción de una genoteca en el bacteriófago λ‐GEM12 ........................................ 53
17.4.1 Preparación del ADN del bacteriófago ................................................................ 53
17.4.2 Preparación del ADN de S. lavendulae ATCC13664 .............................................. 54

I
 Índice 

17.4.3 Construcción de la genoteca .............................................................................. 54

17.4.4 Caracterización de los clones que contienen el gen pva......................................... 55
17.4.5 Subclonaje de los clones que contienen el gen pva en E. coli .................................. 56
17.5 Clonación y expresión del gen pva en E. coli con y sin su péptido señal ....................... 56
17.6 Clonación y expresión del gen pva en S. lividans ........................................................ 58
17.6.1 Obtención del plásmido recombinante pPVASl0.1 ............................................... 59
17.6.2 Obtención del plásmido recombinante pASL‐7 ................................................... 60
17.6.3 Estudio de la expresión del gen pva en S. lividans................................................. 61
18. PENICILINA V ACILASA DE S. lavendulae ATCC 13664  
PRODUCIDA POR S. lividans CECT 3376 ....................................................................... 62
18.1 Optimización de la producción de SlPVA ................................................................. 62
18.1.1 Estudio del medio de producción ....................................................................... 62
18.1.2 Optimización del tamaño de inóculo .................................................................. 62
18.1.3 Optimización de la temperatura de producción .................................................. 63
18.2 Aislamiento y purificación de SlPVA........................................................................ 63
18.2.1 Cromatografía de intercambio iónico S‐Sepharose (Fast‐Flow) .............................. 63
19. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN aac DE A. utahensis NRRL  12052 
 QUE CODIFICA LA ACULEACINA A ACILASA .......................................................... 64
19.1 Clonación y expresión del gen aac en E. coli ............................................................... 64
19.2 Clonación y expresión del gen aac en S. lividans ......................................................... 65
20. AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE AuAAC  
PRODUCIDA EN S. lividans CECT 3377 ......................................................................... 67
20.1 Cromatografía de intercambio iónico S‐Sepharose (Fast‐Flow) .................................... 67
20.2 Cromatografía de penetrabilidad Superose 12 (Fast‐Flow) ......................................... 67
21. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA .............................................................................. 68
22. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PENICILINA V ACILASA ............................... 68
22.1 Método del PDAB ................................................................................................... 69
22.2 Método del fluram .................................................................................................. 69
23. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI‐SlPVA ............................................................. 70
24. TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS DE PROTEÍNAS....................................................... 70
24.1 Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes ..................................... 70
24.2 Electrotransferencia de proteínas a membranas de nitrocelulosa 
e inmunodetección de SlPVA (Western blot) ............................................................. 71
24.3 Electrotransferencia de proteínas a membranas de PVDF 
y análisis de la secuencia aminoterminal. .................................................................. 71
25. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS ACILASAS 
 PRODUCIDAS POR LOS MICROORGANISMOS RECOMBINANTES ............................ 72
25.1 Estudios de estabilidad y actividad respecto al pH .................................................... 72
25.1.1 Estabilidad frente al pH..................................................................................... 72
25.1.2 Estudio del pH óptimo ...................................................................................... 72
25.2 Estudios de estabilidad y actividad respecto a la temperatura .................................... 73
25.2.1 Estabilidad frente a la temperatura..................................................................... 73
25.2.2 Estudio de la temperatura óptima ...................................................................... 73
25.3 Estudio de la actividad enzimática respecto a la fuerza iónica .................................... 73
25.4 Determinación de los parámetros cinéticos de la acilasas 
 frente a distintas penicilinas .................................................................................... 73
26. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LAS ACILASAS  
PRODUCIDAS POR LOS MICROORGANISMOS RECOMBINANTES ............................. 74
26.1 Espectro de absorción UV‐visible ............................................................................. 74

II
Índice 

26.2 Cálculo del coeficiente de extinción molar................................................................. 74
26.3 Espectroscopia de fluorescencia ............................................................................... 75
26.4 Dicroísmo circular ................................................................................................... 75
26.5 Modelización de la estructura terciaria ..................................................................... 76
RESULTADOS ....................................................................................................................... 77
I. CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE 
 LA PENICILINA V ACILASA DE S. lavendulae ATCC 13664 ................................................. 79
1. SECUENCIACIÓN DEL GEN QUE CODIFICA EL ARNr 16s 
 DE S. lavendulae ATCC 13664......................................................................................... 79
2. OBTENCIÓN DE UNA GENOTECA DE S. lavendulae ATCC 13664  
EN E. coli HB101 ........................................................................................................... 81
3. AMPLIFICACIÓN, CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN 
 DEL GEN pva DE S. lavendulae ATCC 13664 MEDIANTE PCR......................................... 81
3.1 Secuenciación de los extremos N‐terminales de SlPVA .............................................. 82
3.2 Obtención por PCR de fragmentos de ADN del gen pva ............................................. 83
3.3 Obtención por PCR inversa de fragmentos del gen pva .............................................. 86
3.3.1 Obtención de la región promotora y 5´ del gen pva .............................................. 87
3.3.2 Obtención de la región 3´ del gen pva .................................................................. 93
3.4 Caracterización del gen pva y de la proteína SlPVA que codifica ................................. 96
4. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN pva EN E. coli .................................................. 101
4.1 Amplificación y clonación del gen pva con y sin la secuencia 
 génica que codifica el péptido señal ....................................................................... 101
4.2 Clonación y expresión del gen pva en E. coli HB101 .................................................. 103
4.3 Clonación y expresión del gen pva en E. coli BL21 (DE3) ........................................... 106
5. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN pva DE S. lavendulae ATCC 13664  
EN S. lividans 1326 ....................................................................................................... 108
5.1 Clonación y expresión del gen pva con su propio promotor ...................................... 108
5.1.1 Construcción de una genoteca de S. lavendulae ATCC 13664  en λ‐GEM12 ........... 108
5.1.2 Reconstrucción del gen pva .............................................................................. 110
5.1.3 Obtención del clon S. lividans CECT 3365 .......................................................... 111
5.1.4 Expresión del gen pva por S. lividans CECT 3365 ................................................ 112
5.1.5 Hidrólisis de penicilinas alifáticas en los caldos 
 de fermentación de S. lividans CECT 3365 ......................................................... 114
5.2 Clonación y expresión del gen pva en el vector de expresión pEM4 ........................... 115
5.2.1 Obtención del clon recombinante S. lividans CECT 3376 ..................................... 116
5.2.2 Optimización de la producción de SlPVA por S. lividans CECT 3376 ................... 117
6. PURIFICACIÓN DE LA SlPVA PRODUCIDA POR S. lividans CECT 3376 ...................... 122
7. CARACTERIZACIÓN DE SlPVA PRODUCIDA POR S. lividans CECT 3376 ................... 124
7.1 Caracterización funcional de la SlPVA recombinante ............................................... 124
7.1.1 Estudio de la estabilidad y de la actividad de SlPVA respecto al pH ................... 125
7.1.2 Estudio de la estabilidad y de la actividad de SlPVA respecto a la temperatura ... 126
7.1.3 Estudio de la actividad SlPVA respecto a la fuerza iónica. .................................. 127
7.1.4 Determinación de los parámetros cinéticos de SlPVA 
 frente a las penicilinas naturales ...................................................................... 128
7.2 Caracterización estructural de la SlPVA recombinante ............................................. 128
7.2.1 Espectro de absorbancia UV‐visible de SlPVA ................................................... 128
7.2.2 Coeficiente de extinción molar de SlPVA .......................................................... 129
7.2.3 Espectro de fluorescencia de SlPVA .................................................................. 130
7.2.4 Espectro de dicroísmo circular de SlPVA .......................................................... 130

III
 Índice 

II.CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE LA ACULEACINA 
A ACILASA DE A. utahensis NRLL 12052 ........................................................................... 134
8.     SECUENCIACIÓN DEL GEN QUE CODIFICA EL ARNr 16s  
DE A. utahensis NRRL 12052 ........................................................................................ 134
9. DETECCIÓN DE ACTIVIDAD PENICILINA V ACILASA EN  
LOS CALDOS DE FERMENTACIÓN DE A. utahensis NRRL 12052 ................................ 136
10. AMPLIFICACIÓN, CLONACIÓN Y SECUENCIACIÓN  
DEL GEN aac DE A. utahensis NRRL 12052. ................................................................... 136
11. ESTUDIOS DE EXPRESIÓN DEL GEN aac EN E. coli BL21 (DE3) ................................... 142
12. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN aac DE A. utahensis NRRL 12052  
EN S. lividans 1326 ...................................................................................................... 143
12.1 Obtención del clon S. lividans CECT 3377 ................................................................ 144
12.2 Producción de AuAAC por S. lividans CECT 3377 .................................................... 145
13. PURIFICACIÓN DE LA AuAAC PRODUCIDA POR S. lividans CECT 3377 .................... 147
14. CARACTERIZACIÓN DE AuAAC PRODUCIDA POR S. lividans CECT 3377. ................ 150
14.1 Caracterización funcional de la AuAAC recombinante............................................. 150
14.1.1 Estudio de la estabilidad y de la actividad de AuAAC respecto al pH. ................ 150
14.1.2 Estudio de la estabilidad y de la actividad de AuAAC respecto a la temperatura. 151
14.1.3 Estudio de actividad de AuAAC respecto a la fuerza iónica. .............................. 153
14.1.4 Determinación de los parámetros cinéticos de AuAAC  
frente a las penicilinas naturales. ...................................................................... 154
14.2 Caracterización estructural de la AuAAC recombinante .......................................... 154
14.2.1 Espectro de absorbancia UV‐visible de AuAAC ................................................. 155
14.2.2 Coeficiente de extinción molar de AuAAC ........................................................ 155
14.2.3 Espectro de fluorescencia de AuAAC ............................................................... 156
14.2.4 Espectro de dicroísmo circular de AuAAc ......................................................... 156
DISCUSIÓN ........................................................................................................................ 161
1. PENCILINA V ACILASA DE S. lavendulae ATCC 13664  
EXPRESADA EN S. lividans ......................................................................................... 164
1.1 Secuenciación y caracterización del gen pva de S. lavendulae ATCC 13664.................. 164
1.2 Caracterización molecular de la SlPVA recombinante .............................................. 166
1.3 Estudios de expresión del gen pva .......................................................................... 168
1.4 Purificación de SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 ..................................... 172
1.5 Caracterización funcional de SlPVA por S. lividans CECT 3376 ................................. 172
2. ACULEACINA A ACILASA DE A. utahensis NRRL 12052  
EXPRESADA EN S. lividans ......................................................................................... 173
2.1 Clonación y caracterización del gen aac de A. utahensis NRRL 12052 ......................... 173
2.2 Caracterización molecular de AuAAC recombinante ............................................... 174
2.3 Estudios de expresión del gen aac........................................................................... 178
2.4 Purificación de AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 ................................... 179
2.5 Caracterización funcional de AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 ............... 180
3. COMPARACIÓN DE LAS SECUENCIAS DE SlPVA Y AuAAC 
 CON OTRAS ACILASAS............................................................................................ 181
3.1 Modelos estructurales propuestos para las subunidades β  
de las acilasas expresadas en S. lividans................................................................... 187
CONCLUSIONES ................................................................................................................ 189
ANEXO 1 ............................................................................................................................ 193
Secuencia de nucleótidos del gen pva y de aminoácidos deducida  
para la penicilina V acilasa de S. lavendulae ATCC 13664. ..................................................... 195

IV
Índice 

ANEXO 2 ............................................................................................................................ 199

Secuencia de nucleótidos del gen aac y de aminoácidos deducida  
para la aculeacina A acilasa de A. utahensis NRRL 12052. ..................................................... 201
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................... 203
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

V
 
 
 
 
 
  ABREVIATURAS
   
   
6‐APA  Ácido 6‐aminobenzaldehido
AAC  Aculeacina A acilasa 
ADN  Ácido desoxirribonucleico
AMA  Ampicilina acilasa 
Ap  Ampicilina 
ARNE  Ácido ribonucleico ribosómico 
AuAAC  Aculeacina A acilasa de Actinoplanes utahensis NRRL 12052
BSA  Albúmina de suero bovino
CHP  Ciclohexapéptido 
Cm  Cloranfenicol 
DC  Dicroísmo circular
DMSO  Dimetilsulfóxido 
dNTP  Desoxinucleótido trifosfato 
EDTA  Ácido etilendiaminotetraacético 
ELO  Medio Extracto de levadura‐oligoelementos 
Fluram  Fluorescamina 
GLA  Glutaril ‐7‐ACA  acilasa
HPLC  Cromatografía líquida de alta resolución 
IPTG  Isopropil‐β‐D‐tiogalactopiranósido 
kcat  Constante catalítica 
kcat/km  Eficacia catalítica 
km  Constante de Michaelis‐Menten 
Kn  Kanamicina 
LB  Medio Luria‐Bertani 
ORF  Marco de lectura abierto 
PBS  Tampón fosfato salino 
PCR  Reacción en cadena de la polimerasa 
PDAB  p‐dimetil‐aminobenzaldehido 
PEG  Polietilenglicol 
PGA  Penicilina G acilasa 
Pre‐AAC  Aculeacina A acilasa inmadura 
Pre‐PVA  Penicilina V acilasa inmadura 
PVA   Penicilina V acilasa 
RBS  Sitio de unión al ribosoma 
SDS  Dodecilsulfato sódico 
SDS‐PAGE  Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de SDS 
SFM  Medio Manitol‐harina de Soja 
SlPVA  Penicilina V acilasa de Streptomyces lavendulae ATCC 13664 
TAE  Tampón Tris HCl‐ácido acético‐EDTA 
TE  Tampón Tris HCl‐EDTA 
TES  Ácido tris(hidroximetil)metil‐2‐aminometanosulfónico 
TSB  Medio triptona de soja 
TSBw/oG  Medio triptona de soja sin glucosa 
Tsr  Tioestreptona 
ufp  Unidades formadoras de placas de lisis 
UI  Unidades internacionales de actividad enzimática 
YEME  Medio Extracto de Levadura‐extracto de Malta 
 

INTRODUCCIÓN
 

1
 

 
Introducción 

1. LOS ANTIBIÓTICOS β‐LACTÁMICOS 

La ciencia en muchas ocasiones se nutre de la casualidad y la buena interpretación 
de  las  “señales”  observadas  puede  llevar  a  grandes  descubrimientos.  Así,  la  casualidad 
hizo que, en 1928, Alexander Fleming descubriese la capacidad antibacteriana del hongo 
Penicillium notatum, tras observar y analizar la contaminación accidental de las placas de 
cultivos  de  Streptococcus  aureus.  Posteriormente,  desarrolló  el  hongo  en  un  medio  de 
cultivo líquido, observando que el extracto filtrado, libre de células, era capaz de inhibir el 
crecimiento  de  muchas  especies  bacterianas.  Al  principio  activo  de  estos  caldos  lo 
denominó “penicilina” (Fleming, 1929). Fleming no pudo seguir avanzando en el estudio 
de  la  penicilina,  ya  que  todos  los  intentos  llevados  a  cabo  para  su  aislamiento  y 
purificación  resultaron  infructuosos  debido  a  su  inestabilidad.  Fue  Ernest  Chain  quien, 
diez  años  más  tarde,  en  1940,  consiguió  aislar  y  obtener  una  preparación  estable  de 
penicilina,  así  como  su  caracterización  físico‐química  (Chain  y  col.,  1940).  Esto  permitió 
que  el  grupo  de  Howard  W.  Florey  desarrollase  los  métodos  que  permitieron  el  uso 
terapéutico  de  la  penicilina,  al  demostrar  su  baja  toxicidad  en  los  animales  (Abraham  y 
col.,  1941),  poniendo  de  manifiesto  su  impresionante  capacidad  como  agente  bactericida 
en el tratamiento de enfermedades infecciosas, lo que hizo posible su utilización con gran 
éxito  durante  la  Segunda  Guerra  Mundial  y  supuso  el  comienzo  de  la  era  de  los 
antibióticos. 

A  partir  de  ese  momento  se  abrió  una  nueva  vía  en  la  lucha  contra  las 
enfermedades  bacterianas  caracterizada  por  la  búsqueda  de  nuevos  microorganismos 
productores  de  penicilina,  así  como  en  la  obtención  de  nuevas  penicilinas  mediante 
métodos  fermentativos.  La  penicilina  descubierta  por  Fleming  fue  la  bencilpenicilina  o 
penicilina  G.  En  1953  se  descubrió  y  describió  la  penicilina  V  o  fenoximetilpenicilina, 
producida mediante la adición de ácido fenoxiacético en los caldos de fermentación para 
obtener  penicilina.  Otras  penicilinas  que  se  descubrieron  posteriormente  fueron  la 
penicilina  K,  la  F  y  la  dihidroF,  todas  ellas  producidas  de  forma  natural  mediante 
fermentación de los microorganismos productores. La comparación de la estructura de las 
diferentes penicilinas permitió observar que todas ellas presentan la misma estructura, un 
núcleo  común  denominado  ácido  6‐aminopenicilánico  (6‐APA),  formado  por  la 
condensación de un anillo β‐lactámico con otro de tiazolidina, un ácido carboxílico libre y 
uno  o  más  sustituyentes  de  carácter  aminoacídico  como  cadena  lateral  (Figura  1).  La 
estructura  β‐lactámica  también  se  puede  interpretar  como  la  fusión  entre  una  cisteina  y 
una valina (Figura 1). Las penicilinas se diferencian por el radical acilo que presentan en 
la  posición  C6  (Crawfoot  y  col.,  1949)  (Tabla  1).  Estas  variaciones  les  van  a  conferir 
diferentes  propiedades  físico‐químicas,  además  de  diversos  espectros  de  acción  frente  a 

3
 Introducción 

las bacterias y distinta resistencia a la acción de β‐lactamasas y (Parry, 1987; Van Krimpen 
y col., 1987). 

 
 

Figura 1. Estructura básica de las penicilinas. 

 
Tabla 1. Estructura de las penicilinas naturales. 

Nombre  R 

Penicilina G 
CH 2
(bencil penicilina) 

Penicilina V  O CH2
(fenoximetil penicilina) 

Penicilina K 
(heptil penicilina)  CH3 (CH2 )6

Penicilina F 
(2‐pentenil penicilina)  CH3 CH2 CH CH CH2

Penicilina dihidroF 
CH3 (CH2 )4
(pentil penicilina) 

Penicilina X 
HO CH2
(hidroxibencil penicilina) 

Penicilina N  HOOC
(aminoadipil penicilina)  H2 N CH (CH2 )3

4
Introducción 

Los  antibióticos  β‐lactámicos  son  producidos  por  un  número  reducido  de 
microorganismos,  formando  parte  de  su  metabolismo  secundario.  La  biosíntesis  de 
penicilinas  implica  la  fusión  entre  3  aminoácidos,  L‐cisteína,  D‐valina  y  el  ácido  L‐α‐
aminoadípico,  catalizada  por  la  enzima  L‐α‐aminoadipil‐L‐cistenil‐D‐valina  sintetasa, 
dando lugar al tripéptido L‐α‐aminoadipil‐L‐cistenil‐D‐valina o ACV, y por medio de la 
acción de la isopenicilina N sintetasa da lugar a la isopenicilina N (Banko y col., 1987). A 
partir  de  esta  última,  y  mediante  la  adición  de  diferentes  radicales  acilo,  se  obtienen  los 
diferentes tipos de penicilinas y otros antibióticos β‐lactámicos, como las cefalosporinas. 

La actividad bactericida de las penicilinas se debe a que interfieren en la síntesis de 
la  pared  celular  bacteriana.  Su  estructura  es  muy  parecida  al  dipéptido  D‐alanil‐D‐
alanina, sustrato de la enzima transpeptidasa, que es la que da lugar a las uniones entre 
las moléculas de peptidoglicano de las paredes bacterianas, por lo  que las penicilinas se 
unen  a  estas  enzimas  dando  lugar  a  paredes  celulares  débiles  y  las  células  se  lisan, 
dificultando,  además,  la  división  celular  (Tipper  y  Srominger,  1965).  Otros  estudios  han 
puesto de manifiesto la existencia de diferentes receptores de membrana a los que se unen 
las  penicilinas  de  forma  covalente  y  a  los  que  se  ha  denominado  Proteínas  que  Unen 
Penicilinas  (del  ingles  penicillin  binding  proteins,  o  PBP).  Entre  este  tipo  de  proteínas 
aparecen carboxipeptidasas, transpeptidasas, endopeptidasas y transglicosilasas, enzimas 
implicadas en el crecimiento y división celular (Blumberg y Strominger, 1974; OʹSullivan y 
Sykes, 1986). El espectro de acción de las penicilinas naturales es muy limitado, actuando 
principalmente  sobre  bacterias  Gram  positivas,  y  no  en  todas,  como  es  el  caso  de  la 
penicilina G, la más empleada (Parry, 1987). 

La  búsqueda  de  nuevos  antibióticos  llevó  al  descubrimiento  en  1948  de  las 
cefalosporinas. Esta nueva clase de antibióticos β‐lactámicos fue aislada por primera vez 
del  hongo  Cephalosporium  acremonium,  que  crecía  en  aguas  residuales  (Brozu,  1948).  A 
partir  de  dicho  microorganismo  se  aisló  la  cefalosporina  C  que  presentaba  la  ventaja, 
respecto de  las penicilinas, de poseer un espectro de acción  más amplio, actuando tanto 
sobre  bacterias  Gram  positivas  como  Gram  negativas.  La  cefalosporina  C  está  formada 
por  un  anillo  β‐lactámico  condensado  con  un  anillo  ∆3‐dihidrotiazina,  que  constituye  el 
núcleo  común  de  las  cefalosporinas,  el  ácido  7‐aminocefalosporánico  (7‐ACA),  así  como 
dos cadenas laterales, Figura 2. 

5
 Introducción 

O OH H
R1 C N
O
N
N SO3
O COOH O
B
C

Figura  2.  Otros  tipos  de  antibióticos  β‐lactámicos:  A,  cefalosporina  C;  B,  ácido
clavulánico;  C,  monobactama;  D,  carbapenema;  R1  y  R2  corresponden  a  los  distintos 
sustituyentes acilo que dan lugar a los diversos tipos de monobactamas y carbapenas. 
 

En las últimas décadas, la aparición de nuevos antibióticos β‐lactámicos ha sufrido 
un  incremento  considerable,  destacando  entre  otros  el  ácido  clavulánico,  producido  por 
Streptomyces  clavurigenus  y  que  es  un  potente  inhibidor  de  las  β‐lactamasas  (Howarth  y 
col.,  1976).  Otros  β‐lactámicos  descritos  pertenecen  a  dos  grupos  principales,  las 
carbapenemas, donde destaca el ácido olivánico, que además de bactericida es inhibidor 
de las β‐lactamasas (Brown y col., 1976) y las monobactamas, donde destaca el antibiótico 
nocardicina, producida por el actinomiceto Nocardia uniformis (Aoki y col., 1976). 

1.1 Las penicilinas semisintéticas 

Como  se  ha  indicado  anteriormente,  el  uso  de  antibióticos  β‐lactámicos  ha 
supuesto una importante herramienta en la lucha contra las enfermedades infecciosas. Los 
antibióticos  β‐lactámicos  más  ampliamente  extendidos  son  las  penicilinas,  ya  que 
suponen  alrededor  del  19%  del  total  utilizado  a  nivel  mundial  en  el  tratamiento  de 
enfermedades (Parmar y col., 2000). Sin embargo, el uso de estas sustancias naturales se ha 
visto limitado por su falta de universalidad como bactericidas, ya que cada una  posee un 
espectro limitado de acción frente a determinados microorganismos. 

Además,  en  los  últimos  años  se  ha  producido  la  aparición,  cada  vez  más 
numerosa, de bacterias resistentes a penicilinas. La resistencia se debe principalmente al 
desarrollo de enzimas β‐lactamasas que hidrolizan el anillo β‐lactámico. Estas enzimas se 
describieron  por  primera  vez  en  1940  (Abraham  y  Chain,  1940).  Por  otra  parte,  se  han 
podido  observar  otros  fenómenos  de  resistencia  por  parte  de  las  bacterias,  como  por 

6
Introducción 

ejemplo,  mutaciones  de  las  enzimas  transpeptidasas  implicadas  en  el  desarrollo  del 
peptidoglucano (Neu, 1992). 

Los problemas anteriormente expuestos hicieron necesaria la búsqueda de nuevos 
antibióticos a partir de su núcleo, el ácido 6‐aminopenicilánico. Surgen así los antibióticos 
β‐lactámicos semisintéticos, que en el caso de las penicilinas semisintéticas se obtienen por 
la adición de una cadena lateral diferente a la que presentan las penicilinas naturales en la 
posición  6  del  6‐APA.  En  la  Tabla  2  se  observan  varios  ejemplos  de  penicilinas 
semisintéticas. 

En  la  actualidad  existe  una  mayor  proporción  de  penicilinas  semisintéticas 
respecto  a  las  producidas  de  forma  natural  que  son  empleadas  en  el  tratamiento  de 
enfermedades;  de  ahí  la  importancia  en  la  búsqueda  de  nuevas  penicilinas.  Las 
penicilinas,  tanto  naturales  como  semisintéticas,  se  clasifican  según  sus  propiedades 
físico‐químicas  y  su  espectro  de  acción,  tal  y  como  aparece  reflejado  en  la  Tabla  3  (Van 
Krimpen y col., 1987).  

 
Tabla 2. Estructura de las penicilinas semisintéticas. 

Nombre  R 

Ampicilina 
CH
(α‐aminobencil penicilina) 
NH2

Amoxicilina 
HO CH
(p‐hidroxiaminobencil 
NH2
penicilina) 

Meticilina  O
(2,6‐dimetoximetil 
O CH3
penicilina) 

Carbenicilina  CH
(α‐carboxibencil penicilina)  COOH

Cl
Cloxacilina  C C
(3‐(ο‐clorofenil)‐5‐metil‐4‐ N C CH3
isoxazolil penicilina))  O

Ciclacilina 
(1‐aminociclohexano  NH2
penicilina) 

7
 Introducción 

Tabla 3. Clasificación de las penicilinas. 

Resistencia  Resistencia a 
Tipo  Ejemplo  Producción 
a pH ácido  β‐lactamasas 

Familia de la  Penicilina G  No  No 

Natural 
bencilpenicilina 
Penicilina V  Sí  No 

Resistentes a  Meticilina  No  Sí 

Semisintéticas 
penicilinasas 
Cloxacilina  Sí  Sí 
Amoxicilina, 
Amino penicilinas  Sí  No  Semisintéticas 
ampicilina 
Penicilinas activas 
Carbenicilina ‐  No  Semisintéticas 
frente a pseudomonas 

Amidinopenicilinas  Meticilina  ‐  No  Semisintéticas 

1.2 Obtención del ácido 6‐aminopenicilánico 

Las  penicilinas  semisintéticas  se  obtienen  a  partir  del  ácido  6‐aminopenicilánico 

(Figura  1),  cuya  obtención  con  buen  rendimiento  y  pureza  es  el  paso  limitante  en  la 
producción industrial de antibióticos β‐lactámicos semisintéticos (Shewale y SivaRaman, 
1989). 

El  6‐APA  se  describió  por  primera  vez  en  1950,  pero  no  se  aisló  hasta  1959 
(Batchelor y col., 1959). En un principio, el 6‐APA se obtenía como un producto secundario 
en las fermentaciones destinadas a producir penicilina G, pero su dificultad de separación 
y el bajo  rendimiento hicieron  que  se abandonase dicha vía. El 6‐APA se puede obtener 
tanto por síntesis química como enzimática (Figura 3). La síntesis química es una vía poco 
rentable  debido  a  sus  elevados  costes  y  los  problemas  ambientales  que  generan  los 
residuos  y  reactivos  empleados  (Sheehan  y  Ferris,  1959).  El  descubrimiento  de  las 
penicilina acilasas (penicilina amidohidrolasas, EC 3.5.1.11) ha permitido el desarrollo de 
procesos de obtención  de 6‐APA  basados en métodos enzimáticos (Rolinson y col., 1960; 
Batchelor  y  col.,  1961;  Rolinson  y  col.,  1961).  Las  penicilina  acilasas  son  enzimas  que 
hidrolizan las penicilinas naturales, rindiendo como productos de su catálisis 6‐APA y el 
ácido carboxílico correspondiente (Figura 3). 

Las  penicilina  acilasas  pertenecen  al  grupo  de  las  enzimas  β‐lactam  acilasas 
(también  clasificadas  como  β‐lactam  amidohidrolasas  o  penicilina  amidohidrolasas,  EC 
3.5.1.11).  Esta  familia  también  incluye  cefalosporina  acilasas  (glutaril‐7‐ACA  acilasas  y 
cefalosporina C acilasas), enzimas utilizadas en la industria para la obtención del ácido 7‐

8
Introducción 

aminocefalosporánico,  punto  de  partida  para  la  obtención  de  cefalosporinas 

semisintéticas (García y col., 1995). 

Existen  tres  tipos  de  penicilina  acilasas  dependiendo  del  sustrato  que  hidrolizan, 
las  penicilina  G  acilasas  (PGA),  las  penicilina  V  acilasas  (PVA)  y  las  ampicilina  acilasas 
(AMA),  pero  sólo  las  dos  primeras  se  utilizan  para  la  producción  industrial  de  ácido  6‐
aminopenicilánico (Sudhakaran y col., 1992). 

 
Figura  3.  Producción  de  ácido  6‐aminopenicilánico,  por  hidrólisis  química  y  enzimática,    para  la  obtención  de 
penicilinas semisintéticas. 
 

9
 Introducción 

En  la  actualidad  la  producción  industrial  de  6‐APA  se  lleva  a  cabo  mediante 
hidrólisis enzimática de las penicilinas naturales, G o V (Figura 3), ya que además de las 
ventajas  anteriormente  indicadas  de  la  hidrólisis  enzimática  frente  a  la  química,  en  los 
últimos  años  se  ha  producido  un  notable  avance  biotecnológico  en  la  producción  de 
penicilina  acilasas,  facilitado  especialmente  por  los  avances  en  las  técnicas  de  biología 
molecular.  Por  otro  lado,  el  desarrollo  industrial  de  reactores  que  utilizan  las  enzimas 
inmovilizadas  ha  permitido  elevar  los  rendimientos  en  la  producción  de  6‐APA, 
reduciendo significativamente los costes. Las compañías farmacéuticas utilizan el 6‐APA 
obtenido  mediante  hidrólisis  de  las  penicilinas  naturales  como  punto  de  partida  para  la 
síntesis  de  penicilinas  semisintéticas,  la  cual  se  realiza  mediante  la  condensación  de 
derivados de D‐aminoácidos con el núcleo β‐lactámico (Figura 3). Así, en los últimos años 
se han desarrollado biorreactores que utilizan las penicilinas acilasas como catalizadores 
en  las  reacciones  de  síntesis  (Bruggink  y  col.,  1998;  Wegman  y  col.,  2001;  Arroyo  y  col., 
2003). 

2 LAS PENICILINA ACILASAS 

Una  buena  eficacia  y  un  buen  rendimiento  en  la  producción  del  ácido  6‐
aminopenicilánico van a ser el punto clave para la obtención de penicilinas semisintéticas. 
En  la  industria  farmacéutica,  este  papel  tan  importante  lo  van  a  jugar  las  penicilina 
acilasas. Las penicilina acilasas empleadas para llevar a cabo dicho proceso de hidrólisis 
son las penicilina G acilasas (PGA) y las penicilina V acilasas (PVA), que van a hidrolizar 
la  penicilina  G  y  la  penicilina  V,  respectivamente,  liberando  el  6‐APA  y  el  ácido 
carboxílico  correspondiente  (Figura  3).  La  especificidad  de  las  penicilina  acilasas  no  es 
absoluta;  por  ejemplo,  la  PGA  de  Escherichia  coli  también  presenta  actividad  frente  a  la 
ampicilina, la cefalexina y otras penicilinas (Margolin y col., 1980), mientras que la PVA de 
Streptomyces  lavendulae  ATCC  13664  puede  hidrolizar  penicilinas  naturales  con  cadena 
lateral alifática (Torres‐Guzmán y col., 2002). 

La  primera  actividad  penicilina  acilasa  se  describió  en  1950  en  caldos  de 
fermentación del hongo Penicillium chrysogenum Q176 (Sakaguchi y Murao, 1950). A partir 
de entonces comenzó la búsqueda intensiva de nuevos microorganismos productores de 
enzimas  penicilina  acilasas.  Las  penicilina  acilasas  están  ampliamente  distribuidas  en  la 
naturaleza,  tanto  entre  procariotas  como  eucariotas  (levaduras  y  hongos)  (Vandamme  y 
Voets,  1974;  Sudhakaran  y  Borkar,  1985a;  Sudhakaran  y  Borkar,  1985b;  Shewale  y 
SivaRaman,  1989).  Se  observa,  por  tanto,  una  gran  variedad  de  microorganismos 
productores de penicilina acilasas, y aunque la producción de PGA y PVA se da tanto en 

10
Introducción 

unos  grupos  como  en  otros,  parece  existir  una  predominancia  en  la  producción  de 
penicilina V acilasas por parte de las levaduras y hongos, mientras que en el caso de las 
penicilina  G  acilasas  se  suelen  observar  más  productores  en  el  grupo  de  los  procariotas 
(Tabla 4). 

Tabla 4. Fuentes biológicas de la penicilina G acilasa y la penicilina V acilasa. 

Enzima   microorganismo  Especie  Referencia 

Escherichia coli ATCC 11105  (Schumacher y col., 1986) 
Escherichia coli ATCC 9637  (García y col., 1995) 
Rhodopseudomonas spheroides KY 4112  (García y col., 1995) 
Pseudomonas aeruginosa KY 3591  (García y col., 1995) 
Xanthomonas sp.  (García y col., 1995) 
Alcaligenes faecalis A‐9424  (García y col., 1995) 
Flavobacterium sp.  (García y col., 1995) 
Azotobacter chroococcum Beeij C12Pr  (García y col., 1995) 
Bacterias  Aerobacter cloacae  (García y col., 1995) 
PGA 
Erwinia sp.  (García y col., 1995) 
Serratia sp.  (García y col., 1995) 
Proteus rettgeri FG 113424  (Daumy y Danley, 1985) 
Kluyvera citrophila ATCC 211285  (Barbero y col., 1986) 
Arthobacter viscosus 8895GU  (Ohashi y col., 1988) 
Bacillus megaterium ATCC 1144945  (Chiang y Bennett, 1967) 
Mycobacterium phlei  (García y col., 1995) 
Nocardia FD 466973  (Huang y col., 1963) 
Hongos  Neurospora Crassa FSD 987  (García y col., 1995) 
Achromobacter sp.  (Savidge y Cole, 1975) 
Bacillus sphaericus  (Carlsen y Emborg, 1981) 
Bacillus subtilis  (Olsson y col., 1985) 
Erwinia aroideae  (Vandamme y Voets, 1975) 
Bacterias 
Pseudomonas acidovorans  (Lowe y col., 1981) 
Streptomyces lavendulae  (Batchelor y col., 1961) 
Nocardia goberula  (García y col., 1995) 
Chainia  (Chauhan y col., 1998) 
Rhodotorula glutinis  (Vandamme y Voets, 1973) 
PVA  Levaduras 
Cryptococcus sp. CCY‐17‐22‐1  (Vojtisek y col., 1987) 
Cephalosporium sp.  (Cole y Sutherland, 1966) 
Emericellopsis minima  (Cole y Sutherland, 1966) 
Epidermophyton interdigitale  (Uri y col., 1963) 
Fusarium sp.  (Sudhakaran y Shewale, 1993) 
Hongos 
Bovista plumbea  (Schneider y Roehr, 1976) 
Malbranchea pulchella var. Sulfurea APM 06  (Singh y col., 1988) 
Pleurotus ostratus  (Kluge y col., 1982) 
Penicillium chrysogenum  (Erickson y Bennett, 1965) 

11
 Introducción 

Respecto a la expresión microbiana de las penicilina acilasas, cabe destacar que no 
existe  un  patrón  fijo,  pudiendo  observar  la  enzima  tanto  intracelular  (en  el  espacio 
periplásmico), como extracelularmente. En este sentido, es más común localizar las PGAs 
en  el  espacio  periplásmico,  y  es  poco  frecuente  su  expresión  extracelular  (Parmar  y  col., 
2000). Respecto a las PVAs, suelen localizarse extracelularmente, aunque también se dan 
casos  de  expresión  intracelular,  como  el  de  la  PVA  de  Bacillus  sphaericus  (Pundle  y 
SivaRaman, 1994). 

2.1 Estructura y biosíntesis 

Pese  a  la  heterogeneidad  que  presentan  las  penicilina  acilasas,  y  las  β‐lactam 
acilasas  en  general,  respecto  a  su  fuente  de  producción  y  su  naturaleza  extra  o 
intracelular, cabe destacar la homogeneidad que presenta su estructura. La gran mayoría 
presenta  un  patrón  común,  ya  que  están  constituidas  por  un  heterodímero,  con  una 
subunidad  pequeña,  α,  con  un  tamaño  que  oscila  alrededor  de  los  20  kDa,  y  una 
subunidad  grande,  β,  con  un  tamaño  alrededor  de  los  60  kDa  (Sudhakaran  y  col.,  1992; 
García y col., 1995). En la Tabla 5 se pueden observar algunos ejemplos. 

 
Tabla 5. Estructura de las β‐lactam acilasas. 

Masa  Masa subunidades 
Enzima  Productor  molecular  (kDa)  referencia 
(kDa)  α  β 
E. coli  85,5  20,5  65,0  (Schumacher y col., 1986) 
PGA  K. citrophila  85,2  23,6  61,6  (Barbero y col., 1986) 
A. viscosus  81,0  24,0  60,0  (Ohashi y col., 1988) 
E. aroideae  62,0  ¿?  ¿?  (Vandamme y Voets, 1975) 
PVA  S. lavendulae  80,0  21,4  59,0  (Torres‐Guzmán, 2004) 
B. sphaericus  140,0  4 x 35,0  (Olsson y col., 1985) 
Pseudomonas sp.  70,0  16,0  54,0  (Matsuda y Komatsu, 1985) 
GLA 
B. laterosporus  70,0  70,0  (Aramori, 1991) 
AMA  P. melanogenum  146,0  2 x 72,0  (Kim y Byun, 1990) 
 

12
Introducción 

Las excepciones a dicho patrón vienen representadas por la PVA de B. sphaericus, 
homotetrámero  cuyas  subunidades  presentan  un  tamaño  de  35  kDa  (Meesschaert  y  col., 
1991; Suresh y col., 1999), la glutaril‐7‐ACA acilasa de B. lateroporus formada por una única 
subunidad de 70 kDa y la ampicilina acilasa (AMA) de P. melanogenum, constituida por un 
homodímero de 72 kDa (Kim y Byun, 1990). 

La  penicilina  acilasa  más  estudiada  es  la  PGA  de  E.  coli  ATCC  1105,  debido 
posiblemente  a  que  es  la  más  utilizada  en  la  industria.  Se  trata  de  un  heterodímero 
compuesto por dos subunidades de 20,5 kDa y 65 kDa respectivamente (Duggleby y col., 
1995). La actividad catalítica reside en la subunidad β, en donde concretamente la serina 
N‐terminal es el aminoácido catalítico, mientras que la subunidad α es responsable de la 
especificidad de sustrato. Se trata de la primera penicilina cuya estructura tridimensional 
se ha conseguido resolver (Figura 4A). 

A    B Asn241 CO NH2 HN Ala69

O
  R C NH R'
O O
H2N
R C NH R' R C
R'
  O O O
H H
O O O
  Ser N H H H Ser N H H
Ser N H
H H H H H H
 

 
Asn241 CO NH2 HN Ala69
O
  R C OH
O O
R C OH H
+ R C O
  O O O H
H H
O O O
  Ser N H H H Ser N H H
Ser N H
H H H H H H
 
 
Figura 4. A, Estructura tridimensional de la penicilina G acilasa de E. coli ATCC 1105 (figura tomada del Protein 
Data Bank, http://www.rcsb.org/pdb/). En rojo las hélices α, en amarillo las láminas β. B, Mecanismo catalítico de 
la PGA de E. coli ATCC1105, ser, serina catalítica (Duggleby y col., 1995). 
 

La PGA de E. coli es sintetizada como una única cadena polipeptídica que sufre un 
procesamiento postraduccional que da lugar a la forma activa (Böck y col., 1983b; Böck y 
col.,  1983a).  La  expresión  del  gen  pac  da  lugar  a  un  único  transcrito  de  93  kDa  (Roa  y 
García, 1999) que contiene las dos subunidades de la proteína madura separadas por un 
péptido espaciador y precedidas por un péptido señal, el cual va a ser el responsable de 

13
 Introducción 

transportar  la  enzima  al  espacio  periplásmico  donde  va  a  tener  lugar  el  procesamiento 
final de la enzima dando lugar a la forma activa (Schumacher y col., 1986; Sizmann y col., 
1990).  La  expresión  de  la  penicilina  G  acilasa  en  E.  coli  por  el  gen  pac  se  encuentra 
fuertemente  regulada.  Por  un  lado,  va  a  estar  afectada  por  factores  ambientales,  como 
temperatura, fuentes de carbono, presencia de fenilacético, etc., que influyen sobre el gen 
regulador  pacR,  cuya  expresión  va  a  reprimir  el  gen  pac  (Yang  y  col.,  1996;  Jiang  y  col., 
1997). Así, altas temperaturas (37 ºC) van a favorecer la expresión de pacR, por lo que no 
se  va  a  producir  expresión  de  PGA  (Dai  y  col.,  2001).  Por  otro  lado,  el  represor  PaaX, 
involucrado en la regulación de los genes implicados en las rutas degradativas del ácido 
fenilacético, parece tener un papel en la regulación de la expresión del gen pac, de manera 
que la presencia de ácido fenilacético reprime la producción de PaaX de forma que este no 
se una a Ppac, promotor del gen pac, dando como resultado la producción de PGA (Galán 
y col., 2004; Kim y col., 2004).  

Otra  forma  de  regulación  de  la  expresión  de  la  PGA  tiene  lugar  durante  el 
procesamiento del transcrito único (pre‐PGA) del gen pac (Sudhakaran y col., 1992), el cual 
transcurre  en  varias  fases  (Figura  5).  En  una  primera  se  produce  la  liberación  de  la  pre‐
PGA  al  espacio  periplásmico,  perdiéndose  entonces  el  péptido  señal.  Posteriormente,  se 
produce  la  liberación  de  la  subunidad  β,  que  se  separa  del  péptido  espaciador  por  su 
extremo  N‐terminal  mediante  la  autoproteólisis  del  enlace  amida  entre  la  Thr263  y  la 
Ser264 (Kasche y col., 1999; Hewitt y col., 2000). Este último aminoácido es el responsable 
de la actividad catalítica de la enzima. Seguidamente el resto del péptido espaciador, que 
permanece unido a la subunidad α es eliminado. Finalmente, se produce el plegamiento y 
unión  de  las  dos  subunidades,  dando  lugar  a  la  enzima  madura.  El  estudio  sobre  la 
expresión en otras penicilina G acilasas ha puesto de manifiesto un proceso similar, como 
ocurre con la PGA de B. megaterium, aunque en este caso el procesamiento es extracelular 
(Martín y col., 1995). 

14
Introducción 

 
 
 

Figura 5. Procesamiento de la PGA de E. coli ATCC11105 (Sizmann y col., 1990). 

15
 Introducción 

2.2 Modo de acción de las penicilina acilasas 

Durante  el  procesamiento  y  maduración  de  la  PGA  de  E.  coli  tiene  lugar  la 
formación  de  un  bolsillo  de  carácter  hidrofóbico  en  el  que  va  a  quedar  situado  el 
aminoácido N‐terminal de la subunidad β de la enzima, la Serβ1 (Hewitt y col., 1999). Esta 
serina es la responsable de la actividad catalítica de la penicilina G acilasa. Los primeros 
mecanismos  propuestos  para  la  hidrólisis  de  la  penicilina  G  eran  similares  a  los 
propuestos para el mecanismo catalítico de las serin‐proteasas, pero hubo que abandonar 
dicha  vía  debido  al  carácter  hidrofóbico  del  bolsillo  que  forma  el  centro  activo  de  la 
enzima.  Este,  está  constituido  por  los  aminoácidos  metionina  (Metα141),  fenilalanina 
(Pheα146),  dos  triptófanos  (Trpβ57  y  Trpβ154)  y  una  isoleucina  (Ileβ177),  formando  una 
cavidad donde se sitúa el radical acilo (fenilacético) de la penicilina. A la entrada de este 
bolsillo  se  encuentran  situados  los  aminoácidos  catalíticos,  Serβ1,  Asnβ241  y  Alaβ69.  En  el 
mecanismo catalítico propuesto, Figura 4B, la Serβ1 ataca el enlace amida entre el 6‐APA y 
el  fenilacético,  formándose  un  intermedio  tetraédrico  que  se  mantiene  estable  gracias  a 
puentes de hidrógeno con la Asnβ241 y Alaβ69. Este intermediario se rompe, liberándose el 
6‐APA, primer producto de la reacción, dando lugar a un intermediario acil‐enzima que 
se  va  a  hidrolizar  por  el  ataque  nucleofílico  de  una  molécula  de  agua,  liberándose 
finalmente el ácido fenilacético, segundo producto de la reacción (Duggleby y col., 1995). 

2.3 Aplicaciones de las penicilina acilasas 

Como  se  ha  comentado  anteriormente,  la  principal  aplicación  industrial  de  las 
penicilina acilasas es la obtención de ácido 6‐aminopenicilánico a partir de las penicilinas 
naturales,  punto  de  partida  en  la  síntesis  de  penicilinas  semisintéticas.  En  una  primera 
etapa los procesos empleados principalmente por la industria para la obtención de 6‐APA 
consisten  en  la  clonación  e  hiperexpresión  de  los  genes  que  codifican  las  enzimas 
penicilina  acilasas.  En  este  sentido,  existen  numerosos  ejemplos  bibliográficos  sobre 
penicilinas G acilasas (Daumy y col., 1986; Ohashi y col., 1988; Verhaert y col., 1997; Chou y 
col.,  2000);  y  sin  embargo,  aquellos  referentes  a  las  penicilina  V  acilasas  son  poco 
frecuentes,  a  excepción  de  la  PVA  de  B.  sphaericus,  que  ha  tomado  cierta  relevancia 
(Olsson  y  col.,  1985).  Una  vez  hiperexpresada  la  penicilina  acilasa,  la  segunda  estrategia 
utilizada por la industria para obtener 6‐APA consiste en la inmovilización de las enzimas 
purificadas o semipurificadas (Braun y col., 1989; Guisán y col., 1990; Bianchi y col., 1996; 
Bianchi  y  col.,  1997;  Chauhan  y  col.,  1998),  o  bien  la  inmovilización  de  las  células 
productoras (Klein y Wagner, 1980; Prabhune y col., 1992; Hsiau y col., 1997; Long y col., 
2000). 

16
Introducción 

Aunque la principal utilización de las penicilina acilasas es la obtención de 6‐APA, 
existen otras posibles aplicaciones de este tipo de enzimas, entre las cuales cabría destacar: 

- Síntesis  de  penicilinas  semisintéticas.  La  reacción  de  hidrólisis  de  las 
penicilinas  por  parte  de  las  penicilina  acilasas  es  una  reacción  bidireccional, 
con  lo  que  la  modificación  y  búsqueda  de  las  condiciones  adecuadas  hace 
posible la síntesis de penicilinas semisintéticas. Así, se ha logrado la síntesis de 
algunas  penicilinas  semisintéticas,  como  la  ampicilina,  la  pivampicilina, 
cefalexina, hidroxipenicilinas, etc. (Cole, 1969; Kasche, 1985; Alonso y col., 1988; 
Fernández‐Lafuente  y  col.,  1991;  Fernández‐Lafuente  y  col.,  1996;  Kim  y  Lee, 
1996; Park y col., 2000; Youshko y Svedas, 2000; Aguirre y col., 2002; Alkema y 
col., 2003). 
 
- Resolución  de  mezclas  racémicas.  Las  penicilina  acilasas  presentan 
estereoespecificidad  por  las  formas  L  de  los  aminoácidos  (Cole,  1964).  Se 
pueden  tratar  los  fenilacetil‐(D,L)‐aminoácidos,  liberando  los  L‐aminoácidos, 
que  pueden  ser  purificados  fácilmente  por  cromatografía.  Finalmente  los  D‐
aminoácidos  pueden  liberarse  por  desacilación  química.  Esta  metodología  ha 
sido utilizada para la obtención de D‐fenilglicina, que puede ser empleada en 
la síntesis de ampicilina o cefalexina (Shewale y col., 1990). 
 
- Acilación y desacilación de compuestos. La capacidad de hidrólisis y síntesis 
de enlaces amida se puede utilizar para la protección de grupos reactivos en la 
síntesis  peptídica  evitando  la  posibilidad  de  que  se  den  reacciones  no 
deseadas, sintetizándose productos como el aspartamo, vasopresina e insulina 
(Fugarti y Grasselli, 1986; Wang y col., 1986; Waldmann, 1988b). Las penicilina 
acilasas también pueden ser empleadas para la protección y desprotección de 
azúcares (Waldmann, 1988a). 
 
- Fabricación  de  biosensores.  En  1998,  se  ha  descrito  la  fabricación  de  un 
biosensor  para  la  penicilina  G  mediante  la  utilización  de  penicilina  G  acilasa 
que es sensible a concentraciones de hasta 0,5 mM de penicilina G (Liu y col., 
1998). 

17
 Introducción 

3. LAS PENICILINA V ACILASAS 

El  85%  del  6‐APA  producido  mundialmente  se  obtiene  mediante  el  empleo  de 
penicilina  G  acilasas  y  el  15%  restante  se  debe  a  la  utilización  de  penicilina  V  acilasas 
(Shewale y Sudhakaran, 1997). Sin embargo, cabe destacar que los procesos de producción 
del ácido 6‐aminopenicilánico basados en el empleo de la hidrólisis de penicilina V como 
sustrato  presentan  una  serie  de  ventajas  en  comparación  con  aquellos  basados  en  la 
utilización de la penicilina G: 

 
1. La penicilina V en solución es más estable que la penicilina G a valores bajos 
de  pH,  lo  que  permite  un  mayor  rendimiento  durante  la  extracción  de  los 
medios de cultivo (Herbach y col., 1984). 
 
2. Las  cepas  productoras  de  penicilina  V  toleran  concentraciones  mayores  de 
ácido fenoxiacético, y su mejora permitiría un rendimiento mayor de penicilina 
V en los caldos de fermentación (Herbach y col., 1984). 
 
3. A  diferencia  de  las  penicilina  G  acilasas,  las  penicilina  V  acilasas  toleran  una 
concentración mayor de penicilina durante su hidrólisis y, por tanto, permiten 
aumentar  la  producción  de  6‐APA  cuyo  rendimiento  puede  llegar  a  ser  del 
99% en el caso de las PVAs (Shewale y Sudhakaran, 1997). 
 
4. El pH óptimo de las penicilina G acilasas suele estar comprendido entre 7,8 y 
8,5 (Shewale y SivaRaman, 1989), mientras que las penicilina V acilasas pueden 
actuar  en  un  intervalo  más  amplio,  entre  5,6  y  8,5  (Shewale  y  Sudhakaran, 
1997).  Esto  va  a  permitir  un  menor  control  de  las  variaciones  de  pH  en  el 
procedimiento de obtención de 6‐APA, con el consiguiente abaratamiento del 
proceso. 

Estas  ventajas  permiten  afirmar  que  una  tecnología  enzimática  basada  en  el 
empleo de las penicilina V acilasas para la obtención de 6‐APA podría ser más interesante 
desde el punto de vista económico que la establecida con las penicilina G acilasas.  

3.1 Características de las penicilina V acilasas 

Como ya se ha indicado anteriormente (Tabla 4), existe una gama muy amplia de 
microorganismos productores de penicilina V acilasas que incluyen tanto bacterias como 
levaduras y hongos. A su vez, la producción de esta enzima puede ser tanto extracelular 
como intracelular (García y col., 1995). A pesar del gran número de PVAs descritas, muy 

18
Introducción 

pocas han sido purificadas, por tanto, la mayoría de los trabajos con estas enzimas se han 
llevado a cabo con extractos crudos o parcialmente purificados. 

Las  masas  moleculares  de  estas  enzimas  presentan  valores  muy  dispares  que 
oscilan  entre  los  58  y  356  kDa,  según  sea  la  fuente  productora.  La  estructura  de  las 
penicilina V acilasas puede ser monomérica como la de Fusarium sp. SKF 235 (Sudhakaran 
y Shewale, 1995), heterodimérica como la de S. lavendulae ATCC 13664 (Torres‐Guzmán, 
2004), o tetramérica, como en el caso de la PVA de B. sphaericus (Olsson y col., 1985; Pundle 
y SivaRaman, 1994; Pundle y SivaRaman, 1997). 

La única PVA de la que se conoce su estructura es la de B. sphaericus, cuyo gen pva 
ha  sido  clonado  y  expresado  en  E.  coli.  Esta  enzima  es  un  tetrámero  formado  por  4 
subunidades polipeptídicas iguales de 35 kDa y su secuencia de aminoácidos no presenta 
homologías  con  respecto  a  la  PGA  de  E.  coli  (Olsson  y  Uhlen,  1986).  No  obstante,  la 
determinación  estructural  de  la  PVA  de  B.  sphaericus  ha  permitido  comprobar  que  su 
residuo  catalítico  se  encuentra  en  el  extremo  N‐terminal  de  la  cadena  polipeptídica 
(Suresh y col., 1999). Se trata, por tanto, de una enzima que pertenece a la superfamilia de 
la Ntn‐hidrolasas al igual que la PGA de E. coli. Estas enzimas se caracterizan la presencia 
de  un  residuo  catalítico  en  el  extremo  N‐terminal,  cuyo  grupo  amino  participa  en  la 
catálisis  enzimática.  En  el  caso  de  la  PVA  de  B.  sphaericus  el  residuo  catalítico  es  una 
cisteína, mientras que en la PGA de E. coli es una serina. 

3.2 La penicilina V acilasa de S. lavendulae 

En 1961 se describió que los caldos de fermentación del actinomiceto S. lavendulae 
ATCC  13664  presentaban  actividad  penicilina  V  acilasa  (Rolinson  y  col.,  1961).  Años 
después se comprobó que S. lavendulae produce una PVA extracelular (Torres y col., 1999).  

La penicilina V acilasa de S. lavendulae ATCC  13664 (SlPVA) en un heterodímero 
αβ,  con  una  subunidad  pequeña,  α,  de  21,4  kDa  y  otra  grande,  β,  de  59  kDa  (Torres‐
Guzmán, 2004). Esta estructura dimérica es muy similar a la que presentan en general las 
enzimas  β‐lactam  acilasas.  Esta  enzima  además  de  hidrolizar  penicilina  V  es  la  única 
descrita hasta el momento capaz de utilizar como sustrato penicilinas naturales alifáticas, 
como la penicilina F, la penicilina dihidroF y la penicilina K, esta última con una elevada 
eficacia  catalítica  (Torres‐Guzmán  y  col.,  2002).  Esta  especificidad  de  sustrato  es  muy 
interesante desde el punto de vista industrial, ya que las penicilinas alifáticas constituyen 
aproximadamente el 2‐3 % de las penicilinas presentes en los caldos de fermentación para 
la  producción  de  penicilina  G  o  penicilina  V,  y  no  pueden  ser  hidrolizadas  por  las 
penicilina  acilasas  usadas  habitualmente,  por  lo  que  se  reduce  el  rendimiento  en  la 
producción de 6‐APA, y por ende, una considerable pérdida económica. 

19
 Introducción 

Los estudios realizados sobre el mecanismo químico de la SlPVA han demostrado 
que  presenta  una  serina  esencial  para  su  actividad.  Además,  el  análisis  de  la  secuencia 
aminoterminal ha puesto de manifiesto que la enzima presenta una serina en el extremo 
N‐terminal  de  la  subunidad  β  (Torres‐Guzmán  y  col.,  2001a).  Asimismo  se  ha  puesto  de 
manifiesto  que  un  grupo  α  amino  es  esencial  para  la  catálisis,  así  como  un  residuo  de 
lisina, que posiblemente esté implicado en la unión del sustrato. Por otro lado, el estudio 
de  su  mecanismo  cinético  ha  permitido  determinar  que  la  enzima  lleva  a  cabo  su 
actividad  mediante  un  mecanismo  ordenado  Uni‐Bi,  en  el  que  durante  la  reacción  se 
libera el 6‐APA como primer producto, lo que implica la formación de un intermedio acil‐
enzima  previo  a  la  liberación  del  segundo  producto,  el  ácido  fenoxiacético  (Torres‐
Guzmán y col., 2001b), al igual que ocurre con la penicilina G acilasa de E. coli o la glutaril‐
7‐ACA de Pseudomonas (Duggleby y col., 1995; Lee y col., 2000). 

Se ha podido observar una potenciación de la actividad de la SlPVA en presencia 
de disolventes orgánicos, algunos de los cuales le aportan cierta estabilidad, así como en 
presencia de alcoholes de cadena corta (Arroyo y col., 1999; Arroyo y col., 2000b; Arroyo y 
col., 2000a; Arroyo y col., 2001). 

Todas  estas características  confieren  a  la  enzima  un  interesante  potencial  para  su 
uso  en  la  industria  farmacéutica  como  biocatalizador  en  la  síntesis  de  penicilinas 
semisintéticas. 

Finalmente,  indicar  que  la  SlPVA  ha  sido  inmovilizada  covalentemente  en 
Eupergit C con buen resultado. Concretamente, la inmovilización de SlPVA en la resina y 
su posterior modificación con albúmina se suero bovino ha permitido la obtención de un 
biocatalizador  denominado  ECPVA,  que  presenta  una  mayor  estabilidad  térmica  que  la 
enzima  en  solución  (hasta  diez  veces  más  a  40  ºC).  Por  otra  parte,  este  biocatalizador 
puede ser utilizado hasta 50 veces en ciclos consecutivos sin pérdida de actividad (Torres‐
Bacete  y  col.,  2000a;  Torres‐Bacete  y  col.,  2000b;  Torres‐Bacete  y  col.,  2001),  datos  que 
apoyan  el  interés  industrial  que  presenta  la  penicilina  V  acilasa  de  S.  lavendulae  ATCC 
13664. 

El análisis de las secuencias de aminoácidos de las subunidades α y β de la SlPVA 
con el programa BLASTP 2.2.8 ha permitido observar que presentan una gran homología 
con la enzima aculeacina A acilasa de Actinoplanes utahensis NRRL 12052, lo que ha hecho 
suponer  que  ambas  enzimas  pudieran  estar  emparentadas  y  presentar  una  actividad 
catalítica similar (Torres‐Guzmán, 2004). 

20
Introducción 

4. LAS EQUINOCANDINAS 

Durante  las  últimas  décadas  se  ha  producido  un  aumento  considerable  en  la 
frecuencia y gravedad de las enfermedades producidas por micosis sistémicas, sobre todo 
debido  al  aumento  de  intervenciones  quirúrgicas  relacionadas  con  los  transplantes  y  al 
incremento  de  enfermedades  inmunosupresoras,  como  el  SIDA.  Los  medicamentos 
disponibles no suelen ser muy eficaces, con tasas de fracaso del 50% en el tratamiento de 
las micosis, y además presentan elevados efectos secundarios no deseados, entre los que 
destaca  su  elevada  toxicidad  hepática  (Carrillo‐Muñoz  y  col.,  2001).  A  tenor  de  todo  lo 
anterior,  la  búsqueda  de  nuevos  medicamentos  antifúgicos  se  presenta  como  un 
importante reto en la actual industria farmacéutica. 

La dificultad del tratamiento de las micosis radica en la naturaleza eucariota de las 
células de los hongos, y por tanto, la búsqueda de tratamientos específicos que no afecten 
a  las  células  del  hospedador  es  difícil.  Los  medicamentos  utilizados  suelen  actuar  bien 
sobre el ergosterol de su membrana, de forma directa como los polienos (anfotericina B), o 
bien  indirectamente  mediante  la  inhibición  de  su  síntesis,  como  los  azoles  (imidazol), 
triazoles  (variconazol),  alilaninas  y  morfolinas.  Otros  medicamentos,  como  la  flucitocina 
actúan  interrumpiendo  la  síntesis  de  proteínas  y  de  ADN,  al  unirse  al  ARN  y  a  la 
timidilato  sintasa  respectivamente.  Un  tercer  tipo  de  medicamento  antifúngico,  como  la 
griseofulvina,  actúa  interrumpiendo  la  síntesis  de  microtúbulos,  aunque  es  poco  eficaz 
(Odds y col., 2003). Sin embargo, estos medicamentos presentan más inconvenientes que 
ventajas  debido  a  su  toxicidad,  su  baja  eficacia  y  la  aparición  de  resistencias  (Groll  y 
Walsh, 2002; Randhawa y Sharma, 2004). 

La  búsqueda  de  nuevas  sustancias  naturales  en  la  lucha  contra  las  micosis  ha 
llevado al descubrimiento de las equinocandinas (Figura 6). Las equinocandinas son una 
clase  de  antibióticos  antifúngicos  muy  activos  frente  a  levaduras  y  hongos  unicelulares, 
mientras que no presentan casi actividad frente a hongos filamentosos (Iwata y col., 1982). 
La  primera  equinocandina  descubierta  fue  la  aculeacina  A,  producida  por  Aspergillus 
aculeatus en caldos de fermentación (Mizuno y col., 1977). 

Su  estructura  está  constituida  por  un  hexapéptido  cíclico  formado  por 
aminoácidos  atípicos,  como  son  dihidroxiornitina,  dihidroxihomotirosina,  3‐hidroxi‐4‐
metilprolina,  treonina  y  4‐hidroxiprolina  (Figura  6)  unidos  a  un  ácido  graso,  el  ácido 
palmítico.  Junto  a  la  aculeacina  A  se  descubrió  que  A.  aculeatus  también  producía  otros 
tipos  de  equinocandinas,  las  aculeacinas  B,  C,  D,  E,  F  y  G  (Satoi  y  col.,  1977). 
Posteriormente  estas  aculeacinas  pasaron  a  denominarse  equinocandinas,  todas  ellas 

21
 Introducción 

comparten  el  ciclohexapéptido  (CHP)  como  núcleo  común,  diferenciándose  básicamente 

por el ácido graso que presentan en posición R1 (Tabla 6). 

 
 
Figura  6.  Estructura  del  núcleo  ciclohexapéptido  básico  de  una  equinocandina,  en  donde  cada 
aminoácido  aparece  representado  con  un  color  diferente.  Como  R1  aparece  el  ácido  graso  unido  al 
ciclohexapéptido a través de un enlace amida. 
 

 
Tabla 6. Tipos de equinocandinas naturales. 

Nombre  R1  R2  R3  R4  R5 

Aculeacina A  Palmítico  OH  OH  CH3  OH 

Equinocandina B  Linoleico  OH  OH  CH3  OH 
Equinocandina C  Linoleico  H  OH  CH3  H 
Equinocandina D  Linoleico  H  H  CH3  H 
A‐30912‐H  Linoleico  OH  OCH3  CH3  OH 
S‐31794 F/I  Mirístico  OH  OH  NH2COCH2  OH 

(10R,12S)‐
Pneumocandina B0  OH  OH  NH2COCH2  OH 
dimetilmirístico 

Las  equinocandinas  son  producidas  principalmente  por  hongos,  destacando  los 

pertenecientes  al  genero  Aspergillus  (Mizuno  y  col.,  1977;  Satoi  y  col.,  1977;  Boeck  y  col., 
1989).  Como  excepciones  destaca  la  Pneumocandina  B0  producida  por  el  hongo  Glarea 
lozoyensis (Leonard y col., 2002), y la WF11899A, producida por Coleomycetes. Esta última 
equinocandina presenta la peculiaridad de llevar un grupo sulfato unido covalentemente 

22
Introducción 

a  la  molécula  de  benceno,  dando  lugar  al  grupo  de  las  sulfo‐equinocandinas,  Figura  7 
(Hino y col., 2001). 

 
 

Figura 7. Estructura de la sulfo‐equinocandina WF11899A. 

Las  equinocandinas  presentan  efecto  antibiótico  frente  a  levaduras  y  hongos, 

concretamente  destaca  su  capacidad  antibiótica  frente  a  diferentes  cepas  de  Candida, 
Pneumicistis  y  Aspergillus.  Por  otro  lado,  no  tienen  efecto  frente  a  hongos  que  presentan 
dimorfismos y/o forman formas miceliares, como Fusarium y Cryptococcus (Denning, 2003). 
Su mecanismo de acción parece que se lleva a cabo mediante la inhibición no competitiva 
de  la  enzima  β‐1,3‐glucano  sintetasa,  responsable  de  la  síntesis  de  β‐glucano  a  partir  de 
UDP‐glucosa (Sawistowska‐Schroder y col., 1984; Wood y col., 1998) e imprescindible para 
la formación de la pared celular de las levaduras. Este efecto inhibitorio se ha observado 
en estudios realizados sobre el efecto de la aculeacina A en Saccharomyces cerevisiae en fase 
de  crecimiento  (Mizoguchi  y  col.,  1977),  aunque  paradójicamente  sólo  es  eficaz  a  bajas 
concentraciones y no presenta efecto a altas concentraciones (Yamaguchi y col., 1982). 

Aunque  las  equinocandinas  parecen  ser  unos  buenos  candidatos  para  el 
tratamiento  de  enfermedades  provocadas  por  hongos,  su  uso  no  está  muy  extendido  y 
solamente la caspofungina y la micafungina son comerciales (Figura 8). La caspofungina 
es  un  derivado  semisintético  de  la  pneumocandina  B0,  obtenido  por  métodos  químicos 
(Leonard  y  col.,  2002),  al  igual  que  la  micafungina,  derivada  de  la  sulfo‐equinocandina 
WF11899A  (Hino  y  col.,  2001).  El  escaso  uso  terapéutico  de  este  tipo  de  antibióticos  se 
debe a que son unos fármacos relativamente recientes y todavía no se han completado sus 
ensayos  clínicos  (Denning,  2003).  Además,  presentan  una  muy  baja  solubilidad  en 

23
 Introducción 

soluciones  acuosas  (Roush  y  col.,  1998),  lo  que  dificulta  su  administración  a  pacientes,  y 
sólo puede administrarse por vía parental (Denning, 1997; Denning, 2003). 

La  búsqueda  de  nuevas  equinocandinas  es  necesaria,  no  sólo  para  mejorar  las 
características farmacológicas de las  ya existentes, sino para incrementar su espectro de 
acción.  Por  un  lado,  esta  búsqueda  se  centra  en  la  identificación  de  nuevos 
microorganismos productores de variedades distintas, y por otro lado, se puede recurrir a 
la  síntesis  y  producción  de  derivados  semisintéticos  de  las  equinocandinas  naturales 
(Figura  8).  De  esta  manera,  se  han  obtenido  la  cilofungina  y  la  anidulafungina, 
equinocandinas  semisintéticas  derivadas  de  la  equinocandina  B  (Boeck  y  col.,  1989; 
Debono y col., 1989; Denning, 1997; Kreuzman y col., 2000), la caspofungina, derivada de la 
pneumocandina  B0  (Leonard  y  col.,  2002),  y  la  micafungina  (FK463),  derivada  de  la 
WF11899A (Hino y col., 2001). De todas ellas sólo la caspofungina y la micafungina se han 
comercializado y han resultado eficaces en el tratamiento de enfermedades micóticas. Por 
el  contrario,  la  cilofungina  nunca  pasó  las  pruebas  necesarias  para  su  utilización  en 
terapéutica (Denning, 2003). 

 
A B
 

  C
 

 
D
 

 
 
 
Figura 8. Equinocandinas semisintéticas. En rojo aparecen las modificaciones respecto de las equinocandinas 
naturales. A, caspofungina, derivada de la pneumocandina B0. B, cilofungina, derivada de la equinocandina 
B. C, anidulafungina, derivada de la equinocandina B. D, micafungina, derivada de WF11899A. 

24
Introducción 

Para  la  obtención  de  las  equinocandinas  semisintéticas  actuales,  los  métodos 
empleados son básicamente químicos de ahí que la implantación de un sistema basado en 
el  uso  de  enzimas  se  supone  que  abaratará,  y  optimizará,  los  procesos.  Un  avance 
importante  en  este  sentido  ha  sido  el  descubrimiento  de  las  enzimas  aculeacina  acilasas 
(equinocandina  acilasas  o  ciclolipopéptido  acilasas,  EC.3.5.1.70).  Estas  enzimas  catalizan 
la  hidrólisis  del  enlace  amida  que  une  el  radical  acilo  con  el  núcleo  ciclohexapéptido 
(CHP). Esta hidrólisis permite obtener CHP libre, que va a servir de punto de partida para 
la obtención de nuevos antibióticos. Como ejemplo, la hidrólisis de equinocandina B por 
medio de la enzima equinocandina B acilasa de A. utahensis  ha permitido la liberación del 
núcleo  CHP  para  su  posterior  modificación  mediante  la  acilación  química  con  un  ácido 
graso, obteniéndose así la equinocandina semisintética cilofungina, Figura 8 (Boeck y col., 
1989; Debono y col., 1989; Kreuzman y col., 2000). 

5. LAS EQUINOCANDINA ACILASAS 

En  1989  se  describió  la  primera  actividad  equinocandina  acilasa  en  caldos  de 
fermentación  del  actinomiceto  A.  utahensis.  En  concreto,  se  observó  que  la  adición  de 
equinocandina  B  a  los  caldos  de  fermentación  de  dicha  bacteria  permitía  la  desacilación 
del  ácido  graso  de  la  equinocandina  obteniéndose  CHP,  que  podía  utilizarse  para  la 
obtención  de  equinocandinas  semisintéticas  (Boeck  y  col.,  1989;  Debono  y  col.,  1989).  Ese 
mismo año se caracterizó la primera equinocandina acilasa, la aculeacina A acilasa (AAC), 
producida por el mismo actinomiceto, A. utahensis (Takeshima y col., 1989). La AAC va a 
eliminar el ácido palmítico de la aculeacina A produciendo la liberación de CHP (Figura 
9). 

 
HO OH
  O HO OH
HO
N O
H3C HO
NH CO (CH2) 14CH3 H3C N
  O NH2
N
O aculeacina A acilasa
H3C O
N CH3 N
H3C O
N CH3
 
HO HO N
O OH
HO HO N
O OH
N O
NH O
  N
NH
OH
HO OH O OH
  HO OH O
HOOC (CH2)14CH3
aculeacina A
ácido palmítico núcleo ciclo-hexapéptido
 
Figura 9. Reacción de hidrólisis de la aculeacina A por la aculeacina A acilasa de A. utahensis. 

25
 Introducción 

En el año 2000, se descubrió que la hidrólisis de equinocandina B observada años 
antes  en  los  caldos  de  fermentación  de  A.  utahensis  se  debía  a  la  presencia  de  una 
equinocandina  B  acilasa  en  la  membrana  del  actinomiceto  (Kreuzman  y  col.,  2000). 
Aunque  los  autores  la  describen  como  una  enzima  distinta  de  la  AAC,  el  análisis  de  su 
secuencia  parece  indicar  que  podría  tratarse  de  la  misma  enzima  que,  posiblemente  por 
un incorrecto plegamiento, queda inserta en la membrana sin liberarse al exterior. 

Hasta el momento no existen muchos estudios sobre este tipo de enzimas, sólo se 
han identificado un número reducido (Tabla 7), y por tanto, no hay mucha información al 
respecto. 

Las equinocandina acilasas son heterodímeros, formados por dos subunidades, α y 
β,  que  al  igual  que  las  penicilina  acilasas  y  las  glutaril  7‐ACA  acilasas  son  expresadas 
como  pre‐enzimas,  presentando  todas  en  su  secuencia  un  péptido  señal  y  un  péptido 
espaciador  entre  las  subunidades  α  y  β.  Por  tanto,  se  supone  que  las  equinocandina 
acilasas van a sufrir un procesamiento similar al que se da en las β‐lactam acilasas (Figura 
5). 

 
Tabla 7. Fuentes biológicas de las equinocandina acilasas. 

Tipo de enzima  Microorganismo productor  Referencias 

Actinoplanes utahensis  (Takeshima y col., 1989) 
Shewanella oneidensis  (Heidelberg y col., 2002) 
Aculeacina A acilasa 
Deinococcus radiodurans R1  (White y col., 1999) 
Ralstonia solanaceum  (Salanoubat y col., 2002) 
Equinocandina B acilasa  Actinoplanes utahensis  (Kreuzman y col., 2000) 
Verticillium sp.  (Ueda y col., 1997a) 
Ciclolipopéptido acilasa 
Streptomyces anulatus  (Ueda y col., 1997b) 
 

5.1 La aculeacina A acilasa de A. utahensis 

La aculeacina A acilasa del actinomiceto A. utahensis NRRL 12052 (AuAAC) es una 
enzima extracelular que cataliza la hidrólisis de la aculeacina A liberando el CHP y ácido 
palmítico,  Figura  9  (Takeshima  y  col.,  1989).  La  enzima  es  un  heterodímero  αβ,  con  una 
subunidad pequeña, α, de 19 kDa, y una grande, β, de 55 kDa. Es sintetizada como una 
pre‐enzima  que,  al  igual  que  las  β‐lactam  acilasas,  posee  un  péptido  señal  y  un  péptido 
espaciador  entre  las  subunidades  α  y  β  y  cuyo  procesamiento  da  lugar  a  la  proteína 

26
Introducción 

madura. Hay que destacar que la enzima presenta una serina en el extremo N‐terminal de 
la subunidad β, que posiblemente sea el residuo catalítico (Inokoshi y col., 1992). 

Aunque  el  gen  aac  que  codifica  la  AuAAC  ya  ha  sido  clonado  y  expresado  en 
Streptomyces  (Inokoshi  y  col.,  1993),  no  existen  estudios  posteriores  sobre  esta  enzima. 
Como en el resto de equinocandina acilasas descritas hasta el momento se ha observado 
que las secuencias, tanto de las enzimas maduras como de las pre‐enzimas, presentan una 
elevada identidad con las β‐lactam acilasas, en concreto con las glutaril‐7‐ACA acilasas de 
Pseudomonas  (Inokoshi  y  col.,  1992;  Kreuzman  y  col.,  2000;  Shibata  y  col.,  2000).  A  este 
respecto,  cabe  destacar  que  en  las  equinocandina  acilasas  y  las  glutaril‐7‐ACA  acilasas 
inmaduras se encuentran muy conservados los aminoácidos serina en la posición 1 de la 
subunidad  β  y  glicina  en  la  posición  anterior  (motivo  Glyβ‐1‐Serβ1),  mientras  que  en  la 
PGA  se  ha  observado  que  la  posición  a  la  Serβ1  el  residuo  que  aparece  es  una  treonina. 
Parece  ser  que  estos  motivos  son  los  responsable  de  la  autoproteólisis  que  da  lugar 
durante  el  procesamiento  de  la  enzima  a  la  separación  de  la  subunidad  β  del  péptido 
espaciador (Inokoshi y col., 1992; Hewitt y col., 2000; Kim y col., 2002), Figura 10. 

Destaca  también  las  secuencias  altamente  conservadas  GxPHI  en  la  subunidad  α 
de  todas  las  acilasas,  y  la  LLxNPHF  en  la  subunidad  β.  Como  se  puede  observar,  en  la 
penicilina G acilasa de E. coli, esta última secuencia corresponde a MVNGPQF, la cual es 
diferente  a  la  presente  en  equinocandina  acilasas  y  glutaril‐7‐ACA  acilasas,  aunque  se 
conserva la naturaleza de los aminoácidos. Este último motivo aparece también en la PGA 
de K. citrophila y A. viscosus (Sudhakaran y col., 1992). 

 
 

 
Figura 10. Comparación parcial de las secuencias de proteínas de las AAC de A. utahensis (AuAAC), de R. 
solanaceum (RsAAC), de D. radiodurans (DrAAC), glutaril 7‐ACA acilasa de Pseudomonas sp. (SpG7ACA) y 
PGA  de  E.  coli  (EcPGA).  (*)  Aminoácido  idéntico,  (:)  sustitución  conservativa,  (.)  sustitución 
semiconservativa,  sp:  péptido  señal,  spa:  péptido  espaciador,  UDspa:  péptido  espaciador  de  tamaño  no 
determinado. En recuadros rojos se marcan los motivos estructurales conservados (Lin y col., 2003). 

27
 

 
 

OBJETIVOS

29
 
Objetivos 

La  penicilina  V  acilasa  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  (SlPVA)  en  una  enzima 
ampliamente estudiada y presenta unas características que la convierte en una importante 
herramienta como biocatalizador en la industria farmacéutica. Sin embargo, a la hora de 
su aplicación industrial la SlPVA presenta una limitación muy importante en cuanto a su 
producción  a  partir  del  microorganismo  parental,  lo  que  lleva  implícito  un  bajo 
rendimiento  en  la  obtención  de  la  enzima,  además  de  requerir  procesos  fermentativos  y 
de purificación costosos y largos. 

Con  el  fin  de  aumentar  la  producción  de  SlPVA  con  vistas  a  su  utilización 
industrial, y a la vez profundizar en el conocimiento de la enzima SlPVA y el gen pva que 
la codifica, se han establecido los siguientes objetivos: 

1. Clonación y secuenciación el gen pva que codifica la penicilina V acilasa de S. 
lavendulae ATCC 13664 y así poner de manifiesto la estructura del mismo con 
vistas a posteriores estudios de expresión. 
2. Clonación  y  expresión  el  gen  pva  en  organismos  heterólogos  con  el  fin  de 
lograr niveles de expresión que permitan la aplicación industrial de SlPVA. En 
paralelo,  el  estudio  de  las  condiciones  óptimas  de  fermentación  para  la 
producción de la enzima por el microorganismo recombinante. 
3. Diseño  de  un  método  sencillo  de  purificación  de  la  enzima  producida  por  el 
microorganismo recombinante que permita su aplicación industrial a partir de 
los caldos de fermentación. 
4. Caracterización  funcional  de  SlPVA  producida  por  el  microorganismo 
recombinante  con  el  fin  de  determinar  que  la  enzima  recombinante  conserva 
las propiedades de la SlPVA parental: 
‐ Estabilidad y actividad frente a pH. 
‐ Estabilidad y actividad frente a temperatura. 
‐ Actividad frente a la fuerza iónica. 
‐ Especificidad  de  sustrato.  Determinación  de  los  parámetros  cinéticos 
frente a las penicilinas naturales (V, G, K, F y dihidroF). 
5. Caracterización  estructural  de  SlPVA  producida  por  el  microorganismo 
recombinante: 
‐ Espectro de absorbancia UV‐visible. 
‐ Espectro de fluorescencia. 
‐ Dicroísmo circular. Predicción de la estructura secundaria. 

La consecución de los objetivos anteriores y la resolución de la estructura primaria 
de  SlPVA  han  puesto  de  manifiesto  la  existencia  de  una  elevada  similitud  de  secuencia 
entre  ésta  y  la  aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL  12052  (AuAAC),  enzima 
implicada en la hidrólisis de equinocandina A, antifúngico natural. Esta semejanza entre 

31
 Objetivos 

ambas enzimas ha planteado abordar el estudio de la AuAAC con vistas a su utilización 
industrial como biocatalizador en la hidrólisis de penicilinas naturales y obtención de 6‐
APA. 

El gen aac que codifica la AuAAC ha sido clonado y expresado en Streptomyces sp. 
(Inokoshi  y  col.,  1993),  asimismo,  la  AuAAc  ha  sido  aislada  y  caracterizada  como 
biocatalizador  en  reacciones  de  hidrólisis  de  aculeacina  A  (Takeshima  y  col.,  1989).  A 
pesar de ello se conoce muy poco acerca de las propiedades de esta enzima, como puede 
ser  su  cinética,  centro  activo,  mecanismo  de  acción,  condiciones  óptimas  de  actividad  o 
especificidad  de  sustrato,  datos  todos  ellos  muy  interesantes  con  vistas  a  su  utilización 
industrial en biorreactores enzimáticos. 

Por ello, y con el fin de aumentar la producción de AuAAC, así como profundizar 
en los conocimientos sobre la AuAAC, y el gen aac que la codifica se han establecido los 
siguientes objetivos: 

6. Clonación y secuenciación y expresión en organismos heterólogos del gen aac 
que  codifica  la  aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL  12052  con  el  fin  de 
lograr niveles de expresión que permitan la aplicación industrial de AuAAC. 
7. Diseño de un método sencillo de purificación de AuAAC a partir de los caldos 
de fermentación del microorganismo recombinante que permita su aplicación 
industrial. 
8. Caracterización  funcional  de  la  enzima  AuAAC  recombinante  con  el  fin  de 
utilizarla  como  biocatalizador  en  las  reacciones  de  hidrólisis  de  penicilinas 
naturales: 
‐ Estabilidad y actividad frente a pH. 
‐ Estabilidad y actividad frente a temperatura. 
‐ Actividad frente a la fuerza iónica. 
‐ Especificidad  de  sustrato.  Determinación  de  los  parámetros  cinéticos 
frente a las penicilinas naturales (V, G, K, F y dihidroF). 
9. Caracterización estructural de la enzima AuAAC recombinante. 
‐ Espectro de absorbancia UV‐visible. 
‐ Espectro de fluorescencia. 
‐ Dicroísmo circular. Predicción de la estructura secundaria.  

32
 

MATERIALES Y MÉTODOS
 

33
Materiales y Métodos 

1. REACTIVOS 

Los  disolventes  empleados  en  la  realización  del  trabajo,  como  el  2‐propanol, 
etanol,  metanol,  dimetilsulfóxido  (DMSO)  y  el  glicerol,  así  como  las  sales  utilizadas,  el 
dodecil‐sulfatosódico (SDS), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), azul de bromofenol 
y el cloruro de guanidinio fueron de Merk (Alemania). La peptona de soja, el extracto de 
levadura y la agarosa (D1 Media EEO) fueron de Pronadisa (España). La Bacto‐peptona, el 
Bacto‐Agar,  la  Bacto‐triptona  y  los  casaminoácidos  fueron  de  Difco  (España).  La 
ampicilina,  el  cloranfenicol,  la  tioestreptona,  la  penicilina  V  y  la  penicilina  G  fueron  de 
Sigma‐Aldrich  (USA),  al  igual  que  la  fluorescamina  (fluram),  p‐dimetil‐
aminobenzaldehido  (PDAB),  la  albúmina  de  suero  bovino  (BSA,  fracción  V),  el  tris‐
(hidroximetil)‐aminometano  (Tris‐HCl),  el  β‐mercaptoetanol,  la  diaminobencidina,  el 
bromuro  de  etidio,  el  isopropil‐β‐D‐tiogalactopiranósido  (IPTG),  el  polietilenglicol  1000 
(PEG‐1000), la sacarosa, el ácido tris(hidroximetil)metil‐2‐aminometanosulfónico (TES). La 
leche  en  polvo  fue  de  Puleva  (España).  La  leche  desnatada  fue  de  Pascual  (España).  La 
harina de soja de El Granero (España). Las resinas y geles cromatográficos, así como los 
patrones  de  electroforesis  de  proteínas  de  masa  molecular  conocida,  tanto  preteñidos 
como sin preteñir, fueron de Amersham‐Pharmacia (Suecia). El reactivo para la valoración 
de proteínas (Protein Reagent, reactivo de Bradford) y las membranas de nitrocelulosa y 
de  PVDF  fueron  de  Bio‐Rad  (USA).  La  prolina,  la  tiamina  y  el  manitol  fueron 
suministrados  por  Fluka  (Suiza).  El  X‐gal  fue  de  Boehringer  Mannheim  (Alemania).  La 
lisozima  fue  suministrada  por  Quantum  Appligene  (Francia).  El  fenol  fue  suministrado 
por Iberlabo (España). El ácido 6‐aminocefalosporánico (6‐APA), las penicilinas naturales 
alifáticas  (penicilina  K,  F  y  dihidroF)  así  como  la  fenoxiacetil‐L‐leucina  fueron 
proporcionados  por  Antibióticos  S.A.  (León).  El  inmunoconjugado  de  cabra  anti‐conejo 
GAR/IgG (H + L)/Po fue de Nordic Immunology (Holanda). Los ácidos y bases utilizados 
fueron de Scharlau (España).  

La  enzima  TaqADN  polimerasa,  las  enzimas  de  restricción  (salvo  BstAPI)  y  la 
ADNsa  I  (RNasa‐free),  fueron  suministrados  por  Roche  (Alemania).  La  enzima  PfuADN 
polimerasa fue de Promega (USA). La enzima de restricción BstAPI fue de New England 
BioLabs  (Inglaterra).  La  enzima  T4  ADN  ligasa  fue  de  USB  (USA).  La  RNasa  A  fue  de 
Sigma‐Aldrich  (USA).  El  marcador  de  tamaño  para  las  electroforesis  de  ADN,  Lambda 
ADN/BstEII fue de MBI Fermentas (Alemania). 

35
 Materiales y Métodos 

2. MICROORGANISMOS Y PLÁSMIDOS 

Para el desarrollo del presente trabajo ha sido necesario el empleo de varios tipos 
de  microorganismos  (Tabla  8)  que  han  servido  tanto  de  donadores  de  material  genético 
como de aceptores, para lo cual han sido utilizados un cierto número de vectores (Tabla 
9). 

 
Tabla 8. Microorganismos utilizados. 

Características genotípicas o 
Microorganismo  Referencia/Fuente 
fenotípicas destacables 

Escherichia sp. 

F‐ φ80dlacZ∆M15 endA1 recA1 hsdR17 
Escherichia coli DH5α  (rk‐mK+) supE44 thi‐1 gyrA96 relA1  (Hanahan, 1983) 
∆(lacZYA‐argF)U169 λ‐ 
F‐ thi‐1 hsdS20 (rB‐mB‐) recA13 ara‐14 
Escherichia coli HB101  leuB6 proA2 lacY1 galK2 rpsL20 (strr)  (Sambrook y col., 1989) 
xyl‐5 mtl‐1 supE44 λ‐ 

Escherichia coli BL21 (DE3)  F‐ ompT hsdSB (rB‐mB‐) gal dcm (DE3)  INVITROGEN 

F‐ e14‐(McrA‐) hsdR514 (rK‐mK+) supE44 
Escherichia coli LE392  supF58 lacY1 galK2 galT22 metB1  PROMEGA 
trpR55 

Escherichia coli MN538  supF hsdR rk‐  PROMEGA 

Actinomicetos 
Streptomyces lavendulae  (Batchelor y col., 1961; 
Productor de penicilina V acilasa 
ATCC13664  Torres y col., 1999) 
Actinoplanes utahensis 
Productor de aculeacina A acilasa  (Takeshima y col., 1989) 
NRRL12052 

Streptomyces lividans 1326  tsrS  Antibióticos S.A. 

Bacteriófagos 

λ‐GEM12    PROMEGA 

 
 
 
 
 
 

36
Materiales y Métodos 

Tabla 9. Vectores utilizados. 

Plásmido  Características  Referencia 

Para E. coli 

pUC18  ApR lacZ tamaño: 2,6kb  (Vieira y Messing, 1982) 

f1Ori ApR lacZ T3p T7p 
pBluescript II KS (+)  STRATAGENE 
tamaño: 2,9kb 

Lineal, T en los extremos ApR 
pGEM‐T Easy Vector  f1Ori lacZ T3p T7p tamaño:  PROMEGA 
3kb 

ApR lacI IppP lacPO tamaño: 
pIN‐III‐A3  (Inouye y Inouye, 1985) 
4,4kb 

ApR lacI IppP lacPO ompA 
pIN‐III‐ompA3  (Ghrayeb y col., 1984) 
tamaño: 7,5kb 

KanR f1Ori T7p lacI tamaño: 
pET28 a(+)  NOVAGEN 
5,3kb 

Bifuncionales E. coli/Streptomyces 

(Larson y Hershberger, 1986), 
ApR tsrR pUCOri SCP2Ori 
pHJL401  proporcionado por Antibióticos 
lacZ tamaño: 5,9kb 
S.A. (León) 

(Quiros y col., 1998), 
ApR tsrR PermE* pUCOri  proporcionado por el Dr. José 
pEM4 
pWHM4Ori tamaño: 7,9kb  Antonio Salas (Universidad de 
Oviedo) 
 

3. OLIGONUCLEÓTIDOS SINTÉTICOS 

Los  oligonucleótidos  utilizados  fueron  sintetizados  por  el  servicio  de  síntesis  de 
oligonucleótidos del Centro de Investigaciones Biológicas (C.I.B.) del Consejo Superior de 
Investigaciones  Científicas  (C.S.I.C.).  En  la  Tabla  10  se  muestran  los  utilizados  en  los 
estudios  llevados  a  cabo  sobre  el  gen  pva  que  codifica  la  penicilina  V  acilasa  de  S. 
lavendulae  ATCC  13664  (SlPVA).  En  la  Tabla  11  los  utilizados  en  los  estudios  con  el  gen 
aac,  que  codifica  la  aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL  12052  (AuAAC).  Y  en  la 
Tabla 12 el resto de oligonucleótidos utilizados. 

37
 Materiales y Métodos 

Tabla 10. Oligonucleótidos utilizados en los estudios con el gen pva. 

NOMBRE  SECUENCIA  Tm 

STREPTOP1  5´‐GGAGGAGGACT(C/G)TCCGC(C/G)AC(C/G)GT‐3´  79±1 

STREPTOP2  5´‐CCGGAATTCAC(C/G)GAGGC(C/G)GGCATCCC(G/C)CA‐3´  98±3 
STREPTOD  5´‐(C/G)GGGCCGTA(C/G)CG(C/G)GTCCACCA‐3´  74±2 
STREPTOD2  5´‐CCGGAATTC(C/G)GGGCCGTA(C/G)CG(C/G)GTCCACCACTG‐3´  102±3 
STREPTOG1  5´‐CCGGAATTCCG(C/G)GGCCT(C/G)CT(C/G)CT(C/G)GGCAACCC(C/G)CA‐3´  120±3 
STREPTOG3  5´‐CCGGAATTCGCC(C/G)CGGAA(C/G)GC(C/G)AC(C/G)GCGTT‐3´  104±5 
N  5´‐CGAACCCGTCGGCCAGCGTGCACA‐3´  81 
N1  5´‐AGAGGGAGAAGTCCGGGGCCGCGTC‐3´  88 
C  5´‐GGCCGATCCCACGGTCTATCTGGT‐3´  77 
N3  5´‐ATCACGTCATGACCGGTGTA‐3´  60 
NsacII  5´‐CCGGAATTCCCGCGGTGGAGACCGCCGCGT‐3  106 
CsacII  5´‐CCGGAATTCCCGCGGGCACCGCCGCCGCC‐3´  110 
FcβD2  5´‐AGCCGGGGCGCGCTGCTCTT‐3´  67 
FcβI2  5´‐AGGCCGCCGACACGT(C/T)(G/A)AC‐3´  66±1 
PVA‐1  5´‐TCTAGAGGGTATTAATAATGACCTTCCGTAACCGCCTCAGACTG‐3´  129 
PVA‐2  5´‐CCGGAATTCCAGGCGGCGGCCTCTCGGCCACCGTG‐3´  124 
PVA‐F  5´‐CCGGAATTCCCTACCGCCGCTCGTGCACCCG‐3´  108 
NCsac3  5´‐CTGCCACCCGCCGCAGCCTCC‐3´  78 
NCsac4  5´‐GCCGCCAGCTCGTCCGTGATCC‐3´  77 
PVAstop  5´‐CAACAGCCGGTGCCCGGTGG‐3´  70 
NCsacI  5´‐GCCGCCGGGTACAACGCCTGGC‐3´  68 
En  verde  se  indican  las  dianas  para  enzimas  de  restricción.  En  azul  se  indican  las  secuencias  que  para  los 
sitios de unión al ribosoma (RBS). En rojo se indican los codones de inicio de la traducción. En naranja los 
codones STOP. 
 

Tabla 11. Oligonucleótidos utilizados en los estudios con el gen aac. 

NOMBRE  SECUENCIA  Tm 

AAC‐1  5´‐TCTAGAGGGTATTAATAATGACGTCCTCGTCAGCGCCTGAAA‐3´  126 

AAC‐2  5´‐CCGGAATTCCTCAGCGTCCCCGCTGTGCCAG‐3´  104 

AAC‐4  5´‐GTCGCCGCGACGCCACCGACAGCC‐3´  90 

AAC‐5  5´‐CACCTTCGACTGGACGCCGGC‐3´  73 

AAC‐6  5´‐CGTCGCGGACGAGTTCGGCGCCG‐3´  86 

AACct  5´‐TCGTGCCGGGCGTGGGATACCCGC‐3´  80 

AACnt  5´‐GCTCACCGTTGGCCGTCACCACGCTCTCGGC‐3´  89 

En  verde  se  indican  las  dianas  para  enzimas  de  restricción.  En  azul  se  indican  las  secuencias  que  para  los 
sitios de unión al ribosoma (RBS). En rojo se indican los codones de inicio de la transcripción. En naranja los 
codones STOP. 

38
Materiales y Métodos 

 
Tabla 12. Otros oligonucleótidos. 

NOMBRE  SECUENCIA  Tm 

63f  5´‐CAGGCCTAACACATGCAAGTC‐3´  64 

1387r  5´‐GGGCGGGTGTACAAGGC‐3´  58 
pEM4‐5  5´‐CTGACCGACGCGGTCCACACGTGCACCGC‐3´  90 
pEM4‐3  5´‐GTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGC‐3´  78 
T3p  5´‐ATTAACCCTCACTAAAGGGA‐3´  56 
T7p  5´‐TAATACGACTCACTATAGGG‐3´  53 

4. MEDIOS DE CULTIVO 

Para el desarrollo del trabajo experimental han sido empleados gran variedad 
de medios de cultivo. Para los cultivos de las distintas cepas de E. coli se han utilizado 
los medios: 

- LB  (Luria‐Bertani),  constituido  por  Triptona  (10  g/l),  extracto  de  levadura  (5 
g/l) y NaCl (5 g/l) a pH 7,5, y que en el caso de cultivos en medio sólido 
se le añadió un 2% de Agar (Sambrook y col., 1989). 
- En el caso particular de las pruebas de expresión en E. coli HB101 se utilizó 
medio  mínimo  M63,  constituido  por  KH2PO4  (0,1  M),  NH4Cl  (20  M), 
MgSO4  (1  mM)  y  FeCl3  1  µM  a  pH  7.  Suplementado  con  tiamina  (2 
µg/ml), glucosa (0,2%), SO4Mg (2 µg/ml) y L‐prolina (5 µg/ml) (Sambrook 
y col., 1989). 
- Las  cepas  de  E.  coli  LE392  y  MN538,  portadoras  de  los  bacteriófagos 
recombinantes,  fueron  crecidas  en  medio  NZCYM,  constituido  por  NZ 
amina (10 g/l), NaCl (5 g/l), extracto de levadura (5 g/l), casaminoácidos 
(1  g/l)  y  MgSO4∙7H2O  (2  g/l),  suplementado  con  maltosa  (0,2%) 
(Sambrook y col., 1989). 

Para el cultivo de los actinomicetos se utilizaron los siguientes medios: 

- Para el crecimiento en medio líquido con el fin de extraer ácidos nucleicos  u 
obtener  protoplastos  se  utilizó  el  medio  YEME  (Yeast  Extract  Malt 
Extract), compuesto por extracto de levadura (3 g/l), bacto‐peptona (5 g/l), 
extracto de malta (3 g/l), glucosa (10 g/l), sacarosa (340 g/l) y MgCl2∙6H2O 
(5 mM) suplementado con glicina (0,5%) (Kieser y col., 2000). 

39
 Materiales y Métodos 

- Para el crecimiento en medio sólido con el fin de obtener esporas se utilizó el 
medio  manitol‐harina  de  soja,  denominado  SFM  (Mannitol  Soya  Flour 
Agar),  compuesto  por  manitol  (20  g/l),  harina  de  soja  (20  g/l)  y  agar  (20 
g/l) (Kieser y col., 2000). 
- Para  el  crecimiento  de  protoplastos  transformados  y  la  selección  de  los 
mismos  se  utilizó  el  medio  R5,  cuya  composición  es:  sacarosa  (103  g/l), 
K2SO4 (0,25 g/l), MgCl2∙6H2O (10,12 g/l), glucosa (10 g/l), casaminoácidos 
(0,1 g/l), extracto de levadura (5 g/l), tampón TES (5,73 g/l) y solución de 
oligoelementos (5 g/l). El medio se autoclavó en volúmenes de 100 ml a 
los  que  se  añadió  2,2  g  de  agar,  y  antes  de  verter  en  las  placas  se  le 
añadió,  en  el  orden  indicado,  KH2PO4  0,5%  (1  ml),  CaCl2∙2H2O  5  M  (0,4 
ml), L‐prolina al 20% (1,5 ml) y NaOH 1 N (0,7 ml) (Kieser y col., 2000). 

La  solución  de  oligoelementos  está  constituida  por  ZnCl2  (40  mg/l), 
FeCl3∙6H2O  (200  mg/l),  CuCl2∙2H2O  (10  mg/l),  MnCl2∙4H2O  (10  mg/l), 
Na2B4O7∙10H2O (10 mg/l) y (NH4)6Mo7O24∙4H2O (10 mg/l). 
- Para los estudios de expresión se utilizaron los medios: 

• TSB  (Tryptone  Soya  Broth),  constituido  por  bacto‐triptona  (17  g/l), 

peptona de soja (3 g/l), glucosa (2,5 g/l), K2HPO4 (2,5 g/l), NaCl (5 g/l) 
y pH 7,3 (Kieser y col., 2000). 
• TSB  sin  glucosa  (TSBw/oG),  igual  que  el  anterior,  pero  sin  añadir 
glucosa. 
• Medio  ELO  (Extracto  de  Levadura‐Oligoelementos)  compuesto  por 
extracto  de  levadura  (25  g/l)  y  CuSO4∙5H2O  (1,25%)  (Torres‐Bacete  y 
col., 2005). 
• Medio Leche desnatada (Torres y col., 1999). 

- Para  la  producción  de  AuAAC  por  A.  utahensis  NRRL  12052  se  utilizó  un 
medio  compuesto  por  sacarosa  (3  g/l),  peptona  (0,5  g/l),  KCl  al  0,05%, 
K2HPO4 al 0,1%, MgSO4∙7H2O al 0,05% y FeSO4∙7H2O al 0,0002% y pH 6,5 
(Takeshima y col., 1989). 

La concentración de antibióticos requerida en los medios de cultivo, cuando ha 
sido  necesario  añadirlos,  fue  de  ampicilina  (Ap)  100  µg/ml,  kanamicina  (Kn)  de  50 
µg/ml, cloranfenicol (Cm) de 30 µg/ml y tioestreptona (Tsr) 5 µg/ml. 

Los medios se esterilizaron en un autoclave JP. SELECTA (España) a 121 °C y 
una presión de 1 kg/cm2 durante 30 minutos, salvo los que contienen concentraciones 
elevadas  de  sacarosa,  que  se  autoclavaron  a  115  °C  durante  60  minutos.  Los 

40
Materiales y Métodos 

suplementos  de  sales,  aminoácidos  y  antibióticos  se  esterilizaron  por  filtración  con 
filtros de 0,2 µm de tamaño de poro (Sartorius, España), excepto la tioestreptona (que 
al  estar  disuelta  la  solución  stock  en  DMSO  no  fue  necesario),  y  el  cloranfenicol  que 
estaba disuelto en etanol. 

5. CUANTIFICACIÓN DEL CRECIMIENTO DE E. coli 

El  crecimiento  de  las  cepas  de  E.  coli  se  siguió  por  medida  de  la  densidad  óptica 
del cultivo a 600 nm en un espectrofotómetro Beckman DU‐70. 

6. OBTENCIÓN Y RECUENTO DE ESPORAS DE Streptomyces sp. 

Las cepas de Streptomyces sp. fueron crecidas en medio SFM durante 5 días a 30 °C. 
A continuación se recogieron las esporas de la superficie mediante la adición de 5 ml de 
glicerol  al  20%  según  el  método  descrito  por  Kieser  y  col  (2000).  Las  esporas  obtenidas 
fueron resuspendidas en glicerol al 20% para su almacenaje a –80 °C. La cuantificación de 
las esporas se realizó sobre diluciones de las soluciones stock de esporas obtenidas, para 
lo que se utilizó una cámara de Neubauer (Sigma, USA). 

7. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE LAS CEPAS DE E. coli 

7.1 Métodos de transformación 

Para  la  transformación  genética  de  las  diferentes  cepas  de  E.  coli  empleadas  se 
utilizaron dos métodos: 

- Transformación  de  células  competentes  obtenidas  mediante  el  método  del 

RbCl  (Hanahan,  1983). La  transformación  se  llevó  a  cabo  por  el  método 
del  choque  térmico  descrito  por  Sambrook  y  col  (1989),  para  ello  se 
sometieron  las  células  competentes  junto  con  el  ADN  plasmídico  o  la 
mezcla  de  ligación  plásmido‐inserto,  a  un  choque  térmico  a  37  °C 
durante  3  minutos,  y  posterior  incubación  5  minutos  en  hielo.  Tras  el 
choque térmico las células se incubaron 1 hora en 1 ml de LB líquido, y 

41
 Materiales y Métodos 

posteriormente  se  sembraron  en  placas  Petri  conteniendo  en  el  medio 
sólido selectivo correspondiente y se incubaron en estufa a 37 ºC durante 
una noche. 
- Mediante  electroporación  (Dower  y  col.,  1988),  para  lo  cual  se  utilizó  un 
equipo  GenePulser  II  de  Bio‐Rad  (USA).  Las  condiciones  empleadas 
fueron  200  Ω,  25  µF  y  2,5  kV,  usando  una  cubeta  de  electroporación  de 
0,2  cm.  Tras  la  transformación  de  las  células  por  electroporación  se 
procedió  a  su  incubación  durante  1  hora  en  1  ml  de  medio  LB  y 
posteriormente se sembraron en medio sólido y se incubaron en estufa a 
37 ºC durante una noche. 

7.2 Métodos de selección en E. coli de los plásmidos recombinantes 

Las  cepas  de  E.  coli  recombinantes  se  seleccionaron  en  primer  lugar  por  su 
crecimiento  en  presencia  de  ampicilina  o  kanamicina  en  el  medio,  dependiendo  del 
marcador de resistencia presente en el plásmido. Posteriormente, los métodos empleados 
para la selección de las bacterias recombinantes que posean los plásmidos recombinantes 
fueron: 

- En aquellos plásmidos que disponen del sistema lacZ, como pUC18, pUC19 y 
pGEM‐T Easy vector se utilizó el sistema de selección de colonias blancas 
(+)  de  las  azules  (‐).  Las  cepas  recombinantes  que  poseen  plásmidos  sin 
insertos presentan color azul debido a la hidrólisis el X‐gal inducida por 
IPTG,  presentes  ambos  en  el  medio,  mientras  que    las  que  poseen  el 
plásmido con el inserto presentan color blanco (Sambrook y col., 1989). 
- En  el  caso  de  las  transformaciones  llevadas  a  cabo  en  E.  coli  HB101  la 
selección se llevó a cabo mediante complementación de auxotrofía, como 
se describe en el apartado 17.1 de Materiales y Métodos. 
- En  todos  los  casos  se  llevó  a  cabo  una  selección  mediante  mini‐prep  de 
colonias.  Este  método  permite  analizar  numerosas  colonias  en  poco 
tiempo,  pudiendo  observarse  la  presencia  de  los  plásmidos  deseados. 
Para ello, se tomó una muestra de cada colonia con la punta de un palillo 
estéril y se depositó en un tubo eppendorf al que se le adicionó 10 µl de 
un  tampón  compuesto  por  lisozima  (0,5  mg/ml),  RNasa  (0,1  mg/ml), 
EDTA  (25  mM),  Tris‐HCl  (25  mM,  pH  7,5),  glicerol  al  10%  y  azul  de 
bromofenol  (2  mg/ml).    Tras  incubar  15  minutos  en  ese  tampón  se 
añadieron 2 µl de fenol y tras su centrifugación a 9.000 xg se analizaron 
los sobrenadantes en una electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. 

42
Materiales y Métodos 

- Todas  las  transformaciones  positivas  se  analizaron  por  purificación  del 

plásmido (apartado 10 de Materiales y Métodos) y análisis de restricción 
y secuenciación. 

8. TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE S. lividans 1326 

La  transformación  de  S.  lividans  1326  con  plásmidos  se  llevó  a  cabo  mediante  la 
transformación de protoplastos en presencia de PEG‐1000 (Kieser y col., 2000). 

8.1 Preparación de protoplastos de S. lividans 1326 

Los protoplastos de S. lividans se prepararon según el protocolo descrito por Kieser 
y col. (2000), que se detalla a continuación:  

1‐ Se crece S. lividans en 100 ml de medio YEME + glicina (en matraz de 250 
ml) durante 40 horas a 30 °C y 250 rpm en un incubador New Brunswick 
Scientific (USA) con agitación orbital. 
2‐ Se centrifuga el cultivo 15 minutos a 3.000 xg a 4 °C en dos tubos Falcon de 
50 ml. 
3‐ Se  elimina  el  sobrenadante  y  se  resuspende  el  precipitado  (células)  en  15 
ml de sacarosa al 10,3%. Se usa una pipeta de 5 ml para homogeneizar. 
4‐ Se centrifuga 15 minutos a 3.000 xg a 4 °C. 
5‐ Se repiten las pasos 3 y 4. 
6‐ Se resuspenden las células lavadas en 4 ml de solución de lisozima 1 mg/ml 
en tampón P, esterilizado por filtración. Se incuban 1 hora a 30 °C. 
7‐ Con una pipeta de 5 ml se resuspende la digestión en solución de lisozima 
4‐5 veces y se incuba a 30 °C 15 minutos más. 
8‐ Se añaden 5 ml de tampón P y se incuba 15 minutos más a 30 °C. 
9‐ Se filtran los protoplastos usando como filtro algodón hidrófobo estéril en 
una jeringuilla estéril de 10 ml. En el eluído quedan los protoplastos. 
10‐ Se centrifuga 7 minutos a 1.000 xg. 
11‐ Tras  eliminar  el  sobrenadante,  se  resuspende  el  precipitado,  los 
protoplastos, en 1 ml de tampón P. Los protoplastos obtenidos pueden ser 
transformados directamente o bien congelarse a –80 °C. 

Para  la  obtención  de  protoplastos  de  Streptomyces,  almacenamiento  de 

estos y su transformación se utilizó el tampón P, compuesto por sacarosa (103 

43
 Materiales y Métodos 

g/l),  K2SO4  (0,25  g/l),  MgCl2∙6H2O  (2,02  g/l)  y  solución  de  elementos  traza 
anterior  (2  ml).  Una  vez  esterilizado,  antes  de  su  uso,  el  tampón  P  fue 
suplementado  (por  cada  80  ml)  con  1  ml  de  KH2PO4  al  0,5%,  10  ml  de 
CaCl2∙H2O al 3,68% y 10 ml de tampón TES al 5,73% pH 7,2 (Kieser y col., 2000). 

8.2 Transformación de protoplastos de S. lividans 1326 

La transformación de S. lividans se llevó a cabo por el método descrito por Kieser y 
col (2000), cuyo protocolo se detalla a continuación: 

1‐ Se añaden 4x 109 protoplastos (en tampón P) en un tubo estéril de 10‐15 ml. 
2‐ Se centrifugan 7 minutos a 1.000 xg. 
3‐ Se resuspenden los protoplastos en la gota de sobrenadante que queda tras 
eliminar el resto. 
4‐ Se añade el plásmido (100 µg/ml) disuelto en 20 µl de TE. 
5‐ Inmediatamente  se  añaden  500  µl  de  PEG‐1000  al  25%  en  tampón  P,  y  se 
mezcla agitando el tubo suavemente. 
6‐ Antes de que pasen 3 minutos se añaden 5 ml de tampón P. 
7‐ Se centrifugan 7 minutos a 1.000 xg. 
8‐ Se  resuspende  el  precipitado  de  células  en  la  gota  de  tampón  que  queda 
tras eliminar el sobrenadante. 
9‐ Se  añaden  200  µl  de  tampón  P  y  se  siembran  en  placas  Petri  conteniendo 
medio R5 sin tioestreptona 
10‐ Se incuban a 30 °C durante 30 horas, hasta que empieza a crecer un césped 
de  células  y  se  añade  1  ml  de  tioestreptona  (25  µg/ml)  en  agua  en  la 
superficie de la placa (“flooding”).  
11‐ Se incuba a 30 °C hasta que empiezan a aparecer colonias. 

8.3 Selección de los S. lividans 1326 transformantes 

La selección de los transformantes positivos de S. lividans se ha llevado a cabo en 
primer  lugar  por  su  crecimiento  en  presencia  de  tioestreptona  adicionada  mediante  el 
método  del  “flooding”,  como  se  ha  descrito  en  el  apartado  8.2  de  Materiales  y  Métodos 
(Kieser y col., 2000). Las colonias positivas obtenidas tras el “flooding” con tioestreptona se 
sembraron  en  placas  Petri  con  medio  SFM  con  tioestreptona  (5  µg/ml).  Las  colonias  que 
crecieron en este medio se sometieron a un análisis posterior que consistió en sembrar el 
microorganismo en medio TSB con tioestreptona y determinar si producía según el caso 
SlPVA o AuAAC. A la vez, se purificó el plásmido (apartado 11 de Materiales y Métodos) 

44
Materiales y Métodos 

y  se  analizó  mediante  digestiones  con  enzimas  de  restricción  y  se  secuenció  el  inserto 
presente en el plásmido. 

9. PURIFICACIÓN DEL ADN TOTAL DE S. lavendulae ATCC 13664 Y DE 

A. utahensis NRRL 12052 

Las células se crecieron en 50 ml de medio YEME más glicina en matraces de 250 
ml durante 72 horas a 28 °C y 180 rpm en un incubador New Brunswick Scientific (USA) 
con  agitación  orbital.  A  continuación,  se  eliminó  el  sobrenadante  por  centrifugación  a 
3.000  xg  durante  15  a  4 ºC.  Las  células  se  lavaron  con  10  ml  de  sacarosa  al  10%, 
recuperándolas  por  centrifugación  igual  que  en  el  paso  anterior.  Las  células  lavadas  se 
resuspendieron en 10 ml de tampón de lisis (Tris‐HCl 25 mM, EDTA 25 mM y sacarosa al 
10%, pH 8) y se les añadió 100 mg de lisozima sólida (10 mg/ml concentración final). La 
mezcla se incubó a 37 °C durante 1 hora observándose lisis celular total. A continuación, 
se  añadió  SDS  hasta  una  concentración  final  del  2%  y,  tras  mezclar  bien,  se  incubó  10 
minutos a 37 °C. 

Los  lisados  se  trataron  6  veces  con  fenol  equilibrado  en  Tris‐HCl  1  M,  pH  8 
conteniendo  0,1%  de  8‐hidroxiquinoleína,  la  fase  acuosa  se  separó  por  centrifugación  a 
3.000 xg. El último tratamiento con fenol se llevó a cabo en presencia de acetato potásico 
0,3 M. 

Tras separar la fase acuosa de la fenólica, el ADN se precipitó con 1 volumen de 2‐
propanol.  Las  hebras  de  ADN  formadas  se  recogieron  con  una  varilla  de  vidrio  y  se 
lavaron con etanol frío al 70%, tras lo cual se disolvieron en 2 ml de tampón TE (Tris‐HCl 
10 mM, pH 7, EDTA 1 mM), se añadió RNasa (40 µg/ml concentración final) y se incubó 3 
horas a 37 °C. Tras la incubación se añadió acetato potásico 0,3 M concentración final y se 
precipitó  el  ADN  con  un  volumen  de  2‐propanol,  purificándose  el  ADN  como  se  ha 
indicado anteriormente. El ADN obtenido se resuspendió en tampón TE. 

En el caso del ADN de S. lavendulae ATCC 13664 se determinó si contenía proteína 
unida, para lo cual se trató con proteinasa K durante 4 horas a 37 °C en tampón Tris‐HCl 
10 mM, EDTA 10 mM, NaCl 100 mM y SDS al 1%. Lo que puso de manifiesto la ausencia 
de proteína unida. 

Este procedimiento permite obtener aproximadamente 4 mg de ADN por cada 50 
ml de cultivo de S. lavendulae ATCC 13664 o de A. utahensis NRRL 12052. 

45
 Materiales y Métodos 

10. PURIFICACIÓN DEL ADN PLASMÍDICO DE E. coli 

Las  cepas  de  E.  coli  se  crecieron  en  4  ml  de  medio  LB  con  el  antibiótico 
correspondiente  a  37  °C  durante  toda  la  noche  a  180  rpm  en  un  incubador  New 
Brunswick Scientific (USA) con agitación orbital. Para la purificación de los plásmidos de 
las distintas cepas de E. coli se utilizó un sistema de purificación comercial, el High Pure 
Pasmid Kit de Roche (Alemania), según las especificaciones del comerciante. 

11. PURIFICACIÓN DEL ADN PLASMÍDICO DE S. lividans  

Las  cepas  recombinantes  de  S.  lividans  se  crecieron  en  4  ml  de  medio  TSB‐YEME 
(50:50)  a  30  °C  durante  48  horas  a  250  rpm  en  un  incubador  New  Brunswick  Scientific 
(USA) con agitación orbital. Para la purificación de plásmidos de los distintos clones de S. 
lividans se usó una modificación del protocolo de purificación de plásmidos de E. coli que 
consistió  en  la  incubación  de  las  células  con  2,5  mg/ml  de  lisozima  durante  1  hora  tras 
haberlas resuspendido en el tampón 1 del High Pure Plasmid Kit de Roche (Alemania). El 
resto de los pasos fueron los especificados por el comerciante. 

12. TÉCNICA  DE  LA  REACCIÓN  EN  CADENA  DE  LA  POLIMERASA 

(PCR) 

Las  amplificaciones  de  ADN  mediante  la  técnica  de  la  PCR  (Saiki  y  col.,  1985; 
Mullis  y  col.,  1986)  fueron  realizadas  en  un  termociclador  MasterCycler  Personal  de 
Eppendorf  (Alemania).  En  todas  las  reacciones  de  amplificación  de  ADN  por  PCR  la 
mezcla de reacción incluía cada uno de los dos oligonucleótidos usados como cebadores a 
una concentración de 0,8 µM y cada uno de los cuatro dNTPs a una concentración de 0,25 
mM. Todas las amplificaciones se realizaron en presencia de DMSO al 10%. En todos los 
casos,  tanto  en  las  amplificaciones  llevadas  a  cabo  con  TaqADN  polimerasa  como  las 
realizadas  con  PfuADN  polimerasa,  los  tampones  de  reacción  utilizados  fueron  los 
recomendados  por  el  fabricante.  Como  controles  en  las  reacciones  de  amplificación  por 
PCR se llevaron a cabo reacciones con cada uno de los cebadores por separado. 

Los  programas  de  amplificación  utilizados  en  las  diferentes  reacciones  de  PCR 
aparecen reflejados en la Tabla 13. 

46
 Materiales y Métodos 

 
Tabla 13. Programas de amplificación por PCR utilizados. 

16s rADN  Pcr1  Pcr2 

1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC.  1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC.  1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC. 

2. Hibridación 10 min. a 45 ºC.  2. Hibridación 10 min. a 45 ºC.  2. Hibridación 10 min. a 50 ºC. 
3. Extensión 2 min. a 72 ºC.  3. Extensión 2 min. a 72 ºC.  3. Extensión 2 min. a 72 ºC. 
4. Desnaturalización 1 min. a 95 ºC.  4. Desnaturalización 1 min. a 95 ºC.  4. Desnaturalización 1 min. a 95 ºC. 
5. Hibridación 2 min. a 45 ºC.  5. Hibridación 2 min. a 40 ºC.  5. Hibridación 2 min. a 50 ºC. 
6. Extensión 2 min. a 72 ºC.  6. Extensión 2 min. a 72 ºC.  6. Extensión 2 min. a 72 ºC. 
7. Los  pasos  4,  5 y  6  se  repitieron  30  7. Los  pasos  4,  5 y  6  se  repitieron  30  7. Los  pasos  4,  5  y  6  se  repitieron  30 
ciclos.  ciclos.  ciclos. 
8. Extensión 20 min. a 72 ºC.  8. Extensión 20 min. a 72 ºC.  8. Extensión 20 min. a 72 ºC. 

Pcr3  Pcr4  Pcr5 

1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC.  1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC.  1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC. 

2. Hibridación 10 min. a 55 ºC.  2. Hibridación 10 min. a 60 ºC.  2. Hibridación 10 min. a 65 ºC. 
3. Extensión 2 min. a 72 ºC.  3. Extensión 2 min. a 72 ºC.  3. Extensión 2 min. a 72 ºC. 
4. Desnaturalización 1 min. a 95 ºC.  4. Desnaturalización 1 min. a 95 ºC.  4. Desnaturalización 1 min. a 95 ºC. 
5. Hibridación 2 min. a 55 ºC.  5. Hibridación 2 min. a 60 ºC.  5. Hibridación 2 min. a 65 ºC. 
6. Extensión 2 min. a 72 ºC.  6. Extensión 2 min. a 72 ºC.  6. Extensión 2 min. a 72 ºC. 
7. Los  pasos  4,  5  y  6  se  repitieron  30  7. Los  pasos  4,  5  y  6  se  repitieron  30  7. Los  pasos  4,  5  y  6  se  repitieron  30 
ciclos.  ciclos.  ciclos. 
8. Extensión 20 min. a 72 ºC.  8. Extensión 20 min. a 72 ºC.  8. Extensión 20 min. a 72 ºC. 

Pcr6  Pcr68  Pcr70 

1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC.  1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC.  1. Desnaturalización 5 min. a 95 ºC. 

2. Hibridación 10 min. a 70 ºC.  2. Hibridación 10 min. a 68 ºC.  2. Hibridación 4 min. a 70 ºC. 
3. Extensión 2 min. a 72 ºC.  3. Extensión 2 min. a 72 ºC.  3. Extensión 5 min. a 72 ºC. 
4. Desnaturalización 1 min. a 95 ºC.  4. Desnaturalización 1 min. A 95 ºC.  4. Desnaturalización 1 min. a 95 ºC. 
5. Hibridación 2 min. a 70 ºC.  5. Hibridación 5 min. a 68 ºC.  5. Hibridación 4 min. a 70 ºC. 
6. Extensión 2 min. a 72 ºC.  6. Extensión 3 min. a 72 ºC.  6. Extensión 5 min. a 72 ºC. 
7. Los  pasos  4,  5  y  6  se  repitieron  30  7. Los  pasos  4,  5 y  6  se  repitieron  40  7. Los  pasos  4,  5  y  6  se  repitieron  30 
ciclos.  ciclos  ciclos. 
8. Extensión 20 min. a 72 ºC.  8. Extensión 20 min. a 72 ºC.  8. Extensión 20 min. a 72 ºC. 

47
 Materiales y Métodos 

 
Tabla 13 (continuación). Programas de amplificación por PCR utilizados. 

T‐d  pfu‐T‐d 
 
1. Desnaturalización 2 min. a 96 ºC.  1. Desnaturalización 2 min. a 96 ºC. 
2. Desnaturalización 1 min. a 96 ºC.  2. Desnaturalización 1 min. a 96 ºC. 
3. Hibridación 2 min. a 70 ºC.  3. Hibridación 2 min. a 70 ºC. 
4. Extensión 3 min. a 72 ºC.  4. Extensión 8 min. a 72 ºC. 
5. Los pasos 2, 3 y 4 se repitieron 5 ciclos.  5. Los pasos 2, 3 y 4 se repitieron 5 ciclos. 
6. Desnaturalización 1 min. a 96 ºC.  6. Desnaturalización 1 min. a 96 ºC. 
7. Hibridación 2 min. a 68 ºC.  7. Hibridación 2 min. a 68 ºC. 
8. Extensión 3 min. a 72 ºC.  8. Extensión 8 min. a 72 ºC. 
9. Los pasos 6, 7 y 8 se repitieron 5 ciclos.  9. Los pasos 6, 7 y 8 se repitieron 5 ciclos 
10.Desnaturalización 1 min. a 96 ºC.  10.Desnaturalización 1 min. a 96 ºC. 
11.Hibridación 2 min. a 63 ºC.  11.Hibridación 2 min. a 63 ºC. 
12.Extensión 3 min. a 72 ºC.  12.Extensión 8 min. a 72 ºC. 
13.Los pasos 10, 11 y 12 se repitieron 5 ciclos.  13.Los pasos 10, 11 y 12 se repitieron 5 ciclos. 
14.Desnaturalización 1 min. a 96 ºC.  14.Desnaturalización 1 min. a 96 ºC. 
15.Hibridación 2 min. a 60 ºC.  15.Hibridación 2 min. a 60 ºC. 
16.Extensión 3 min. a 72 ºC.  16.Extensión 8 min. a 72 ºC. 
17.Los pasos 14, 15 y 16 se repitieron 20 ciclos.  17.Los pasos 14, 15 y 16 se repitieron 20 ciclos. 
18.Último ciclo de extensión 20 min. a 72 ºC.  18.Ultimo ciclo de extensión 20 min. a 72 ºC. 

12.1  Técnica de la PCR inversa 

Para  la  clonación  del  gen  pva  se  ha  utilizado  una  técnica  derivada  de  la  PCR 
denominada  PCR  inversa  (Ochman  y  col.,  1988),  que  consiste  en  digerir  el  ADN  total, 
circularizar los fragmentos resultantes con ellos mismos mediante una ligación realizada 
en  alta  dilución  y  a  continuación  proceder  a  una  amplificación  por  PCR  del  ADN 
circularizado  utilizando  como  cebadores  oligonucleótidos  diseñados,  a  partir  de  las 
secuencias de nucleótidos obtenidas de los extremos 5´ y 3´ de los fragmentos conocidos, 
para que amplifiquen hacia el exterior. 

La preparación de las muestras de ADN para llevar a cabo las PCR inversas se ha 
realizado  digiriendo  8  µg  del  ADN  total  de  S.  lavendulae  con  las  endonucleasas 
correspondientes durante 1 hora a la temperatura recomendada para cada enzima en un 
volumen  final  de  30  µl.  Las  digestiones  se  pararon  por  precipitación  del  ADN  con  2‐
propanol y se resuspendieron en un volumen final de 20 µl de tampón TE. Los fragmentos 
generados  en  las  digestiones  se  circularizaron  mediante  una  reacción  de  ligación  con  la 
enzima T4 ADN ligasa en un volumen de 300 µl, usando el tampón recomendado por el 
fabricante,  durante  16  horas  a  4  ºC.  Trascurrido  ese  tiempo  se  precipitó  el  ADN  con  2‐
propanol  y  posteriormente  se  lavó  con  etanol  puro  frío.  El  ADN  precipitado  se 

48
Materiales y Métodos 

resuspendió en 25 µl de tampón TE. 5 µl del ADN circularizado en estas condiciones fue 
utilizado en cada una de las reacciones de amplificación por PCR inversa, para lo que se 
han usado las condiciones descritas anteriormente y los programas de amplificación Pcr68 
y Pcr70 (Tabla 13). 

13. PURIFICACIÓN DE FRAGMENTOS DE ADN 

Los fragmentos de ADN obtenidos por digestión con enzimas de restricción o por 
PCR fueron aislados y purificados a partir de geles de agarosa, para lo cual se separaron 
en una electroforesis en geles de agarosa al 0,8% y se recortaron las bandas de interés. Los 
fragmentos  de  agarosa  recortados  se  disolvieron  y  el  ADN  se  purificó  por  adsorción  a 
partículas  de  vidrio  siguiendo  la  técnica  del  Gene‐Clean  según  las  especificaciones  del 
comerciante (GeneClean Kit de Q‐BIOgene, USA). 

14. ELECTROFORESIS DE ADN 

Las  electroforesis  de  ADN  se  han  llevado  a  cabo  en  geles  de  agarosa  al  0,8%  en 
tampón  TAE  (Tris‐HCl  40  mM,  EDTA  2  mM  y  ácido  acético  20  mM,  pH  8).  Este mismo 
tampón  se  utilizó  como  electrolito.  Las  electroforesis  se  realizaron  en  un  equipo  MINI‐
SUB®  CELL  GT  de  Bio‐Rad  (USA)  y  a  una  corriente  constante  de  8  V/cm.  El  tampón  de 
carga  utilizado  para  aplicar  las  muestras  de  ADN  al  gel  está  compuesto  por  Ficoll  400 
(30%), azul de bromofenol (0,2%), xilencianol (0,2%) y EDTA 40 mM, pH 7. La detección 
de  las  bandas  de  ADN  en  el  gel  de  electroforesis  se  llevó  a  cabo  mediante  bromuro  de 
etidio (3 µg/ml) y se observaron con luz ultravioleta en un Transiluminador UVIPro V1.0 
de UVItec Limited (Inglaterra). 

Como marcador de tamaño en las electroforesis se utilizó un digerido del ADN del 
fago λ con la enzima de restricción BstEII (MBI Fermentas, Alemania). 

15. TÉCNICA DE HIBRIDACIÓN DEL ADN (SOUTHERN BLOT) 

La  hibridación  de  las  digestiones  del  genoma  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  por 
Southern  blot  se  ha  llevado  a  cabo  sobre  8  µg  de  ADN  genómico  digerido  con  varias 

49
 Materiales y Métodos 

endonucleasas  (AccI,  PstI,  SalI,  AvrI,  BclI,  BglII,  DraI,  NcoI,  NheI  y  SacII)  de  acuerdo  al 
método descrito por Sambrook y col. (1989). Como sonda se usó un fragmento del gen pva 
de 630 pb obtenido por PCR utilizando los oligonucleótidos STREPTOP2 y STREPTOG3 
(Tabla  10)  y  marcado  con  el  sistema  de  la  digoxigenina  (DIG  ADN  labelling  kit, 
Boheringer Mannhein). La finalidad del Southern blot es la de determinar los tamaños de 
los fragmentos generados que puedan contener el gen pva.  

Las digestiones se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 0,8% con el fin 
de  separar  las  bandas  en  base  a  su  tamaño  molecular.  Una  vez  finalizadas  las 
electroforesis  los  geles  se  irradiaron  con  luz  ultravioleta  durante  10  minutos  por  ambos 
lados.  Seguidamente,  se  sumergieron  en  una  solución  desnaturalizante  (NaCl  1,5  M, 
NaOH 0,5 M) durante 30 minutos. A continuación los geles se lavaron en agua destilada y 
se  incubaron  30  minutos  a  temperatura  ambiente  y  agitación  suave  en  una  solución 
neutralizante (NaCl 1,5 M, Tris‐HCl 0,5 M, pH 7). Los geles se lavaron de nuevo con agua 
destilada y se transfirieron los fragmentos de ADN a filtros de nylon Immobilon‐S de 0,45 
µm (Millipore) por aplicación de vacío mediante Transblot (Bio‐Rad). Para su realización 
se colocó en el Transblot una lámina de papel Whatman 3MM, de las mismas dimensiones 
del  gel,  empapada  en  una  solución  de  2  x  SSC  (NaCl  150  mM,  citrato  sódico  15  mM)  y 
sobre ella se colocó un filtro, de las mismas dimensiones del gel, empapado en la solución 
2 x SSC. Sobre el filtro se colocó el gel de agarosa. En todo el proceso se evitó la formación 
de  burbujas.  A  continuación  se  aplicó  el  vacío  de  forma  que  los  fragmentos  de  ADN  se 
transfieren al filtro intercalado. 

Una vez transferido el ADN, los filtros se irradiaron con luz ultravioleta durante 
10 minutos por cada lado. Seguidamente, se llevó a cabo la prehibridación y la hibridación 
con  la  sonda  marcada  con  digoxigenina.  La  prehibridación  de  los  filtros  se  realizó 
incubándolos  2  horas  a  65 ºC  con  tampón  de  prehibridación  (Sambrook  y  col.,  1989).  La 
hibridación  se  llevó  a  cabo  eliminando  el  tampón  de  prehibridación  y  añadiendo  el 
tampón  de  hibridación  junto  con  250  ng  de  la  sonda  previamente  desnaturalizada.  Los 
filtros  se  incubaron  16  horas  a  65 ºC.  Pasado  ese  tiempo,  se  eliminó  el  tampón  de 
hibridación y se lavaron los filtros dos veces durante 10 minutos a 65 ºC con solución 2 x 
SSC precalentada a la misma temperatura. Posteriormente, se realizaron otros dos lavados 
en las mismas condiciones, añadiendo SDS al 0,1% a la solución 2 x SSC. A continuación, 
se volvió a lavar otras dos veces en las mismas condiciones con solución 0,1 x SSC y SDS 
(0,1%).  Finalmente,  se  revelaron  los  filtros  por  quimioluminiscencia  utilizando  DIG 
Luminiscent  Detection  Kit  (Boheringer  Mannheim  GmBH,  Alemania),  siguiendo  las 
instrucciones del fabricante. 

50
Materiales y Métodos 

16. SECUENCIACIÓN DEL ADN 

Todas  las  secuenciaciones  del  ADN  se  han  realizado  en  el  Servicio  de 
Secuenciación Automática de ADN (SSAD) del CIB del CSIC. El secuenciador utilizado ha 
sido un Secuenciador Automático ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems, Perkin‐Elmer). 

17. CLONACIÓN  Y  EXPRESIÓN  DEL  GEN  pva  DE  S.  lavendulae  ATCC 

13664 

17.1 Construcción de una genoteca de S. lavendulae ATCC 13664 en E. coli HB101 

Este  método  está  basado  en  la  capacidad  que  tienen  las  penicilina  acilasas  de 
hidrolizar  derivados  de  L‐aminoácidos,  que  en  el  caso  de  SlPVA  son  del  tipo  de 
fenoxiacetil‐L‐aminoácidos.  Se  comprobó  que  SlPVA  es  capaz  de  hidrolizar  la 
fenoxiacetil‐L‐leucina  liberando  fenoxiacético  y  L‐leucina.  La  L‐leucina  que  se  libera 
puede ser utilizada por una bacteria que tenga dicha actividad acilasa. 

Para la obtención del gen pva mediante la creación de una genoteca plasmídica se 
ha  utilizado  una  cepa  de  E.  coli  auxótrofa  para  L‐leucina,  E.  coli  HB101  (Tabla  8).  Los 
vectores escogidos para la obtención de la genoteca de S. lavendulae ATCC 13664 fueron 
pUC18 y pIN‐III‐A3 (Tabla 9). 

Las  genotecas  se  realizaron  utilizando  las  endonucleasas  Sau3A,  BamHI,  EcoRI, 
HindIII, PstI, SalI y XhoI. En todos los casos las reacciones de restricción se llevaron a cabo 
sobre  2,7  µg  de  ADN  genómico  de  S.  lavendulae  y  se  realizaron  a  37  ºC  durante  1  hora, 
hasta la completa digestión del ADN, salvo en el caso de las digestiones con la enzima de 
restricción Sau3A en la que también se llevaron a cabo digestiones parciales en las que la 
reacción se detuvo a los 10 minutos. En todos los casos las reacciones se pararon mediante 
choque térmico a 80 ºC durante 10 minutos. 

Asimismo,  los  plásmidos  pUC18  y  pIN‐III‐A3  fueron  también  digeridos  con  las 
mismas enzimas de restricción utilizadas con el ADN genómico de S. lavendulae, salvo en 
el  caso  de  XhoI,  ausente  en  pUC18,  donde  se  utilizó  la  endonucleasa  SalI  cuya  diana  es 
compatible con XhoI. En todos los casos se digirieron 4 µg de cada plásmido en cada una 
de las reacciones, las cuales se llevaron a cabo a 37 ºC durante 2 horas. Las restricciones se 
pararon mediante choque térmico a 80 ºC durante 10 minutos. 

51
 Materiales y Métodos 

Finalmente, se  procedió  a  la  ligación  de  las  digestiones  del ADN  genómico  de  S. 
lavendulae con los plásmidos cortados con las mismas enzimas de restricción. En todos los 
casos  se  usó  una  proporción  de  vector:ADN  de  S.  lavendulae  de  1:2.  Las  mezclas  de 
ligación  contenían  2,5  µg  de  ADN  y  1,33  µg  de  vector.  Todas  las  ligaciones  fueron 
catalizadas por la enzima T4 ADN ligasa, en el tampón recomendado por el comerciante, 
durante 5 horas a temperatura ambiente. 

Las mezclas de ligación se utilizaron para transformar por choque térmico células 
competentes de E. coli HB101 obtenidas por el método del RbCl. Tras su transformación, 
las  células  se  mantuvieron  creciendo  en  un  medio  rico,  LB,  durante  1  hora  a  37  ºC.  A 
continuación  se  lavaron  dos  veces  con  solución  salina  estéril  y  finalmente  se 
resuspendieron  en  100  µl  de  suero  salino  y  se  sembraron  en  placas  Petri  que  contenían 
medio mínimo M63 suplementado con 20 mg/ml de L‐Pro, 100 mg/ml de ampicilina y 10 
mg/ml de fenoxiacetil‐L‐leucina, y se incubaron a 37 ºC.  

La  selección  de  los  clones  positivos  que  contengan  el  gen  pva  se  ha  realizado  en 
medio mínimo M63, donde la L‐leucina necesaria para el crecimiento se reemplaza por la 
fenoxiacetil‐L‐leucina.  De  esta  forma  sólo  las  cepas  que  adquieran  el  gen  que 
complementa  la  mutación  auxotrófica  o  las  que  incorporen  el  gen  de  la  acilasa  podrán 
crecer.  Una  posterior  selección  permite  distinguir  ambos  tipos  de  bacterias,  ya  que  las 
primeras crecen en medios mínimos sin fenoxiacetil‐L‐leucina en tanto que las segundas 
no lo pueden hacer. 

17.2 Obtención por PCR de fragmentos de ADN del gen pva 

Se ha llevado a cabo la amplificación del gen pva que codifica la SlPVA mediante 
PCR. En base a las secuencias de aminoácidos N‐terminales obtenidos de la subunidad α, 
β y β truncada (βt) (apartado 24.3 de Materiales y Métodos), y teniendo en cuenta el uso 
de  codones  de  los  actinomicetos  (Wright  y  Bibb,  1992),  se  diseñaron  y  sintetizaron  una 
serie  de  oligonucleótidos  degenerados:  STREPTOP1  (P1),  STREPTOP2  (P2),  STREPTOD 
(D), STREPTOD2 (D2), STREPTOG1 (G1) y STREPTOG3 (G3) (Tabla 10) que han servido 
como cebadores en las reacciones de amplificación de fragmentos del gen pva por PCR. 

Con  estos  cebadores  y  probando  distintas  combinaciones  de  parejas  de 

oligonucleótidos se realizaron amplificaciones, sobre el genoma completo de S. lavendulae 
ATCC  13664  con  el  fin  de  obtener  parte  de  la  secuencia  del  gen  pva.  Todas  las 
amplificaciones se realizaron utilizando la enzima TaqADN polimerasa en las condiciones 
indicas en el apartado 12 de Materiales y Métodos, para un volumen final de 0,1 ml. Los 
programas  de  amplificación  utilizados  fueron  Pcr1,  Pcr2,  Pcr3,  Pcr4,  Pcr5  y  Pcr6  (Tabla 
13). 

52
Materiales y Métodos 

Los  fragmentos  de  ADN,  producto  de  las  amplificaciones,  se  aislaron  por  Gene‐
Clean  y  se  clonaron  en  E.  coli  DH5α  utilizando  como  vector  el  plásmido  pUC18.  Los 
fragmentos  amplificados  presentes  en  los  plásmidos  obtenidos  se  secuenciaron  en  el 
SSAD de CIB del CSIC por ambos extremos del fragmento. 

17.3 Obtención por PCR inversa de fragmentos de ADN del gen pva 

La obtención de fragmentos del gen pva mediante PCR inversa se ha llevado a cabo 
a  partir  de  digestiones  con  las  endonucleasa  SacII,  BamHI,  HincII,  BstEII  y  PvuI.  Para  lo 
cual se ha seguido el protocolo descrito en el apartado 12.1 de Materiales y Métodos. 

El resultado de las PCRs inversas se visualizó mediante electroforesis en geles de 
agarosa y los fragmentos amplificados de ADN obtenidos se purificaron por Gene‐Clean 
y se clonaron en E. coli DH5α utilizando como vector el plásmido pUC18.  

17.4 Construcción de una genoteca en el bacteriófago λ‐GEM12 

La  genoteca  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  en  el  bacteriófago  λ‐GEM12  se  llevó  a 
cabo  en  Antibióticos  S.A.  (León),  se  acuerdo  con  el  procedimiento  desarrollado  a 
continuación. 

17.4.1 Preparación del ADN del bacteriófago 

El  ADN  del  fago  λ‐GEM12  se  preparó  de  acuerdo  con  el  protocolo  descrito  por 
Sambrook  y  col.  (1989).  Para  llevarlo  a  cabo,  se  creció  la  cepa  E.  coli  LE392  en  medio 
NZCYM  con  un  0,2%  de  maltosa  durante  10  horas  a  37  ºC,  hasta  que  su  crecimiento 
alcanzó las 3x109 células. En ese momento las células se precipitaron por centrifugación a 
1.000  xg  a  4 ºC  durante 10  minutos,  y  se  resuspendieron  en  1,2  ml  de  tampón  SM  (Tris‐
HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,1 M, MgSO4∙7H20 2 g/l y gelatina al 0,01%). A las células se les 
añadió 3x107 unidades formadoras de placas (ufp) del fago. La mezcla se incubó a 37 ºC 
durante 30 minutos y sin agitación. Con cantidades de 0,2 ml de estas células infectadas se 
inocularon  100  ml  de  medio  NZCYM  con  0,2%  de  maltosa  precalentado  a  37 ºC  en 
matraces de 50 ml y se incubaron a 37 ºC durante 5‐6 horas hasta que se observó el cultivo 
lisado. 

Los lisados se trataron con DNasa (1 µg/ml) y RNasa (1 µg/ml) durante 45 minutos 
a temperatura ambiente. Posteriormente se añadieron 5,8 g de NaCl por cada 100 ml de 
lisado y la mezcla se incubó en hielo durante 1 hora. Pasado ese tiempo, el lisado se filtro 
con el fin de eliminar restos celulares y se le añadió al filtrado 20 ml de PEG‐6000 al 50%. 
Se  incubó  todo  en  hielo  1  hora  y,  posteriormente,  se  centrifugó  a  10.000  xg  durante  20 

53
 Materiales y Métodos 

minutos a 4 ºC. El ADN del fago se resuspendió en 1 ml de TE. Seguidamente, se trató dos 
veces  en  CIA  (cloroformo:alcohol  isoamílico,  24:1)  para  eliminar  los  restos  de  PEG‐6000. 
Posteriormente,  se  lavó  dos  veces  con  fenol,  una  con  fenol:CIA  (50:50)  y  una  final  con 
CIA.  A  la  fase  acuosa  obtenida  se  le  añadió  NaCl  hasta  una  concentración  de  0,5  M.  El 
ADN  se  precipitó  finalmente  con  dos  volúmenes  de  etanol  absoluto  frío  y  se  lavó  con 
etanol al 70% frío. Tras secarlo, se resuspendió en 50 µl de TE. 

Con el fin de eliminar la región dispensable o ”stuffer”, 50 µg de ADN de λ‐GEM12 
se  digirieron  con  las  enzimas  de  restricción  BamHI  y  EcoRI  durante  2  horas  a  37 ºC.  A 
continuación  el  ADN  se  extrajo  con  fenol:CIA  (50:50)  y  CIA,  y  se  precipitó  con  etanol 
absoluto  frío,  se  lavó  con  etanol  al  70%  frío  y  se  resuspendió  en  50  µl  de  TE. 
Posteriormente,  se  procedió  a  unir  los  brazos  del  ADN  del  fago  por  sus  extremos 
cohesivos,  para  lo  cual  se  le  añadió MgCl2  hasta  una  concentración  final  de  10  mM y  se 
incubó 1 hora a 42 ºC. Tras la hibridación, y evitando temperaturas superiores a 68 ºC para 
que no se separen los extremos cohesivos, se centrifugó el ADN en 10 ml de un gradiente 
de  sacarosa  (10%‐40%)  a  20.000  xg  durante  15  horas  a  28 ºC.  Pasado  ese  tiempo  se 
recogieron  fracciones  de  0,5  ml,  y  se  analizaron  alícuotas  de  15  µl  cada  una  en 
electroforesis  en  geles  de  agarosa  al  0,5%.  Las  fracciones  analizadas  que  carecían  del 
fragmento  central  del  ADN  del  fago  se  recogieron  y  se  diluyeron  en  agua  hasta  una 
concentración de sacarosa del 10%. El ADN se precipitó y se resuspendió en 50 µl de TE. 

17.4.2 Preparación del ADN de S. lavendulae ATCC13664 

Se digirieron parcialmente 200 µg de ADN de S. lavendulae con 10, 5 ó 2,5 unidades 
de  la  enzima  de  restricción  Sau3AI  a  37 ºC  y  en  volumen  de  reacción  de  1,2  ml.  Las 
digestiones se detuvieron por adición de EDTA 35 mM frío. El ADN de las digestiones se 
precipitó  tras  lavar  con  1  volumen  de  fenol:CIA  (50:50)  y  otro  de  CIA.  El  ADN  se 
resuspendió  en  600  µl  de  TE.  Seguidamente,  el  ADN  se  calentó  10  minutos  a  68 ºC  y  se 
enfrió  lentamente  a  temperatura  ambiente.  A  continuación,  se  centrifugó  a  20.000  xg 
durante 18 horas a 25 ºC en un gradiente de sacarosa (10%‐40%). Se recogieron alícuotas 
de 0,25 ml y se analizaron en electroforesis en gel de agarosa al 0,5%. Las fracciones que 
poseían fragmentos de ADN de entre 15 y 20 kb se mezclaron y se diluyeron en TE hasta 
alcanzar  la  sacarosa  una  concentración  del  10%.  A  continuación  se  concentró  el  ADN 
mediante precipitación con etanol absoluto y resuspensión en 25 µl de TE. 

17.4.3 Construcción de la genoteca 

En  un  primer  paso  se  llevó  a  cabo  la  ligación  entre  el  ADN  digerido  de  S. 
lavendulae y el ADN del bacteriófago. Las ligaciones tuvieron lugar en varias series en las 
que se varió la cantidad del ADN de S. lavendulae digerido con Sau3AI (que fueron de 0,1 

54
Materiales y Métodos 

a  0,75  µg),  manteniendo  una  cantidad  fija  de  ADN  del  fago  (0,25  µg).  Las  reacciones  se 
llevaron  a  cabo  utilizando  la  T4  ADN  ligasa,  en  el  tampón  recomendado  por  el 
comerciante,  durante  16  horas  a  temperatura  ambiente.  Finalmente,  se  mezclaron  todas 
las  reacciones  de  ligación  y,  tras  precipitar  el  ADN  de  estas  con  etanol  absoluto  frío,  se 
resuspendieron en 5 µl del tampón de ligación. 

La  encapsidación  del  ADN  de  los  fagos  recombinantes  se  realizó  utilizando  el 
sistema  de  empaquetamiento  in  vitro  Packagene  (Promega,  USA).  El  resultado  de  la 
encapsidación, resuspendido en 0,5 ml de tampón SM, se utilizó para realizar infecciones 
de E. coli LB392, con el fin de titular la genoteca, y en E. coli NM539, con la finalidad de 
determinar  el  porcentaje  de  fagos  recombinantes,  según  el  protocolo  descrito  por 
Sambrook y col. (1989). A continuación, se volvió a infectar E. coli NM539 y se extendió la 
genoteca  completa  sobre  10  placas  Petri  con  medio  LB.  Los  fagos  de  las  placas  de  lisis 
fueron recogidos en 50 ml de tampón SM y se tomaron 40 ml y tras añadirles 2,5 ml de 
cloroformo se conservaron a 4 ºC. Al resto se les añadió DMSO al 7% y se almacenaron a   
‐80 ºC. 

17.4.4 Caracterización de los clones que contienen el gen pva 

Para  la  identificación  de  los  bacteriófagos  positivos,  portadores  del  gen  pva,  se 
diseñó  una  sonda  de  ADN  que  correspondía  a  un  fragmento  intermedio  del  gen  que 
comprende  parte  de  la  secuencia  génica  que  codifica  la  subunidad  α  y  parte  de  la 
subunidad  β.  Este  fragmento  de  ADN,  de  900  pb,  se  obtuvo  por  PCR,  utilizando  los 
oligonucleótidos  NCsacI  y  NCsac4  como  cebadores.  La  amplificación  se  realizó  con  la 
enzima  TaqADN  polimerasa  en  un  volumen  de  reacción  de  0,1  ml.  El  programa  de 
amplificación  utilizado  fue  el  T‐d  (Tabla  13).  El  resultado  de  la  amplificación  se  analizó 
mediante electroforesis en gel de agarosa, y la banda de 900 pb (NCsacI4) resultado de la 
PCR se purificó por Gene‐Clean. 

El  fragmento  NCsacI4  se  marcó  con  digoxigenina  para  poder  ser  utilizado  como 
sonda. Para ello se utilizó el kit DIG ADN labelling kit (Boheringer Mannhein) de acuerdo 
a las instrucciones del fabricante. 

Para la selección de los fagos recombinantes positivos se utilizó como hospedador 
de  las  infecciones  E.  coli  LE392.  Tras  la  infección  alrededor  de  300  ufp/placa  fueron 
sembradas en placas Petri con medio LB sólido. Las ufp se transfirieron a filtros de nylon 
(Roche)  para  la  selección  de  los  clones  positivos,  que  se  llevó  a  cabo  mediante  la 
hibridación  del  ADN  de  los  fagos  transferidos  a  los  filtros  con  la  sonda  NCsacI4 
(Sambrook y col., 1989).  

55
 Materiales y Métodos 

Se obtuvieron 18 placas de lisis positivas que fueron recogidas cada una con una 
pipeta Pasteur estéril y se resuspendieron en 1 ml de SM. Posteriormente se añadieron 50 
µl de cloroformo para su almacenamiento a 4 ºC. Con el fin de descartar falsos positivos se 
repitieron los pasos anteriores sobre distintas diluciones de los fagos positivos.  

Finalmente,  con  el  fin  de  realizar  un  último  análisis  de  los  fagos  positivos  estos 
fueron amplificados mediante PCR. Para ello, se tomaron alícuotas de 5 µl de cada una de 
las  soluciones  de  fagos  positivos  y  se  incubaron  a  90 ºC  durante  15  minutos. 
Seguidamente, se enfriaron rápidamente en hielo y ese volumen se utilizó para amplificar 
el  fragmento  de  900  pb  de  la  sonda  con  los  oligonucleótidos  NCsacI  y  NCsac4  como 
cebadores  (Tabla  10).  Las  amplificaciones  se  llevaron  a  cabo  con  la  enzima  TaqADN 
polimerasa  en  las  mismas  condiciones  de  ensayo  utilizadas  para  la  amplificación  del 
fragmento de ADN de la sonda (apartado 17.1.4 de Materiales y Métodos). El programa 
de amplificación utilizado fue el Pcr70 (Tabla 13).  

17.4.5 Subclonaje de los clones que contienen el gen pva en E. coli 

Con  el  fin  de  subclonar  y  secuenciar  los  clones  positivos  de  la  genoteca  en  λ‐
GEM12,  se  purificó  el  ADN  de  estos  clones,  para  lo  que  se  utilizó  el  kit  comercial  High 
Pure  Lambda  Isolation  Kit  (Boheringer  manheim)  según  las  especificaciones  del 
comerciante. 

5 µg de ADN fágico se digirieron con la enzima de restricción SacI 1 hora a 37 ºC 
en  el  tampón  recomendado  por  el  comerciante.  Los  fragmento  liberados  se  purificaron 
por Gene‐Clean y se ligaron al plásmido pBluescript II KS (+) previamente digerido con la 
misma enzima. La ligación se llevó a cabo con la enzima T4 ADN ligasa durante 5 horas a 
12 ºC.  La  mezcla  de  ligación  se  utilizó  para  transformar  células  competentes  de  E.  coli 
DH5α mediante choque térmico. Los transformantes se seleccionaron en medio LB sólido 
con  cloranfenicol  (30  µg/ml),  X‐gal  (40  µg/µl)  e  IPTG  (0,2  mM).  Se  aisló  un  clon  positivo 
denominado E. coli DH5α (pALSL6). El plásmido pALSL6 se aisló y secuenció por ambos 
extremos del inserto. 

17.5 Clonación y expresión del gen pva en E. coli con y sin su péptido señal 

Para llevar a cabo la clonación y expresión del gen pva con la secuencia génica que 
codifica su péptido señal en E. coli se han utilizado las cepas HB101 y BL21 (DE3) (Tabla 8) 
y  como  vectores  los  plásmidos  pIN‐III‐A3  y  pET28  a  (+)  (Tabla  9).  Para  la  clonación  del 
gen  pva  sin  la  secuencia  génica  que  codifica  su  péptido  señal  se  ha  utilizado  como 
hospedador E. coli HB101 (Tabla 8) y como vector el plásmido pIN‐III‐ompA3 (Tabla 9).  

56
Materiales y Métodos 

Con  el  fin  de  amplificar  el  marco  de  lectura  abierto  (ORF)  que  codifica  la  SlPVA 
con  y  sin  su  péptido  señal,  según  la  secuencia  del  gen  pva  se  diseñaron  los 
oligonucleótidos (Tabla 10): 

- PVA‐1,  que  corresponde  al  extremo  5´  del  gen  pva  incluyendo  la  secuencia 
que  codifica  su  péptido  señal  y  que,  además,  presenta  una  diana  de 
restricción XbaI en el extremo 5´ e incluye la secuencia del sitio de unión 
al ribosoma (RBS) de E. coli (GAGGG) y el codón de iniciación ATG. 
- PVA‐2,  que  corresponde  al  extremo  5´  del  gen  pva  sin  incluir  el  péptido 
señal. Presenta una diana de restricción EcoRI en el extremo 5´. 
- PVA‐F,  que  corresponde  al  extremo  3´  del  gen  pva.  Incluye  una  diana  de 
restricción  EcoRI  en  el  extremo  3´  y  la  secuencia  que  codifica  el  codón 
STOP del gen. 

Estos  oligonucleótidos  se  utilizaron  como  cebadores  en  reacciones  de 

amplificación  por  PCR  utilizando  la  enzima  PfuADN  polimerasa  que  tiene  actividad 
correctora de errores 3´→5´. Las condiciones de las reacciones fueron las indicadas en el 
apartado  12  de  Materiales  y  Métodos,  para  un  volumen  de  reacción  de  100  µl.  El 
programa de amplificación utilizado fue el pfu‐T‐d (Tabla 13). 

El resultado de las PCRs se analizó en electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, y las 
bandas  positivas  obtenidas,  denominadas  PVA1F  y  PVA2F,  se  purificaron  por  Gene‐
Clean  y  se  clonaron  en  E.  coli  DH5α  utilizando  como  vector  el  plásmido  pGEM‐T  Easy 
vector (Tabla 9), obteniéndose los clones E. coli DH5α (pPVAT) y E. coli DH5α (pPVA2F‐1) 
que  contienen  el  gen  pva  con  y  sin  la  secuencia  que  codifica  su  péptido  señal 
respectivamente. 

Para  la  clonación  y  expresión  del  gen  pva  que  codifica  la  SlPVA  con  su  propio 
péptido señal se utilizaron como vector de clonación el plásmido pIN‐III‐A3 y pET28 a (+). 
Para  ello  se  digirieron  0,4  µg  del  plásmido  pPVAT  con  las  enzimas  XbaI  y  EcoRI,  en  el 
tampón recomendado por el comerciante, durante 3 horas a 37 ºC. Una vez llevada a cabo 
la  digestión,  ésta  se  analizó  mediante  electroforesis  en  gel  de  agarosa  y  se  procedió  a  la 
purificación del fragmento PVA1F liberado por medio de la técnica del Gene‐Clean. 

0,2  µg  del  fragmento  PVA1F  se  ligaron  con  0,1  µg  de  los  plásmidos  pIN‐III‐A3  y 
pET28  a  (+)  (previamente  digeridos,  en  las  mismas  condiciones,  con  las  mismas 
endonucleasas).  La  ligaciones  se  llevaron  a  cabo  con  la  enzima  T4  ADN  ligasa  durante 
toda la noche a 4 ºC. 

57
 Materiales y Métodos 

La  mezcla  de  ligación  PVA1F‐pIN‐III‐A3  se  utilizó  para  transformar  células 
competentes  de  E.  coli  HB101,  obtenidas  por  el  método  del  RbCl.  La  transformación  y 
selección de clones positivos se realizó por complementación de auxotrofía, utilizando el 
mismo método descrito para la obtención de la genoteca de S. lavendulae en E. coli HB101, 
apartado 17.1 de Materiales y Métodos. 

La  mezcla  de  ligación  PVA1F‐pET28  a  (+)  se  utilizó  para  transformar  células 
competentes de E. coli DH5α, obtenidas por el método del RbCl. Los clones positivos se 
seleccionaron  por  su  crecimiento  en  LB  con  kanamicina  y  por  mini‐prep  de  colonias.  Se 
obtuvo  así  el  clon  recombinante  E.  coli  DH5α  (pET28PVAT),  que  poseía  el  plásmido 
recombinante pET28PVAT. Este plásmido fue purificado y secuenciado y se utilizó para 
transformar  E.  coli  BL21  (DE3)  mediante  electroporación.  Los  clones  positivos  se 
seleccionaron  por  crecimiento  en  medio  LB  con  kanamicina  y  mediante  mini‐prep  de 
colonias.  Se  obtuvo  así  el  clon  recombinante  E.  coli  BL21  (pET28PVAT),  que  posee  el 
plásmido pPVAT. Este plásmido se purificó y secuenció. 

Para  la  clonación  y  expresión  del  gen  pva  que  codifica  la  SlPVA  sin  su  péptido 
señal  se  utilizó  como  vector  de  clonación  el  plásmido  pIN‐III‐ompA3.  Para  ello  se 
digirieron 0,4 µg del plásmido pPVA2F‐1 con la enzima de restricción EcoRI, en el tampón 
recomendado  por  el  comerciante,  durante  3  horas  a  37 ºC.  Una  vez  llevada  a  cabo  la 
digestión,  esta  se  analizó  mediante  electroforesis  en  gel  de  agarosa  y  se  procedió  a  la 
purificación del fragmento PVA2F liberado por medio de la técnica del Gene‐Clean. 

0,2  µg  del  fragmento  PVA2F  se  ligaron  con  0,1  µg  del  plásmido  pIN‐III‐ompA3 
(previamente  digerido,  en  las  mismas  condiciones  con  la  enzima  EcoRI).  La  ligación  se 
llevó  a  cabo  con  la  enzima  T4  ADN  ligasa  durante  toda  la  noche  a  4 ºC.  La  mezcla  de 
ligación se utilizó para transformar células competentes de E. coli HB101, producidas por 
el método del RbCl. La transformación y selección de clones positivos se llevó a utilizando 
el  mismo  método  descrito  para  la  obtención  de  la  genoteca  de  S.  lavendulae  en  E.  coli 
HB101, apartado 17.1 de Materiales y Métodos. 

17.6 Clonación y expresión del gen pva en S. lividans  

Para la clonación y expresión del gen pva de S. lavendulae ATCC 13664 en S. lividans 
se seleccionó como hospedador la cepa S. lividans 1326, bacteria que ha sido utilizada con 
éxito  en  la  clonación  de  numerosos  genes  que  codifican  proteínas  expresadas  por 
representantes el genero Streptomyces (Gilbert y col., 1995; Sathyamoorthy y col., 1996). La 
primera  estrategia  diseñada  consistió  en  la  clonación  y  expresión  del  gen  pva  bajo  el 
control  de  su  propio  promotor,  para  ello,  ante  la  dificultad  que  existe  de  obtener 
plásmidos  comerciales  de  Streptomyces,  dispusimos  del  vector  pHJL401  (Larson  y 

58
Materiales y Métodos 

Hershberger,  1986),  proporcionado  por  Antibióticos  S.A.  (León),  plásmido  bifuncional 

que  permite  la  clonación  tanto  en  E.  coli  como  en  S.  lividans,  ya  que  presenta  origen  de 
replicación y marcadores de resistencia para ambos microorganismos (Tabla 9). 

Otra estrategia llevada a cabo para la expresión de SlPVA con una mayor eficacia 
fue  la  utilización  del  vector  de  expresión  pEM4,  proporcionado  por  el  Dr.  José  Antonio 
Salas  de  la  Universidad  de  Oviedo  (Quiros  y  col.,  1998).  Este  plásmido  presenta  el 
promotor  de  la  eritromicina,  PermE*,  promotor  fuerte  y  constitutivo,  de  alto  número  de 
copias y, además, es un vector bifuncional, presentando tanto origen de replicación para 
E.  coli  como  origen  de  replicación  para  Streptomyces.  Como  marcadores  de  selección 
presenta resistencia a ampicilina, para su selección en E. coli, y resistencia a tioestreptona, 
para su selección en Streptomyces (Tabla 9). 

Se llevó a cabo la reconstrucción del gen pva completo con su propio promotor a 
partir  de  la  genoteca  en  el  fago  λ‐GEM12  (apartado  17.4  de  Materiales  y  Métodos)  y  el 
fragmento amplificado PVA1F (apartado 17.5 de Materiales y Métodos). 

17.6.1 Obtención del plásmido recombinante pPVASl0.1 

4  µg  del  plásmido  pPVAT  (obtenido  como  se  describe  en  el  apartado  17.5  de 
Materiales y Métodos) se digirieron con las enzimas de restricción EcoRI y BstAPI en un 
volumen  final  de  60  µl  en  el  tampón  compatible  aconsejado  por  el  comerciante.  La 
digestión  se  hizo  en  dos  etapas.  En  una  primera  se  digirió  el  plásmido  con  la 
endonucleasa  EcoRI  a  37 ºC  3  horas,  a  continuación  se  añadió  la  enzima  BstAPI  y  se 
incubó la reacción otras 3 horas a 60 ºC. Seguidamente, la reacción se detuvo calentándola 
a 80 ºC durante 15 minutos, obteniéndose un fragmento de ADN de 1 kb que se purificó 
por Gene‐Clean. 

El  plásmido  pASLS6  (obtenido  como  se  describe  en  el  apartado  17.4.5  de 
Materiales  y  Métodos)  se  digirió  con  las  enzimas  EcoRI  y  BstAPI  en  las  mismas 
condiciones  que  se  han  descrito  anteriormente  para  la  digestión  del  plásmido  pPVAT, 
consiguiéndose un fragmento de ADN de 4,8 kb que contiene el plásmido pBluescript II 
KS (+) y la región promotora y 5´ del gen pva. 

1  µg  de  este  último  fragmento  se  ligó  con  1  µg  del  fragmento  de  1  kb  obtenido 
anteriormente.  La  ligación  se  llevó  a  cabo  toda  la  noche  a  4 ºC  y  fue  catalizada  por  la 
enzima T4 ADN ligasa en el tampón recomendado por el fabricante y en un volumen final 
de 20 µl. 

10  µl  de  la  mezcla  de  ligación  se  utilizó  para  transformar  células  E.  coli  DH5α 
competentes. Las células transformadas se crecieron en medio sólido LB con cloranfenicol. 

59
 Materiales y Métodos 

Las  células  recombinantes  que  crecieron  se  analizaron  por  mini‐prep  de  colonias.  Se 
obtuvo  así  un  clon  positivo,  E.  coli  DH5α  (pBCPVASl0.1)  que  contiene  el  plásmido 
recombinante pBCPVASl0.1, que tras su purificación se secuenció usando como cebadores 
los oligonucleótidos N PVA‐1, PVA‐F, NCsac3, NCsac4, NCsacI y PVAstop (Tabla 10). 

A continuación, 4 µg del plásmido recombinante pBCPVASl0.1 se cortaron con las 
enzimas  de restricción  EcoRI,  SacI  y  DraI,  las  dos  primeras  utilizadas  para  liberar  el  gen 
pva del plásmido y la tercera para cortar el plásmido por la mitad y así poder purificar con 
mayor  facilidad  el  gen  pva,  ya  que  éste  y  el  plásmido  tienen  el  mismo  tamaño.  La 
digestión se hizo en un volumen de 40 µl, en el tampón recomendado por el comerciante 
que  permite  la  actividad  de  las  3  enzimas.  Las  digestiones  se  realizaron  de  forma 
secuencial, una primera con la enzima EcoRI durante 1,5 horas a 37 ºC, a continuación se 
llevó a cabo la digestión con la endonucleasa SacI durante otra hora y media a 37 ºC y, por 
último,  se  realizó  la  digestión  con  la  enzima  DraI  durante  1,5  horas  a  la  misma 
temperatura. Finalizadas las digestiones las enzimas se inactivaron por choque térmico a 
80 ºC durante 10 minutos. Se liberó así un fragmento de ADN de 3 kb que contiene el gen 
pva. El fragmento liberado del plásmido se purificó por Gene‐Clean. 

Paralelamente,  se  digirieron  3  µg  del  plásmido  pHJL401  con  las  enzimas  de 
restricción  EcoRI  y  SacI,  en  las  mismas  condiciones  que  la  digestión  del  plásmido 
pBCPVASl0.1. 

1 µg del fragmento de ADN que contiene el gen pva se ligó con 2 µg del plásmido 
pHJL401  digerido  en  un  volumen  de  20  µl.  La  reacción  fue  catalizada  por  la  enzima  T4 
ADN ligasa, se llevó a cabo durante toda la noche a 4 ºC. 10 µl de la mezcla de ligación se 
utilizaron  para  transformar  células  competentes  de  E.  coli  DH5α.  Las  células 
transformantes se seleccionaron en medio LB sólido con ampicilina y mediante mini‐prep 
de  colonias.  Se  obtuvo  así  el  clon  recombinante  E.  coli  DH5α  (pPVASl0.1).  Se  purificó  el 
plásmido y se secuenció el inserto usando como cebadores los oligonucleótidos N, PVA‐F, 
NCsac3, NCsac4, NCsacI y PVAstop con el fin de comprobar la ausencia de mutaciones. 

17.6.2 Obtención del plásmido recombinante pASL‐7 

4  µg  del  plásmido  recombinante  pPVASl0.1  se  cortaron  con  las  enzimas  de 
restricción  XbaI  y  EcoRI.  La  digestión  se  hizo  en  un  volumen  de  40  µl  en  el  tampón 
recomendado  por  el  comerciante  que  permite  la  actividad  de  ambas  enzimas.  Las 
digestiones se realizaron de forma secuencial, una primera con la enzima XbaI durante 2 
horas  a  37 ºC  y  a  continuación  se  llevó  a  cabo  la  digestión  con  la  endonucleasa  EcoRI 
durante  otras  2  horas  a  37 ºC.  A  continuación,  las  enzimas  se  inactivaron  por  choque 

60
Materiales y Métodos 

térmico  a  80 ºC  durante  10  minutos.  Se  liberó  así  el  fragmento  de  ADN  de  3  kb  que 
contiene el gen pva y que se purificó por Gene‐Clean. 

Paralelamente,  se  digirieron  3  µg  del  plásmido  pEM4  con  las  enzimas  de 
restricción  EcoRI  y  XbaI,  en  las  mismas  condiciones  que  la  digestión  del  plásmido 
pPVASl0.1. 

2  µg  del  fragmento  de  ADN  que  contiene  el  gen  pva  se  ligaron  con  1  µg  del 
plásmido  pEM4  linealizado  en  un  volumen  de  20  µl.  La  ligación  se  llevó  a  cabo  con  la 
enzima T4 ADN ligasa durante toda la noche a 4 ºC en el tampón adecuado. 10 µl de la 
mezcla de ligación se utilizaron para transformar células competentes de E. coli DH5α. Las 
células  transformantes  se  seleccionaron  en  medio  LB  sólido  con  ampicilina  y  mediante 
mini‐prep  de  colonias.  Se  obtuvo  así  el  clon  recombinante  E.  coli  DH5α  (pASL‐7).  El 
plásmido  recombinante  se  purificó  y  el  inserto  se  secuenció  usando  como  cebadores  los 
oligonucleótidos N, PVA‐F, NCsac3, NCsac4, NCsacI, PVAstop, pEM4‐5´ y pEM4‐3´ con 
el fin de comprobar la ausencia de mutaciones. 

17.6.3 Estudio de la expresión del gen pva en S. lividans 

Las  transformaciones  de  protoplastos  de  S.  lividans  1326  con  los  plásmidos 
pPVASl0.1 y pASL‐7 se han realizado siguiendo el protocolo descrito en el apartado 8 de 
Material  y  Métodos.  El  análisis  de  los  recombinantes  ha  permitido  obtener  los  clones  S. 
lividans  (pPVASl0.1)  y  S.  lividans  (pASL‐7),  que  han  sido  depositados  bajo  patente  en  la 
Colección  Española  de  Cultivos  Tipo  con  la  denominación  S.  lividans  CECT  3365  y  S. 
lividans CECT 3376 respectivamente. 

Los plásmidos pPVASl0.1 de S. lividans CECT 3365 y pASL‐7 de S. lividans CECT 
3376 han sido purificados siguiendo el protocolo descrito en el apartado 11 de Material y 
Métodos y secuenciados para comprobar la ausencia de mutaciones. 

Para el estudio de la expresión de SlPVA por los clones recombinantes S. lividans 
CECT 3365 y S. lividans CECT 3376 se han llevado a cabo una serie de fermentaciones en 
distintos  medios  de  producción  a  20 ºC  y  30 ºC  durante  140  horas  y  a  250  rpm  en  un 
incubador  New  Brunswick  Scientific  (USA)  con  agitación  orbital.  Todas  las 
fermentaciones se realizaron inoculando en cada medio 2x106 esporas/ml de cultivo. 

Cada  24  horas  se  tomaron  alícuotas  de  los  caldos  de  fermentación  y,  tras 
centrifugarlas  30  minutos  a  3.000  xg  a  4 ºC,  se  procedió  a  determinar  la  actividad 
penicilina V acilasa mediante el método del PDAB (apartado 22.1 de Material y Métodos). 
La actividad acilasa se analizó tanto en los caldos de fermentación como en los extractos 
celulares  obtenidos  tras  la  ruptura  celular  de  las  células  por  sonicación,  4  ciclos  de  10 

61
 Materiales y Métodos 

segundos  con  una  amplitud  de  10  a  intervalos  de  0,5  segundos  en  hielo  (sonicador 
Branson modelo 450). 

La  producción  de  SlPVA  también  se  analizó  mediante  inmunodetección  de  la 
enzima en los caldos de fermentación de 140 horas de cultivo. 

En estos estudios se utilizaron como controles fermentaciones de S. lividans 1326 y 
S. lividans (pHJL401). 

18. PENICILINA V ACILASA DE S. lavendulae ATCC 13664 PRODUCIDA 

POR S. lividans CECT 3376 

18.1 Optimización de la producción de SlPVA  

Con  el  clon  recombinante  S.  lividans  CECT  3376  superproductor  de  SlPVA  se 
procedió a optimizar las condiciones de producción de la enzima. 

18.1.1 Estudio del medio de producción 

Con  el  fin  de  optimizar  la  producción  de  SlPVA  se  llevó  a  cabo  el  estudio  del 
medio óptimo de producción. Los medios analizados fueron Leche desnatada, ELO, TSB y 
TSBw/oG  (apartado  4  de  Materiales  y  Métodos).  Todas  las  fermentaciones  se  llevaron  a 
cabo  en  matraces  de  25  ml  que  contenían  10  ml  de  medio.  Las  fermentaciones  se 
realizaron  a  30 ºC  y  250  rpm  en  un  incubador  New  Brunswick  Scientific  (USA)  con 
agitación  orbital.  Todos  los  medios  fueron  inoculados  con  2x106  esporas/ml  de  cultivo. 
Cada 24 horas se pararon fermentaciones, para lo cual se centrifugaron a 3.000 xg durante 
15 minutos a 4 ºC.  

Tras  centrifugar  se  analizó  la  actividad  penicilina  V  acilasa  en  los  caldos  de 
fermentación  mediante  el  método  del  PDAB  utilizando  penicilina  V  como  sustrato 
(apartado 22.1 de Materiales y Métodos). 

18.1.2 Optimización del tamaño de inóculo 

Con el fin de optimizar el tamaño del inóculo de esporas de S. lividans CECT 3376 
en la producción de SlPVA se llevaron a cabo una serie de fermentaciones en medio TSB 
variando  el  número  de  esporas  de  S.  lividans  CECT  3376  inoculadas.  Todas  las 
fermentaciones se realizaron en 10 ml de medio en matraces de 25 ml a 30 ºC y 250 rpm en 

62
Materiales y Métodos 

un  incubador  New  Brunswick  Scientific  (USA)  con  agitación  orbital.  Las  fermentaciones 
se llevaron a cabo a un tiempo final de 120 horas, tomando alícuotas cada 24 horas. 

Los  tamaños  de  inóculos  estudiados  han  sido:  1x106,  2x106,  5x106,  1x107  y  2x107 
esporas/ml  de  cultivo.  La  producción  de  SlPVA  se  determinó  en  cada  caso  y  para  cada 
tiempo  de  fermentación  mediante  la  cuantificación  de  la  actividad  por  el  método  del 
PDAB utilizando penicilina V como sustrato (apartado 22.1 de Materiales y Métodos). 

18.1.3 Optimización de la temperatura de producción 

El estudio de la temperatura óptima de producción de SlPVA por S. lividans CECT 
3376 se ha realizado a 20 ºC, 30 ºC y 35 ºC. Todos los experimentos se han llevado a cabo 
mediante fermentaciones en 10 ml de medio TSB en matraces de 25 ml y a 250 rpm en un 
incubador  New  Brunswick  (USA)  con  agitación  orbital.  Las  fermentaciones  se  han 
realizado a un tiempo final de 120 horas, tomando alícuotas cada 24 horas. La producción 
de SlPVA se determinó como se ha indicado en el apartado anterior. 

18.2 Aislamiento y purificación de SlPVA  

La enzima SlPVA producida por el microorganismo recombinante S. lividans CECT 
3376 se ha purificado en un sólo paso cromatográfico. La producción de la enzima se ha 
llevado  a  cabo  por  fermentación  en  medio  TSB.  Para  ello,  400  ml  de  medio  TSB  en 
matraces  de  1  l  fueron  inoculados  con  2x106  esporas/ml  de  cultivo.  La  fermentación  se 
llevó  a  cabo  a  30 ºC  durante  96  horas  y  a  250  rpm  en  un  incubador  New  Brunswick 
Scientific  (USA)  con  agitación  orbital.  A  continuación,  las  células  se  eliminaron  por 
centrifugación a 9.000 xg durante 30 minutos a 4 ºC. El caldo de fermentación se ajustó a 
pH 7 por adición de HCl 1 N. 

18.2.1 Cromatografía de intercambio iónico S‐Sepharose (Fast‐Flow) 

El caldo de fermentación ajustado a pH 7 se aplicó en una columna de S‐Sepharose 
(2,5 x 30 cm) equilibrada en tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7. La columna se eluyó 
isocráticamente con 300 ml del mismo tampón. La proteína eluyó mediante la aplicación 
de  un  gradiente  continuo  de  0  a  1 M  de  NaCl  en  tampón  fosfato  potásico  10  mM,  pH  7 
(150 ml), seguido de una elución isocrática con 150 ml de tampón fosfato potásico 10 mM, 
pH 7 con 1 M de NaCl. 

La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente mediante un sistema de 
cromatografía  rápida  para  proteínas  (Fast  Performance  Liquid  Chromatography,  FPLC)  de 
Amersham‐Pharmacia  (Suecia)  y  con  un  flujo  de  elución  de  1  ml/min.  Se  recogieron 
fracciones de 1,5 ml. 

63
 Materiales y Métodos 

19. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN aac DE A. utahensis NRRL 12052 

QUE CODIFICA LA ACULEACINA A ACILASA 

19.1 Clonación y expresión del gen aac en E. coli 

La clonación y expresión en E. coli BL21 (DE3) utilizando el vector pET28 a (+) se 
realizó  utilizando  el  gen  aac  con  la  secuencia  génica  que  codifica  su  péptido  señal 
(AAC12). 

En  base  a  la  secuencia  del  gen  aac  de  A.  utahensis  NRRL  12052  (Inokoshi  y  col., 
1992)  se  diseñaron  2  oligonucleótidos  con  el  fin  de  amplificar  la  ORF  que  codifica  la 
AuAAC  con  su  péptido  señal  para  su  posterior  clonación  y  expresión  en  E.  coli.  Los 
oligonucleótidos diseñados fueron (Tabla 11): 

- AAC‐1,  que  corresponde  al  extremo  5´  del  gen  aac  incluyendo  la  secuencia 
que  codifica  su  péptido  señal  y  que,  además,  presenta  una  diana  de 
restricción XbaI en el extremo 5´ e incluye la secuencia del RBS de E. coli 
(GAGGG) y ATG como codón de iniciación. 
- AAC‐2,  que  corresponde  al  extremo  3´  del  gen  aac.  Incluye  una  diana  de 
restricción  EcoRI  en  el  extremo  3´  y  la  secuencia  que  codifica  el  codón 
STOP del gen. 

La  amplificación  se  realizó  utilizando  la  enzima  PfuADN  polimerasa  utilizando 
como molde 0,5 µg de ADN genómico de A. utahensis NRRL 12052. Las condiciones de la 
reacción fueron las indicadas en el apartado 12 de Materiales y Métodos, para un volumen 
de reacción de 100 µl. El programa de amplificación utilizado fue el pfu‐T‐d (Tabla 13). 

El resultado de la PCR se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% 
y la banda positiva obtenida, denominada AAC12, se purificó por Gene‐Clean y se clonó 
en  E.  coli  DH5α  utilizando  como  vector  el  plásmido  pGEM‐T  Easy  vector,  siguiendo  las 
recomendaciones  del  fabricante.  El  análisis  de  las  cepas  recombinantes  permitió  obtener 
un clon positivo, E. coli DH5α (pAAC12). Se purificó el plásmido recombinante, pAAC12, 
de dicho clon y se secuenció. 

0,4  µg  del  plásmido  pAAC12  se  digirieron  con  las  enzimas  XbaI  y  EcoRI  en  el 
tampón  recomendado  por  el  fabricante,  durante  3  horas  a  37 ºC  y  se  procedió  como  se 
describe en el apartado 17.5 de Materiales y Métodos para la clonación del gen pva en E. 
coli. Se obtuvo el microorganismo recombinante E. coli DH5α (pET28AAC12) que posee el 
plásmido pET28AAC12 que fue purificado y secuenciado. 

64
Materiales y Métodos 

El plásmido pET28AAC12 se utilizó para transformar E. coli BL21 (DE3) mediante 
electroporación. Los clones positivos se seleccionaron por crecimiento en medio LB sólido 
con kanamicina y mediante mini‐prep de colonias. Se obtuvo el clon recombinante E. coli 
BL21 (pET28AAC12). 

Se  llevaron  a  cabo  las  pruebas  de  expresión  inoculando  con  E.  coli  BL21 
(pET28AAC12) 3 ml de medio LB líquido con kanamicina. El clon se incubó durante toda 
la noche a 30 ºC y 37 ºC en presencia o ausencia de IPTG (1 mM). La incubación se detuvo 
centrifugando las células a 3.000 xg durante 15 minutos a 4 ºC. 

La determinación de la actividad de AuAAC se llevó a cabo mediante ensayos de 
hidrólisis de penicilina V tanto en los caldos como en las células, para ello, por un lado se 
ensayaron  directamente  135  µl  del  caldo,  con  penicilina  V  como  sustrato  durante  un 
tiempo  de  ensayo  de  2,5  horas  a  40 ºC  usando  el  método  del  PDAB  (apartado  22.1  de 
Materiales y Métodos). Por otro lado, las células se rompieron por sonicación (3 ciclos de 
10  segundos  con  una  amplitud  de  10  a  intervalos  de  0,5  segundos,  en  un  sonicador 
Branson modelo 450) y se ensayaron 135 µl del extracto celular en las mismas condiciones. 

Asimismo,  se  analizó  la  presencia  de  AuAAC,  tanto  en  el  caldo  de  fermentación 
como  en  los  extractos  celulares,  mediante  detección  de  la  enzima  por  electroforesis  en 
geles de acrilamida al 12,5%. Las muestras ensayadas fueron: 

- Se tomaron alícuotas de 1 ml de los caldos libres de células y se procedió a 
precipitar  las  proteínas  mediante  la  adición  de  1,5  ml  de  acetona.  Las 
proteínas  precipitadas,  tras  eliminar  los  restos  de  acetona  por 
evaporación  a  temperatura  ambiente,  se  resuspendieron  en  20  µl  de 
tampón  de  ruptura  y  se  sometieron  a  electroforesis  en  geles  de 
poliacrilamida  en  presencia  de  SDS  (apartado  24.1  de  Materiales  y 
Métodos). 
- Las  células  presentes  en  2  ml  de  cultivo,  tras  su  centrifugación,  se 
resuspendieron  directamente  en  100  µl  de  tampón  de  muestra  y  se 
calentaron a 90 ºC durante 15 minutos y finalmente se aplicaron 20 µl en 
un  gel  de  electroforesis  de  proteínas  SDS‐PAGE  (apartado  24.1de 
Materiales y Métodos). 

19.2 Clonación y expresión del gen aac en S. lividans 

El  gen  aac  de  A.  utahensis  NRRL  12052  se  clonó  en  S.  lividans  1326,  usando  como 
vector de expresión el plásmido pEM4 (Quiros y col., 1998), Tabla 9. 

65
 Materiales y Métodos 

10  µg  del  plásmido  recombinante  pAAC12  se  cortaron  con  las  enzimas  de 
restricción XbaI y EcoRI. La digestión se llevó a cabo en un volumen de 40 µl, en el tampón 
recomendado  por  el  fabricante  que  permite  la  actividad  de  ambas  enzimas.  Las 
digestiones  se  realizaron  de  forma  secuencial  como  se  describe  en  el  apartado  17.6.2  de 
Materiales  y  Métodos  en  el  caso  de  la  construcción  del  plásmido  pASL‐7.  Se  obtuvo  el 
fragmento AAC12 de 2,3 kb que contiene el gen aac y que se purificó por Gene‐Clean. 

Paralelamente,  se  digirieron  3  µg  del  plásmido  pEM4  con  las  enzimas  de 
restricción  EcoRI  y  XbaI,  en  las  mismas  condiciones  que  la  digestión  del  plásmido 
pAAC12. 

2 µg del fragmento AAC12 se ligaron con 1 µg del plásmido pEM4 linealizado en 
un volumen de 20 µl. La ligación se realizó con la enzima T4 ADN ligasa, durante toda la 
noche  a  4 ºC.  10  µl  de  la  mezcla  de  ligación  se  utilizaron  para  transformar  células 
competentes  de  E.  coli  DH5α.  Las  células  transformantes  se  seleccionaron  en  medio  LB 
sólido  con  ampicilina  y  mediante  mini‐prep  de  colonias.  Se  obtuvo  así  el  clon 
recombinante E. coli DH5α (pAACAU). El plásmido recombinante pAACAU se purificó y 
el inserto se secuenció usando como cebadores los oligonucleótidos AAC‐1, AAC‐2, AAC‐
4, AAC‐5, AAC‐6, AACnt y AACct (Tabla 11) y pEM4‐5´ y pEM4‐3´ (Tabla 12) con el fin 
de constatar la ausencia de mutaciones. 

El plásmido pAACAU se utilizó para transformar protoplastos de S. lividans 1326. 
Para ello se llevó a cabo el protocolo descrito en el apartado 8 de Material y Métodos. El 
análisis  de  los  clones  recombinantes  permitió  obtener  el  clon  S.  lividans  (pAACAU),  que 
fue depositado bajo patente en la Colección Española de Cultivos Tipo con el nombre de 
S. lividans CECT 3377. 

Con los clones recombinantes se determinó la actividad penicilina V acilasa, para 
ello se llevaron a cabo fermentaciones en medio TSB en volúmenes de 10 ml de medio, en 
matraces de 25 ml, a 30 ºC y 250 rpm en un incubador  New Brunswick Scientific  (USA) 
con agitación orbital, a un tiempo final de 140 horas. Se tomaron alícuotas cada 24 horas y 
se  realizaron  ensayos  de  actividad  utilizando  penicilina  V  como  sustrato,  el  6‐APA 
liberado  se  cuantificó  mediante  el  ensayo  del  PDAB  (apartado  22.1  de  Materiales  y 
Métodos).  Como  controles  negativos  se  realizaron  fermentaciones  en  las  mismas 
condiciones con S. lividans 1326 y S. lividans (pEM4). 

El  plásmido  pAACAU  se  purificó  y  secuenció  para  comprobar  la  ausencia  de 
mutaciones en el gen aac. 

66
Materiales y Métodos 

20. AISLAMIENTO  Y  PURIFICACIÓN  DE  AuAAC  PRODUCIDA  EN  S. 

lividans CECT 3377 

La  enzima  AuAAC  producida  por  el  microorganismo  recombinante,  S.  lividans 
CECT 3377 ha sido purificada en dos pasos cromatográficos. La producción de la enzima 
se  llevó  a  cabo  por  fermentación  en  medio  TSB.  Para  ello,  200  ml  de  medio  TSB,  en 
matraces de 0,5 l, se inocularon con 2x106 esporas/ml de cultivo. La fermentación se llevó 
a cabo a 30 ºC durante 96 horas y a 250 rpm en un incubador New Brunswick Scientific 
(USA) con agitación orbital. Finalizada la fermentación las células se eliminaron mediante 
centrifugación a 9.000 xg durante 30 minutos a 4 ºC. El caldo de fermentación se ajustó a 
pH 6 por la adición de HCl 1 N. 

La  detección  y  cuantificación  de  AuAAC  en  cada  paso  de  purificación  se  realizó 
mediante  ensayos  de  hidrólisis  de  penicilina  V,  utilizando  el  método  del  PDAB  para  la 
cuantificación  del  6‐APA  liberado  (apartado  22.1  de  Materiales  y  Métodos).  También  se 
siguió el proceso de purificación mediante análisis de las proteínas presentes en cada paso 
por  electroforesis  en  geles  de  poliacrilamida  en  condiciones  desnaturalizantes  (apartado 
24.1 de Materiales y Métodos). 

20.1 Cromatografía de intercambio iónico S‐Sepharose (Fast‐Flow) 

300 ml de caldo de fermentación ajustado a pH 7 se aplicaron a una columna de S‐
Sepharose (2,5 x 30 cm) equilibrada en tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7. La columna 
se  eluyó  isocráticamente  con  200  ml  del  mismo  tampón  y  la  proteína  eluyó  mediante  la 
aplicación  de  un  gradiente  continuo  de  0  a  1  M  de  NaCl  en  tampón  fosfato  potásico  10 
mM,  pH  7  (150  ml),  seguido  de  una  elución  isocrática  con  150  ml  de  tampón  fosfato 
potásico 10 mM, pH 7 con 1 M de NaCl. 

La cromatografía se llevó a cabo a temperatura ambiente mediante un sistema de 
cromatografía  rápida  para  proteínas  (Fast  Performance  Liquid  Chromatography,  FPLC)  de 
Amersham‐Pharmacia  (Suecia)  y  con  un  flujo  de  elución  de  1  ml/min.  Se  recogieron 
fracciones de 1,5 ml.  

20.2 Cromatografía de penetrabilidad Superose 12 (Fast‐Flow) 

Las  fracciones  eludías  de  la  cromatografía  de  intercambio  iónico  en  las  que  se 
detectó  la  presencia  de  AuAAC  se  juntaron  y  fueron  concentradas  en  un  lecho  de  PEG‐
35000 hasta reducir su volumen y, a continuación, se aplicaron en una columna Superose 

67
 Materiales y Métodos 

12  (1,5  x  30  cm)  equilibrada  en  tampón  fosfato  50  mM,  pH  7.  La  AuAAC  fue  eluída 
isocráticamente con tampón fosfato 50 mM pH 7. 

Al igual que la cromatografía anterior, ésta se llevó a cabo a temperatura ambiente 
mediante  un  sistema  de  cromatografía  rápida  para  proteínas  (Fast  Performance  Liquid 
Chromatography,  FPLC)  de  Amersham‐Pharmacia  (Suecia)  con  un  flujo  de  elución  de  0,5 
ml/min. Se recogieron fracciones de 1 ml. 

21. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNA 

La determinación de la concentración de proteínas presente en cada muestra se ha 
llevado a cabo mediante el método colorimétrico de Bradford (Bradford, 1976), utilizando 
un  reactivo  comercial  (Protein  Reagent  de  Bio‐Rad).  A  800  μl  de  muestra,  a  la  dilución 
adecuada  en  agua  destilada,  se  añadieron  200  μl  de  reactivo.  Tras  agitación  vigorosa,  la 
reacción  se  incubó  durante  10  minutos  a  temperatura  ambiente.  A  continuación  se  ha 
medido  la  absorbancia  de  las  muestras  a  588,4  nm  en  un  espectrofotómetro  DU‐70 
(Beckman, USA) en una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso óptico.  

La recta patrón se construye utilizando disoluciones de concentraciones crecientes 
de albúmina de suero bovino. Todos los ensayos se han realizado por triplicado. 

22. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD PENICILINA V ACILASA 

Los  métodos  de  valoración  de  la  actividad  penicilina  acilasa  empleados  en  este 
trabajo  se  basan  en  la  cuantificación  del  grupo  amino  del  ácido  6‐aminopenicilánico  (6‐
APA)  que  queda  libre  tras  la  hidrólisis  del  enlace  amida  de  la  cadena  lateral  de  la 
penicilina. 

Todos  los  ensayos  se  han  realizado  por  triplicado.  La  actividad  enzimática  se 
cuantifica como unidades internacionales (UI) que se definen como la cantidad de enzima 
que produce 1 µmol de 6‐APA por minuto en las condiciones de ensayo. 

68
Materiales y Métodos 

22.1 Método del PDAB 

El método se basa en que al poner en contacto el ácido 6‐aminopenicilánico con el 
p‐dimetilaminobenzaldehído  (PDAB)  a  pH  ácido,  el  grupo  aldehído  de  este  último 
reacciona  con  el  amino  libre  del  6‐APA  formándose  una  base  de  Schiff.  El  compuesto 
formado presenta un máximo de absorción a 414 nm (Balasingham y col., 1972), por lo que 
puede  valorarse  colorimétricamente.  El  método  permite  valorar  concentraciones  de  6‐
APA de 50‐100 μM. 

El ensayo para determinar la actividad penicilina acilasa se realiza añadiendo 150 
µl de solución enzimática, equilibrada en tampón fosfato potásico 50 mM, pH 8, a 150 µl 
de penicilina V (45 mg/ml). La reacción se incuba 30 minutos a 40 ºC en un baño de agua 
con  agitación  en  vaivén  (Unitron  250  OR,  Selecta,  España)  y  se  detiene  mediante  la 
adición  de  0,9  ml  de  ácido  acético  al  20%  (v/v)  e  incubando  las  muestras  en  hielo. 
Seguidamente  la  mezcla  se  centrifuga  2  minutos  a  9.000  xg  y  se  recogen  0,3  ml  de 
sobrenadante. A estos 0,3 ml se les añade 0,1 ml de PDAB al 0,5% (p/v) en metanol. Tras 2 
minutos de incubación se mide la absorbancia de las muestras a 414 nm en placas de 96 
pocillos en un lector de placas DigiScan 340 (ASYS HITECH GMBH, Alemania).  

La  actividad  se  cuantifica  utilizando  una  recta  patrón  construida  con 
concentraciones crecientes de 6‐APA. 

22.2 Método del fluram 

Este  método  se  basa  en  la  capacidad  de  la  fluorescamina  (fluram)  de  reaccionar 
con los grupos amino primarios, dando lugar a un fluoróforo muy estable (Udenfriend y 
col., 1972). Así, el fluram va a reaccionar con el grupo amino libre del 6‐APA. El fluoróforo 
formado  puede  medirse  colorimétricamente  a  378  nm.  Con  este  método  de  ensayo  se 
consigue una mayor sensibilidad en la valoración del 6‐APA producido.  

El ensayo para determinar la actividad penicilina acilasa se realiza añadiendo 75 µl 
de  solución  enzimática,  equilibrada  en  tampón  fosfato  potásico  0,1  M,  pH  8,  a  25  µl  de 
solución de penicilina V (45 mg/ml). La reacción se incuba 20 minutos a 40 ºC en un baño 
de agua con agitación en vaivén, y se detiene mediante adición de 0,4 ml de acetato sódico 
0,5 M, pH 4,5. Seguidamente la mezcla se centrifuga 2 minutos a 9.000 xg y se recogen 0,45 
ml  de  sobrenadante.  A  estos  0,45  ml  se  les  añade  50  µl  de  solución  de  fluram  (0,1%  en 
acetona). Tras 40 minutos de incubación a temperatura ambiente se mide la absorbancia a 
378 nm en un espectrofotómetro modelo DU‐70 en una cubeta de cuarzo de 1 cm de paso 
óptico. 

69
 Materiales y Métodos 

La  actividad  se  cuantifica  utilizando  una  recta  patrón  construida  con 
concentraciones crecientes de 6‐APA. 

23. OBTENCIÓN DE ANTICUERPOS ANTI‐SlPVA 

Los anticuerpos anti‐SlPVA se obtuvieron mediante la inmunización de un conejo 
con la enzima pura. El proceso de inmunización se llevo a cabo en tres etapas, en cada una 
de  las  cuales  se  inyectó  intramuscularmente  al  animal  0,3  µg  de  SlPVA  pura.  En  la 
primera  etapa  se  inyectó  la  enzima  junto  con  el  coadyuvante  de  Freund  incompleto  en 
tampón  PBS  (Phosphate  Buffer  Saline),  (NaCl  8  g/l,  KCl  0,2  g/l,  Na2HPO4  1,44  g/l  KH2PO4 
0,24  g/l,  pH  7,4).  En  la  segunda  y  tercera  etapa  de  inmunización  junto  con  la  enzima  se 
añadió  el  coadyuvante de  Freund  completo.  Entre  cada  administración  de  la  proteína  al 
conejo se dejo transcurrir tres semanas. Tras pasar tres semanas de la última inmunización 
se  extrajo  la  sangre  del  conejo  y  se  incubó  a  37  ºC  durante  30  minutos  dando  lugar  a  la 
formación  del  coágulo,  el  cual  se  incubó  a  4  ºC  durante  toda  la  noche  con  el  fin  de 
producir su retracción. Tras centrifugar a 1.500 xg durante 30 minutos se obtuvo el suero 
sanguíneo y se procedió a la desactivación del complemento incubándolo 30 minutos a 56 
ºC. 

Finalmente, el suero se incubó con extracto celular de E. coli a 37 ºC para bloquear 
posibles uniones inespecíficas entre al anticuerpo y las proteínas de E. coli. Finalmente el 
suero se alicuotó y almacenó a ‐80 ºC. 

24. TÉCNICAS ELECTROFORÉTICAS DE PROTEÍNAS 

24.1 Electroforesis de proteínas en condiciones desnaturalizantes 

Las  electroforesis  de  proteínas  en  condiciones  desnaturalizantes  se  han  llevado  a 
cabo en geles de poliacrilamida en presencia de SDS al 0,1% (SDS‐PAGE), excepto en las 
electroforesis utilizadas para realizar electrotransferencias a membranas de PVDF donde 
la  concentración  de  SDS  fue  del  0,2%.  Los  geles  de  poliacrilamida  se  prepararon  a  una 
concentración de acrilamida/bis‐acrilamida del 12,5% en la zona separadora y del 4% en la 
concentrante (Laemmli, 1970). Las electroforesis fueron realizadas en cubeta Miniprotean 
de  Bio‐Rad  (USA).  La  tinción  de  proteínas  en  el  gel  se  realizó  utilizando  una  mezcla  de 
metanol:acético:agua  destilada  en  proporciones  46:8:46  con  un  0,1%  (p/v)  de  azul  de 

70
Materiales y Métodos 

Coomassie  G‐250.  El  exceso  de  colorante  se  eliminó  mediante  sucesivos  lavados  en  una 
mezcla de metanol:acético:agua (20:8:73). 

Como  marcadores  de  masa  molecular  se  utilizaron  los  patrones  preteñidos  SDS‐
PAGE con un intervalo amplio de masas y patrones no preteñidos SDS‐PAGE, ambos de 
Bio‐Rad (USA).  

24.2 Electrotransferencia  de  proteínas  a  membranas  de  nitrocelulosa  e 

inmunodetección de SlPVA (Western blot) 

Las  proteínas  separadas  mediante  electroforesis  fueron  transferidas  a  una 

membrana de nitrocelulosa (Bio‐Rad) en cubetas de transferencia Mini Trans‐Blot® de Bio‐
Rad a 20 mA durante toda la noche, en tampón Tris‐HCl 10 mM, glicina 10 mM, metanol 
10% (v/v) a pH 8,3. 

Una vez transferidas las proteínas a la membrana de nitrocelulosa, se procedió al 
bloqueo  de  la  misma  con  el  fin  de  que  los  anticuerpos  no  se  unieran  inespecíficamente. 
Para ello se procedió a la incubación de la membrana en primer lugar con una disolución 
de  leche  desnatada  en  polvo  al  4%  (p/v)  en  tampón  PBS,  durante  1,5  horas  a  37 ºC.  A 
continuación,  se  procedió  a  lavar  la  membrana  tres  veces  durante  10  minutos  cada  una 
con tampón PBS con Tween‐20 al 0,1%. Por último se incubó durante 2 horas a 37 ºC con 
el  suero  con  anticuerpos  Anti‐SlPVA  diluido  1/5.000  en  el  tampón  anterior  con  leche 
desnatada  en  polvo  al  1,33%  (p/v).  El  exceso  de  suero  se  eliminó  mediante  sucesivos 
lavados  de  la  membrana  con  tampón  PBS  con  Tween‐20  al  0,1%,  durante  10  minutos  a 
temperatura ambiente. Finalmente se incubó la membrana durante 1 hora a temperatura 
ambiente con el anticuerpo inmunoconjudado de cabra anti‐conejo en PBS con Tween‐20 
0,1%  y  leche  desnatada  en  polvo  al  1,33%  (p/v)  y  se  eliminó  el  exceso  de 
inmunoconjugado  lavando  de  nuevo  con  tampón  de  bloqueo  durante  10  minutos  y 
después con PBS para eliminar el exceso de detergente. 

El  resultado  de  la  inmunodetección  se  reveló  añadiendo  diaminobencidina  (5 
mg/ml)  en  PBS  con  peróxido  de  hidrógeno  (0,3  μl/ml).  Tras  el  desarrollo  del  color  se 
eliminó el exceso de diaminobencidina lavando la membrana con agua. 

24.3 Electrotransferencia de proteínas a membranas de PVDF y análisis de la secuencia 

aminoterminal. 

Para la secuenciación de los extremos aminoterminales de las subunidades α, β y β 
truncada  de  SlPVA  la  enzima  se  obtuvo  y  purificó  según  los  métodos  descritos 

71
 Materiales y Métodos 

previamente por Torres y col. (1998, 1999). Las subunidades de SlPVA separadas mediante 
electroforesis  se  transfirieron  a  una  membrana  de  PVDF  (Immobilon-PSQ de Millipore)  en 
cubetas  de  transferencia  Mini  Trans‐Blot®  de  Bio‐Rad  a  20 mA  durante  toda  la noche  en 
tampón Tris‐HCl 10 mM, glicina 10mM, 0,2% de SDS. Al tampón del electrodo superior se 
le  añadió  tioglicolato  (10  µg/ml).  La  detección  de  proteínas  en  la  membrana  se  realizó 
mediante tinción con Negro amido 0,1% (p/v) en ácido acético al 10% (v/v). 

Las bandas de proteína se recortaron para su secuenciación en un secuenciador de 
proteínas Applied Biosystems del servicio de secuenciación del Centro de Investigaciones 
Biológicas del C.S.I.C. 

25. CARACTERIZACIÓN FUNCIONAL DE LAS ACILASAS 

PRODUCIDAS POR LOS MICROORGANISMOS RECOMBINANTES 

Todos los ensayos realizados para llevar a cabo los estudios de las enzimas SlPVA 
producida  por  S.  lividans  CECT  3376  y  AuAAC  producida  por  S.  lividans  CECT  3377 
fueron llevados a cabo por triplicado. 

25.1 Estudios de estabilidad y actividad respecto al pH 

El  tampón  utilizado  para  llevar  a  cabo  los  estudios  de  estabilidad  y  actividad  de 
variación  de  pH  fue  un  sistema  de  tampones  borato/fosfato  potásico  10  mM  a  fuerza 
iónica constante (50 mM). 

25.1.1 Estabilidad frente al pH 

0,1 µg de enzima se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente en un 
intervalo  entre  pH  7,5  y  pH  11.  Tras  la  incubación,  las  enzimas  se  ajustaron  a  pH  8 
mediante la adición de tampón fosfato potásico hasta una concentración final de 0,1 M. La 
actividad de hidrólisis de penicilina V retenida a cada pH se determinó por el método del 
fluram (apartado 22.2 de Material y Métodos). 

25.1.2 Estudio del pH óptimo 

0,1  µg  de  enzima  han  sido  ensayados  en  cada  pH.  La  actividad  se  determinó 
utilizando  penicilina  V  como  sustrato  mediante  el  método  del  fluram  (apartado  22.2  de 
Materiales y Métodos). 

72
Materiales y Métodos 

25.2 Estudios de estabilidad y actividad respecto a la temperatura 

Las  temperaturas  utilizadas  para  realizar  los  estudios  de  estabilidad  y  actividad 
frente a la variación de temperatura estuvieron comprendidas en un intervalo entre 35 ºC 
y 60 ºC. Todos los ensayos se realizaron en tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 8.  

25.2.1 Estabilidad frente a la temperatura 

0,1  µg  de  las  enzimas  se  incubaron  durante  20  minutos  a  distintas  temperaturas. 
Las incubaciones se detuvieron en hielo. Tras 20 minutos en hielo la actividad retenida de 
hidrólisis  de  penicilina  V  a  cada  temperatura  se  determinó  por  el  método  del  fluram 
(apartado 22.2 de Material y Métodos). 

25.2.2 Estudio de la temperatura óptima  

0,1  µg  de  enzima  se  han  utilizado  en  cada  uno  de  los  ensayos  de  actividad  de 
hidrólisis  de  penicilina  V  en  cada  una  de  las  temperaturas.  La  actividad  se  determinó 
mediante el método del fluram (apartado 22.2 de Materiales y Métodos). 

25.3 Estudio de la actividad enzimática respecto a la fuerza iónica 

Todos  los  ensayos  realizados  para  llevar  a  cabo  el  estudio  de  la  actividad  de  las 
enzimas SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 y AuAAC producida por S. lividans 
CECT 3377 se han llevado a cabo por triplicado. 

El  estudio  del  efecto  de  la  fuerza  iónica  sobre  la  actividad  se  ha  llevado  a  cabo 
realizando distintos ensayos de actividad de hidrólisis de penicilina V a diferentes fuerzas 
iónicas.  La  variación  de  la  fuerza  iónica  en  cada  ensayo  se  realizó  por  adición  de  NaCl 
hasta una concentración de 3 M al tampón de reacción (fosfato potásico 0,1 M, pH 8). Para 
llevar a cabo el ensayo se utilizaron 0,1 µg de enzima. La actividad se determinó mediante 
el método del fluram (apartado 22.2 de Materiales y Métodos). 

25.4 Determinación de los parámetros cinéticos de la acilasas frente a distintas 

penicilinas 

Los parámetros cinéticos, Km, kcat y kcat/Km, de las enzimas SlPVA producida por S. 
lividans CECT 3376 y AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 han sido determinados 
frente a las distintas penicilinas naturales: penicilina V, F, dihidroF, K y G. 

73
 Materiales y Métodos 

Para  ello,  se  han  utilizado  0,5  µg  de  enzima  en  ensayos  de  actividad  con 
concentraciones  crecientes  de  los  diferentes  sustratos.  En  el  caso  de  SlPVA,  todos  los 
ensayos  se  han  realizado  en  tampón  fosfato  potásico  0,1  M,  pH  8  a  40 ºC,  durante  un 
tiempo  de  incubación  de  20  minutos  y  en  un  volumen  de  0,1  ml.  En  el  caso  de  AuAAC 
todos  los  ensayos  se  han  realizado  en  tampón  fosfato  potásico  0,1  M,  pH  8  a  45 ºC, 
durante un tiempo de incubación de 15 minutos y en un volumen de 0,1 ml. La actividad 
hidrolítica  se  ha  determinado,  en  cada  caso,  por  valoración  del  6‐APA  producido 
mediante el método del fluram (apartado 22.2 de Materiales y Métodos). Los parámetros 
cinéticos se han determinado ajustando los datos a la ecuación de Hanes‐Woolf, Ecuación 
1  (Segel,  1975)  para  lo  que  se  utilizó  el  programa  informático  Hiperbolic  Regression 
(http://homepage.ntleorld.com/jon.easterby/sofware.html).  

 
[s] = 1
[s] + Km Ecuación 1 
V Vmax Vmax
 

26. CARACTERIZACIÓN ESTRUCTURAL DE LAS ACILASAS 

PRODUCIDAS POR LOS MICROORGANISMOS RECOMBINANTES 

26.1 Espectro de absorción UV‐visible 

El  espectro  de  absorción  de  las  enzimas  SlPVA  producida  por  S.  lividans  CECT 
3376 y AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 en la región UV‐visible se ha llevado 
a cabo en un espectrofotómetro DU‐70 (Beckman, USA), utilizando una cubeta de cuarzo 
de  1  cm  de  paso  óptico.  La  cantidad  de  enzima  utilizada  fue  de  0,1  mg/ml  en  tampón 
fosfato potásico 10 mM, pH 7 y 0,1 M de NaCl. 

26.2 Cálculo del coeficiente de extinción molar 

El cálculo del coeficiente de extinción molar de la SlPVA producida por S. lividans 
CECT 3376 y la AuAAC producida por S. lividans CECT  3377 se han llevado a cabo con 
una  solución  de  enzima  pura  de  70  µg/ml.  Para  el  cálculo  cada  una  de  las  enzimas  se 
incubó  durante  3  horas  a  37 ºC  en  tampón  fosfato  20  mM,  pH  6  que  contenía  6  M  de 
cloruro de guanidinio.  

74
Materiales y Métodos 

El  coeficiente  de  extinción  molar  se  determinó  según  el  método  de  Edelhoch 
(Edelhoch, 1967). Se midieron las absorbancias a 280 nm de las enzimas SlPVA y AuAAC 
nativas en tampón fosfato potásico 20 mM, pH 6, y de ambas desplegadas en presencia de 
cloruro  de  guanidinio.  Como  blancos  se  utilizaron  los  tampones.  Las  medidas  han  sido 
realizadas en un espectrofotómetro DU‐70 (Beckman, USA). Para el cálculo del coeficiente 
de extinción molar se utilizó la Ecuación 2. 

 
Αnat εnat Ecuación 2 
=
  Αdes εdes

Donde Anat y Ades son los valores de absorbancia a 280 nm de la proteína nativa y 
desplegada,  respectivamente,  y  εdes  es  el  coeficiente  de  extinción  molar  de  la  proteína 
desplegada, calculado según la secuencia de aminoácidos de las proteínas con ayuda del 
programa  ProtParam  http://us.expasy.org/cgi‐bin/protoparam  (Gill  y  von  Hippel,  1989). 
Tras sustituir estos valores, se pudo calcular εnat es el coeficiente de extinción molar de la 
proteína nativa. 

26.3 Espectroscopia de fluorescencia  

Los  espectros  de  fluorescencia  de  SlPVA  producida  por  S.  lividans  CECT  3376  y 
AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 se han realizado en un espectrofluorímetro 
Sm‐Aminco  8000.  Las  cubetas  utilizadas  fueron  de  0,4  cm  y  1  cm  de  paso  óptico  de 
excitación  y  emisión  respectivamente.  La  anchura  de  rendija  empleada  fue  5  nm  para 
ambos  haces  (excitación  y  emisión).  El  voltaje  se  ajustó  en  cada  caso  para  obtener  una 
señal  dentro  del  intervalo  del  registro  como  se  indica  en  cada  figura.  La  velocidad  de 
barrido fue 60 nm/min. Se registraron los espectros de fluorescencia tras excitar a 275 nm 
y 295 nm. 

La  concentración  de  proteína  utilizada  fue  de  0,1  mg/ml  en  tampón  fosfato 
potásico 50 mM, pH 7. 

26.4 Dicroísmo circular 

Los  espectros  de  dicroísmo  circular  en  el  ultravioleta  lejano  de  SlPVA  producida 
por  S.  lividans  CECT  3376  y  de  AuAAC  producida  por  S.  lividans  CECT  3377  se  han 
obtenido utilizando un dicrógrafo Jasco J‐715 (Japón). Para ello, se utilizó una cubeta de 
0,1  cm  de  paso  óptico.  La  concentración  de  enzima  utilizada  en  ambos  casos  ha  sido  de 

75
 Materiales y Métodos 

0,28  mg/ml  en  tampón  fosfato  potásico  50  mM,  pH  7.  El  espectro  se  realizó  a  25 ºC, 
midiéndose la elipticidad molar entre 175 y 240 nm. 

También se ha analizado la desnaturalización térmica de ambas enzimas mediante 
la medida de la variación de su elipticidad molar a 222 nm en el caso de SlPVA y 220 nm 
en  el  de  AuAAC  en  el  intervalo  de  temperaturas  entre  25‐85 ºC,  a  una  velocidad  de 
cambio de temperatura de 20 ºC/hora. 

A partir de los datos del dicroísmo circular en la región del UV lejano se determinó 
el  contenido  en  estructura  secundaria  de  SlPVA  y  de  AuAAC  empleando  para  ello  dos 
programas  informáticos:  el  CCA  (Convex  Constrain  Analysis)  (Perczel  y  col.,  1991)  y  el 
CDNN  V2.0.3.188  (Böhm  y  col.,  1992).  Ambos  programas  detectan  patrones  y 
correlaciones  entre  los  espectros  de  dicroísmo  circular  de  una  serie  de  proteínas  cuya 
estructura tridimensional es conocida por cristalografía de rayos X. 

Paralelamente,  y  con  el  fin  de  llevar  a  cabo  la  predicción  de  la  estructura 
secundaria  en  función  de  la  secuencia  de  aminoácidos  de  SlPVA  y  de  AuAAC  se  han 
utilizado  tres  programas  informáticos  diferentes  basados  en  el  alineamiento  múltiple  de 
las secuencias de las proteínas con otras de estructura conocida. Los métodos empleados 
son: 

- PSIpred ((McGuffi y col., 2000), http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred 
- PHD (Rost y Sander, 1994), http://cubil.bioc.columbia.edu/predictprotein 
- JUFO (Meiler y col., 2001), www.jens‐meiler.de. 

26.5 Modelización de la estructura terciaria 

Se ha realizado un modelo de la posible estructura terciaria de las subunidades β 
de  las  enzimas  SlPVA  producida  por  S.  lividans  CECT  3376  y  AuAAC  producida  por  S. 
lividans  CECT  3377  según  su  secuencia  de  aminoácidos.  Los  modelos  se  han  realizado 
utilizado el programa CPH models 2.0 server (www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels), que 
compara  la  secuencia  de  aminoácidos  de  una  proteína  problema  con  una  base  de  datos 
que  incluye  la  secuencia  de  aminoácidos  de  proteínas  con  la  estructura  tridimensional 
resuelta  por  rayos  X.  De  esta  manera  constituye  un  modelo  estructural  a  partir  de  la 
proteína o proteínas que presenten una mayor identidad con la proteína problema. En los 
casos de la subunidad β de SlPVA y de AuAAC el programa ha utilizado como modelo la 
subunidad  β de  la enzima glutaril  7‐ACA acilasa de Pseudomonas sp. (código PDB 1gk1) 
con  la  que  presentan  una  identidad  del  27,9%  y  del  26,1%,  respectivamente.  No  se  ha 
encontrado  un  modelo  adecuado  para  la  modelización  de  la  estructura  terciaria  de  las 
subunidades α de ambas enzimas. 

76
 

RESULTADOS

77
Resultados 

I. CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE LA PENICILINA V 

ACILASA DE S. lavendulae ATCC 13664 

1. SECUENCIACIÓN DEL GEN QUE CODIFICA EL ARNr 16s DE S. 

lavendulae ATCC 13664 

Con  el  fin  de  constatar  la  clasificación  del  microorganismo  S.  lavendulae  ATCC 
13664  se  ha  llevado  a  cabo  la  amplificación  y  secuenciación  de  la  secuencia  génica  que 
codifica su ARNr 16s. La amplificación mediante PCR del ADN total del microorganismo, 
utilizando como cebadores los oligonucleótidos consenso 63f y 1387r, Tabla 12 (Marchesi y 
col.,  1998) y  utilizando  el  programa  de  amplificación  16s  rADN  (Tabla  13)  ha  permitido 
obtener un fragmento de ADN de 1,3 kb, que se ha purificado y clonado en E. coli DH5α 
utilizando como vector el plásmido pGEM-T Easy vector (Tabla 9), obteniéndose  el 
microorganismo  recombinante  E.  coli  DH5α  (pGEM16SRNASl‐1)  que  contiene  el  ADNr 
16s de S. lavendulae ATCC13664. La secuenciación del inserto del plásmido recombinante 
pGEM16SRNASl‐1  ha  proporcionado  la  secuencia  que  codifica  el  ARNr  16s  de  S. 
lavendulae ATCC 13664 (Figura 11). 

 
CAGGCCTNTCACATGCAAGTCGAACGATGAAGCTCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGG 60
  GTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTA
ATACCGGATAACACTCTGTCCCGCATGGGACGGGGTTAAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATG
120
180
AGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGC 240
  CGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAG 300
GCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGG 360
ATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCT 420
  GCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCG 480
TTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAG 540
CCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGA 600
  TCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCANATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAG 660
GCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTA 720
GATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTC 780
  GTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAA 840
ACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCA 900
ACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCC 960
  TTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGT 1020
TAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATG 1080
GGGACTCACAGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCAT 1140
  CATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGAT 1200
GCCGCGAGGCGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTC 1260
GACCCCATGAAGTCGGAGTTGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTT 1320
  CCCGGGCCTTGTACACTCCTCCCA 1344

Figura 11. Secuencia del gen que codifica el ARNr 16s de S. lavendulae ATCC 13664. 

La  secuencia  obtenida  se  ha  analizado  utilizando  el  servidor  Ribosomal  Database 
Project  II  (http://rdp.cme.msu.edu/html/)  que  se  encuentra  enfocado  en  el  análisis  de  las 
secuencias  de  los  ARNr  y  que  dispone  de  una  amplia  base  de  datos  de  secuencias  que 

79
 Resultados 

codifican los ARNr de numerosas especies, además de presentar los programas necesarios 
para  su  comparación.  El  análisis  preliminar  de  la  secuencia  del  ARNr  16s  ha  permitido 
constatar  la  clasificación  de  S.  lavendulae  ACTT  13664  de  acuerdo  a  la  siguiente  escala 
filogenética:  

Dominio: Bacteria 
  Phylum: Actinobacteria 
    Clase: Actinobacteria 
      Orden: Actinomycetales 
        Familia: Streptomycetaceae 
          Género: Streptomyces 

Se  ha  llevado  a  cabo  un  estudio  comparativo  con  diferentes  especies  del  género 
Streptomyces.  El  resultado  ha  permitido  obtener  un  dendograma  (Figura  12),  donde  se 
pueden observar las relaciones filogenéticas que se dan entre S. lavendulae ATCC 13664 y 
las diferentes especies de Streptomyces. Cabe destacar la elevada similitud que presenta en 
relación  a  las  diferentes  especies  de  S.  griseus,  sin  embargo,  se  observa  una  mayor 
diferencia respecto a las otras especies de S. lavendulae descritas.  

 
 
 
Figura 12. Árbol filogenético del género Streptomyces, construido a partir de la secuencia génica del ARNr 16s. 

80
Resultados 

2. OBTENCIÓN DE UNA GENOTECA DE S. lavendulae ATCC 13664 EN E. 

coli HB101 

Con el fin de obtener el gen pva que codifica la enzima penicilina V acilasa de S. 
lavendulae ATCC 13664 (SlPVA) se procedió a la realización de genotecas en E. coli. Para 
ello  se  realizaron  digestiones  parciales  sobre  el  ADN  total  de  S.  lavendulae  ATCC  13664 
con  las  enzimas  de  restricción  Sau3A,  BamHI,  EcoRI,  HindIII,  PstI,  SalI  y  XhoI,  como  se 
describe en el apartado 17.1 de Materiales y Métodos. Como vectores para llevar a cabo la 
genoteca se utilizaron los plásmidos pUC18 y pIN‐III‐A3. La cepa utilizada para realizar 
la  genoteca  fue  E.  coli  HB101,  bacteria  auxótrofa  para  L‐leucina  y  L‐prolina,  ya  que  se 
pretende seleccionar los clones positivos que presenten el gen pva por complementación 
de  auxotrofía,  de  manera  que  los  que  expresen  la  enzima  SlPVA  van  a  hidrolizar 
hidroxiacetil‐L‐leucina, adicionada al medio mínimo M63, liberando L‐leucina, por lo que 
quedará  disponible  para  la  célula  hospedadora  y  podrá  crecer  (apartado  17.1  de 
Materiales y Métodos). 

El  análisis  de  la  transformaciones  realizadas  en  E.  coli  HB101  con  las 
construcciones  realizadas  con  las  ligaciones  de  las  diferentes  digestiones  con  los  dos 
plásmidos no ha permitido observar ninguna célula que manifestase el fenotipo deseado, 
por lo que se puede concluir que ninguna presenta el gen pva. Posiblemente se deba a que 
este método requiere una buena expresión por parte del organismo hospedador. En este 
caso hay que considerar la diferencia en el uso de codones que se da entre Streptomyces y 
E. coli. 

El  resultado  obtenido  hizo  plantear  y  abordar  una  nueva  estrategia  para  la 
obtención del gen pva. 

3. AMPLIFICACIÓN,  CLONACIÓN  Y  SECUENCIACIÓN  DEL  GEN  pva 

DE S. lavendulae ATCC 13664 MEDIANTE PCR 

En  vista  de  que  la  obtención  del  gen  pva  mediante  genoteca  en  E.  coli  no  dio  un 
resultado  positivo,  se  ha  abordado  otra  estrategia  diferente.  El  método  elegido  ha  sido 
mediante amplificación del gen por Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). 

81
 Resultados 

3.1 Secuenciación de los extremos N‐terminales de SlPVA 

Con  la  finalidad  de  diseñar  oligonucleótidos  que  sirvieran  de  cebadores  para  las 
reacciones  de  amplificación  por  PCR  del  gen  pva  se  procedió  a  la  secuenciación  de  los 
extremos N‐terminales de las dos subunidades, α y β, de SlPVA así como de la subunidad 
β  truncada,  que  se  origina  espontáneamente  a  partir  de  la  enzima  pura  durante  su 
conservación a 4 ºC (Torres‐Guzmán y col., 2001c). Para ello, tras producir la enzima por 
fermentación de S. lavendulae ATCC 13664 se procedió a su purificación de acuerdo con el 
método  descrito  previamente  (Torres  y  col.,  1998;  Torres  y  col.,  1999)  y  se  sometió  a 
electroforesis en geles de poliacrilamida. Seguidamente, se transfirió a una membrana de 
PVDF para separar las subunidades de la enzima y poder secuenciarlas (apartado 24.3 de 
Materiales y Métodos). El resultado de la transferencia de SlPVA a la membrana de PVDF 
se puede observar en la Figura 13. 

 
 
1 2 3
  kDa
  94
67
  Subunidad β
 Subunidad β-truncada 43

 
30
 

  Subunidad α
20.1
  14,4
 

 
Figura 13. Electrotransferencia SlPVA a membrana de PVDF teñida con negro amido. 1, SlPVA 
obtenida  tras  su  purificación.  2,  SlPVA  tras  permanecer  conservada  a  4  ºC  durante  1  mes.  3, 
marcadores de masa molecular. 
 

En la Tabla 14 se recogen las secuencias aminoterminales de las subunidades α, β y 
β‐truncada de SlPVA. 

82
Resultados 

Tabla  14.  Secuencia  de  aminoácidos  de  los  extremos  N‐terminales  de  cada 
una de las subunidades de SlPVA. 
 

Subunidad  Secuencia de aminoácidos 

α  GGGLSATVRXTEAGIPHXVADK 

β  SNAVAFRGSTTANGRGLLLGNPHY 

β‐truncada  AAPVTRTQWWTRYGPVVTSLGA 
X : aminoácido no determinado 

A  partir  de  las  secuencias  de  aminoácidos  de  los  extremos  N‐terminales  de  cada 
una de las subunidades de SlPVA, y teniendo en cuenta el uso de codones de Streptomyces 
(Wright  y  Bibb,  1992)  se  diseñaron  los  oligonucleótidos  degenerados:  STREPTOP1  (P1), 
STREPTOP2  (P2),  STREPTOD  (D),  STREPTOD2  (D2),  STREPTOG1  (G1)  y  STREPTOG3 
(G3) (Tabla 10), apartado 17.2 de Materiales y Métodos. 

3.2 Obtención por PCR de fragmentos de ADN del gen pva 

Los  oligonucleótidos  diseñados a  partir  de  las  secuencias  aminoterminales  de  las 
subunidades de SlPVA se utilizaron como cebadores en reacciones de PCR sobre el ADN 
total de S. lavendulae ATCC 13664 (apartado 17.2 de Materiales y Métodos), para lo que se 
utilizaron las combinaciones de oligonucleótidos: 

a) STREPTOP1/STREPTOD (P1/D). 
b) STREPTOP1/STREPTOD2 (P1/D2). 
c) STREPTOP1/STREPTOG3 (P1/G3). 
d) STREPTOP2/STREPTOD (P2/D). 
e) STREPTOP2/STREPTOD2 (P2/D2). 
f) STREPTOP2/STREPTOG3 (P2/G3). 
g) STREPTOG1/STREPTOD (G1/D). 
h) STREPTOG1/STREPTOD2 (G1/D2). 

Los  programas  de  amplificación  utilizados  fueron  Pcr1,  Pcr2,  Pcr3,  Pcr4,  Pcr5  y 
Pcr6 (Tabla 13). De todas las combinaciones sólo se han obtenido dos resultados positivos 
de  la  combinación  de  los  oligonucleótidos  STREPTOP2/STREPTOG3  (P1/G3),  que  se 

83
 Resultados 

obtiene  una  banda  específica  de  600  pb,  y  de  STREPTOG1/STREPTOD2  (G1/D2),  que  se 
obtiene una banda específica de 336 pb (Figura 14). 

 
λ  P1 P2  D  D2  G1  G3 P1 P1 P1 P2 P2 P2 G1 G1
      D D2 G3 D D2 G3 D D2

 
600 pb 
  336 pb 
 
 
Figura  14.  Controles  y  reacciones  de  PCR  sobre  el  ADN  total  de  S.  lavendulae  con  los 
oligonucleótidos  degenerados.  λ,  marcador  de  tamaño,  digestión  de  ADN  del  Fago  lambda 
con  la  enzima  de  restricción  BstEII.  Controles:  P1,  P2,  D,  D2,  G1  y  G3.  Reacciones  de 
amplificación por PCR: P1/D, P1/D2, P1/G3, P2/D, P2/D2, P2/G3, G1/D y G1/D2. 
 

Los  fragmentos  de  ADN  de  600  y  336  pb  se  clonaron  en  E.  coli  DH5α  utilizando 
como vector pUC18, dando lugar a los plásmidos pIJL1 y pIJL21. Ambos plásmidos han 
sido secuenciados por ambos extremos de los fragmentos insertados (Figura 15). 

84
Resultados 

 
A
 
 
T E Y G I P H I V A K D Y A N L G F
  ACG GAG gcg GGC ATT CCG CAC ATC GTG GCG AAG GAC TAC GCG AAC CTG GGC TTC 54
STREPTOP2
  G T G W A Q A A D Q V C T L A D G F
  GGC ACC GGC TGG GCA CAG GCC GCC GAC CAG GTG TGC ACG CTG GCC GAC GGG TTC 108
  V T V R G E R S K F F G P D A A P D
GTC ACG GTA CGC GGC GAG CGG TCG AAG TTC TTC GGC CCG GAC GCG GCC CCG GAC 162
 
F S L S S A A K N L S S D L Y F R G
  TTC TCC CTC TCC TCG GCG GCG AAG AAC CTC TCC AGC GAT CTG TAC TTC CGG GGC 216
  V R D S G T V E K L L K V P A P A G
  GTC CGG GAC AGC GGC ACC GTG GAG AAG CTG CTG AAG GTC CCG GCT CCG GCG GGT 270
  P S R D A K E S M R G F A A G Y N A
CCG AGC CGG GAC GCC AAG GAG TCG ATG CGC GGA TTC GCC GCC GGG TAC AAC GCC 324
 
W L R Q N R D R I T D P A C R G A S
  TGG CTC CGG CAG AAC CGC GAC CGC ATC ACC GAC CCC GCC TGC CGG GGC GCC TCC 378
  W V R P V T A L D V A V R G F A L A
  TGG GTG CGC CCG GTC ACC GCG CTG GAC GTG GCG GTA CGG GGC TTC GCC CTG GCC 432
  V L G G Q G R G I D G I T A A Q P P
GTG CTC GGC GGC CAG GGG CGC GGC ATC GAC GGC ATC ACC GCC GCC CAG CCC CCG 486
 
T A A P P A A G V T P K E A A A A A
  ACG GCC GCA CCG CCC GCC GCC GGG GTC ACC CCG AAG GAG GCG GCA GCG GCG GCC 540
  Q R L L S T Q N A D M G S N A V A F
  CAG CGG CTT CTG TCC ACG CAG AAC GCC GAC ATG GGC TCC AAC GCG GTC GCC TTC 594
STREPTOG3
  R G
  CGG GGG 600
   
 
  B 
   
  R G L L L G N P H Y P W D G G R R F
  CGC GGG CTG CTC CTC GGC AAC CCG CAC TAT CCG TGG GAC GGC GGC CGC CGC TTC 54
STREPTOG1
  W Q S Q Q T I P G E L N V A G G S L
  TGG CAG TCG CAG CAG ACG ATC CCG GGC GAG CTG AAC GTG GCG GGC GGA TCC CTG 108

  L G S T T V S I G H N A D V A W S H
CTC GGC TCG ACG ACC GTC TCG ATC GGG CAC AAC GCG GAC GTG GCC TGG AGC CAC 162
 
T V A T G V T L N L H Q L T L D P A
  ACG GTG GCG ACC GGC GTC ACG CTG AAC CTG CAC CAG CTG ACC CTG GAT CCG GCC 216
  D P T V Y L V D G K P Q R M T Q R T
  GAT CCC ACG GTC TAT CTG GTG GAC GGG AAG CCG CAG CGG ATG ACG CAG CGC ACG 270

  V A V P V K G A A P V T R T Q W W T
GTC GCC GTG CCG GTG AAG GGC GCC GCC CCG GTG ACC CGG ACC CAG TGG TGG ACC 324
 
R Y G P STREPTOD2
  CGG TAC GGC CCG 336
 
 
 
 
Figura 15. Secuencia de nucleótidos y de los aminoácidos deducidos de los fragmentos de 600 pb (A) 
y 336 pb (B). Subrayados aparecen las zonas de hibridación de los oligonucleótidos y en amarillo las 
secuencias que se corresponden a los extremos aminoterminales de las subunidades de SlPVA. 
 

El  análisis  de  las  secuencias  de  ambos  fragmentos  muestra  la  aparición  de  un 
marco de lectura abierto (ORF) en cada uno de ellos, de forma que el fragmento de 600 pb 
codifica la secuencia de aminoácidos de SlPVA comprendida entre el extremo N‐terminal 

85
 Resultados 

de la subunidad α y el extremo N‐terminal de la subunidad β. Mientras que el fragmento 
de 336 pb codifica la secuencia de aminoácidos comprendida entre el extremo N‐terminal 
de la subunidad β y el N‐terminal de la subunidad β‐truncada (Figura 16). 

 
Figura 16. Esquema de las PCRs realizadas para la obtención de los fragmentos de 600 y 336 pb. En la 
figura se indica a que región del gen pva se corresponde cada fragmento. 
 

La  comparación  de  las  secuencias  de  aminoácidos  deducidas  de  cada  uno  de  los 
dos  fragmentos  amplificados  por  PCR  muestra  que  estos  codifican  una  proteína  muy 
parecida a otras acilasas bacterianas.  

3.3 Obtención por PCR inversa de fragmentos del gen pva 

Con el fin de obtener el resto de la secuencia del gen pva se procedió a la clonación 
y secuenciación del mismo mediante la técnica denominada PCR inversa (Ochman y col., 
1988). Esta técnica consiste en digerir el ADN con enzimas de restricción que no presenten 
un  elevado  número  de  dianas,  y  que  generen  fragmentos  de  entre  2  y  4  kb,  y 
posteriormente circularizar con ellos mismos los fragmentos generados mediante ligación. 
Finalmente,  se  amplifica  el  ADN  circularizado  por  PCR,  utilizando  como  cebadores 
oligonucleótidos diseñados para que la reacción de amplificación tenga lugar en dirección 
a las zonas que flanquean la región conocida (Figura 17). 

86
Resultados 

 
 

 
Figura  17.  Método  de  la  PCR  inversa.  La  zona  verde‐amarilla  representa  la  secuencia  conocida, 
representando las zonas verdes las regiones que se pretenden amplificar y secuenciar. Los * indican 
las posiciones de las dianas de las enzimas de restricción. 
 

3.3.1 Obtención de la región promotora y 5´ del gen pva 

Para  realizar  las  PCR  inversas  sobre  el  genoma  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  se 
procedió  en  primer  lugar  a  la  elección  de  las  enzimas  de  restricción,  para  lo  cual  se  ha 
llevado a cabo un experimento de hibridación de las digestiones de su genoma, Southern 
blot,  tal  como  se  describe  en  el  apartado  15  de  Materiales  y  Métodos.  El  objetivo  del 
experimento es determinar si el tamaño de los fragmentos generados tras las digestiones 
del  ADN  total  puede  contener  el  gen  pva.  El  resultado  de  las  hibridaciones  aparece 
reflejado en la Figura 18. 

87
 Resultados 

A  
 

 
B 
 

 
 
Figura 18. A; Electroforesis de las digestiones del ADN de S. lavendulae ATCC 13664 con las enzimas 
de  restricción  AccI,  PstI,  SalI,  StuI,  AvrI,  BclI,  BglII,  DraI,  NcoI,  NheI  y  SacII.  B;  Southern  Blot  de  las 
digestiones. Controles plásmido pIJL1 y fragmento de 630 pb. λ, marcador de tamaño, digestión de 
ADN del Fago lambda con la enzima de restricción BstEII. 
 

Como  se  puede  observar  aparecen  bandas  de  hibridación  muy  claras  en  las 
digestiones del ADN de S. lavendulae ATCC 13664 con las endonucleasas AccI, SalI, BclII, 
NcoI  y  SacII.  En  concreto,  la  banda  positiva  obtenida  en  la  digestión  del  ADN  con  la 
enzima  SacII  presenta  un  tamaño  de  3,6  kb  muy  adecuado  para  contener  la  secuencia 
completa del gen pva y por tanto para llevar a cabo la amplificación del mismo por PCR 
inversa, por lo que dicha enzima ha sido la que se ha utilizado para digerir el genoma de 
S. lavendulae ATCC 13664. 

88
Resultados 

Tras  digerir  el  ADN  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  con  SacII  se  procedió  a  la 
circularización con él mismo de acuerdo con el protocolo descrito en el apartado 17.2 de 
Materiales  y  Métodos.  Las  mezclas  de  ligación  que  contienen  los  fragmentos 
circularizados se utilizaron como molde para llevar a cabo las amplificaciones mediante la 
técnica  de  la  PCR  inversa,  utilizando  como  cebadores  los  oligonucleótidos  sintéticos  N, 
N1 y C (Tabla 10), diseñados a partir de las secuencias 5´ del fragmento de 600 pb (N y 
N1) y 3´ del fragmento de 336 pb (C). Las combinaciones de los oligonucleótidos probadas 
fueron N/C y N1/C, de las cuales sólo se ha obtenido amplificación cuando se ha utilizado 
como cebadores la combinación N/C (Figura 19), dando lugar a un fragmento de 1.500 pb.  

 
 

Figura 19. PCR inversas sobre el ADN de S. lavendulae ATCC 13664 digerido con SacII. En la 
parte superior se indican las dos combinaciones de oligonucleótidos utilizados (N/C y N1/C), 
así como los controles realizados (N, N1 y C). λ, marcador de tamaño. 
 

El  fragmento  de  1.500  pb  se  clonó  en  E.  coli  DH5α  utilizando  como  vector  el 
plásmido pUC18, obteniéndose los clones recombinantes E. coli DH5α (pIJLNsac) y E. coli 
DH5α  (pIJLCsac).  El  inserto  de  1.500  pares  de  bases  presente  en  cada  uno  de  los 
plásmidos  fue  secuenciado  por  ambos  extremos  (Figura  20A),  observándose  que  ambos 
presentan el mismo inserto pero con orientación opuesta. Como se puede observar en la 
secuencia,  la  región  5´  del  fragmento  corresponde  a  la  secuencia  de  nucleótidos  que  se 
encuentra  en  dirección  3´  del  fragmento  de  336  pb,  mientras  que  los  últimos  570 
nucleótidos del fragmento de 1.500 pb son los que están en dirección 5´ del fragmento de 
600 pb (Figura 20B). 

89
 Resultados 

  A
GGCCGATCCCACGGTCTATCTGGTGGACGGGAAGCCGCAGCGGATGACGCAGCGCACGGT 60
  C
CGCCGTGCCGGTGAAGGGCGCCGCCCCGGTGACCCGGACCCAGTGGTGGACCCGGTACGG 120
CCCGGTGGTCACCTCGCTGGGGGCGGCGCTGCCGCTGCCCTGGACGGCGAGCACCGCGTA 180
  CGCGCTGAACGACCCGAACGCGGTGAACCTGCGCAGCGCCGACACCTCGCTCGGCTTCAG 240
CAAGGCACGCTCCACCGCCGGGATCGAGCGGGCGCTCCACCGGTCCCAGGGGCTGCCCTG 300
GGTGAACACGATCGCCGCCGACCGGTCGGGGAACTCCTTCTTCTCCCAGTCGCAGGTTCT 360
  GCCGAGGATCACGGACGAGCTGGCGGCACGCTGCTCGACCCCGCTGGGCCAGGCCACCTA 420
CCCGTCGGCCGGGCTCGCGGTGCTGGACGGATCGACGTCGGCCTGCGCGCTGGGGAGCGA 480
  CCGGGACGCGGTACAGCCGGGGATCTTCGGGCCGGGCCGGATGCCGACGCTGAAGAACGC 540
CCCGTACGTCGAGAACTCCAACGACAGCGCCTGGCTGACCAACGCCGACCGCCCGCTGAC 600
  CGGTTACGAGCGGGTCTTCGGCACGACCGCCACCCAGCGGTCGATCCGGACCCGGGGCGC 660
GATCGAGGATGTCGCGGCGATGGCGGAGCGCGGGCGGCTGCGTGTGACGGACCTGGAGCG 720
CCAGCAGCTCGCCAACCGGGCGCCGACCGGGGATCTGGTCGCGGCCGACGTGGCGAAGTG 780
  GTGCGCCGCCCTGCCCGGCGGGACCGCCGTGGGCAGCAGCGGTACGCCGGTCGACGTGTC 840
GGCGGCCTGCCCGGTGCTGCGGCGGTGGGACCGGAGCGTGGACAGCGACAGCCGGGGCGC 900
  GCTGCTCTTCGACCGGTTCTGGCGCAAGGCGGCGGCGGTGCCCGCGGTGGAGACCGCCGC 960
GTCCAGGGCGCCGTAGGTCCAGGCCCGGTCGGCGTACCGCACGGCGGTCCGTTCCGGGGT 1020
  GCGGCGGGCGCTGCGGGTGAGGACGCCGTCGACTGTGCTGCTGCGTACACCGGTCATGAC 1080
GTGATCCTGTGCGGCCGGGTCCCGGCGGGTCAAGGGGCCGTGAGGAGTGTCGGAGGGCAC 1140
TGAGGCGGCTGGATACCGACCAGACGGTTGACAGATCCGGGAGCGCCCTGGCTGAGTGGC 1200
  GCGTGGCTGCCCGGCGGGTTCGGGCAACCTCCTTGGCCACCCGCCTTGTTGGGAGGAACA 1260
CCCTTGACCTTCCGTAACCGCCTCAGACTGTTCGCGGTCTCCGGTCTCGCCCTGTTCACC 1320
  GTGTCGGCGTCGCTGCCACCCGCCGCAGCCTCCGGAGCGCCGGAGGCCCGGCATCCGTCG 1380
GGCGGCGGCCTCTCGGCCACCGTCCGGTACACGGAGTACGGCATTCCGCACATCGTGGCG 1440
  AAGGACTACGCGAACCTGGGCTTCGGCACCGGCTGGGCACAGGCCGCCGACCAGGTGTGC 1500

ACGCTGGCCGACGGGTTCG 1519
 
N 
 

  B 
 

 
 
 
 
Figura 20. A, Secuencia de nucleótidos del fragmento de 1.500 pb. Resaltado en azul se indica la 
diana  de  la  enzima  de  restricción  SacII.  Subrayados  aparecen  las  zonas  de  hibridación  de  los 
oligonucleótidos N y C. B, Esquema de la posición en el gen pva de los fragmentos secuenciados, 
en rojo la región 5´ del gen pva, y en negro la región 3´. 
 

Al comparar la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de nucleótidos 
de  este  fragmento  de  1.500  pb  se  observa  que  presenta  homología  con  otras  acilasas, 
presentando, al igual que la comparación de los fragmentos de 600 y 336 pb, una mayor 
similitud con la enzima aculeacina A acilasa de A. utahensis NRRL 12052.  

El  fragmento  de  1500  pb  obtenido  comprende  las  secuencias  génicas  que  se 
encuentran en los extremos 5´ y 3´ de los fragmentos de 600 pb y 336 pb respectivamente 
(Figura  20B).  Con  la  finalidad  de  obtener  un  único  fragmento  que  contenga  todas  las 
secuencias, a partir del fragmento de 1500 pb se diseñaron los oligonucleótidos NsacII y 

90
Resultados 

CsacII  (Tabla  10),  que  se  utilizaron  como  cebadores  en  una  reacción  de  amplificación 
sobre el ADN total de S. lavendulae ATCC 13664. 

 
 
Figura  21.  Amplificación  por  PCR  del  fragmento  de  NCsacII;  1,  PCR  para 
amplificar  el  fragmento  NCsacII;  2,  control  con  el  cebador  NsacII;  3,  control 
con el cebador CsacII. λ, marcador de tamaño. 
 

El  resultado  de  la  amplificación  muestra  la  aparición  de  una  banda  específica  de 
2,2 kb que se corresponde con el tamaño esperado, al que se denomina fragmento NCsacII 
(Figura 21). El fragmento se purificó del gel y se clonó en E. coli DH5α, utilizando como 
vector  el  plásmido  pUC18,  obteniéndose  el  clon  recombinante  E.  coli  DH5α 
(pUC18NCsacII), portador del plásmido pUC18NCsacII, que se purificó y se secuenció el 
fragmento NCsacII (Figura 22). 

 
 
 
 
 

91
 Resultados 

 
 CCG CGG TGG AGA CCG CCG CGT CCA GGG CGC CGT AGG TCC AGG CCC GGT CGG CGT ACC GCA 60
 CGG CGG TCC GTT CCG GGG TGC GGC GGG CGC TGC GGG TGA GGA CGC CGT CGA CTG TGC TGC 120
 ATG CGT ACC CGG TCA TGA CGT GAT CCT GTG CGG CCG GGT CCC GGC GGG TCA AGG GGC CGT 180
GAG GAG TGT CGG AGG GCA CTG AGG CGG CTG GAT ACC GAC CAG ACG GTT GAC AGA TCC GGG 240
 AGC GCC CTG GCT GAG TGG CGG CGT GCT GCC CGG CGG GTT CGG GCA ACC TCC TTG GCC GCC 300
  L T F R N R L R L F A V S G
 TTG TTG GGA GGA ACA CCC TTG ACC TTC CGT AAC CGC CTC AGA CTG TTC GCG GTC TCC GGT 360
L A L F T V S A S L P P A A A S G A P E
 
CTCGCC CTG TTC ACC GTG TCG GCG TCG CTG CCA CCC GCC GCA GCC TCC GGA GCG CCG GAG 420
  A R H P S G G G L S A T V R Y T E Y G I
 GCC CGG CAT CCG TCG GGC GGC GGC CTC TCG GCC ACC GTC CGG TAC ACG GAG TAC GGC ATT 480
  P H I V A K D Y A N L G F G T G W A Q A
CCGCAC ATC GTG GCG AAG GAC TAC GCG AAC CTG GGC TTC GGC ACC GGC TGG GCA CAG GCC 540
  A D Q V C T L A D G F V T V R G E R S K
 GCC GAC CAG GTG TGC ACG CTG GCC GAC GGG TTC GTC ACG GTA CGC GGC GAG CGG TCG AAG 600
  F F G P D A A P D F S L S S A A K N L S
 TTC TTC GGC CCG GAC GCG GCC CCG GAC TTC TCC CTC TCC TCG GCG GCG AAG AAC CTC TCC 660
S D L Y F R G V R D S G T V E K L L K V
 AGC GAT CTG TAC TTC CGG GGC GTC CGG GAC AGC GGC ACC GTG GAG AAG CTG CTG AAG GTC 720
  P A P A G P S R D A K E S M R G F A A G
 CCG GCT CCG GCG GGT CCG AGC CGG GAC GCC AAG GAG TCG ATG CGC GGA TTC GCC GCC GGG 780
Y N A W L R Q N R D R I T D P A C R G A
 TAC AAC GCC TGG CTC CGG CAG AAC CGC GAC CGC ATC ACC GAC CCC GCC TGC CGG GGC GCC 840
  S W V R P V T A L D V A V R G F A L A V
 TCC TGG GTG CGC CCG GTC ACC GCG CTG GAC GTG GCG GTA CGG GGC TTC GCC CTG GCC GTG 900
  L G G Q G R G I D G I T A A Q P P T A A
CTCGGC GGC CAG GGG CGC GGC ATC GAC GGC ATC ACC GCC GCC CAG CCC CCG ACG GCC GCA 960
  P P A A G V T P K E A A A A A Q R L L S
 CCG CCC GCC GCC GGG GTC ACC CCG AAG GAG GCG GCA GCG GCG GCC CAG CGG CTT CTG TCC 1020
  T Q N A D M G S N A V A F R G S T T A N
ACGCAG AAC GCC GAC ATG GGC TCC AAC GCG GTC GCC TTC CGG GGG TCC ACC ACG GCG AAC 1080
 
G R G L L L G N P H Y P W D G G R R F W
 GGG CGC GGG CTG CTC CTC GGC AAC CCG CAC TAT CCG TGG GAC GGC GGC CGC CGC TTC TGG 1140
  Q S Q Q T I P G E L N V A G G S L L G S
 CAG TCG CAG CAG ACG ATC CCG GGC GAG CTG AAC GTG GCG GGC GGA TCC CTG CTC GGC TCG 1200
T T V S I G H N A D V A W S H T V A T G
 ACG ACC GTC TCG ATC GGG CAC AAC GCG GAC GTG GCC TGG AGC CAC ACG GTG GCG ACC GGC 1260
  V T L N L H Q L T L D P A D P T V Y L V
 GTC ACG CTG AAC CTG CAC CAG CTG ACC CTG GAT CCG GCC GAT CCC ACG GTC TAT CTG GTG 1320
  D G K P Q R M T Q R T V A V P V K G A A
GACGGG AAG CCG CAG CGG ATG ACG CAG CGC ACG GTC GCC GTG CCG GTG AAG GGC GCC GCC 1380
  P V T R T Q W W T R Y G P V V T S L G A
 CCG GTG ACC CGG ACC CAG TGG TGG ACC CGG TAC GGC CCG GTG GTC ACC TCG CTG GGG GCG 1440
  A L P L P W T A S T A Y A L N D P N A V
GCGCTG CCG CTG CCC TGG ACG GCG AGC ACC GCG TAC GCG CTG AAC GAC CCG AAC GCG GTG 1500
  N L R S A D T S L G F S K A R S T A G I
 AAC CTG CGC AGC GCC GAC ACC TCG CTC GGC TTC AGC AAG GCA CGC TCC ACC GCC GGG ATC 1560
  E R A L H R S Q G L P W V N T I A A D R
 GAG CGG GCG CTC CAC CGG TCC CAG GGG CTG CCC TGG GTG AAC ACG ATC GCC GCC GAC CGG 1620
S G N S F F S Q S Q V L P R I T D E L A
 TCG GGG AAC TCC TTC TTC TCC CAG TCG CAG GTT CTG CCG AGG ATC ACG GAC GAG CTG GCG 1680
  A R C S T P L G Q A T Y P S A G L A V L
 GCA CGC TGC TCG ACC CCG CTG GGC CAG GCC ACC TAC CCG TCG GCC GGG CTC GCG GTG CTG 1740
  D G S T S A C A L G S D R D A V Q P G I
GACGGA TCG ACG TCG GCC TGC GCG CTG GGG AGC GAC CGG GAC GCG GTA CAG CCG GGG ATC 1800
  F G P G R M P T L K N A P Y V E N S N D
 TTC GGG CCG GGC CGG ATG CCG ACG CTG AAG AAC GCC CCG TAC GTC GAG AAC TCC AAC GAC 1860
  S A W L T N A D R P L T G Y E R V F G T
AGCGCC TGG CTG ACC AAC GCC GAC CGC CCG CTG ACC GGT TAC GAG CGG GTC TTC GGC ACG 1920
  T A T Q R S I R T R G A I E D V A A M A
 ACC GCC ACC CAG CGG TCG ATC CGG ACC CGG GGC GCG ATC GAG GAT GTC GCG GCG ATG GCG 1980
  E R G R L R V T D L E R Q Q L A N R A P
 GAG CGC GGG CGG CTG CGT GTG ACG GAC CTG GAG CGC CAG CAG CTC GCC AAC CGG GCG CCG 2040
T G D L V A A D V A K W C A A L P G G T
 ACC GGG GAT CTG GTC GCG GCC GAC GTG GCG AAG TGG TGC GCC GCC CTG CCC GGC GGG ACC 2100
  A V G S S G T P V D V S A A C P V L R R
 GCC GTG GGC AGC AGC GGT ACG CCG GTC GAC GTG TCG GCG GCC TGC CCG GTG CTG CGG CGG 2160
W D R S V D S D S R G A L L F D R F W R
 TGG GAC CGG AGC GTG GAC AGC GAC AGC CGG GGC GCG CTG CTC TTC GAC CGG TTC TGG CGC 2220
  K A A A V P A
 AAG GCG GCG GCG GTG CCC GCG G 2242
 
Figura  22.  Secuencia  de  nucleótidos  del  fragmento  NCsacII.  En  rojo  se  muestra  la  secuencia  de  aminoácidos 
deducida. En la figura se indica subrayado el posible sitio de unión al ribosoma (RBS), resaltado en azul el posible codón de 
inicio de la traducción y en amarillo se indican las posibles cajas ‐35 y ‐10. 
 
 

Al  analizar  la  secuencia  de  nucleótidos  del  fragmento  NCsacII  se  observa  la 
existencia  de  un  marco  de  lectura  abierto  (ORF)  de  1.924  nucleótidos  (Figura  22).  La 

92
Resultados 

secuencia  GAGG  aparece  subrayada  como  posible  sitio  de  unión  al  ribosoma  (RBS)  y  a 
una  distancia  de  7  nucleótidos  hacía  el  extremo  3´  del  gen  se  encuentra  el  triplete  TTG, 
que puede ser considerado el codón de iniciación de la traducción. Hay que señalar que si 
bien este triplete no es habitual como codón de iniciación, en Streptomyces aparece con una 
frecuencia del 3% (Kieser y col., 2000). Asimismo, caben destacar las secuencias TTGACA 
y CTGAGT (marcadas en amarillo en la Figura 22), que pueden corresponder a las cajas ‐
35 y ‐10 del promotor, respectivamente, ya que se corresponden con la secuencia consenso 
de Streptomyces (Strohl, 1992). 

No se observa ningún posible codón de terminación de la traducción, lo que indica 
que  la  secuencia  no  se  encuentra  completa,  puesto  que  al  comparar  el  tamaño  de  la 
secuencia  de  aminoácidos  deducida  para  SlPVA  a  partir  de  la  secuencia  de  nucleótidos 
obtenida  (Figura  22)  con  el  tamaño  de  la  proteína  purificada  (Figura  13)  se  observa  que 
faltan  aproximadamente  500  aminoácidos,  por  lo  que  al  fragmento  NCsacII  el  faltan 
aproximadamente 1.500 nucleótidos del extremo 3´ del gen pva. 

3.3.2 Obtención de la región 3´ del gen pva 

Con  el  fin  de  obtener  la  secuencia  de  nucleótidos  que  corresponde  al  extremo  3´ 
del gen pva se procedió de nuevo a llevar a cabo una reacción de amplificación mediante 
PCR inversa. En este caso, y en base a la secuencia de nucleótidos obtenida, las enzimas 
de restricción seleccionadas fueron BamHI, HincII, BstEII y PvuI, ya que el fragmento del 
gen  pva  secuenciado  presenta  dianas  para  estas  endonucleasas  a  una  distancia 
aproximada  de  1.000  pb  de  su  extremo  3’,  por  lo  que  pueden  generar  fragmentos  que 
contengan el extremo 3´ del gen pva. Para llevar a cabo las reacciones de amplificación se 
diseñaron como cebadores los oligonucleótidos FcβD2 y FcβI2 a partir de la secuencia del 
extremo  3´  del  fragmento  NCsacII  (Tabla  10).  El  resultado  de  las  amplificaciones  se 
muestra en la Figura 23. 

Como se puede observar la PCR inversa realizada sobre la digestión del ADN de 
S.  lavendulae  con  la  enzima  de  restricción  HincII  muestra  la  aparición  de  una  banda 
específica de alrededor de 1 kb, fragmento FcβID2 (Figura 23). Este fragmento se purificó 
por Gene‐Clean del gel de agarosa y se clonó en E. coli y se secuenció. Como se observa en 
la Figura 24, el fragmento FcβID2 solapa con el extremo 3´ del fragmento NCsacII, lo que 
se  corresponde  con  la  región  terminadora  del  gen  pva,  ya  que  presenta  el  triplete  TAG 
como codón de finalización de la traducción y una región palindrómica a una distancia de 
19 nucleótidos que actuaría como región terminadora de la transcripción.  

93
 Resultados 

 
 

 
 

 
 
Figura  23.  Electroforesis  de  las  PCR  inversas  de  las  digestiones  del  ADN  de  S  .lavendulae  ATCC 
13664  con  las  enzimas  BamHI,  HincII,  y  PvuI.  1,  Control  de  la  PCR  inversa  de  la  digestión  con 
BamHI; 2, PCR inversa de la digestión con BamHI; 3, control de la PCR inversa de la digestión con 
PuvI;  4,  PCR  inversa  de  la  digestión  con  PuvI;  5,  control  de  la  PCR  inversa  de  la  digestión  con 
HincII; 6, PCR inversa de la digestión con HincII. λ, marcador de tamaño. 
 

 S R G A L L F D R F W R K A A A V P A A
AGC CGG GGC GCG CTG CTC TTC GAC CGG TTC TGG CGC AAG GCG GCG GCG GTG CCC GCG GCC 60
  FcβD2 
E L W K V P F D A A D P V R T P R G L N
GAG
  CTG TGG AAG GTA CCG TTC GAC GCG GCC GAT CCG GTA CGG ACC CCG CGC GGC CTC AAC 120
T A A P G V G K A L A D T V T E L K A A
ACC GCC GCA CCC GGC GTG GGG AAG GCG CTG GCC GAC ACG GTG ACG GAG CTG AAG GCG GCG 180
 G I A L N A P L G E H Q F V V R N G K R
GGC ATC GCG CTC AAC GCG CCT TTG GGT GAG CAC CAG TTC GTC GTA CGG AAC GGG AAG CGC 240
 I P V G G G T E S L G I W N K I E P V W
ATC CCG GTC GGC GGC GGC ACG GAG TCG CTC GGC ATC TGG AAC AAG ATC GAG CCG GTG TGG 300
 N P A A G G Y T E V S A G S S Y I Q A V
AAC CCG GCG GCG GGC GGC TAC ACC GAG GTG TCG GCC GGG TCC AGC TAC ATC CAG GCG GTC 360
G W D N S C P V A R T L L T Y S Q S S R
 
GGC TGG GAC AAC AGC CGG TGC CCG GTG GCC CGG ACG CTG CTC ACG TAC TCC CAG TCC TCG 420
N P N S P H Y S D Q T R L F S G E R W V
 
AAC CCG AAC TCG CCG CAC TAC AGC GAC CAG ACG CGG CTG TTC TCG GGT GAG CGC TGG GTG 480
T R F C E K D I A R S P Q L K V V R S V
ACG
  TCC CGG TTC TGC GAG AAG GAC ATC GCC CGC TCG CCG CAG CTG AAG GTG GTG CGG GTG 540
H E R R *
CAC GAG CGG CGG TAG GGG GTG CAG GAC GTG GTG AGC CGG GTC CGC GAG GGG GTG TCG CTC 600
 
GCG GAC CCG GCG TTC TAC AGG GGC CGT TGG TGC CCC TCC CAG TAG GGT TCC CTC AGC CGC 660
CGT TTG TAC AGC TTG CCG TTG GGG TCG CGG GGC ATC GCG GCG ATG AAG TCG AGG GAG CGG 720
 
GGG CGT TTG TAG CCG GCG AGC CGC TCC TCG CAG TGG GCG AGG ATC TCG GCG GCG AGC GCG 780
CCC CCG GGC TCG TAC CCC TCG GCC GGC TCG ACG ACC GCT TTG ACC TCC TCG CCC CGG TCG 840
GCG TGC GGG ATG CCG AAG GCG GCG GCG TCC GCG ACG GCG GGG TGG GTG AGC AGG GCG GAC 900
 
TCG ATC TCG GCG GGG TAG ATG TTC ACG CCA CCC GCG ATG ATC ATG TCG ATC TTG CGG TCG 960
CGG AGG AAG AGA GAG CCG TCG GCG TCC AGC ACA CCG AGG TCT GCC GAC GGT GAA GAA GTC 1020
TGC  
CGA TCC GA 1031
 
 
 
Figura  24.  Secuencia  de  nucleótidos  del  fragmento  de  FcβID2  y  secuencia  de  aminoácidos  deducida  (en 
rojo). Resaltado en azul el codón de finalización de la traducción. Subrayado la secuencia de hibridación 
del oligonucleótido FcβD2. En amarillo la secuencia que solapa con el extremo 3´ del fragmento NCsacII. 
En gris está señalada la secuencia palindrómica, terminadora de la transcripción. 
 

94
Resultados 

Como  se  puede  observar  en  la  figura  24  se  ha  obtenido  el  fragmento  3´  que 
quedaba para completar la secuencia completa del gen pva.  

En  la  Figura  25  se  resume  el  proceso  por  el  que  se  ha  obtenido  la  secuencia 
completa del gen pva. 

 
 

 
 
Figura 25. Esquema de los pasos llevados a cabo para obtener la secuencia completa del gen pva. 

95
 Resultados 

3.4 Caracterización del gen pva y de la proteína SlPVA que codifica 

Uno de los objetivos planteados en el presente trabajo es la caracterización del gen 
pva  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  que  codifica  la  SlPVA.  La  estrategia  seguida  hasta  el 
momento, esquematizada en la Figura 25, ha permitido obtener su secuencia, así como la 
deducción de la secuencia de aminoácidos de SlPVA codificada por él (Anexo 1). El gen 
pva  esta  constituido  por  aproximadamente  3.000  pb,  donde  destaca  un  marco  de  lectura 
abierto  (ORF)  de  2.420  pb  que  da  lugar  a  una  única  proteína  de  806  aminoácidos, 
precedido de una región promotora, y finalmente se observa una región terminadora de 
donde destaca la presencia de una secuencia palindrómica (Figura 26). 

Figura  26.  Esquema  del  gen  pva  de  S.  lavendulae  ATCC  13664.  PS:  secuencia  génica  que  codifica  el 
péptido señal. En amarillo se indican las cajas ‐35 y ‐10. Subrayado se indica el RBS. Resaltado en azul el 
posible  codón  de  iniciación  de  la  traducción.  En  verde  el  codón  de  finalización  de  la  traducción.  Las 
flechas indican la presencia de una región palindrómica terminadora. 

96
Resultados 

El análisis del gen pva indica que no forma parte de ningún operón, poseyendo su 
propia región promotora. Así, como se observa en la Figura 26, las secuencias TTGACA y 
CTGAGT,  en  la  posiciones  226  y  251  respectivamente,  pueden  ser  asignadas  como  las 
cajas  promotoras  ‐35  y  ‐10,  ya  que  coinciden  con  las  secuencias  consenso  para  estas 
secuencias descritas en el género Streptomyces (Strohl, 1992; Kormanec y Sevcikova, 2002). 
Otro  dato  que  apoya  que  el  gen  pva  no  forma  parte  de  un  operón  es  la  presencia  de  la 
posible  región  terminadora  de  la  transcripción  donde,  a  una  distancia de  19  nucleótidos 
del codón STOP (TAG), aparece una secuencia palindrómica (Figura 26) que posiblemente 
tenga implicaciones en el proceso de finalización de la transcripción. 

El análisis de la secuencia del gen pva con el programa FramePlot 2.3.2 (Ishakawa y 
Hotta,  1999)  (http://www.nih.go.jp/~jun/cgi‐bin/frameplot.pl)  que  permite  la  predicción 
de las regiones codificantes en secuencias de ADN que presentan alto contenido en G+C 
muestra una clara ORF de 2.420 pb que comienza en la posición 323 y termina en la 2.741, 
presentando  el  triplete  TTG  en  posición  323  como  posible  codón  de  iniciación  de  la 
traducción  y  el  triplete  TAG  en  posición  2.741  como  codón  de  finalización  de  la 
traducción  (Figura  27).  Si  se  realiza  el  mismo  análisis  utilizando  como  codones  de 
iniciación  de  la  traducción  alternativos  ATG  o  GTG,  mucho  más  abundantes  en  la 
naturaleza, no se observa la aparición de claros marcos de lectura abiertos. Este resultado 
viene  apoyado  por  la  presencia  del  potencial  RBS  a  una  distancia  de  7  nucleótidos  del 
triplete  TTG.  Esta  secuencia  GGAGG,  coincide  con  la  secuencia  RBS  consenso  en  los 
Streptomyces (Strohl, 1992). 

 
 
 
Figura 27. Resultado del análisis del gen pva con el programa FramePlot 2.3.2. El segundo marco de 
lectura (2, en verde) muestra una clara ORF que comienza en el codón TTG en la posición 323 y acaba 
en el triplete TAG en la posición 2.741. 
 

97
 Resultados 

El  gen  pva  presenta  un  elevado  porcentaje  de  citosinas  y  guaninas  (72,6%), 
característico de los Streptomyces, lo que da lugar a un uso de codones típico del empleado 
por este tipo de microorganismo (Wright y Bibb, 1992). A este respecto destaca el elevado 
porcentaje de ambos nucleótidos que se observan como tercera base en los codones de la 
región codificante, alcanzando este porcentaje el 94,9%. 

SlPVA  es  un  heterodímero  constituido  con  una  subunidad  pequeña,  α,  y  otra 
mayor,  β  (Torres  y  col.,  1998).  La  comparación  de  la  secuencia  de  aminoácidos  de  los 
extremos N‐terminales de cada una de las subunidades, Tabla 14, con la deducida a partir 
de  la  secuencia  de  nucleótidos  del gen  pva,  permite  indicar  que  ambas subunidades  son 
producidas en un único transcrito por lo que la PVA se va a sintetizar, al igual que sucede 
con  otras  acilasas,  de  forma  inmadura  (pre‐PVA)  sufriendo  un  proceso  de  maduración 
postraduccional  que  dará  lugar  a  la  forma  activa  de  la  enzima  (Sudhakaran  y  col.,  1992; 
García  y  col.,  1995).  En  la  Figura  28  se  muestra  la  secuencia  de  aminoácidos  de  SlPVA, 
indicando en verde la secuencia de aminoácidos de la subunidad α y en azul la secuencia 
de la subunidad β. 

 
 
LTFRNRLRLFAVSGLALFTVSASLPPAAASGAPEARHPSGGGLSATVRYTEYGIPHIVAK 60
DYANLGFGTGWAQAADQVCTLADGFVTVRGERSKFFGPDAAPDFSLSSAAKNLSSDLYFR
  120
GVRDSGTVEKLLKVPAPAGPSRDAKESMRGFAAGYNAWLRQNRDRITDPACRGASWVRPV 180
 
TALDVAVRGFALAVLGGQGRGIDGITAAQPPTAAPPAAGVTPKEAAAAAQRLLSTQNADM 240
GSNAVAFRGSTTANGRGLLLGNPHYPWDGGRRFWQSQQTIPGELNVAGGSLLGSTTVSIG
  300
HNADVAWSHTVATGVTLNLHQLTLDPADPTVYLVDGKPQRMTQRTVAVPVKGAAPVTRTQ 360
 
WWTRYGPVVTSLGAALPLPWTASTAYALNDPNAVNLRSADTSLGFSKARSTAGIERALHR 420
SQGLPWVNTIAADRSGNSFFSQSQVLPRITDELAARCSTPLGQATYPSAGLAVLDGSTSA
  480
CALGSDRDAVQPGIFGPGRMPTLKNAPYVENSNDSAWLTNADRPLTGYERVFGTTATQRS
  540
IRTRGAIEDVAAMAERGRLRVTDLERQQLANRAPTGDLVAADVAKWCAALPGGTAVGSSG 600
 
TPVDVSAACPVLRRWDRSVDSDSRGALLFDRFWRKAAAVPAAELWKVPFDAADPVRTPRG 660
LNTAAPGVGKALADTVTELKAAGIALNAPLGEHQFVVRNGKRIPVGGGTESLGIWNKIEP
  720
VWNPAAGGYTEVSAGSSYIQAVGWDNSRCPVARTLLTYSQSSNPNSPHYSDQTRLFSGER 780
 
WVTSRFCEKDIARSPQLKVVRVHERR 806
 

 
 
Figura  28.  Secuencia  de  aminoácidos  de  SlPVA.  En  amarillo  la  subunidad  α,  en  gris  la 
subunidad β. Subrayada en rojo se indica la secuencia del péptido señal. 
 

El  análisis  de  la  secuencia  de  aminoácidos  de  SlPVA  pone  de  manifiesto  la 
presencia de un fragmento de 39 aminoácidos en el extremo aminoterminal de la pre‐PVA 
que constituye el péptido señal de la enzima y que, durante el proceso de maduración de 

98
Resultados 

SlPVA,  permite  la  migración  de  la  enzima  al  espacio  extracelular,  donde  posiblemente 
concluya la maduración de la proteína, al igual que sucede con la PGA de E. coli (Sizmann 
y col., 1990). La secuencia del péptido señal de la enzima que se muestra en la Figura 29 
revela que presenta una distribución típica de aminoácidos que suele ser característica en 
los  péptidos  señal  de  las  proteínas  extracelulares  del  género  Streptomyces,  presentando 
una región N‐terminal caracterizada por ser de pequeño tamaño y en la que predominan 
los aminoácidos con carga positiva; una zona central que se caracteriza por la presencia de 
aminoácidos  de  carácter  hidrofóbico;  y  una  región  C‐terminal  que  constituye  una 
secuencia  diana  para  la  acción  de  una  peptidasa  que  de  lugar  a  la  escisión  del  péptido 
señal de la proteína (Von Heijne y Abrahmsen, 1989; Lammertyn y Anne, 1998).  

 
 
LTFRNRLR LFAVSGLALFTVSASLPPAAAS GAPEARHPS
 

  Región Nt                                            Región Central                                     Región Ct 
              Carga +          Predominan los aminoácidos hidrofóbicos 
 
                                               Estructura en α‐hélice                         Estructura en β‐lámina
 
 
 
Figura 29. Secuencia del péptido señal de SlPVA. Se indican las características de cada una 
de las regiones en las que se divide, indicando en negro los aminoácidos que constituyen el 
extremo N‐terminal (Nt), en verde los que constituyen el extremo C‐terminal (Ct), y en rojo 
los que constituyen la zona hidrofóbica. 
 

La  SlPVA  madura  es  un  heterodímero  constituido  por  una  subunidad  α,  de  202 
residuos, y otra β, de 565 residuos, que dan lugar a una proteína de 767 aminoácidos que 
presenta  una  masa  molecular  de  81  kDa,  Figura  28,  de  los  cuales  el  11,7%  son  residuos 
básicos (R + H, + K), el 8,3% son residuos ácidos (D + E), el 23,0% son residuos polares (S+ 
T+ C + N + Q) y el 56,6% son residuos apolares (A + G + I+ L + M + P + V + F + W +Y), de 
los que un 7,6% corresponden a residuos aromáticos (F + W + Y). La Tabla 15 muestra la 
composición  de  aminoácidos  de  SlPVA,  indicando  también  la  composición  por 
subunidades. 

99
 Resultados 

Tabla 15. Composición de aminoácidos de SlPVA. 
 

Número de residuos (frecuencia, %) 
Aminoácidos 
Subunidad α  Subunidad β  α + β 
Gly  G  24(11,9) 52 (9,2) 76(10,0)
Ala  A  35(17,3) 71(12,5) 106(14,0)
Val  V  14 (7,0) 46 (8,1) 60 (7,8)
Leu  L  14 (7,0) 47 (8,3) 61 (7,9)
Ile  I  5 (2,4) 14 (2,4) 19 (2,5)
Met  M  2 (1,0) 3 (0,5) 5 (0,6)
Pro  P  13 (6,4) 38 (6,7) 51 (6,6)
Phe  F  8 (4,0) 13 (2,3) 21 (2,7)
Tyr  Y  5 (2,4) 11 (1,9) 16 (2,1)
Trp  W  3 (1,5) 16 (2,8) 19 (2,5)
Ser  S  12 (5,9) 45 (7,9) 57 (7,4)
Thr  T  12 (5,9) 46 (8,1) 58 (7,5)
Cys  C  2 (1,0) 6 (1,0) 8 (1,0)
Asn  N  5 (2,4) 24 (4,2) 29 (3,8)
Gln  Q  7 (3,4) 20 (3,5) 27 (3,5)
Lys  K  7 (3,4) 13 (2,3) 20 (2,6)
His  H  1 (0,5) 8 (1,4) 9 (1,2)
Arg  R  15 (7,4) 46 (8,1) 61 (7,9)
Asp  D  13 (6,4) 29 (5,1) 42 (5,5)
Glu  E  5 (2,5) 17 (3,0) 22 (2,8)

Total    202 565 767

 

La  comparación  de  la  secuencia  de  aminoácidos  deducida  para  la  penicilina  V 
acilasa de S. lavendulae ATCC 13664 con otras proteínas descritas utilizando el programa 
BLASTP 2.2.8 (Altschul y col., 1997) pone de manifiesto que existe homología de secuencia 
entre la enzima y el resto de β‐lactam acilasas, si bien hay que destacar la mayor similitud 
que  presenta  con  las  ciclolipopéptido  acilasas,  particularmente  con  la  ciclolipopéptido 
acilasa de Streptomyces sp. FERM BP‐5809, con la que tiene una identidad del 85% y una 
similitud del 92% (Shibata y col., 2000). Destaca también la elevada similitud que presenta 
con la aculeacina A acilasa de A. utahensis NRRL 12052, con la que tiene una identidad del 
41%  y  un  similitud  del  55%  (Inokoshi  y  col.,  1992),  mientras  que  presenta  una  menor 
similitud  con  la  penicilina  G  acilasa  de  E.  coli  y  con  la  glutaril  7‐  ACA  acilasa  de 
Pseudomonas  sp.  (  23%  y  32%,  respectivamente)  (Oh  y  col.,  1987;  Li  y  col.,  1999).  Por  otro 
lado, cabe destacar la elevada similitud (53%) que presenta con la enzima acil‐homoserina 

100
Resultados 

lactona  acilasa  de  Ralstonia  sp.  XJ12B,  enzima  implicada  en  la  desactivación  de  N‐acil‐
homoserin‐lactosas, moléculas usadas por la protobacterias como señales celulares (Lin y 
col., 2003). 

No se ha observado homología de secuencia entre SlPVA y la penicilina V acilasa 
de B. sphaericus (Olsson y Uhlen, 1986), única PVA cristalizada hasta el momento, y con la 
que  no  comparte  ningún  parecido,  ni  en  la  secuencia  ni  en  su  estructura,  puesto  que  la 
PVA de B. sphaericus es un homotetrámero (Suresh y col., 1999). 

4. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN pva EN E. coli 

Una vez obtenida la secuencia del gen pva que codifica la SlPVA se abordaron los 
estudios  de  su  expresión  en  organismos  heterólogos,  con  el  fin  de  conseguir  elevados 
niveles de enzima con vista a su utilización en biorreactores enzimáticos. En una primera 
aproximación,  se  escogió  E.  coli  como  organismo  hospedador  debido  al  amplio 
conocimiento  que  se  tiene  sobre  este  microorganismo  como  sistema  de  clonación  y 
expresión de proteínas. 

La  clonación  del  gen  pva  se  afrontó  en  base  al  conocimiento  de  su  secuencia,  de 
forma que la estrategia seguida implicó clonarlo tanto con la secuencia génica que codifica 
su péptido señal como sin ella, utilizando como hospedadores E. coli HB101 y BL21 (DE3) 
y los vectores de expresión pIN‐III‐A3, pIN‐III‐ompA3 y pET28 a (+).  

4.1 Amplificación y clonación del gen pva con y sin la secuencia génica que codifica el 

péptido señal 

Con la finalidad de obtener el gen pva con y sin la secuencia génica que codifica el 
péptido  señal  de  SlPVA  y  poder  clonarlo  posteriormente  en  los  plásmidos  de  expresión 
anteriores, se diseñaron los oligonucleótidos sintéticos PVA‐1, PVA‐2 y PVA‐F (Tabla 10) 
que  sirvieron  de  cebadores  para  reacciones  de  amplificación  por  PCR  (apartado  17.5  de 
Materiales y Métodos). 

La  amplificación  utilizando  los  oligonucleótidos  PVA‐1  y  PVA‐F  ha  permitido 

obtener  un  fragmento  de  ADN  de  aproximadamente  2,4  kb  al  que  se  ha  denominado 
fragmento PVA1F y que incluye el gen pva con la secuencia génica para su péptido señal 
con el codón TTG de inicio de la traducción mutado por el triplete ATG. Se han incluido 
las  dianas  para  las  endonucleasas  XbaI  y  EcoRI  en  sus  extremos  5´  y  3´  respectivamente 

101
 Resultados 

(Figura 30 y 31A). Por otro lado, la amplificación por PCR utilizando los oligonucleótidos 
PVA‐2 y PVA‐F ha permitido obtener el fragmento PVA2F, de aproximadamente 2,3 kb, 
que incluye el gen pva sin la secuencia génica que codifica su péptido señal con dos dianas 
para la endonucleasa EcoRI en sus extremos (Figura 30 y 31B). 

 
 
 
 
Figura 30. Electroforesis de las PCR para la obtención de los fragmentos de PVA1F y 
PVA2F; 1, fragmento PVA2F; 2, fragmento PVA1F; λ, marcador de tamaño. 
 
A  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
B  

 
Figura 31. Esquema de las amplificaciones realizadas sobre el ADN total de S. lavendulae ATCC 13664 
para obtener los fragmentos PVA1F (A) y PVA2F (B), apartado 17.5 de Materiales y Métodos. 

102
Resultados 

Los  fragmentos  PVA1F  y  PVA2F  han  sido  clonados  en  E.  coli  DH5α  utilizando 
como  vector  de  clonación  plásmido  pGEMT‐Easy  vector  (Figura  32).  De  esta  manera  se 
han  obtenido  los  clones  E.  coli  DH5α  (pPVAT),  que  contiene  la  gen  pva  incluyendo  la 
secuencia  génica  de  su  péptido  señal  y  el  clon  E.  coli  DH5α  (pPVA2F‐1)  que  presenta  el 
gen pva sin la secuencia que codifica el péptido señal. 

 
A
 

  B

 
 
 
 
Figura 32. Construcción de los plásmidos pPVAT (A) y pPVA2F‐1 (B). EL plásmido pGEMT‐
easy  vector  se  indica  como  pGEM.  T,  residuos  de  timina.  Ori,  origen  de  replicación.  Apr, 
resistencia a ampicilina. 
 

4.2 Clonación y expresión del gen pva en E. coli HB101 

Para la clonación y expresión del gen pva con y sin la secuencia génica que codifica 
su péptido señal, en E. coli HB101, se han seleccionado los vectores de expresión pIN‐III‐

103
 Resultados 

A3  (Inouye  y  Inouye,  1985)  y  pIN‐III‐ompA3  (Ghrayeb  y  col.,  1984).  Ambos  vectores 
presentan  el  promotor  Plpp‐lac  que  va  a  ser  el  que  va  a  regular  la  expresión  del  gen  a 
clonar y se diferencian en que el segundo posee la secuencia del péptido señal ompA, que 
permite la expresión extracelular de proteínas (Pines y Inouye, 1999). La selección de los 
clones  positivos,  que  expresen  SlPVA,  se  ha  realizado  por  complementación  de 
auxotrofía, de la misma manera que se procedió en la realización de la genoteca (apartado 
17.1 de Materiales y Métodos). 

Para la expresión del gen pva con su propio péptido señal se utilizó el vector pIN‐
III‐A3.  Se  partió  del  fragmento  PVA1F,  que  se  extrajo  del  plásmido  pPVAT  y  se  ligó  al 
plásmido  pIN‐III‐A3,  dando  lugar  al  plásmido  pIN‐PVA1F.  La  mezcla  de  ligación  se 
utilizó  para  transformar  células  competentes  de  E.  coli  HB101,  tal  como  se  indica  en  el 
apartado 17.5 de Materiales y Métodos (Figura 33).  

 
Figura  33.  Construcción  del  plásmido  pIN‐PVA1F  para  la  expresión  del  gen  pva  con  su  propio 
péptido señal y posterior transformación y selección en E. coli HB101. Ori, origen de replicación. Apr, 
resistencia a ampicilina. T7p promotor T7. lac I represor lacI. Ippp promotor lacPO promotor‐operador 
del gen lacZ. 

104
Resultados 

El  proceso  de  selección  de  clones  positivos  no  dio  ningún  resultado  positivo,  sin 
observarse  crecimiento  bacteriano  en  medio  M63  en  presencia  de  fenoxiacetil‐L‐leucina 
durante 5 días a 30ºC, lo que indica que no se está produciendo SlPVA, y por tanto, no se 
está dando la hidrólisis de fenoxiacetil‐L‐leucina que libera L‐leucina al medio y permite 
complementar la auxotrofía de E. coli HB101. 

La expresión del gen pva sin la secuencia que codifica su propio péptido señal se 
llevó a cabo utilizando el vector pIN‐III‐ompA3. Para ello, se partió del fragmento PVA2F, 
que  se  extrajo  del  plásmido  pPVAT2F‐1.  Este  fragmento  se  ligó  al  plásmido  pIN‐III‐
ompA3, dando lugar al plásmido pIN‐ompAPVA2F, y la mezcla de ligación se utilizó para 
transformar células competentes de E. coli HB101, tal como se indica en el apartado 17.5 
de Materiales y Métodos (Figura 34).  

 
 
 
Figura 34. Construcción del plásmido pIN‐ompAPVA2F para la expresión del gen pva con 
el  péptido  señal  ompA  de  E.  coli  y  posterior  transformación  y  selección  en  E.  coli  HB101. 
Ori, origen de replicación. Apr, resistencia a ampicilina. T7p promotor T7. lac I represor lacI. 
Ippp promotor lacPO promotor‐operador del gen lacZ. O, secuencia del péptido señal OmpA 

105
 Resultados 

Al  igual  que  en  el  caso  anterior,  tampoco  se  obtuvieron  resultados  positivos,  no 
detectándose en el proceso de selección ningún clon positivo que produjese la expresión 
de SlPVA. 

4.3  Clonación y expresión del gen pva en E. coli BL21 (DE3) 

Otra  estrategia  abordada  para  conseguir  la  clonación  y  la  expresión  del  gen  pva 
con la secuencia que codifica su propio péptido señal fue en otro sistema de expresión, el 
vector  de  expresión  pET28  a  (+)  (Tabla  9).  Este  plásmido  posee  el  promotor  T7p  del 
bacteriófago  T7,  que  es  inducible  por  IPTG  en  aquellas  células  que  expresan  la  T7  ARN 
polimerasa,  como  es  el  caso  de  E.  coli  BL21  (DE3).  La  selección  de  los  plásmidos 
recombinantes que incluyen el gen pva no se pudo hacer directamente en estas células, por 
lo  que  hubo  que  seleccionarlos  usando  como  sistema  E.  coli  DH5α,  ya  que  el  promotor 
T7p es muy fuerte, y el producto de su expresión puede ser muy tóxico.  

El fragmento PVA1F se extrajo del plásmido pPVAT y se introdujo en el vector de 
expresión  pET28  a  (+),  dando  lugar  al  plásmido  recombinante  pET28PVAT  (Figura  35) 
que  tras  ser  seleccionado  en  E.  coli  DH5α,  se  utilizó  para  transformar  E.  coli  BL21  (DE3) 
obteniéndose el clon positivo E. coli BL21 (pET28PVAT) con el que se han llevado a cabo 
estudios de expresión del gen pva. 

 
 

 
Figura 35. Construcción del plásmido pET28PVAT. Ori, origen de replicación. 
Knr, resistencia a kanamicina. Apr, resistencia a ampicilina. T7p promotor T7. 
lac I represor lacI. 

106
Resultados 

Las pruebas de expresión de SlPVA por E. coli BL21 (pET28PVAT) se han realizado 
inoculando  el  microorganismo  recombinante  en  3  ml  de  medio  LB  con  kanamicina,  e 
incubando el clon durante toda la noche a 30 ºC y 37 ºC en presencia o ausencia de IPTG 
(1 mM). La producción de SlPVA se ha determinado tanto en los caldos de fermentación 
como  en  los  extractos  celulares  por  ensayo  enzimático  de  hidrólisis  de  penicilina  V 
utilizando  el  método  del  PDAB  (apartado  22.1  de  Materiales  y  Métodos).  También  se 
analizó  la  presencia  de  SlPVA  mediante  Western  blot  (apartado  24.2  de  Materiales  y 
Métodos) tanto en los caldos libres de células como en los extractos celulares. 

Los  resultados  obtenidos  de  los  estudios  de  expresión  de  SlPVA  por  E.  coli  BL21 
(pET28PVAT) fueron negativos, no observándose la presencia de enzima activa ni en los 
caldos  de  fermentación  ni  en  los  extractos  celulares  mediante  ensayos  enzimáticos. 
Asimismo, no se detectó la presencia de SlPVA ni en los caldos ni en las células mediante 
electroforesis  de  proteínas  e  inmunodetección  (Figura  36),  por  lo  que  se  puede  afirmar 
que E. coli no produce expresión del gen pva. 

  A A’
 
 

 
B B’
 

 
 
 
Figura  36.  Estudio  de  la  producción  de  SlPVA  por  E.  coli  BL21  (pET28PVAT)  mediante 
electroforesis de proteínas (A y B) e inmunodetección (A’ y B’) tanto en los caldos de fermentación 
(A y A’) como en los extractos celulares (B y B’). 1, Patrones de proteínas; 2, control SlPVA pura; 3, 
fermentación a 30 °C sin IPTG; 4, fermentación a 30 °C con IPTG; 5, fermentación a 37 °C sin IPTG; 
6, fermentación a 37 °C con IPTG; 7, control negativo a 30 °C sin IPTG; 8, control negativo a 30 °C 
con IPTG; 9, control negativo a 37 °C sin IPTG; 10, control negativo a 37 °C con IPTG. 
 

107
 Resultados 

5. CLONACIÓN  Y  EXPRESIÓN  DEL  GEN  pva  DE  S.  lavendulae  ATCC 

13664 EN S. lividans 1326 

Como se ha descrito, los resultados obtenidos en los estudios de expresión del gen 
pva  utilizando  E.  coli  como  hospedador  han  sido  infructuosos,  no  observándose 
producción enzimática en ningún caso, por lo que se ha procedido a abordar su expresión 
en un microorganismo similar, S. lividans 1326. Para ello se han seguido dos estrategias, en 
una  primera  etapa  se  ha  abordado  la  clonación  y  expresión  del  gen  pva  con  su  propio 
promotor,  para  lo  cual  se  ha  utilizado  el  vector  de  clonación  pHJL401  que  permitirá 
estudiar las señales de regulación de la expresión. A continuación, en una segunda etapa, 
se ha procedido a optimizar la expresión mediante la clonación del gen pva utilizando el 
vector de expresión pEM4 (Quiros y col., 1998). 

5.1 Clonación y expresión del gen pva con su propio promotor 

La clonación y expresión en S. lividans 1326 del gen pva con su propio promotor se 
ha  llevado  a  cabo  utilizando  como  vector  de  clonación  el  plásmido  pHJL401  (Larson  y 
Hershberger,  1986),  plásmido  bifuncional  con  origen  de  replicación  para  E.  coli  y  para 
Streptomyces,  que  presenta  marcadores  de  resistencia  para  su  selección  en  ambos 
microorganismos,  ampicilina  para  E.  coli  y  tioestreptona  para  Streptomyces.  pHJL401  no 
posee  secuencias  promotoras  que  permita  la  expresión  de  los  genes  clonados  en  él,  por 
tanto la expresión del gen pva va a estar regulada por su propio promotor. 

Si bien conocemos la secuencia completa del gen pva, con el objetivo de clonarlo y 
expresarlo  utilizando  el  plásmido  pHJL401,  se  hace  necesario  obtener  un  fragmento  de 
ADN que contenga el gen completo, incluyendo su supuesta zona promotora, por dicho 
motivo se ha realizado una genoteca del ADN de S. lavendulae ATCC 13664 en el fago λ‐
GEM12. 

5.1.1 Construcción de una genoteca de S. lavendulae ATCC 13664  en λ‐GEM12 

La genoteca de S. lavendulae ATCC13664 se construyó en el fago λ‐GEM12 a partir 
de los fragmentos, de entre 15 y 20 kb, generados tras la digestión del ADN cromosómico 
con la enzima de restricción Sau3AI, tal como se describe en el apartado 17.4 de Materiales 
y Métodos. Estos fragmentos fueron utilizados para realizar reacciones de ligación con el 
vector  fágico  λ‐GEM12,  al  que  se  había  eliminado  la  región  “stuffer”  y  posteriormente 
fueron  encapsidados.  El  producto  de  la  encapsidación  se  utilizó  para  infectar  E.  coli 
NM539 y E. coli LE392 que sólo generan placas de lisis en fagos que carecen de la región 
central. El título fágico resultante fue de 650.000 y 950.000 ufp (unidades formadoras de 

108
Resultados 

placas de lisis) respectivamente, para cada una de las infecciones, lo que permitió estimar 
que  el  70%  de  los  fagos  eran  portadores  de  ADN  exógeno.  El  procesó  de  selección 
posterior ha dado lugar a la selección de 3 clones positivos, los fagos λ18‐3, λ18‐4 y λ18‐5. 

Con  la  finalidad  de  subclonar  y  secuenciar  los  fragmentos  de  ADN  de  los  fagos 
positivos,  se  purificó  el  ADN  de  éstos,  y tras  una  digestión  con  la enzima  de  restricción 
SacI se clonaron en el plásmido pBluescriptII KS (+), utilizando como hospedador E. coli 
DH5α. Se ha obtenido así el clon positivo E. coli DH5α (pASLS6), que posee el plásmido 
pASLS6 (Figura 37A), que presenta un inserto de ADN de aproximadamente 2 kb, 1,3 kb 
inferior al esperado si contuviera toda la secuencia del gen pva. 

  A 
 

 
B 
 

 
 
 
 
Figura  37.  A,  esquema  del  proceso  de  clonación  del  gen  pva  de  S.  lavendulae  ATCC13664 
mediante  genoteca  en  λ‐GEM12  y  subclonaje  del  inserto  del  fago  positivo  λ18‐4  para  la 
obtención  del  plásmido  pASLS6.  Apr  resistencia  a  ampicilina;  lacp  promotor  del  gen  lacZ;  Ori, 
origen  de  replicación  B,  Esquema  del  inserto  de  pASLS6,  que  incluye  la  región  promotora,  el 
RBS y 1,4 kb de la ORF del gen pva.  

109
 Resultados 

El  análisis  de  la  secuencia  del  inserto  de  2,1  kb  presente  en  el  plásmido  pASLS6 
(Figura  37B)  muestra  la  presencia  de  la  secuencia  correspondiente  a  toda  la  región 
promotora del gen pva así como gran parte de la ORF del gen, que incluye toda la región 
que  codifica  la  subunidad  α  de  la  proteína  y  alrededor  de  750  pb  de  la  secuencia  que 
codifica  la  subunidad  β,  por  lo  que  se  comprueba  que  la  ORF  del  gen  está  incompleta, 
faltando aproximadamente 1,3 kb de su extremo 3´. 

5.1.2 Reconstrucción del gen pva  

Como se ha indicado el análisis del fragmento del gen pva obtenido a partir de la 
genoteca en el fago λ‐GEM12 muestra que el gen no está completo por lo que se procedió 
a  reconstruirlo  a  partir  del  fragmento  PVA1F  obtenido  por  amplificación  mediante  PCR 
(Figura 31) y clonado en el plásmido pPVAT (Figura 32). 

Para ello, se analizó la secuencia del gen pva con el fin de localizar la presencia de 
una  diana  de  restricción  única  en  la  secuencia  y  que  se  encuentre  a  unos  150  pb  del 
extremo 3’ del fragmento y que no esté presente en los plásmidos de clonación. La enzima 
que reúne todos los requisitos es BstAPI.  

Una  vez  seleccionada  la  enzima,  para  la  reconstrucción  se  digirió  el  plásmido 
pASLS6  con  las  enzimas  de  restricción  EcoRI  y  BstAPI,  liberando  el  fragmento  de  ADN 
EcoRI‐BstAPI de 4,8 kb, que incluye el plásmido pBluescript II KS (+) y el gen pva hasta la 
secuencia  de  la  endonucleasa  BstAPI  (apartado  17.6.1  de  Materiales  y  Métodos). 
Paralelamente,  se  digirió  el  plásmido  pPVAT  con  las  mismas  enzimas  liberándose  el 
fragmento de ADN BstAPI‐EcoRI de 1 kb que corresponde al extremo 3´ del gen pva (hasta 
el  codón  STOP,  sin  incluir  el  terminador  de  la  transcripción).  Seguidamente,  ambos 
fragmentos fueron ligados obteniéndose el plásmido recombinante pBCPVASl0.1 (Figura 
38). Este plásmido se clonó E. coli DH5α, dando lugar al clon E. coli DH5α (pBCPVASl0.1). 
Dicho  plásmido  presenta  el  gen  pva  completo,  incluyendo  tanto  su  región  promotora 
como su ORF completa. 

110
Resultados 

 
 
Figura  38.  Esquema  de  la  reconstrucción  del  gen  pva  a  partir  de  los  plásmidos  pASLS6  y 
pPVAT,  que  dan  lugar  al  plásmido  pBCPVASl0.1,  que  contiene  la  secuencia  completa  del  gen 
pva, incluyendo su propio promotor (Ppva). Apr resistencia a ampicilina; Plac promotor del gen 
lacZ; Ori, origen de replicación. 
 

5.1.3 Obtención del clon S. lividans CECT 3365 

Tras obtener el gen pva completo, y con el fin del clonarlo en el plásmido pHJL401 
para su expresión en S. lividans 1326 bajo el control de su propio promotor, se procedió a 
extraer el gen del plásmido pBCPVASl0.1 mediante digestión con las endonucleasas SacI y 
EcoRI y tras su purificación se ligó en el plásmido pHJL401, previamente linealizado por 
digestión  con  las  mismas  enzimas  de  restricción.  La  mezcla  de  ligación  se  utilizó  para 
transformar células de E. coli DH5α obteniéndose el clon E. coli DH5α (pPVASl0.1) (Figura 
39), que contiene la secuencia completa del gen pva, incluyendo su región promotora. A 
continuación,  a  partir  del  clon  recombinante  de  E.  coli  se  aisló  y  purificó  el  plásmido 
pPVASl0.1 y se utilizó para transformar protoplastos de S. lividans 1326, obteniéndose el 
clon  S.  lividans  (pPVASl0.1),  que  contiene  el  gen  pva  de  S.  lavendulae  ATCC13664  con  su 
propio promotor. Este clon ha sido depositado bajo patente en la Colección Española de 

111
 Resultados 

Cultivos  Tipo  (CECT),  con  la  denominación  de  S.  lividans  CECT  3365,  que  se  utilizará  a 
partir de ahora. 

 
 

Figura 39. Obtención del clon S. lividans CECT 3365 que posee el plásmido pPVASl0.1. pvaP 
promotor  del  gen  pva;  Apr  gen  de  resistencia  a  ampicilina;  Tsrr  gen  de  resistencia  a 
tioestreptona; lac Z, gen lac Z; Ori pUC19, origen de replicación para E. coli; Ori SPC2, origen 
de replicación para S. lividans. 
 

5.1.4 Expresión del gen pva por S. lividans CECT 3365 

Se han llevado a cabo estudios de producción de SlPVA por el clon recombinante 
S.  lividans  CECT  3365.  Para  ello,  se  han  realizado  una  serie  de  fermentaciones  en 
diferentes  medios:  Leche  desnatada,  medio  de  producción  de  SlPVA  por  S.  lavendulae 
ATCC  13664  (Torres  y  col.,  1999),  medio  TSB  (Inokoshi  y  col.,  1992),  y  medio  TSB  sin 
glucosa (TSBw/oG). Las fermentaciones se realizaron a 20 °C (temperatura de producción 

112
Resultados 

de SlPVA por S. lavendulae) y a 30 °C (temperatura de crecimiento óptima de S. lividans). 
Se tomaron muestras de las fermentaciones cada 24 horas hasta completar un total de 140 
horas,  analizándose  en  cada  una  la  producción  de  SlPVA  mediante  el  ensayo  de  la 
actividad  de  hidrólisis  de  penicilina  V  en  los  caldos  de  fermentación  y  en  los  extractos 
celulares mediante el método del PDAB (apartado 22.1 de Materiales y Métodos). Como 
controles  negativos  se  realizaron  fermentaciones  en  las  mismas  condiciones  inoculando 
los medios con S. lividans 1326 o con S. lividans a los que se había introducido el plásmido 
(pHJL401). 

En la Tabla 16 se recogen los resultados obtenidos en la detección de SlPVA en los 
caldos  de  fermentación  de  los  diferentes  medios  por  los  distintos  microorganismos.  La 
actividad  enzimática  penicilina  V  acilasa  sólo  se  detecta  en  los  caldos  de  de  S.  lividans 
CECT 3365, no observándose actividad en los extractos celulares. Los mayores niveles de 
enzima se observan en los caldos de cultivo procedentes de las fermentaciones realizadas 
en medio TSBw/oG, donde la máxima producción se da a las 72 horas de cultivo. Aunque 
la  diferencia  de  producción  de  SlPVA  por  el  microorganismo  recombinante  en  los 
distintos  medios  no  es  muy  significativa.  Por  otro  lado,  no  se  observa  producción  de  la 
enzima ni en S. lividans 1326 ni en S. lividans (pHJL401). 

 
Tabla  16.  Producción  de  SlPVA  con  el  tiempo  en  los  distintitos  medios  de 
fermentación por S. lividans CECT 3365, S. lividans 1326 y S. lividans (pHJL401).  
 

SlPVA producida (UI/ml)* 
Microorganismo Medio 
0  48  72  96  140 
horas  horas  horas  horas  horas 
Leche  0  0  0  0  0 
S. lividans 1326  TSB  0  0  0  0  0 
TSBw/oG  0  0  0  0  0 
Leche  0  0  0  0  0 
S. lividans 
TSB  0  0  0  0  0 
(pHJL401) 
TSBw/oG  0  0  0  0  0 
Leche  0  0  0,0115  0,0114  0,0110 
S. lividans 
TSB  0  0  0,0006  0,0027  0,0054 
CECT 3365 
TSBw/oG  0  0  0,0200  0,0200  0,0200 
* UI: µmoles de 6‐APA producidos por minuto en las condiciones de ensayo. 

113
 Resultados 

Con  la  finalidad  de  asegurar  que  la  actividad  detectada  en  el  caldo  de  la 
fermentación de S. lividans CECT 3365 se corresponde a la enzima SlPVA se ha realizado 
una  inmunodetección  de  la  proteína  procedente  del  medio  TSBw/oG  tras  140  horas  de 
cultivo (Figura 40). 

 
 
A B
 

 
 

Figura  40.  Estudio  de  la  producción  de  SlPVA  por  S.  lividans  CECT  3365  mediante  electroforesis  en 
PAGA‐SDS (A) e inmunodetección (B) en los caldos de las fermentaciones en medio TSBw/oG a las 140 
horas. 1, Patrones de proteínas preteñidos; 2, Fermentación control con S. lividans 1326; 3, Fermentación 
control  con  S.  lividans  pHJL401;  4,  fermentación  con  S.  lividans  CECT  3365;  5,  control  SlPVA  pura.  Se 
indican la posición de las subunidades α y β de la PVA. 
 

Como  se  puede  observar  en  la  Figura  40  el  microorganismo  recombinante  S. 
lividans  CECT  3365  está  produciendo  SlPVA.  Además,  esta  enzima  es  activa,  ya  que  se 
detecta mediante los ensayos enzimáticos realizados en los caldos de fermentación de los 
diferentes medios. De todas formas, la producción de SlPVA por S. lividans CECT 3365 no 
es muy elevada, suponiendo el 10% de la que se da en el microorganismo parental (Torres 
y col., 1999), pero aún así, este resultado permite concluir que el gen pva de S. lavendulae 
ATCC  13664  puede  ser  clonado  y  expresado  en  S.  lividans,  lo  que  supone  el  inicio  a 
mejoras en cuanto a la producción de SlPVA utilizando este hospedador. 

5.1.5 Hidrólisis de penicilinas alifáticas en los caldos de fermentación de S. lividans 
CECT 3365 

Como ya se ha señalado la penicilina V acilasa de S. lavendulae ATCC 13664 es la 
única  penicilina  acilasa  que  presenta  actividad  hidrolítica  sobre  las  penicilinas  naturales 
cadena  lineal  alifáticas,  penicilina  F,  penicilina  dihidroF  y  penicilina  K,  presentes  en  los 
caldos de producción de las penicilinas G y V (Torres‐Guzmán y col., 2002).  

Con el fin de determinar si la SlPVA expresada en S. lividans CECT 3365 conserva 
la  capacidad  de  hidrolizar  este  tipo  de  penicilinas  se  llevaron  a  cabo  fermentaciones  en 
medio TSBw/oG durante 72 horas y a 250 rpm. Seguidamente se procedió a determinar la 

114
Resultados 

capacidad de producir 6‐APA a partir de las penicilinas F, dihidroF y K en los caldos de 
fermentación  obtenidos  mediante  el  método  del  PDAB  (apartado  22.1  de  Materiales  y 
Métodos). El resultado aparece reflejado en la Figura 41. 

 
 

Figura  41.  Actividad  de  hidrólisis  de  penicilinas  alifáticas  naturales  detectada  en 
los  caldos  de  fermentación  de  S.  lividans  CECT  3365  en  medio  TSBw/oG  a  las 140 
horas  de  fermentación.  La  actividad  se  determinó  en  UI/ml  (µmoles  de  6‐APA 
producidos  por  minuto  en  1  ml  de  caldo  de  fermentación.  Penicilina  DHF: 
penicilina dihidroF. 
 

Como  reflejan  los  resultados  obtenidos,  se  observa  hidrólisis  de  las  penicilinas 
alifáticas  en  los  caldos  de  fermentación  de  S.  lividans  CECT  3365,  mientras  que  en  las 
fermentaciones  realizadas  con  los  microorganismos  control  (S.  lividans  1326  y  S.  lividans 
(pHJL401)) no se detecta hidrólisis de dichas penicilinas, al igual que tampoco se observa 
hidrólisis  de  penicilina  V,  por  lo  que  se  puede  concluir  que  el  microorganismo 
recombinante  S.  lividans  CECT  3365  produce  SlPVA  y  que  esta  enzima  conserva  su 
actividad hidrolítica frente a diferentes penicilinas alifáticas. 

5.2 Clonación y expresión del gen pva en el vector de expresión pEM4 

La  clonación  y  expresión  del  gen  pva  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  en  S.  lividans 
1326 constituye un éxito notable, ya que este sistema no está muy extendido y no es fácil 
de manejar. Sin embargo, los niveles de expresión del gen obtenidos en S. lividans CECT 
3365 no representan una mejora notable, sobre todo con vistas a la utilización industrial 
de esta enzima, donde se requiere gran cantidad de la misma. 

115
 Resultados 

Con el fin de conseguir mayores niveles de expresión del gen pva, se procedió a su 
clonación utilizando el vector de expresión pEM4 (Quiros y col., 1998; Aguirrezabalaga y 
col.,  2000).  Este  vector  plasmídico  presenta  las  ventajas  frente  a  pHJL401  de  que  es  un 
plásmido de alto número de copias, además de poseer un promotor fuerte y constitutivo, 
el PermE* (Bibb y col., 1994), derivado del promotor de la eritromicina PermE (Bibb y col., 
1985).  Se  trata  también  de  un  plásmido  bi‐funcional,  con  orígenes  de  replicación  tanto 
para E. coli como para Streptomyces y con marcadores para la selección en cada una de las 
bacterias, ampicilina y tioestreptona, respectivamente. 

5.2.1 Obtención del clon recombinante S. lividans CECT 3376 

Con  el  objetivo  de  clonar  y  expresar  el  gen  pva  utilizando  el  plásmido  pEM4,  se 
extrajo  el  gen  del  plásmido  pVASl0.1  mediante  digestión  con  las  enzimas  de  restricción 
XbaI  y  EcoRI.  Seguidamente  el  gen  pva  se  ligó  en  el  plásmido  pEM4,  previamente 
linealizado por digestión con las mismas endonucleasas (apartado 17.6.2 de Materiales y 
Métodos). La mezcla de ligación se utilizó para transformar células competentes de E. coli 
DH5α, obteniéndose el clon recombinante E. coli Dh5α (pASL‐7). El plásmido pASL‐7, que 
contiene la secuencia completa del gen pva, se utilizó para transformar protoplastos de S. 
lividans  1326  (Figura  42),  dando  lugar  al  clon  recombinante  S.  lividans  (pASL‐7),  que 
contiene el gen pva de S. lavendulae ATCC 13664. Este clon ha sido depositado bajo patente 
en  la  Colección  Española  de  Cultivos  Tipo  (CECT),  pasándose  a  denominar  S.  lividans 
CECT 3376, nombre que se utilizará a partir de ahora. 

116
Resultados 

 
 

Figura  42.  Obtención  del  clon  recombinante  S.  lividans  CECT  3376  que  posee  el  plásmido  pASL‐7.  Ppva 
promotor del gen pva; PermE*, promotor de la eritromicina; Apr resistencia a ampicilina; Tsrr resistencia a 
tioestreptona;  lac  Z,  gen  lacZ;  Ori  pUC,  origen  de  replicación  para  E.  coli;  Ori  pWHM4,  origen  de 
replicación para S. lividans. 
 
 

5.2.2 Optimización de la producción de SlPVA por S. lividans CECT 3376 

Se  han  llevado  a  cabo  estudios  de  producción  de  la  enzima  SlPVA  por  el 
microorganismo recombinante S. lividans CECT 3376. Para ello se han realizado una serie 
de fermentaciones en diferentes medios con el fin de determinar el más adecuado para la 
producción de la enzima. Los medios estudiados han sido leche desnatada (Torres y col., 
1999), medio ELO (Torres‐Bacete y col., 2005), medio TSB  (Inokoshi y col., 1992) y medio 
TSB sin glucosa (TSBw/oG), apartado 18.1 de Materiales y Métodos. Las fermentaciones se 
han realizado a 30 °C (temperatura óptima de producción de SlPVA por S. lividans CECT 
3365).  Se  tomaron  alícuotas  a  las  72,  96,  120  y  144  horas,  analizándose  la  producción  de 
SlPVA  mediante  la  determinación  de  la  actividad  de  hidrólisis  de  penicilina  V  en  los 
caldos  de  fermentación  mediante  el  método  del  PDAB  (apartado  22.1  de  Materiales  y 
Métodos).  Como  controles  negativos,  se  realizaron  fermentaciones  en  las  mismas 

117
 Resultados 

condiciones  con  S.  lividans  1326  y  con  S.  lividans  (pEM4).  Los  resultados  obtenidos 
aparecen reflejados en la Tabla 17. 

Tabla 17. Producción de SlPVA en los diferentes medios de fermentación por S. lividans CECT 
3376, S. lividans 1326 y S. lividans (pEM4).  
 

PVA producida con el tiempo (UI/ml)* 
Microorganismo  Medio  0  72  96  120  140 
horas  horas  horas  horas  horas 
Leche  0  0  0  0  0 
ELO  0  0  0  0  0 
S. lividans 1326 
TSB  0  0  0  0  0 
TSBw/oG  0  0  0  0  0 
Leche  0  0  0  0  0 
S. lividans  ELO  0  0  0  0  0 
(pEM4)  TSB  0  0  0  0  0 
TSBw/oG  0  0  0  0  0 
Leche  0  0  0  0  0 
S. lividans  ELO  0  0,120  0,206  0,223  0,200 
CECT 3376  TSB  0  0,580  0,650  0,620  0,670 
TSBw/oG  0  0,380  0,310  0.270  0.470 
* UI: µmoles de 6‐APA producidos por minuto en las condiciones de ensayo. 

En  la  Tabla  17  se  recogen  los  resultados  obtenidos.  Los  mayores  niveles  de 
producción  de  SlPVA  por  S.  lividans  CECT  3376  se  consiguen  cuando  se  utiliza  medio 
TSB, siendo el tiempo máximo de fermentación 96 horas (0,65 UI/ml), lo que supone una 
producción 3 veces superior a la que se obtiene en S. lavendulae ATCC 13664 y en menos 
tiempo de fermentación (Torres y col., 1999). Además hay que destacar un incremento de 
32 veces respecto a la obtenida en S. lividans CECT 3365 (Tabla 16). Estos resultados nos 
permiten  establecer  el  medio  TSB  como  el  más  adecuado  para  la  producción  de  SlPVA 
por S. lividans CECT 3376.  

Una  vez  seleccionado  el  medio  más  idóneo  para  la  producción  de  SlPVA,  se 
procedió  a  la  optimización  del  tamaño  de  inóculo  de  S.  lividans  CECT  3376.  Para ello  se 
han  realizado  una  serie  de  fermentaciones  en  medio  TSB  en  las  que  se  han  utilizado 
inóculos  de  1x106,  2x106,  5x106,  1x107  y  2x107  esporas/ml.  Las  fermentaciones  se  han 
llevado  a  cabo  durante  un  tiempo  de  hasta  120  horas  a  30  °C.  Se  ha  analizado  la 

118
Resultados 

producción extracelular de SlPVA cada 24 horas. Los resultados obtenidos se muestran en 
la Figura 43. 

 
 

Figura 43. Producción de SlPVA por S. lividans CECT 3376 en función del tamaño del inóculo. 
La actividad viene definida en UI/ml.  „ 1x 106 esporas/ml;  „ 2 x 106 esporas/ml;  „  5 x 106 
esporas/ml; „ 1 x 107 esporas/ml; „ 2x107 esporas/ml. 
 

Como se puede observar en la Figura 43, no existen grandes variaciones en cuanto 
a  los  niveles  de  SlPVA  producidos  respecto  al  tamaño  del  inóculo  utilizado,  aunque  la 
producción  es  más  lenta  cuando  el  tamaño  del  inóculo  es  de  1x106  esporas/ml, 
acelerándose con inóculos de 1x107 y 2x107 esporas/ml. Respecto a los inóculos de 2x106 y 
5x106  esporas/ml  la  producción  es  prácticamente  la  misma,  siendo  en  ambos  casos 
ligeramente superior a la observada en el resto. En relación a esto hay que señalar que la 
cantidad  de  proteína  extracelular  en  ambos  casos  es  similar,  aunque  se  observa  una 
menor  concentración  en  las  fermentaciones  en  la  que  se  utilizó  un  inóculo  menor.  Eso 
hace que las fermentaciones realizadas con 2x106 esporas/ml presenten una tasa de SlPVA 
producida por miligramo de proteína extracelular ligeramente superior que en el caso del 
inóculo  de  5x106  esporas/ml.  Este  último  dato  hace  que  el  tamaño  de  inóculo  quede 
establecido en 2x106 esporas/ml como el más idóneo para la producción de SlPVA por S. 
lividans CECT 3376 en medio TSB. 

Una vez optimizado tanto el medio de fermentación como el tamaño de inóculo, se 
ha  llevado  a  cabo  el  estudio  de  la  temperatura  óptima  de  producción  de  SlPVA  por  S. 

119
 Resultados 

lividans CECT 3376. Para ello se han realizado una serie de fermentaciones en medio TSB a 
distintas temperaturas: 35 °C, 30 °C y 25 °C. En todos los casos los medios se inocularon 
con 2x106 esporas/ml. Las fermentaciones se llevaron a cabo hasta un tiempo final de 96 
horas,  tomándose  alícuotas  cada  24  horas,  con  el  fin  de  determinar  la  producción  de 
SlPVA por el método del PDAB (apartado 22.1 de Materiales y Métodos). Los resultados 
aparecen reflejados en la Figura 44. 

 
 

Figura  44.  Producción  de  SlPVA  por  S.  lividans  CECT  3376  en  función  de  temperatura  de 
fermentación. La actividad viene definida en UI/ml. „ 35 ºC; „ 30 ºC; „ 25 ºC. 
 

Como  se  observa  claramente  en  la  Figura  44,  la  producción  de  SlPVA  por  S. 
lividans CECT 3376 es mucho mayor a 30 °C, siendo muy inferior tanto a 35 ºC como a 25 
°C. Esto puede ser debido principalmente a que la producción de SlPVA esté relacionada 
con  el  crecimiento  del  microorganismo  y,  por  tanto,  a  30  °C,  temperatura  óptima  de  S. 
lividans, se den las condiciones para una mejor producción (Kieser y col., 2000). 

Una  vez  establecidos  el  medio,  el  tamaño  de  inóculo  y  la  temperatura  de 
fermentación  para  la  producción  de  SlPVA  por  S.  lividans  CECT  3376,  se  procedió  a 
estudiar la producción de la enzima en función del tiempo de fermentación con el fin de 
determinar las condiciones óptimas para la producción de la enzima.  

Para ello, se ha llevado a cabo la fermentación de S. lividans CECT 3376 en medio 
TSB  a  30  °C  y  durante  un  período  de  hasta  160  horas,  utilizando  un  inóculo  de  2x106 
esporas/ml.  Cada  24  horas  se  ha  determinado  la  producción  de  SlPVA  en  los  caldos  de 

120
Resultados 

fermentación, así como de la proteína extracelular producida (Figura 45). Paralelamente, y 
con el fin de determinar si quedaba SlPVA intracelularmente, se ha determinado también 
la  cantidad  de  enzima  presente  en  los  extractos  celulares  durante  el  proceso  de 
fermentación. 

El  seguimiento  del  crecimiento  celular  se  ha  determinado  por  el  cálculo  de  la 
proteína intracelular total (Figura 45). 

 
 

 
Figura 45. Curva de crecimiento y producción de SlPVA por S. lividans CECT 3376 en medio TSB a 
30 °C. El tamaño de inóculo fue de 2x106 esporas/ml. ⎯•⎯ actividad penicilina acilasa (UI/ml); ‐ ‐ 
‐„‐  ‐  ‐  proteína  extracelular  (mg/ml);  •••S•••  crecimiento  celular  (mg  totales  de  proteína 
intracelular). 
 

Como  se  puede  observar  en  la  figura  45,  tras  una  fase  de  latencia  de  24  horas 
comienza  la  producción  de  SlPVA  coincidiendo  con  la  fase  exponencial  del  crecimiento 
celular.  El  máximo  de  producción  se  alcanza  a  las  96  horas,  momento  en  el  que  el 
crecimiento  celular  entra  en  la  fase  estacionaria  y  posteriormente  en  la  fase  de  muerte 
celular. La cantidad de enzima producida se mantiene constante a partir de las 96 horas, 
mientras  que  la  cantidad  de  proteína  extracelular  sigue  aumentando.  Esto  hace  que  a 
partir  de  ese  momento  sea  menor  la  proporción  de  SlPVA  respecto  de  otras  proteínas 
presentes en el caldo de fermentación, lo que podría llevar asociados problemas a la hora 
de  purificar  la  enzima,  e  incluso  podrían  estar  apareciendo  proteasas  en  el  medio  que 
puedan hidrolizar la SlPVA. 

121
 Resultados 

Por tanto, de la curva de crecimiento y producción de SlPVA por S. lividans CECT 
3376  en  medio  TSB  se  puede  establecer  el  tiempo  óptimo  en  96  horas,  alcanzándose 
niveles de producción de 670 UI/l, lo que supone un incremento de 3 veces respecto a la 
cantidad de SlPVA producida por S. lavendulae ATCC 13664 y en un tiempo inferior a las 
140 horas (Torres y col., 1999).  

Por  otro  lado,  del  análisis  de  SlPVA  intracelular  se  descarta  que  ésta  se  esté 
acumulando  en  el  interior  de  las  células.  Su  presencia  en  los  extractos  celulares  es  muy 
poco  significativa  durante  el  transcurso  de  la  fermentación.  Esto  indicaría  que  toda  la 
proteína que se está produciendo está siendo excretada al medio. 

6. PURIFICACIÓN  DE  LA  SlPVA  PRODUCIDA  POR  S.  lividans  CECT 

3376 

Una  vez  establecidas  las  condiciones  óptimas  de  producción  de  SlPVA  mediante 
fermentación del microorganismo recombinante S. lividans CECT 3376, con la finalidad de 
obtener  enzima  pura  para  poder  llevar  a  cabo  estudios  de  caracterización  que  permitan 
determinar si la enzima presenta las mismas características que la enzima parental se ha 
llevado a cabo el diseño de un proceso de purificación que permite obtener SlPVA pura a 
homogeneidad en tan sólo un paso cromatográfico que consiste en una cromatografía de 
intercambio iónico S‐Sepharose. 

La purificación de SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 se ha llevado a cabo 
a  partir  de  un  cultivo  de  96  horas  a  30  °C  en  400  ml  de  medio  TSB  inoculado  con  2x106 
esporas/ml  tal  como  se  describe  en  el  apartado  18.2  de  Materiales  y  Métodos.  En  las 
condiciones  descritas  toda  la  actividad  penicilina  V  acilasa  presente  en  el  caldo  de 
fermentación queda retenida en la columna de S‐Sepharose. La SlPVA se eluye aplicando 
un gradiente continuo de NaCl entre 0 y 1 M seguido de una elución isocrática con NaCl 1 
M, el pico de actividad penicilina V acilasa coincide con un pico de proteína (Figura 46). 
El  análisis  de  la  proteína  de  las  fracciones  de  este  pico  mediante  electroforesis  en  SDS‐
PAGE  e  inmunodetección  (Western  blot)  muestra  que  SlPVA  se  encuentra  pura  a 
homogeneidad  (Figura  47).  El  seguimiento  del  proceso  de  purificación  en  cada  etapa  se 
resume en la Tabla 18. 

122
Resultados 

 
 

Figura  46.  Purificación  de  SlPVA  producida  por  S.  lividans  CECT  3376,  cromatografía  de 
intercambio  iónico  S‐Sepharose.  ⎯  absorbancia  a  280  nm;  ⎯  actividad  PVA  (UI/ml);  ‐  ‐  ‐  ‐ 
gradiente de NaCl (M). 
 

 
A B
 

 
Figura 47. A, electroforesis en SDS‐PAGE de los pasos de purificación de SlPVA producida por S. 
lividans CECT 3376; B, inmunodetección de SlPVA por Western blot en cada uno de los pasos de 
purificación.  1,  Patrones  de  proteínas  preteñidos;  2,  Fermentación  control  con  S.  lividans  1326;  3, 
Fermentación  control con S. lividans (pEM4); 4, Extracto libre de células de la fermentación de S. 
lividans  CECT  3376;  5,  SlPVA  pura  obtenida  tras  la  cromatografía  en  S‐Sepharose;  6,  Control 
SlPVA pura. 
 

123
 Resultados 

Tabla 18. Purificación de SlPVA producida por S. lividans CECT 3376. 
 

Paso de  Actividad PVA  Actividad 

Rendimiento  F.P.1 
purificación  Total  Específica 
(%)   
  (UI)  (UI/mg proteína) 
Extracto libre de 
254,295  6,72  100  ‐ 
células 

S‐Sepharose  177,320  81,43  71  12,53 

1  F.P. Factor de purificación. 

Como  se  observa  en  la  Tabla  18,  el  proceso  desarrollado  para  llevar  a  cabo  la 
purificación  de  SlPVA  producida  por  S.  lividans  CECT  3376  permite  la  recuperación  del 
71% de la enzima pura a homogeneidad en un solo paso de purificación. 

7. CARACTERIZACIÓN  DE  SlPVA  PRODUCIDA  POR  S.  lividans  CECT 

3376 

Una vez purificada la SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 se han llevado a 
cabo  estudios  de  caracterización  de  la  enzima,  tanto  desde  un  punto  de  vista  funcional 
como desde un punto de vista estructural con el fin de compararla con la enzima parental. 

7.1 Caracterización funcional de la SlPVA recombinante 

Respecto a la caracterización funcional de SlPVA producida por S. lividans CECT 
3376  se  han  realizado  estudios  de  estabilidad  y  actividad  enzimática  de  la  enzima  en 
función del pH y la temperatura, así como estudios de la actividad enzimática respecto de 
la  fuerza  iónica.  Posteriormente,  se  han  realizado  estudios  de  determinación  de  los 
parámetros cinéticos de la SlPVA recombinante utilizando como sustratos las penicilinas 
naturales  (penicilina  V,  G,  K,  F  y  dihidroF),  utilizando  el  método  del  Fluram  para 
cuantificar el 6‐APA producida (apartado 22.2 de Materiales y Métodos). 

124
Resultados 

7.1.1 Estudio de la estabilidad y de la actividad de SlPVA respecto al pH 

Se ha llevado a cabo un estudio de  la estabilidad de la enzima SlPVA  producida 

por  S.  lividans  CECT  3376  frente  al  pH  del  medio.  Para  ello  se  incubó  la  proteína  a 
distintos valores de pH en un intervalo comprendido entre 7,5 y 11. Las incubaciones se 
realizaron durante 20 minutos (tiempo que dura el ensayo de actividad de la enzima) en 
un sistema de tampones fosfato/borato potásico 10 mM. A continuación se ajustó el pH de 
la solución enzimática a pH 8 tal como se describe en el apartado 25.1.1 de Materiales y 
métodos.  Seguidamente  se  determinó  la  actividad  penicilina  V  acilasa  retenida  por  la 
enzima.  

Como  se  observa  en  la  Figura  48A,  la  enzima  SlPVA  producida  por  S.  lividans 
CECT 3376 es estable en un intervalo de pH entre 7,5 y 10,5, disminuyendo ligeramente su 
actividad a valores de pH superiores a 0,5. Estos datos coinciden con los observados en la 
SlPVA parental (Torres‐Guzmán, 2004). 

Respecto  al  pH  óptimo  de  actividad  de  la  enzima,  su  determinación  se  realizó 
llevando a cabo ensayos de hidrólisis de penicilina V como sustrato a distintos valores de 
pH, utilizando el mismo intervalo de pH que el empleado en los estudios de estabilidad, 
tal  como  se  describe  en  el  apartado  25.1.2  de  Materiales  y  Métodos.  Los  resultados  se 
muestran en la Figura 48B. La SlPVA recombinante presenta un pH óptimo de actividad 
de  hidrólisis  de  penicilina  V  en  el  intervalo  de  pH  entre  9,5  y  10,5.  Estos  datos  se 
corresponden con los observados en la enzima SlPVA parental (Torres‐Guzmán, 2004). 

A
B
 

 
 

 
 
Figura 48. A, estabilidad de SlPVA frente al pH. B, actividad de SlPVA en función del pH. 
 

125
 Resultados 

7.1.2 Estudio de la estabilidad y de la actividad de SlPVA respecto a la temperatura 

Con  el  fin  de  determinar  la  estabilidad  de  la  enzima  SlPVA  producida  por  S. 
lividans  CECT  3376  frente  a  la  temperatura  se  incubó  la  proteína  en  un  intervalo  de 
temperatura entre 35‐60 °C. Las incubaciones se realizaron durante 20 minutos en tampón 
fosfato  potásico  0,1M,  pH  8.  A  continuación,  se  incubó  la  enzima  a  0  °C  durante  20 
minutos.  Seguidamente,  se  determinó  la  actividad  penicilina  V  acilasa  retenida  por 
SlPVA.  

Como  se  observa  en  la  Figura  49A,  la  enzima  SlPVA  producida  por  S.  lividans 
CECT  3376  es  estable  hasta  los  45  °C,  disminuyendo  progresivamente  su  actividad  a 
temperaturas  superiores.  A  60  °C  apenas  retiene  un  20%  de  su  actividad.  Estos  datos 
coinciden con los observados en la SlPVA parental (Torres‐Guzmán, 2004). 

Para determinar la temperatura óptima de la reacción de hidrólisis de la SlPVA se 
realizaron ensayos de hidrólisis de penicilina V en el intervalo de temperatura de 35‐60 °C 
en  tampón  fosfato  potásico  0,1M,  pH  8,  tal  como  se  describe  en  el  apartado  26.2.2  de 
Materiales  y  Métodos.  Los  resultados  se  muestran  en  la  Figura  49B.  Como  se  puede 
observar  la  SlPVA  recombinante  presenta  una  temperatura  óptima  de  actividad  de 
hidrólisis  de  penicilina  V  a  55  °C. Estos  datos se  corresponden  con  los  observados  en  la 
enzima SlPVA parental (Torres‐Guzmán, 2004).  

  A
B
 

 
 
Figura 49. A, estabilidad de SlPVA frente a la temperatura.; B, actividad de SlPVA frente a la temperatura. 
 

126
Resultados 

A partir de los resultados de actividad de hidrólisis de la penicilina V en función 
de  la  temperatura  se  determinó  la  energía  de  activación  de  la  reacción  catalizada  por  la 
SlPVA recombinante, cuyo valor es de 14,12 kJ/mol (Figura 50). 

 
 
 
Figura  50.  Cálculo  de  la  energía  de  activación  (Ea)  de  la  reacción  de 
hidrólisis de penicilina V catalizada por SlPVA. 
 

7.1.3 Estudio de la actividad SlPVA respecto a la fuerza iónica. 

El estudio de la actividad de la SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 frente a 
la fuerza iónica se llevó a cabo realizando ensayos de hidrólisis de penicilina V en tampón 
fosfato  0,1  M,  pH  8  en  presencia  de  distintas  concentraciones  de  NaCl  hasta  una 
concentración  final  de  3  M.  Los  resultados  se  muestran  en  la  Figura  51.  Se  observa  un 
aumento progresivo de la actividad de la enzima al adicionar NaCl hasta 0,6 M. Adiciones 
posteriores  producen  un  descenso en  la  actividad  de  la  enzima,  reteniendo  el  60%  de  la 
actividad a concentraciones de NaCl de 3 M. 

 
 

 
 

 
Figura 51. Estudio de la actividad de la SlPVA frente a la fuerza iónica. 

127
 Resultados 

7.1.4 Determinación  de  los  parámetros  cinéticos  de  SlPVA  frente  a  las  penicilinas 
naturales 

Con el fin de determinar si la enzima SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 
presenta  la  misma  especificidad  de  sustrato  frente  a  las  diferentes  penicilinas  naturales 
(penicilina V, K, F, dihidroF y G) que la SlPVA parental, se determinaron las constantes 
catalíticas  (Km,  kcat  y  kcat/Km)  frente  a  ellas.  Para  ello,  se  llevaron  a  cabo  los  ensayos 
descritos en el apartado 25.4 de Materiales y Métodos. 

En la Tabla 19 se muestran los resultados obtenidos para cada uno de los sustratos, 
que  coinciden  con  los  parámetros  catalíticos  obtenidos  para  la  SlPVA  parental  (Torres‐
Guzmán  y  col.,  2002).  Así  se  observa  el  mismo  comportamiento  de  la  enzima  parental, 
destacando  la  elevada  eficacia  catalítica  (244,11  mM‐1  s‐1)  que  muestra  al  utilizar  la 
penicilina K como sustrato. Por otro lado cabe destacar la baja actividad que posee cuando 
se utiliza la penicilina G como sustrato. 

 
Tabla  19.  Parámetros  cinéticos  de  SlPVA  producida  por  S.  lividans  CECT  3376 
frente a las distintas penicilinas naturales. 
 

Km  kcat  kcat/Km 

Sustrato 
(mM)  (s‐1)  (mM‐1 s‐1) 

Penicilina V  3,68  77,92  21,17 

Penicilina K  0,14  35,58  244,11 
Penicilina dihidroF  0,82  14,75  17,93 
Penicilina F  1,39  3,33  2,40 
Penicilina G  58,18  10,95  0,18 
 

7.2 Caracterización estructural de la SlPVA recombinante 

Se  han  realizado  estudios  de  caracterización  estructural  con  el  objetivo  de 
determinar, mediante técnicas espectroscópicas, si SlPVA producida por S. lividans CECT 
3376 presenta las mismas características estructurales que la SlPVA parental. 

7.2.1 Espectro de absorbancia UV‐visible de SlPVA 

El  análisis  del  espectro  de  absorbancia  UV‐visible  de  la  SlPVA  producida  por  S. 
lividans  CECT  3376  se  muestra  en  la  Figura  52.  Como  se  puede  apreciar,  se  trata  de  un 

128
Resultados 

espectro  en  el  que  la  contribución  de  tirosinas  y  triptófanos  es  similar,  donde  la  enzima 
presenta un máximo de absorbancia en torno a los 275 nm. 

 
Figura  52.  Espectro  de  absorbancia  UV‐visible  de  SlPVA.  La  concentración  de  proteína 
empleada fue de 0,1 mg/ml en tampón fosfato potásico 10 mM, pH 7 y 0,1 M de NaCl.  
 

7.2.2 Coeficiente de extinción molar de SlPVA 

El coeficiente de extinción molar de la SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 
se  ha  calculado  según  el  método  de  Edelhoch  (Edelhoch,  1967).  Para  ello,  se  ha 
determinado  la  absorbancia  a  280  nm  de  la  proteína  en  solución  y  de  la  proteína 
desplegada  en  presencia  de  cloruro  de  guanidinio  6  M.  En  función  de  estos  valores  de 
absorbancia, y el coeficiente de extinción molar teórico de SlPVA desplegada calculado en 
base a su secuencia de aminoácidos, con ayuda del programa ProtParam y cuyo valor es 
ε2800,1% (1g/l) = 1,59 (g/l)‐1 cm‐1, se calculó el coeficiente de extinción molar de la penicilina V 
acilasa, cuyo valor es: 

ε2800,1% = 1,27 (g/l)  cm   ‐1 ‐1

129
 Resultados 

7.2.3 Espectro de fluorescencia de SlPVA 

Se realizaron los espectros de fluorescencia de la enzima SlPVA producida por S. 
lividans  CECT  3376  utilizando  dos longitudes  de  onda  de excitación  (λexcitación):  a  275  nm, 
donde se consigue la excitación de las tirosinas, y 295 nm, donde se consigue la excitación 
de  los  triptófanos.  Los  espectros  de  fluorescencia  obtenidos  tras  excitar  a  ambas 
longitudes  de  onda  muestran  un  máximo  de  emisión  a  la  misma  longitud  de  onda, 
concretamente a 326 nm (Figura 53). Este resultado indica que el espectro de emisión está 
dominado  exclusivamente  por  los  triptofanos,  y  que  la  contribución  de  las  tirosinas  es 
mínima. 

 
Figura 53. Espectros de fluorescencia de SlPVA. La concentración de proteína empleada fue 
de  0,1  m/ml  en  tampón  fosfato  potásico  50  mM,  pH  7.  ⎯  λexcitación  275  nm;  ⎯  λexcitación  295 
nm. 
 

7.2.4 Espectro de dicroísmo circular de SlPVA 

Se  llevó  a  cabo  el  espectro  de  dicroísmo  circular  en  el  ultravioleta  lejano  de  la 
enzima SlPVA producida por S. lividans CECT 3376. El resultado obtenido aparece en la 
Figura 54. Como se puede observar, la proteína presenta dos mínimos a 210 y 222 nm. Se 
trataría  de  un  espectro  que  corresponde  a  una  enzima  cuyo  contenido  en  α‐hélice  es 
elevado. 

130
Resultados 

 
 

Figura  54.  Espectro  de  dicroísmo  circular  en  el  ultravioleta  lejano  de  SlPVA.  La 
concentración de proteína empleada fue de 0,28 mg/ml en tampón fosfato potásico 0,1 
M, pH 7. 
 

A  partir  de  los  datos  obtenidos  del  espectro  de  dicroísmo  circular,  se  ha 
determinado el contenido en estructura secundaria de SlPVA, para lo que se han utilizado 
los  programas  informáticos  CCA  y  CDNN  (Apartado  26.4  de  Materiales  y  métodos). 
Paralelamente,  se  ha  realizado  la  predicción  de  la  estructura  secundaria  de  la  enzima  a 
partir  de  su  estructura  primaria,  para  lo  cual  se  han  utilizado  los  programas  PSIpred, 
PHD  y  JUFO,  tal  como  se  indica  en  el  apartado  26.4  de  Materiales  y  Métodos.  Los 
resultados de la predicción de estructura secundaria aparecen reflejados en la Tabla 20. 

Tabla  20.  Predicción  de  la  estructura  secundaria  de  SlPVA  en  función  del  espectro  de 
dicroísmo  circular  (DC)  y  en  función  de  su  secuencia  de  aminoácidos.  Los  resultados 
vienen dados en %. 
 

Método de predicción 
 
Basados en el espectro de DC  Basados en la secuencia de aminoácidos 

Elemento 
CCA  CDNN  PSIPREP  PHD  JUFO 
estructural 
Hélice α  24  35,1  34,1  25,9  30,6 

Lámina β  30  15,0  15,0  16,7  15,4 

Giros β  16  15,3  22,7  20,1  ‐ 

Aperiódica  30  31,7  28,1  37,1  ‐ 

131
 Resultados 

Los  resultados  obtenidos  en  función  de  su  secuencia  (Tabla  20)  han  servido  para 
llevar a cabo la predicción de la estructura secundaria sobre la secuencia de aminoácidos 
de SlPVA, para lo que se han considerado sólo aquellos aminoácidos en los que coinciden 
al  menos  el  mismo  elemento  estructural  en  dos  de  los  métodos  empleados  y  que 
presentan  una  fiabilidad  mayor  de  6,  o  lo  que  es  lo  mismo,  mayor  del  85%  (Saiz  y  col., 
2002) (Figura 55). 

 
 

 
 
Figura 55. Predicción de la estructura secundaria de SlPVA en base a las estimaciones obtenidas con 
los programas PHD, PSIPREP y JUFO. Rectángulos verdes: hélice α; flechas azules: lámina β; líneas 
rojas; giros β. Flecha vertical negra: punto de inicio de la subunidad β de SlPVA. 
 

Como se puede observar en la figura 55 se observa un equilibrio entre motivos en 
hélice  α  y  lámina  β,  aunque  las  hélices  α  son  de  mayor  tamaño.  Cabe  destacar  que  los 
motivos estructurales en lámina β son más abundantes en los primeros 200 nucleótidos de 

132
Resultados 

la subunidad β, donde constituyen el motivo estructural mayoritario, mientras que en el 
resto  de  la  subunidad  β  predomina  el  contenido  en  hélice  α.  En  relación  a  la  estructura 
secundaria de la subunidad α, destaca el alto contenido en hélice α. 

Se ha estudiado la desnaturalización térmica de la enzima SlPVA producida por S. 
lividans  CECT  3376  por  dicroísmo  circular.  La  Figura  56  muestra  la  curva  de 
desnaturalización  térmica  obtenida.  Como  se  puede  observar  la  enzima  permanece 
ordenada hasta los 50 °C, momento en el que empieza a desplegarse paulatinamente hasta 
que  a  los  70  °C  SlPVA  ha  perdido  prácticamente  su  estructura.  La  enzima  presenta  una 
temperatura de transición (Tm) de 62 °C. 

 
 

Figura  56.  Curva  de  desnaturalización  térmica  de  SlPVA.  La  concentración  de  proteína 
empleada  fue  de  0,28  mg/ml  en  tampón  fosfato  potásico  0,1  M,  pH  7.  La  longitud  de  onda 
utilizada fue de 222 nm. 
 
 
 
 
 
 

133
 Resultados 

II. CLONACIÓN, EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE LA ACULEACINA A 

ACILASA DE A. utahensis NRLL 12052 

8. SECUENCIACIÓN DEL GEN QUE CODIFICA EL ARNr 16s DE A. 

utahensis NRRL 12052 

Con el fin de constatar la filiación del microorganismo A. utahensis NRRL 12052 se 
ha  amplificado  y  secuenciado  su  ARNr  16s.  La  amplificación  mediante  PCR  del  ADN 
total del microorganismo, utilizando como cebadores los oligonucleótidos consenso 63f y 
1387r  (Tabla  12)  y  el  programa  de  amplificación  16s  rADN  (Tabla  13)  ha  permitido 
obtener  un  fragmento  de  ADN  de  1,3  kb,  el  cual  se  ha  purificado  y  clonado  en  E.  coli 
DH5α  utilizando como vector el plásmido pGEM-T Easy vector (Tabla 9), obteniéndose  el 
microorganismo  recombinante  E.  coli  DH5α  (pGEM16SRNAAu‐2).  La  secuenciación  del 
inserto  del  plásmido  recombinante  pGEM16SRNAAu‐2  ha  proporcionado  la  secuencia 
que codifica el ARNr 16s de A. utahensis NRRL 12052 (Figura 57). 

 
CAGGCCTAACACATGCAAGTCGAGCGGAAAGGCCCTTCGGGGTACTCGAGCGGCGAACGG 60
 
GTGAGTAACACGTGAGTAACCTGCCCCAGACTTTGGGATAACCCTCGGAAACGGGGGCTA 120
ATACCGAATATGACTTGGCTTCGCATGGAGCTTGGTGGAAAGTTTTTCGGTTTGGGATGG
  180
ACTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCC 240
 
GGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGG 300
CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGA
  360
TGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTG 420
 
CAGAAGAAGCGCCGGCCAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAAGACGTAGGGCGCGAGCGT 480
TGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGAATGTGAAAAC
  540
CCGAGGCTCAACCTCGGGCTTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGAC 600
 
TGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGG 660
 
CGGGTCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAG 720
ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGGACCCTCTCCGGGTT 780
 
TCTGCGCCGCAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAA 840
 
CTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGCGGATTAATCCGATGCAA 900
CGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATCGCCGGAAAACTCGCAGAGATGCGGGGTCCTT 960
 
CGGGGCCGGTGACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA 1020
 
Figura 57. Secuencia del gen que codifica el ARNr 16s de A. utahensis NRRL 12052 
 

La  secuencia  obtenida  fue  analizada  utilizando  el  servidor  Ribosomal  Database 
Project II (http://rdp.cme.msu.edu/html/). El análisis preliminar de la secuencia del ARNr 
16s  ha  permitido  constatar  la  clasificación  de  A.  utahensis  NRRL  12052  de  acuerdo  a  la 
siguiente escala filogenética:  

134
Resultados 

Dominio: Bacteria 
  Phylum: Actinobacteria 
    Clase: Actinobacteria 
      Orden: Actinomycetales 
        Familia: Micromonosporaceae 
          Género: Actinoplanes 

Por otro lado, se ha llevado a cabo un estudio comparativo con diferentes especies 
del  género  Actinoplanes.  El  resultado  ha  permitido  obtener  un  dendograma  donde  se 
pueden observar las relaciones filogenéticas que se dan entre A. utahensis NRRL 12052 y 
las diferentes especies de la familia Micromonosporaceae (Figura 58).  

 
 

 
 
Figura  58.  Árbol  filogenético  de  la  Familia  Micromonospora,  incluyendo  el  género 
Actinoplanes, construido a partir de la secuencia génica del ARNr 16s.  
 

135
 Resultados 

9. DETECCIÓN DE ACTIVIDAD PENICILINA V ACILASA EN LOS 

CALDOS DE FERMENTACIÓN DE A. utahensis NRRL 12052 

Al analizar la secuencia de aminoácidos de SlPVA y comparar su secuencia con la 
de  otras  proteínas  utilizando  el  programa  BLASTP  2.2.8  (Altschul  y  col.,  1997)  se  ha 
observado  que  presenta  una  elevada  similitud  con  la  enzima  aculeacina  A  acilasa  de  A. 
utahensis NRRL 12052 (AuAAC) (Takeshima y col., 1989; Inokoshi y col., 1992). En concreto 
presenta  una  identidad  del  41%  y  una  similitud  del  54%.  Además,  en  1964  se  había 
descrito  la  presencia  de  actividad  penicilina  acilasa  en  los  caldos  de  fermentación  de 
microorganismos  del  género  Actinoplanes,  que  incluían  A.  utahensis  ATCC  14539 
(Kleinschmidt  y  col.,  1964).  Este  hecho  hizo  suponer  que  esta  enzima  podría  poseer 
actividad penicilina V acilasa, por lo que se ha procedido a analizar la presencia de dicha 
actividad en los caldos de fermentación de A. utahensis NRRL 12052. 

Para  ello  se  cultivó  el  microorganismo  en  el  medio  y  condiciones  descritas  por 
Takeshima  y  col  (1989)  para  la  fermentación  y  producción  de  AuAAC  (apartado  4  de 
Materiales  y  Métodos)  durante  96  horas  a  30 ºC  y  250  rpm  en  un  incubador  New 
Brunswick  Scientific  (USA)  con  agitación  orbital.  Una  vez  transcurrido  el  tiempo  de 
fermentación  se  eliminaron  las  células  mediante  centrifugación  y  se  determinó  la 
actividad  de  hidrólisis  de  penicilina  V  como  sustrato  mediante  el  método  del  PDAB 
(apartado 22.1 de Materiales y Métodos). 

El análisis de los caldos de fermentación ha permitido detectar actividad penicilina 
V acilasa, obteniéndose una producción de 0,06 UI/ml a las 96 horas de cultivo. Por tanto, 
se  ha  decidido  expresar  la  enzima  AuAAC  en  un  organismo  heterólogo  con  el  fin  de 
estudiar  si  es  la  responsable  de  la  actividad  acilasa,  así  como  caracterizar  la  reacción  de 
hidrólisis de penicilina V y estudiar si presenta actividad frente a las penicilina alifáticas 
naturales, al igual que ocurre con SlPVA. 

10.  AMPLIFICACIÓN,  CLONACIÓN  Y  SECUENCIACIÓN  DEL  GEN  aac 

DE A. utahensis NRRL 12052. 

La enzima AuAAC, al igual que ocurre con SlPVA, es un heterodímero, compuesto 
por  una  subunidad  pequeña,  α  de  20  kDa  y  una  grande,  β  de  55  kDa.  Esta  enzima  se 
produce  como  una  pre‐proteína,  en  la  que  se  mantiene  el  esquema  péptido  señal‐
subunidad  α‐subunidad  β,  y  que  tras  ser  procesada  da  lugar  a  la  proteína  madura 

136
Resultados 

(Inokoshi y col., 1992). Con el fin de clonar y secuenciar el gen aac que codifica la AuAAC, 
incluyendo  la secuencia que codifica su péptido señal, se diseñaron los oligonucleótidos 
AAC‐1  y  AAC‐2  (Tabla  11)  en  base  a  la  secuencia  del  gen  aac  completo  (Inokoshi  y  col., 
1992). Estos oligonucleótidos se utilizaron en reacciones de amplificación por PCR (Figura 
59). 

A
 

 
B
 

 
 
 
Figura 59. A, Electroforesis de la PCR del fragmento AAC12 (λ, marcador de tamaño); B, Esquema 
de la amplificación realizada sobre el ADN total de A. utahensis para obtener el fragmento AAC12. 
El fragmento presenta la secuencia completa del gen aac con el codón de iniciación GTG mutado 
por el codón de iniciación ATG, además se ha añadido la secuencia del RBS de E. coli (GAGGG) y 
se  le  han  añadido  las  secuencias  diana  para  las  enzimas  de  restricción  XbaI  y  EcoRI  en  sus 
extremos. 
 

La amplificación por PCR ha dado lugar a la obtención del fragmento AAC12 de 
aproximadamente 2,4 kb (Figura 59A). Este fragmento presenta la ORF completa del gen 
aac,  incluyendo  la  secuencia  que  codifica  su  péptido  señal.  Se  ha  mutado  el  codón  de 
iniciación de la traducción de GTG a ATG y se han añadido las dianas para las enzimas de 
restricción XbaI y EcoRI en los extremos del fragmento y el RBS consenso de E. coli. 

137
 Resultados 

El  fragmento  AAC12  se  clonó  en  E.  coli  DH5α  utilizando  el  vector  pGEMT‐Easy 
vector  (Figura  60),  obteniéndose  el  clon  recombinante  E.  coli  DH5  α  (pAAC12).  En  la 
Figura 61 se muestra un esquema del fragmento AAC12 que contiene la secuencia del gen 
aac, indicando la posición de las dianas de restricción (XbaI y EcoRI) así como la posición 
de los codones de iniciación y finalización de la traducción. 

 
 
 
Figura  60.  Construcción  del  plásmido  pAAC12.  El  plásmido  pGEMT‐easy  vector  se  indica 
como pGEM. T, residuos de timina. Ori, origen de replicación. Apr, resistencia a ampicilina. 
 

 
 
 
Figura 61. Esquema del fragmento AAC12 que presenta el gen aac de A. utahensis NRRL 12052. 
PS secuencia génica que codifica el péptido señal. Subrayado se indica el RBS de E. coli. En azul 
el  codón  de  iniciación  de  la  traducción  (ATG);  En  verde  el  codón  de  finalización  de  la 
traducción (TGA). 

138
Resultados 

El análisis del gen aac de A. utahensis NRRL 12052 muestra que al igual que sucede 
con  el  gen  pva  de  S.  lavendulae  ATCC  13664,  se  aprecia  un  elevado  porcentaje  en  el 
contenido  de  citosina  y  guanina  (Anexo  2).  Ese  es  un  hecho  común  en  las  distintas 
especies  de  actinomicetos.  Como  se  indica  en  la  Figura  61,  el  gen  aac  que  codifica  la 
AuAAC  presenta  una  ORF  de  2.364  pb,  que  da  lugar  a  una  única  proteína  de  787 
aminoácidos. Esta proteína, al igual que sucede con SlPVA sufre un procesamiento post‐
traduccional  que  va  a  dar  lugar  a  la  proteína  madura,  compuesta  por  dos  subunidades, 
una pequeña, α, de 196 aminoácidos y otra grande, β, de 557 aminoácidos. Inokoshi y col. 
(1992)  proponen  la  presencia  de  un  péptido  espaciador  de  15  aminoácidos  entre  las 
subunidades α y β, con lo que el tamaño de la subunidad α sería de 181 aminoácidos. Hay 
que señalar que este dato es una mera hipótesis que no ha sido confirmada. En la Figura 
62 se muestra la secuencia de aminoácidos de AuAAC, indicando en verde la secuencia de 
aminoácidos de la subunidad α y en azul la secuencia de la subunidad β. 

 
 
MTSSYMRLKAAAIAFGVIVATAAVPSPASGREHDGGYAALIRRASYGVPHITADDFGSLG 60
 
FGVGYVQAEDNICVIAESVVTANGERSRWFGATGPDDADVRSDLFHRKAIDDRVAERLLE 120
 
GPRDGVRAPSDDVRDQMRGFVAGYNHFLRRTGVHRLTDPACRGKAWVRPLSEIDLWRTSW 180
 
DSMVRAGSGALLDGIVAATPPTAAGPASAPEAPDAAAIAAALDGTSAGIGSNAYGLGAQA 240
 
TVNGSGMVLANPHFPWQGAERFYRMHLKVPGRYDVEGAALIGDPIIEIGHNRTVAWSHTV 300
 
STARRFVWHRLSLVPGDPTSYYVDGRPERMRARTVTVQTGSGPVSRTFHDTRYGPVAVVP 360
GTFDWTPATAYAITDVNAGNNRAFDGWLRMGQAKDVRALKAVLDRHQFLPWVNVIAADAR
  420
GEALYGDHSVVPRVTGALAAACIPAPFQPLYASSGQAVLDGSRSDCALGADPDAAVPGIL
  480
GPASLPVRFRDDYVTNSNDSHWLASPAAPLEGFPRILGNERTPRSLRTRFGLDQIQQRLA
 
540
GTDGLPGKGFTTARLWQVMFGNRMHGAELVRDDLVALCRRQPTATASNGAIVDLTAACTA 600
 
LSRFDERADLDSRGAHLFTEFALAGGIRFADTFEVTDPVRTPRRLNTTDPRVRTALADAV 660
 
QRLAGIPLDAKLGDIHTDSRGERRIPIHGGRGEAGTFNVITNPLVPGVGYPQVVHGTSFV 720
 
MAVELGPHGPSGRQILTYAQSTNPNSPWYADQTVLYSRKGWDTIKYTEAQIAADPNLRVY 780
 
RVAQRGR 787
 
 
Figura  62.  Secuencia  de  aminoácidos  de  AuAAC.  En  amarillo  la  subunidad  α,  en  gris  la 
subunidad β. Subrayada en rojo se indica la secuencia del péptido señal 
 
 

Cabe destacar que la secuencia de aminoácidos de la enzima AuAAC obtenida en 
este trabajo presenta diferencias (96% de identidad) en su secuencia respecto de la descrita 
en la bibliografía (Inokoshi y col., 1992). Este hecho puede significar que nos encontremos 

139
 Resultados 

ante  una  proteína  mutada  respecto  a  la  que  se  había  descrito  anteriormente  o  bien  que, 
debido al aumento en la sensibilidad de los métodos de secuenciación en los últimos años 
se ha logrado obtener una secuencia con una mayor fidelidad o bien errores derivados de 
la  amplificación  por  PCR,  aunque  este  último  caso  se  ha  descartado  realizando  varias 
secuenciaciones directas del gen aac obtenido en distintas PCRs. 

La  AuAAC  inmadura  presenta  en  su  extremo  N‐terminal  un  fragmento  de  34 
aminoácidos que constituyen su péptido señal (Figura 62). Este péptido señal, al igual que 
el que presenta SlPVA, aunque más pequeño de tamaño, presenta la estructura típica que 
suele ser característica el género Streptomyces y, por extensión en los Actinomicetos. Como 
se observa en la Figura 63, el péptido señal presenta una región N‐terminal, de pequeño 
tamaño  y  con  predominancia  de  carga  positiva;  una  región  central,  caracterizada por  su 
abundancia  en  aminoácidos  de  carácter  hidrofóbico;  y  finalmente,  la  región  C‐terminal 
presenta  la  secuencia  diana  para  la  acción  de  una  peptidasa  que  liberaría  el  resto  de  la 
proteína (Von Heijne y Abrahmsen, 1989; Lammertyn y Anne, 1998).  

 
MTSSYMRLK AAAIAFGVIVATAAVPSPAS GREHD
 

           Región Nt                                          Región Central                               Región Ct 
           Carga +            Predominan aminoácidos hidrofóbicos 
 
                                             Estructura en α‐hélice                    Estructura en β‐lámina 
 
Figura 63. Secuencia del péptido señal de AuAAC. Se indican las características de cada una de 
las  regiones  en  las  que  se  divide,  indicando  en  negro  los  aminoácidos  que  constituyen  el 
extremo N‐terminal (Nt), y en verde los que constituyen el extremo C‐terminal (Ct), y en rojo los 
que constituyen la zona hidrofóbica. 
 

La enzima AuAAC, al igual que la SlPVA, es un heterodímero constituido por una 
subunidad  α  y  otra  β  que  dan  lugar  a  una  proteína  de  aproximadamente  80  kDa 
constituida por 753 aminoácidos (Figura 62), de los cuales el 13,2% son residuos básicos (R 
+ H, + K), el 10,3% son residuos ácidos (D + E), el 18,3% son residuos polares (S+ T+ C + N 
+ Q) y el 50% son residuos apolares (A + G + I+ L + M + P + V + F + W +Y), de los que un 
7,9%  corresponderían  a  residuos  aromáticos  (F  +  W  +  Y).  Estos  porcentajes  son  muy 
similares  a  los  que  presenta  SlPVA  en  su  composición.  La  Tabla  21  muestra  la 
composición  de  aminoácidos  de  AuAAC,  indicando  también  la  composición  por 
subunidades. 

140
Resultados 

 
Tabla 21. Composición de aminoácidos de AuAAC 
 

Número de residuos (frecuencia, %) 
Aminoácidos 
Subunidad α  Subunidad β  α + β 
Gly  G  23 11,7) 54 (9,7) 77(10,2)
Ala  A  31(15,8) 66(11,8) 97(12,8)
Val  V  15 (7,6) 45 (8,0) 60 (7,9)
Leu  L  12 (6,1) 43 (7,7) 55 (7,3)
Ile  I  9 (4,6) 20 (3,6) 29 (3,8)
Met  M  2 (1,0) 7 (1,2) 9 (1,2)
Pro  P  11 (5,6) 39 (7,0) 50 (6,6)
Phe  F  6 (3,0) 20 (3,6) 26 (3,4)
Tyr  Y  4 (2,0) 16 (2,9) 20 (2,6)
Trp  W  4 (2,0) 10 (1,8) 14 (1,8)
Ser  S  12 (6,1) 27 (4,8) 39 (5,2)
Thr  T  9 (4,6) 41 (7,3) 50 (6,6)
Cys  C  2 (1,0) 4 (0,7) 6 (0,8)
Asn  N  3 (1,5) 19 (3,4) 22 (3,0)
Gln  Q  2 (1,0) 19 (3,4) 21 (2,8)
Lys  K  2 (1,0) 7 (1,2) 9 (1,2)
His  H  4 (2,0) 15 (2,7) 19 (2,5)
Arg  R  19 (9,7) 53 (9,5) 72 (9,6)
Asp  D  19 (9,7) 37 (6,6) 56 (7,4)
Glu  E  7 (3,5) 15 (2,7) 22 (2,9)
Total  196 557 753
 

La comparación de la secuencia de aminoácidos deducida para la enzima AuAAC 
con otras proteínas descritas, utilizando el programa BLASTP 2.2.8 (Altschul y col., 1997) 
muestra que la proteína presenta homología con las β‐lactam acilasas. Al igual que sucede 
con  SlPVA  la  proteína más  similar  que  aparece  descrita  es  la  ciclolipopéptido  acilasa  de 
Streptomyces  sp.  FERM  BP‐5809,  con  la  que  presenta  una  identidad  del  43%  y  una 
similitud  del  56%  (Shibata  y  col.,  2000).  Otra  enzima  con  la  que  presenta  una  elevada 
similitud  (41%)  es  la  acil‐homoserina  lactona  acilasa  de  Ralstonia  sp.  XJ12B  (Lin  y  col., 
2003),  mientras  que  con  otras  aculeacina  A  acilasas,  como  son  las  de  D.  radiodurans  y  S. 
onidensiss  MR‐1  la  similitud  disminuye  (White  y  col.,  1999;  Heidelberg  y  col.,  2002). 
Respecto de otras acilasas, como son la penicilina G acilasa de E. coli y la glutaril 7‐ACA 
acilasa  de  Pseudomonas  sp.  el  parecido  disminuye,  conservando  sólo  el  21  y  el  25  %  de 
identidad, respectivamente (Oh y col., 1987; Li y col., 1999). 

141
 Resultados 

Por otro lado, como se indicaba anteriormente, la enzima AuAAC secuenciada en 
el  presente  trabajo  presenta  una  ligera  diferencia  en  la  secuencia  en  comparación  con  la 
misma enzima descrita por Inokoshi y col. (1992). Hay que destacar en este sentido, que si 
comparamos  ambas  secuencias  con  la  de  SlPVA,  la  AuAAC  descrita  en  este  trabajo 
presenta una identidad del 42,4%, ligeramente superior a la que presenta con respecto a la 
enzima descrita en la bibliografía, que es del 41%. 

11. ESTUDIOS DE EXPRESIÓN DEL GEN aac EN E. coli BL21 (DE3) 

Los  estudios  de  clonación  y  expresión  del  gen  aac,  utilizando  E.  coli  BL21  (DE3) 
como  célula  hospedadora,  se  realizaron  incluyendo  la  secuencia  que  codifica  su  propio 
péptido señal, por lo que se partió del plásmido pAAC12. El vector de expresión utilizado 
ha sido pET28 a (+).  

El  plásmido  recombinante  pET28AAC12  se  obtuvo  tras  extraer  el  fragmento 
AAC12  mediante  digestión  del  plásmido  pAAC12  con  las  endonucleasas  XbaI  y  EcoRI  e 
introducirlo en el vector de expresión pET28 a (+) mediante ligación, tal como se indica en 
el apartado 19.1 de Materiales y Métodos (Figura 64). Tras su selección en E. coli DH5α, el 
plásmido  recombinante  pET28AAC12  se  utilizó  para  transformar  E.  coli  BL21  (DE3) 
obteniéndose el microorganismo recombinante E. coli BL21 (pET28AAC12), con el que se 
han llevado a cabo estudios de expresión de AuAAC. 

 
 
Figura  64.  Construcción  del  plásmido  pET28AAC12.  Ori,  origen  de  replicación;  Knr, 
resistencia a kanamicina; Apr, resistencia a ampicilina; T7p promotor T7; lac I represor lacI. 

142
Resultados 

Para los estudios de expresión de AuAAC por E. coli BL21 (pET28AAC12) se han 
inoculado 4 ml de medio LB con kanamicina, con el microorganismo recombinante, tanto 
en  presencia  como  en  ausencia  de  inductor,  IPTG  1  mM,  y  a  30  ºC  y  37  ºC  durante  12 
horas, tal como se describe en el apartado 19.1 de Materiales y Métodos. Transcurrido el 
tiempo  de  incubación  se  buscó  la  presencia  de  AuAAc  mediante  ensayos  enzimáticos 
utilizando penicilina V como sustrato (apartado 22.1 de Materiales y Métodos). No se ha 
detectado  actividad  enzimática  ni  en  los  caldos  de  fermentación  ni  en  los  extractos 
celulares. Por otro lado, con el fin de observar si se produce la enzima de una forma no 
activa, se llevaron a cabo electroforesis en geles de poliacrilamida tanto de los caldos de 
fermentación como de los extractos celulares (Figura 65). No se observó tampoco ningún 
resultado claro que haga suponer que existe expresión de la enzima por parte de E. coli 
BL21 (pET28AAC12). 

 
 
A   B

 
 
Figura  65.  Estudio  de  la  producción  de  AuAAC  por  E.  coli  BL21TE28AAC12  mediante  electroforesis  de 
proteínas  en  los  caldos  de  fermentación  (A)  y  en  los  extractos  celulares  (B).  1,  Patrones  de  proteínas;  2, 
fermentación  a  30  °C  sin  IPTG;  3,  fermentación  a  30  °C  con  IPTG;  4,  fermentación  a  37  °C  sin  IPTG;  5, 
Fermentación a 37 °C con IPTG; 6, control negativo a 30 °C sin IPTG; 7, control negativo a 30 °C con IPTG; 
8, control negativo a 37 °C sin IPTG; 9, control negativo a 37 °C con IPTG.  
 

12. CLONACIÓN Y EXPRESIÓN DEL GEN aac DE A. utahensis NRRL 12052 

EN S. lividans 1326 

En  vista  de  que  el  resultado  obtenido  en  el  intento  de  clonación  y  expresión  del 
gen  aac  de  A.  utahensis  NRRL  12052  en  E.  coli  ha  sido  negativo  se  ha  abordado  su 
clonación y expresión en S. lividans 1326 utilizando como vector de expresión el plásmido 
pEM4 (Quiros y col., 1998; Aguirrezabalaga y col., 2000). 

143
 Resultados 

12.1 Obtención del clon S. lividans CECT 3377 

El fragmento AAC12, que contiene la ORF del gen aac con la secuencia génica que 
codifica  su  péptido  señal  y  el  codón  de  iniciación  de  la  traducción  (GTG)  mutado  por  
ATG, se extrajo del plásmido pAAC12 con las endonucleasas XbaI y EcoRI y se introdujo 
mediante  ligación  en  el  plásmido  pEM4,  previamente  linealizado  por  digestión  con  las  
mismas endonucleasas. La mezcla de ligación se utilizó para transformar células de E. coli 
DH5α, obteniéndose el clon E. coli DH5α (pAACAU) (Figura 66).  

 
 
 
 
 
 
 
Figura 66. Obtención del clon recombinante S. lividans CECT 3377 que posee el plásmido 
pAACAU.  PermE*,  promotor  de  la  eritromicina;  Apr  resistencia  a  ampicilina;  Tsrr 
resistencia a tioestreptona; lac Z, gen lac Z; Ori pUC, origen de replicación para E. coli; Ori 
pWHM4, origen de replicación para S. lividans. 

144
Resultados 

El plásmido pAACAU se utilizó para transformar protoplastos de S. lividans 1326, 
obteniéndose  así  el  clon  S.  lividans  (pAACAU),  que  contiene  el  gen  aac  de  A.  utahensis 
NRRL  12052,  Figura  66.  Este  microorganismo  ha  sido  depositado  bajo  patente  en  la 
Colección  Española  de  Cultivos  Tipo  (CECT),  con  la  denominación  de  S.  lividans  CECT 
3377, nombre utilizado a partir de ahora. 

12.2 Producción de AuAAC por S. lividans CECT 3377 

Con el fin de estudiar si S. lividans CECT 3377 produce AuAAC se llevaron a cabo 
fermentaciones del microorganismo recombinante en medio TSB, ya que se ha visto que 
es  el  óptimo  para  producir  SlPVA  por  S.  lividans  CECT  3376.  Las  fermentaciones  se 
realizaron inoculando el medio con 2x106 esporas/ml e incubando a 30 ºC y con agitación 
orbital  a  250  rpm  durante  un  período  de  hasta  140  horas,  condiciones  óptimas  de 
producción  de penicilina V acilasa por S. lividans CECT 3376. Cada 24 horas se tomaron 
alícuotas de los caldos de fermentación y se realizaron ensayos enzimáticos de hidrólisis 
de penicilina V utilizando el método del PDAB (apartado 22.1 de Materiales y Métodos). 
Como  controles  negativos    se  realizaron  fermentaciones  utilizando  S.  lividans  1326  y  S. 
lividans (pEM4). Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla 22. 

Tabla 22. Producción de AuAAC en medio TSB por S. lividans CECT 3377 y los 
microorganismos control S. lividans 1326 y S. lividans (pEM4).  
 

Producción de AuAAC (UI/ml)* 
Microorganismo 
0  72  96  120  140 
horas  horas  horas  horas  horas 

S. lividans 1326  0  0  0  0  0 

S. lividans (pEM4)  0  0  0  0  0 

S. lividans CECT 3377  0  0,695  0,870  0,849  0,861 

* UI: µmoles de 6‐APA producidos por minuto en las condiciones de ensayo. 

Se detecta una elevada producción de AuAAC por el clon recombinante S. lividans 
CECT 3377, que alcanza un máximo de producción de 0,87 UI/ml a las 96 horas de cultivo. 
Esto supone un incremento de 14,5 veces respecto a la actividad detectada en los caldos 
de fermentación de A. utahensis NRRL 12052 (apartado 9 de Resultados) y lo que mejora 

145
 Resultados 

los  resultados  obtenidos  en  la  clonación  de  AuAAC  en  S.  lividans  descritos  en  la 
bibliografía  con  vistas  a  su  utilización  en  la  hidrólisis  de  aculeacina  A  (Inokoshi  y  col., 
1992; Inokoshi y col., 1993) 

En vista de los resultados obtenidos, se ha procedido a profundizar en el estudio 
de la producción de AuAAC respecto al tiempo con el fin de determinar las condiciones 
de  fermentación  con  vistas  a  su  posterior  purificación  y  caracterización.  Para  ello,  se  ha 
llevado  la  fermentación  de  S.  lividans  CECT  3377  en  medio  TSB  a  30  °C  y  durante  un 
periodo  de  hasta  140  horas.  El  inoculo  utilizado  fue  de  2x106  esporas/ml.  Se  tomaron 
alícuotas  cada  24  horas  y  se  determinó  la  actividad  de  la  enzima  en  los  caldos  de 
fermentación  utilizando  penicilina  V  como  sustrato  mediante  el  método  del  PDAB 
(apartado  22.1  de  Materiales  y  Métodos)  (Figura  67).  Asimismo,  se  llevó  a  cabo  la 
determinación de la presencia de AuAAC en los extractos celulares. 

El estudio del crecimiento de S. lividans CECT 3377 en cada etapa del proceso de 
fermentación  se  llevó  a  cabo  determinando  la  cantidad  de  proteína  intracelular  total 
(Figura 67). 

 
 
Figura  67.  Curva  de  crecimiento  y  producción  de  AuAAC  por  S.  lividans  CECT  3377  en 
medio  TSB  a  30  °C.  El  tamaño  de  inóculo  fue  de  2x106  esporas/ml.  ⎯•⎯  actividad 
penicilina  acilasa  (UI/ml);  ‐  ‐  ‐„‐  ‐  ‐  proteína  extracelular  (mg/ml);  •••S•••  crecimiento 
celular (mg totales de proteína intracelular). 
 

146
Resultados 

Como  se  observa  en  la  Figura  67,  la  producción  de  AuAAC  por  el  clon 
recombinante  S.  lividans  CECT  3377  está  asociada  al  crecimiento  celular.  Este 
comportamiento es similar al observado en la producción de SlPVA por S. lividans CECT 
3376 (Figura 45), así, se observa que la producción de enzima comienza a las 24 horas de 
fermentación, tras la fase de latencia del microorganismo recombinante, alcanzándose un 
máximo  de  producción  a  las  96  horas  (870  UI/l),  que  coincide  con  el  final  de  la  fase  de 
crecimiento exponencial de S. lividans CECT 3377. A partir de ese momento, coincidiendo 
con  la  fase  de  muerte  celular,  los  niveles  de  enzima  se  mantienen  constantes,  aunque  la 
cantidad de proteína extracelular sigue aumentando ligeramente.  

Por otro lado, del análisis de la enzima AuAAC intracelular se descarta que se esté 
acumulando  en  el  interior  de  las  células.  Su  presencia  en  los  extractos  celulares  es  muy 
escasa durante la fermentación. Este hecho indicaría que toda la proteína que se produce 
se está excretando al medio. 

13.  PURIFICACIÓN  DE  LA  AuAAC  PRODUCIDA  POR  S.  lividans  CECT 

3377 

Una vez definidas las condiciones de producción de AuAAC por S. lividans CECT 
3377  se  procedió  a  la  puesta  a  punto  de  un  método  de  purificación  que  permite  la 
obtención  de  la  enzima  pura  con  el  fin  de  llevar  a  cabo  posteriores  estudios  de 
caracterización. 

La purificación de la AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 se ha llevado a 
cabo  a  partir  de  un  cultivo  de  96  horas  a  30  °C  en  200  ml  de  medio  TSB  inoculado  con 
2x106  esporas/ml,  tal  como  se  describe  en  el  apartado  20  de  Materiales  y  Métodos.  La 
fermentación se detuvo tras eliminar las células por centrifugación a 9.000 xg. 200 ml del 
caldo  de  cultivo  que  presentan  actividad  penicilina  acilasa  se  equilibraron  a  pH  6 
mediante adición de HCl, y se aplicaron en una columna de cromatografía de intercambio 
iónico  S‐Sepharose  equilibrada  en  tampón  fosfato  potásico  10  mM,  pH  6.  En  estas 
condiciones  no  toda  la  enzima  queda  retenida  en  la  columna,  perdiéndose  parte  en  la 
elución isocrática con tampón fosfato potásico 10 mM, pH 6. AuAAC se eluye aplicando 
un  gradiente  continuo  de  NaCl  entre  0  y  1  M,  seguido  de  una  elución  isocrática  en  el 
mismo  tampón  con  NaCl  1  M.  Durante  la  elución  isocrática  a  fuerza  iónica  elevada  se 
observa  la  aparición  de  un  pico  de  proteína  que  coincide  con  un  pico  de  actividad 
penicilina acilasa (Figura 68). El análisis de la proteína de este pico mediante electroforesis 
de proteínas  muestra que AuAAC no se encuentra pura (Figura 70). 

147
 Resultados 

 
 
 
 
 
Figura 68. Cromatografía de intercambio iónico S‐Sepharose para la purificación 
de  AuAAC  producida  por  S.  lividans  CECT  3377.  ⎯  absorbancia  a  280  nm;  ⎯  
actividad penicilina acilasa (UI/ml);  ‐ ‐ ‐ ‐ gradiente de NaCl (M). 
 

Las fracciones de proteína con actividad penicilina acilasa se recogieron, juntaron, 
concentraron,  y  sometieron  a  una  cromatografía  de  penetrabilidad  en  Superose  12, 
equilibrada  en  tampón  fosfato  potásico  50  mM,  pH  7.  El  perfil  de  elución  de  esta 
cromatografía se muestra en la Figura 69A. Como se puede observar se obtienen dos picos 
de  proteína  que  coinciden  con  dos  picos  de  actividad  penicilina  acilasa.  El  análisis  de 
ambos  por  electroforesis  en  SDS‐PAGE  mostró  que  en  ambos  picos  está  presente  la 
AuAAC (Figura 69B).  

El  seguimiento  del  proceso  de  purificación  de  AuAAC  producida  por  S.  lividans 
CECT 3377 en cada etapa se resume en la Tabla 23. Como se puede apreciar, el proceso de 
purificación de la enzima produce un rendimiento del 38% de la proteína tras la primera 
etapa cromatográfica. Finalmente, tras la cromatografía de penetrabilidad en Superose 12 
se obtiene la enzima pura a homogeneidad con un rendimiento del 21% (Figura 70). 

148
Resultados 

 
A
 

 
B
 

 
 

Figura 69. A, Cromatografía de penetrabilidad Superosa12 para la purificación de AuAAC 
producida  por  S.  lividans  CECT  3377.  ⎯  proteína  (mg/ml).  ⎯  actividad  penicilina  acilasa 
(UI/ml).  B,  Electroforesis  en  SDS‐PAGE  de  los  picos  obtenidos  en  la  cromatografía  de 
penetrabilidad Superose 12. P, patrones de proteínas; 1, Pico 1; Pico 2. 
 

 
Tabla 23. Purificación de AuAAC producida por S. lividans CECT 3377. 
 

Actividad  Actividad 
Paso de  Rendimiento  F.P.1
penicilina acilasa  Específica 
purificación  (%)   
total (UI)  (UI/mg proteína) 
Extracto libre de 
172,10  3,15  100  ‐ 
células 

S‐Sepharose  66,73  33,60  38,8  10,7 

Superosa12  35,80  42,80  21,0  13,6 

1 F.P. Factor de purificación. 

149
 Resultados 

 
Figura 70. Electroforesis en SDS‐PAGE  de los pasos de purificación de AuAAC 
producida  por  S.  lividans  CECT  3377.  1,  Patrones  de  proteínas;  2,  Fermentación 
control con S. lividans (pEM4); 3, Extracto libre de células de la fermentación de 
S.  lividans  CECT  3377  en  medio  TSB;  4,  cromatografía  en  S‐Sepharose;  5, 
cromatografía en Superose 12. 
 

14. CARACTERIZACIÓN  DE  AuAAC  PRODUCIDA  POR  S.  lividans  CECT 

3377. 

La  aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL  12052  se  ha  descrito  como  una 
enzima  que  cataliza  la  hidrólisis  de  equinocandinas,  en  concreto  la  aculeacina  A, 
liberando  su  núcleo  ciclohexapéptido  (Takeshima  y  col.,  1989).  Uno  de  los  objetivos 
planteados  en  el  presente  trabajo  es  la  caracterización  funcional  de  AuAAC  como 
catalizador  en  reacciones  de  hidrólisis  de  penicilinas  para  la  obtención  de  6‐APA,  así 
como su caracterización estructural.  

14.1 Caracterización funcional de la AuAAC recombinante 

Respecto a la caracterización funcional de AuAAC producida por S. lividans CECT 
3377  se  han  realizado  estudios  de  estabilidad  y  actividad  enzimática  de  hidrólisis  de 
penicilina  V  con  respecto  al  pH  y  la  temperatura,  así  como  estudios  de  la  actividad 
enzimática  en  función  de  la  fuerza  iónica.  Seguidamente  se  ha  llevado  a  cabo  la 
determinación de los parámetros cinéticos de la enzima AuAAC utilizando como sustrato 
penicilina V, penicilina G y las penicilinas alifáticas naturales (penicilinas K, F y dihidroF). 
Todos  los  ensayos  se  han  realizado  utilizando  el  método  del  fluram  (apartado  22.2  de 
Materiales y Métodos). 

14.1.1 Estudio de la estabilidad y de la actividad de AuAAC respecto al pH. 

El estudio de la estabilidad de AuAAC frente al pH del medio se ha llevado a cabo 
incubando la enzima a distintos valores de pH en un intervalo comprendido entre 7 y 11 

150
Resultados 

en un sistema de tampones borato/fosfato potásico 10 mM durante 20 minutos (apartado 
25.1.1  de  Materiales  y  Métodos).  Tras  la  incubación,  las  soluciones  enzimáticas  se 
ajustaron  a  pH  8,  mediante  la  adición  de  tampón  fosfato  potásico  1  M,  pH  8  hasta  una 
concentración  final  de  0,1  M,  y  se  determinó  la  actividad  penicilina  acilasa  retenida 
mediante  ensayos  de  hidrólisis  de  penicilina  V.  Como  se  observa  en  la  Figura  71A,  la 
enzima  AuAAC  producida  por  S.  lividans  CECT  3377  es  estable  en  un  intervalo  de  pH 
entre  7  y  10,  disminuyendo  ligeramente  la  actividad  retenida  por  la  enzima  a  valores 
superiores de pH. 

La determinación del pH óptimo de AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 
se ha llevado a cabo utilizando penicilina V como sustrato a distintos valores de pH, en el 
mismo  intervalo  de  pH  que  el  empleado  en  los  estudios  de  estabilidad.  Los  resultados  
muestran que AuAAC presenta un pH óptimo de actividad de hidrólisis de penicilina V 
entre 8 y 8,5 (Figura 71B). 

 
A  B

 
 
 
 
Figura  71.  A,  Estabilidad  de  AuAAC  frente  al  pH.  B,  Estudio  de  la  actividad  de 
hidrólisis de la penicilina V por AuAAC frente al pH. 
 

14.1.2 Estudio de la estabilidad y de la actividad de AuAAC respecto a la temperatura. 

El  estudio  de  la  estabilidad  frente  a  la  temperatura  de  la  enzima  AuAAC 
producida por S. lividans CECT 3377 se ha llevado a cabo incubando la proteína a distintas 
temperaturas,  en  un  intervalo  comprendido  entre  30  ºC  y  80  °C,  en  tampón  fosfato 
potásico 0,1 M, pH 8, tal como se describe en el apartado 26.2.1 de Materiales y Métodos. 
Finalizada  la  incubación  a  las  diferentes  temperaturas,  las  soluciones  enzimáticas  se 

151
 Resultados 

incubaron  20  minutos  en  hielo  y  se  determinó  la  actividad  penicilina  acilasa  retenida 
mediante reacciones de hidrólisis de penicilina V. Los resultados muestran que AuAAC se 
mantiene  estable  hasta  50  ºC,  disminuyendo  progresivamente  su  estabilidad  a 
temperaturas superiores (Figura 72A). A partir de 75 ºC se observa una reducción brusca 
de la actividad retenida por la proteína, siendo tan sólo del 20% a 80 ºC. 

 
A
  B
 

 
 
Figura  72.  A,  Estabilidad  de  AuAAC  frente  a  la  temperatura.  B,  Estudio  de  la 
actividad de hidrólisis de la penicilina V por AuAAC frente a la temperatura. 
 

Para determinar la temperatura óptima de la reacción de hidrólisis de penicilina V 
por  AuAAC  producida  por  S.  lividans  CECT  3377  se  han  llevado  a  cabo  reacciones  de 
hidrólisis de penicilina V a distintas temperaturas (30‐80 °C) en tampón fosfato potásico 
0,1 M, pH 8. Los resultados muestran que  AuAAC presenta una temperatura óptima de 
actividad de hidrólisis de penicilina V a 75 °C (Figura 72B). No obstante, como se ha visto 
anteriormente,  a  esta  temperatura  la  enzima  es  muy  poco  estable,  por  lo  que  en  las 
reacciones  de  hidrólisis  de  penicilina  es  necesario  utilizar  temperaturas  inferiores, 
determinándose que la temperatura óptima para llevar a cabo las reacciones de hidrólisis 
de penicilina V es 45 ºC.  

A partir de los resultados de actividad de hidrólisis de la penicilina V en función 
de  la  temperatura  se  determinó  la  energía  de  activación  de  la  reacción  de  hidrólisis 
catalizada por AuAAC. Esta energía se ha calculado en 20,9 kJ/mol (Figura 73). 

152
Resultados 

 
 
 
 
Figura 73. Cálculo de la energía de activación (Ea) de la reacción de hidrólisis 
de penicilina V catalizada por  AuAAC. 
 
 

14.1.3 Estudio de actividad de AuAAC respecto a la fuerza iónica. 

El  estudio  de  la  actividad  de  la  enzima  AuAAC  producida  por  S.  lividans  CECT 
3377 frente a la fuerza iónica se llevó a cabo utilizando la penicilina V como sustrato en 
reacciones  de  hidrólisis  realizadas  en  tampón  fosfato  potásico  0,1  M,  pH  8  que  contenía 
diferentes concentraciones de NaCl, hasta una final de 2,5 M. Los resultados muestran un 
aumento  progresivo  de  la  actividad  de  la  enzima  al  adicionar  NaCl  hasta  0,6  M  (Figura 
74). A fuerzas iónicas superiores no se aprecian variaciones en la actividad de la enzima 
respecto a fuerzas iónicas bajas. 

 
 

 
 
 
Figura 74. Estudio de la actividad de hidrólisis de penicilina V por AuAAC en función de la fuerza iónica. 

153
 Resultados 

14.1.4 Determinación  de  los  parámetros  cinéticos  de  AuAAC  frente  a  las  penicilinas 
naturales. 

Con  el  fin  de  llevar  a  cabo  los  estudios  de  la  capacidad  de  hidrólisis  de  AuAAC 
sobre las diferentes penicilinas naturales se han determinado las constantes catalíticas (Km, 
kcat y kcat/Km) frente a penicilina V, K, F, dihidroF y G.  

En la Tabla 24 se muestran los resultados obtenidos para cada uno de los sustratos. 
Como se puede observar AuAAC presenta actividad tanto frente a la penicilina V, como 
frente  a  las  diferentes  penicilinas  naturales  de  cadena  lateral  alifática  (penicilina  K, 
penicilina F y penicilina dihidroF). En el caso de esta enzima, como ocurre con SlPVA, se 
observa una mayor eficacia catalítica en la reacción de hidrólisis de la penicilina K (34,79 
mM‐1  s‐1).  Al  igual  que  SlPVA  no  presenta  prácticamente  ninguna  actividad  sobre  la 
penicilina G. 

 
Tabla 24. Parámetros cinéticos de AuAAC frente a las distintas penicilinas naturales. 
 

Km kcat kcat/Km
Sustrato
(mM) (s-1) (mM-1 s-1)

Penicilina V 15,44 70,27 4,55

Penicilina K 0,95 33,25 34,79

Penicilina dihidroF 5,62 4,24 0,75

Penicilina F 15,14 1,90 0,13

Penicilina G 155,80 2,20 0,01

 

14.2 Caracterización estructural de la AuAAC recombinante 

La enzima AuAAC es un heterodímero de 75 kDa, compuesto por una subunidad 
α  de  19,6  kDa  y  una  subunidad  β  de  55,7  kDa  (Inokoshi  y  col.,  1992).  Como  se  ha  visto 
anteriormente, el proceso de clonación del gen aac y de su expresión en S. lividans CECT 
3377  no  ha  alterado  ni  el  tamaño  de  la  enzima  ni  su  estructura  heterodimérica.  Cabe 
destacar  que  no  existe  más  información  sobre  la  estructura  de  esta  enzima.  Por  este 
motivo se han realizado una serie de estudios espectroscópicos con el fin de aportar algún 
dato estructural de AuAAC. 

154
Resultados 

14.2.1 Espectro de absorbancia UV‐visible de AuAAC 

El  análisis  del  espectro  de  absorbancia  UV‐visible  de  AuAAC  producida  por  S. 
lividans CECT 3377 muestra que la enzima presenta un máximo de absorbancia en torno a 
los 266 nm (Figura 75). Este valor parece ser indicativo de una mayor contribución de las 
tirosinas al espectro de la enzima. 

 
 
 
 
Figura  75.  Espectro  de  absorbancia  UV‐visible  de  AuAAC.  La  concentración 
de  proteína  empleada  fue  de  0,1  mg/ml  en  tampón  fosfato  potásico  10  mM, 
pH 7 y 0,1 M de NaCl (apartado 26.1 de Materiales y Métodos).  
 

14.2.2 Coeficiente de extinción molar de AuAAC 

La determinación del coeficiente de extinción molar de AuAAC producida por S. 
lividans CECT 3377 se ha llevado a cabo según el método  de Edelhoch (Edelhoch, 1967). 
Para  lo  cual  se  ha  determinado  la  absorbancia  a  280  nm  de  la  proteína  en  solución  así 
como  de  la  proteína  desplegada  en  presencia  de  cloruro  de  guanidinio  6  M.  Se  ha 
calculado  el  coeficiente  de  extinción  molar  de  AuAAC  en  función  de  sus  valores  de 
absorbancia  y  del  coeficiente  de  extinción  molar  teórico  de  la  enzima  desplegada, 
calculado  en  base  a  su  secuencia  con  el  programa  ProtParam  (http://us.expasy.org/cgi‐
bin/protparam), y cuyo valor es ε2800,1% (1g/l) = 1,324 (g/l)‐1 cm‐1. El valor del coeficiente de 
extinción molar calculado para AuAAC es: 

ε2800,1% = 1,323 (g/l)  cm   ‐1 ‐1

155
 Resultados 

14.2.3 Espectro de fluorescencia de AuAAC 

Se  han  realizado  los  espectros  de  fluorescencia  de  AuAAC  producida  por  S. 
lividans  CECT  3377  utilizando  dos longitudes  de  onda  de excitación  (λexcitación):  a  275  nm, 
donde se consigue la excitación de las tirosinas, y 295 nm, donde se consigue la excitación 
de  los  triptófanos.  Los  espectros  de  fluorescencia  obtenidos  tras  excitar  a  ambas 
longitudes de onda muestran un único máximo de emisión a la misma longitud de onda, 
a 334 nm (Figura 76). Este resultado indica que el espectro de emisión está dominado por 
los  triptófanos.  

 
 

 
Figura  76.  Espectros  de  fluorescencia  de  AuAAC.  La  concentración  de 
proteína empleada fue de 0,1 mg/ml en tampón fosfato potásico 50 mM, pH 
7 (apartado 26.3 de Materiales y Métodos). 
 

14.2.4 Espectro de dicroísmo circular de AuAAc 

Se ha llevado a cabo el espectro de dicroísmo circular en el ultravioleta lejano de 
AuAAC producida por S. lividans CECT 3377. El resultado obtenido aparece en la figura 
77. La proteína presenta dos mínimos de elipticidad molar a 212 y 222 nm. Este espectro 
correspondería a una enzima con un contenido similar en α‐hélice y β‐lámina. 

156
Resultados 

 
 
 
 
Figura  77.  Espectro  de  dicroísmo  circular  en  el  ultravioleta  lejano  de 
AuAAC.  La  concentración  de  proteína  empleada  fue  de  0,28  mg/ml  en 
tampón fosfato potásico 0,1 M, pH 7. 
 

A  partir  de  los  datos  obtenidos  del  espectro  de  dicroísmo  circular  se  ha 
determinado  el  contenido  en  estructura  secundaria  de  AuAAC,  para  lo  que  se  han 
utilizado  los  programas  informáticos  CCA  y  CDNN  (Apartado  26.4  de  Materiales  y 
métodos).  Paralelamente,  se  ha  realizado  la  predicción  de  la  estructura  secundaria  de  la 
enzima  a  partir  de  su  estructura  primaria,  para  lo  que  se  han  utilizado  los  programas 
PSIpred,  PHD  y  JUFO,  tal  como  se  indica  en  el  apartado  26.4  de  Materiales  y  Métodos. 
Los resultados de la predicción de estructura secundaria aparecen reflejados en la Tabla 
25. 

Tabla  25.  Predicción  de  la  estructura  secundaria  de  AuAAC  en  función  del  espectro  de 
dicroísmo circular (DC) y en función de su secuencia de aminoácidos. Los resultados están 
reflejados en porcentaje (%). 
 

Método de predicción 
 
Basados en el espectro de DC  Basados en la secuencia de aminoácidos 

Elemento 
CCA  CDNN  PSIPREP  PHD  JUFO 
estructural 
Hélice α  19,0  29,3  33,0  27,2  29,7 

Lámina β  33,5  18  17,2  18,1  18,7 

Giros β  13,9  17,2  21,4  21,9  ‐ 

Aperiódica  33,6  36,0  28,1  32,7  ‐ 

157
 Resultados 

A partir de los resultados obtenidos de la estimación del contenido en estructura 
secundaria  de  AuAAC  en  función  de  su  secuencia  (Tabla  24),  se  ha  llevado  a  cabo  la 
predicción  sobre  su  secuencia  de  aminoácidos  de  la  distribución  de  los  elementos  de 
estructura  secundaria,  para  lo  que  se  han  considerado  sólo  aquellos  aminoácidos  en  los 
que coinciden al menos el mismo elemento estructural en dos de los métodos empleados 
y que presentan una fiabilidad mayor de 6, o lo que es lo mismo mayor del 85% (Saiz y 
col., 2002) (Figura 78). 

 
 
Figura  78.  Predicción  de  la  estructura  secundaria  de  AuAAC  según  las  estimaciones 
obtenidas en la predicción con los programas PHD, PSIPREP y JUFO. Rectángulos verdes: 
hélice  α;  flechas  azules:  Lámina  β;  líneas  rojas;  giros  β.  La  flecha  vertical  negra  indica  el 
punto de inicio de la subunidad β de AuAAC. 
 

158
Resultados 

Como  se  puede  observar  en  la  Figura  78  se  aprecia  un  paralelismo  en  la 
distribución de los motivos de estructura secundaria entre AuAAC y SlPVA (Figura 55). 
Así, los motivos en lámina β son más abundantes en los primeros 200 aminoácidos de la 
subunidad β, en donde constituyen las unidades estructurales mayoritarias, mientras que 
en  el  resto  de  la  subunidad  β  destaca  la  abundancia  en  hélice  α.  Por  otro  lado,  la 
subunidad  α  presenta  claramente  un  mayor  porcentaje  de  motivos  en  hélice  α,  al  igual 
que ocurre en SlPVA. 

Se ha estudiado también la desnaturalización térmica de AuAAC producida por S. 
lividans  CECT  3377  mediante  dicroísmo  circular.  La  Figura  79  muestra  la  curva  de 
desnaturalización  térmica  obtenida.  Como  se  puede  observar  la  enzima  mantiene  su 
estructura  secundaria  hasta  prácticamente  los  80  °C,  momento  en  el  que  empieza  a 
desplegarse hasta que a los 86 °C ha perdido su estructura nativa. La enzima presenta una 
temperatura de transición (TM) de 81,5 °C. 

 
 
 
 
Figura  79.  Curva  de  desnaturalización  térmica  de  AuAAC.  La  concentración  de 
proteína  empleada  fue  de  0,28  mg/ml  en  tampón  fosfato  potásico  0,1  M,  pH  7.  La 
longitud de onda utilizada fue de 222 nm. 
 

159
 

DISCUSIÓN
 

161
 

 
Discusión 

El mercado mundial de los antibióticos β‐lactámicos ocupa actualmente el primer 
lugar  entre  los  metabolitos  secundarios,  y  su  valoración  se  estima  por  encima  de  los 
15.000 millones de dólares anuales. 

Un  aspecto  fundamental  en  el  empleo  farmacológico  de  la  penicilina  es  la 
posibilidad  de  fabricar  penicilinas  semisintéticas  a  partir  de  las  penicilinas  naturales 
producidas  por  fermentación,  las  penicilinas  G  y  V.  La  obtención  de  penicilinas 
semisintéticas ofrece la ventaja de mejorar las características de las penicilinas naturales, 
como  son  la  ampliación  de  su  espectro  de  acción,  una  mayor  actividad  antibiótica  y 
mejoras  en  su  estabilidad  y  absorción,  así  como  reducción  de  sus  efectos  secundarios  y 
menor  toxicidad.  Además,  el  desarrollo  de  penicilinas  semisintéticas  ayuda  a  evitar  los 
problemas  derivados  de  la  aparición  de  resistencias  microbianas.  Todas  estas  mejoras 
conducen a la búsqueda del denominado “antibiótico ideal”. 

El proceso de producción de las penicilinas semisintéticas a partir de las naturales 
incluye  dos  etapas  fundamentales.  La  primera  de  ellas  consiste  en  la  desacilación  que 
conduce a la obtención del ácido 6‐aminopenicilánico (6‐APA) y a segunda etapa consiste 
en  la  acilación  del  6‐APA  con  diferentes  ácidos  carboxílicos  para  obtener  las  penicilinas 
semisintéticas.  Ambas  etapas  pueden  realizarse  bien  por  vía  enzimática  bien  por  vía 
química. La vía enzimática, catalizada por acilasas, es la elección a nivel industrial. 

La  penicilina  G  constituye  el  punto  de  partida  para  la  producción  de  penicilinas 
semisintéticas en el 85% de los procesos industriales, mientras que la penicilina V supone 
el  15%.  La  penicilina  G  se  produce  industrialmente  mediante  procesos  fermentativos  en 
los que también se sintetizan otras penicilinas naturales (penicilina K, F y dihidroF) que 
representan  un  1‐2%  de  la  penicilina  total  de  los  caldos.  Estas  penicilinas  no  son 
hidrolizadas  por  las  penicilina  G  acilasas,  y su  presencia  dificulta  la  cristalización  del  6‐
APA.  Ambos  hechos  implican  un  menor  rendimiento  en  la  obtención  del  6‐APA, 
ocasionando pérdidas económicas significativas (de la Mata y col., 2005). 

La penicilina V acilasa de S. lavendulae ATCC 13664 (SlPVA) es la única penicilina 
acilasa  descrita  capaz  de  hidrolizar  estas  penicilinas  alifáticas  (Torres‐Guzmán  y  col., 
2002).  En  estudios  previos  realizados  se  ha  puesto  de  manifiesto  el  gran  interés  de  esta 
enzima,  basado  en  propiedades  tales  como  que  no  presentan  inhibición  en  presencia  de 
elevadas  concentraciones  de  penicilina  G  o  de  los  productos  de  su  hidrólisis,  el  ácido 
fenilacético  y  el  6‐APA;  su  elevada  estabilidad,  así  como  el  aumento  de  la  actividad  y 
estabilidad  en  presencia  de  ciertos  disolventes  (Arroyo  y  col.,  1999;  Arroyo  y  col.,  2000b; 
Arroyo  y  col.,  2000a;  Arroyo  y  col.,  2001;  Torres‐Guzmán  y  col.,  2001b;  Torres‐Guzmán  y 
col., 2001a; Torres‐Guzmán y col., 2002). Todo ello resulta muy interesante con vistas a su 

163
 Discusión 

utilización en biorreactores enzimáticos para la producción de 6‐APA, razón por la cual se 
ha  diseñado  y  optimizado  un  método  de  inmovilización  de  la  enzima  en  el  soporte 
Eupergit‐C©  (Torres‐Bacete  y  col.,  2000a;  Torres‐Bacete  y  col.,  2000b;  Torres‐Bacete  y  col., 
2001). 

Dado que la producción de la SlPVA por el microorganismo parental, S. lavendulae 
ATCC  13664,  es  muy  baja,  lo  que  no  permite  el  escalado  de  su  producción  a  nivel 
industrial, en está memoria se ha abordado la clonación e hiperexpresión en organismos 
heterólogos del gen que codifica la enzima, así como su purificación y caracterización con 
vistas a su utilización industrial en biorreactores enzimáticos. 

Por otro lado, estudios previos de comparación de las secuencias aminoterminales 
de  las  subunidades  de  SlPVA  pusieron  de  manifiesto  que  esta  enzima  presentaba  una 
gran  similitud  de  secuencia  con  la  aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL  12052 
(AuAAC),  lo  que  planteó  la  hipótesis  de  su  posible  uso  como  biocatalizador  en  la 
producción de 6‐APA a partir de las penicilinas naturales (Torres‐Guzmán, 2004). Por ello, 
se ha llevado a cabo la clonación y expresión del gen aac que codifica la enzima AuAAC, 
implicada  en  la  hidrólisis  de  aculeacina  A  para  la  producción  de  antifúngicos 
semisintéticos (Inokoshi y col., 1992), con el fin de realizar estudios de caracterización de 
esta  enzima  con  vistas  a  su  uso  en  biorreactores  enzimáticos  para  la  producción  de  6‐
APA. 

1. PENCILINA V ACILASA DE S. lavendulae ATCC 13664 EXPRESADA 

EN S. lividans 

1.1 Secuenciación y caracterización del gen pva de S. lavendulae ATCC 13664 

Se han abordado diferentes estrategias con el fin de secuenciar y caracterizar el gen 
pva que codifica la enzima SlPVA. En una primera etapa se intentó obtener el gen a partir 
de una genoteca en E. coli HB101 mediante complementación auxotrófica, para lo cual se 
probaron  distintos  vectores  (apartado  2  de  Resultados).  No  se  obtuvo  el  resultado 
deseado,  posiblemente  debido  a  la  diferencia  en  el  uso  de  codones  entre  Escherichia  y 
Streptomyces, (Wright y Bibb, 1992; Kieser y col., 2000), ya que hay que considerar que el 
porcentaje  de  guaninas  y  citosinas  en  el  ADN  de  los  Streptomyces  es  mayor  del  70%, 
mientras que en E. coli es de alrededor del 50%, lo que va a llevar implícito diferencias en 
el uso de codones utilizados en la síntesis de proteínas. 

164
Discusión 

Seguidamente, se abordó la clonación y secuenciación del  gen pva mediante PCR 
en  varias  etapas,  incluyendo  PCR  inversa  (apartado  3  de  Resultados),  así  como  la 
obtención de una genoteca en el fago λ‐GEM12 (apartados 5.1.1 y 5.1.2 de Resultados). A 
partir  de  los  resultados  obtenidos  de  ambas  estrategias  se  ha  conseguido  reconstruir  y, 
por tanto, clonar y secuenciar completamente el gen pva de S. lavendulae ATCC 13664. 

El análisis de la secuencia del gen pva (Figura 26) muestra una distribución típica 
de un gen que no forma parte de ningún operón, con una región promotora, de alrededor 
de  300  pb,  donde  las  secuencias  TTGACA  y  CTGAGT  en  las  posiciones  226  y  251, 
actuarían  como  las  cajas  promotoras  ‐35  y  ‐10.  Estas  secuencias  se  corresponden  con  las 
secuencias consenso ‐35 y ‐10 propuestas en el genero Streptomyces, TTGAC(Pu)‐N(16/18)‐
TAG(Pu)(Pu)T (Strohl, 1992; Kormanec y Sevcikova, 2002). Además, estas secuencias son 
muy similares a las observadas en el gen mrd que codifica la resistencia a mitomicina en 
otra cepa de S. lavendulae (Sheldon y col., 1997).  

La secuencia del gen pva de S. lavendulae ACTT 13664 presenta una alto contenido 
en guanina y citosina, característico de estos microorganismos (Wright y Bibb, 1992). Así, 
se alcanzan porcentajes superiores al 70%, siendo del 94,9% en referencia a la tercera base 
observada en los codones. 

La región promotora precede a una región codificante que, como se observa por el 
análisis realizado con el programa FramePlot 2.3.2. (Figura 27), muestra un claro marco de 
lectura abierto (ORF) de 2.420 pb cuando se considera el triplete TTG  como el codón de 
iniciación  de  la  traducción,  triplete  no  muy  habitual  como  codón  de  iniciación  de  la 
traducción, pero que se ha observado en el 3% de los genes analizados en las diferentes 
especies de Streptomyces (Kieser y col., 2000). A una distancia de 7 nucleótidos del triplete 
TTG, hacia la región promotora, se observa la presencia de la potencial secuencia de unión 
al  ribosoma  (RBS).  Esta  secuencia,  GGAGG,  coincide  con  las  secuencias  consenso  de  las 
regiones  RBS  en  los  Streptomyces  (Strohl,  1992).  Una  disposición  muy  similar,  con  el 
mismo  codón  iniciación  y  la  misma  secuencia  RBS  se  ha  observado  en  la  enzima 
ciclolipopéptido acilasa de Streptomyces sp. FERM BP‐5809 (Shibata y col., 2000).  

Finalmente, tras la ORF se aprecia la aparición de una región terminadora donde 
destaca  la  presencia  de  una  secuencia  palindrómica  a  unos  19  nucleótidos  del  codón  de 
terminación  de  la  traducción  (TAG)  que  posiblemente  tenga  implicaciones  en  la 
finalización de la transcripción. 

165
 Discusión 

1.2 Caracterización molecular de la SlPVA recombinante 

Estudios previos de la enzima SlPVA indican que es un heterodímero, constituido 
por dos subunidades de diferente tamaño, una pequeña, α, de 21,4 kDa y otra grande, β, 
de 59 kDa (Torres‐Guzmán, 2004). El análisis de la secuencia del gen pva de S. lavendulae 
ATCC  13664  muestra  la  presencia  de  un  único  ORF  que  codifica  una  proteína  de  806 
aminoácidos  (Figura  28),  de  lo  que  se  deduce  que  el  gen  pva  va  a  dar  lugar  a  un  único 
tránscrito, que a su vez va a codificar una sola secuencia de aminoácidos. Este dato hace 
suponer  que  la  proteína  una  vez  sintetizada  va  a  sufrir  un  proceso  de  maduración 
postraduccional  que  dará  lugar  a  la  proteína  madura  y  activa.  Este  proceso  ha  sido 
observado  con  anterioridad  en  las  penicilina  G  acilasas  y  las  glutaril‐7‐ACA  acilasas 
(Sudhakaran y col., 1992; Kasche y col., 1999; Hewitt y col., 2000; Lee y col., 2000), así como 
en la aculeacina A acilasa de A. utahensis y la ciclolipopéptido acilasa de Streptomyces sp. 
FERM BP‐5809 (Inokoshi y col., 1992; Ueda y col., 1997a). 

Al comparar la secuencia de aminoácidos deducida para SlPVA, Figura 28, con las 
secuencias  de  aminoácidos  aminoterminales  de  las  subunidades  α  y  β,  Tabla  14,  se 
observa  que  la  SlPVA  inmadura  (pre‐PVA)  presenta  en  su  extremo  N‐terminal  un 
fragmento  de  39  aminoácidos  que  probablemente  constituyan  el  péptido  señal  que  va  a 
permitir  la  migración  de  la  proteína  al  espacio  extracelular,  donde  concluya  su 
procesamiento  que  va  a  dar  lugar  a  las  dos  subunidades  y,  por  tanto,  a  su  forma  activa 
como ocurre en la mayor parte de las β‐lactam acilasas extracelulares (García y col., 1995). 

El  péptido  señal  de  SlPVA  presenta  un  tamaño  de  39  aminoácidos,  ligeramente 
superior  al  tamaño  medio  de  los  péptidos  señal  de  Streptomyces,  que  se  encuentra 
alrededor de los 35 residuos (Von Heijne y Abrahmsen, 1989). El análisis de la secuencia 
del péptido señal muestra una distribución típica de aminoácidos de los péptidos señal de 
las proteínas extracelulares del género Streptomyces (Figura 29), donde se puede observar 
una  región  N‐terminal  de  pequeño  tamaño  y  con  carga  positiva,  una  zona  central  de 
carácter hidrofóbico y una región C‐terminal que constituye la diana para la acción de una 
peptidasa que provoca la escisión del resto de la proteína (Lammertyn y Anne, 1998). Los 
péptidos señal de la mayor parte de las proteínas de Streptomyces presentan la secuencia 
Ala‐Xxx‐Ala  como  diana  de  la  peptidasa,  sin  embargo,  esta  secuencia  no  se  observa  en 
SlPVA, lo cual hace suponer la presencia de otra secuencia diana al igual  que ocurre en 
otras  proteínas  extracelulares  de  Streptomyces,  como  por  ejemplo  la  ciclolipopéptido 
acilasa de Streptomyces sp. FERM BP‐5809 (Ueda y col., 1997a). 

La  maduración  de  la  pre‐PVA  va  a  dar  lugar  a  la  SlPVA  madura  heterodimérica 
constituida por una subunidad α de 202 residuos y otra β de 565 residuos que dan lugar a 
una proteína de 81 kDa constituida por 767 aminoácidos. El 11,7% de estos aminoácidos 

166
Discusión 

son residuos de carácter básico, el 8,3% son de carácter ácido, el 23% son polares, el 56,6% 
son  apolares  y  el  7,6%  restante  son  aromáticos  (Tabla  15).  El  alto  contenido  en  residuos 
hidrofóbicos, entre los que destaca el elevado porcentaje que representan los aminoácidos 
de  cadena  lateral  pequeña,  alanina  (13,8%)  y  glicina  (9,9%),  supone  una  estructura  muy 
compacta estabilizada por fuerzas hidrofóbicas. Estos residuos también son indicativos de 
una proteína con un alto contenido en α‐hélice, dato que se ve apoyado por los resultados 
obtenidos en el análisis de la enzima por dicroísmo circular, Figura 54, y por la estimación 
de  los  componentes  de  estructura  secundaria  utilizando  el  programa  CDNN  da  unos 
valores  del  35,1%  de  hélice  α,  un  15%  de  lámina  β,  un  15,3%  de  giros  β  y  un  31,7%  de 
estructura aperiódica, Tabla 20. Respecto a la caracterización espectroscópica de SlPVA se 
observa un máximo de absorción a 276 nm, típico de tirosinas. Dado que el contenido de 
triptófanos es similar al de tirosinas, y éstas presentan un menor coeficiente de extinción, 
es  posible  que  los  triptófanos  se  encuentren  apantallados  en  el  interior  de  la  molécula. 
Esta  hipótesis  viene  apoyada  por  los  espectros  de  emisión  de  fluorescencia  obtenidos  a 
275 y 295 nm de longitudes de onda de excitación, los cuales presentan un máximo a 326 
nm en ambos casos. Este valor está desplazado hacia longitudes de onda inferiores a 348 
nm, máximo de emisión de fluorescencia de triptófanos expuestos en medios polares, lo 
que permite afirmar que los triptofanos de la SlPVA se encuentran “enterrados dentro” de 
la estructura proteica. 

A  partir  de  los  datos  de  elipticidad  molar  obtenidos  del  espectro  de  dicroísmo 
circular de la enzima SlPVA expresada en S. lividans CECT 3376, Figura 54, y junto con la 
estructura  primaria  de  la  enzima,  Figura  28,  se  ha  realizado  una  predicción  de  la 
estructura  secundaria  de  SlPVA  utilizando  varios  programas  bioinformáticas,  Tabla  20. 
Como se puede observar, existe una elevada variabilidad en los porcentajes de cada uno 
de  los  elementos  estructurales  de  la  enzima,  debido  posiblemente  a  la  diferente 
sensibilidad  de  los  métodos  empleados.  De  la  tabla  20  se  puede  especular  que  la 
estructura  secundaria  de  SlPVA  estaría  constituida  por  aproximadamente  un  25‐30%  de 
hélice α, un 16% de lámina β, un 15‐20% de giros β y un 30% de estructura aperiódica. Si 
consideramos los métodos de deducción de estructura secundaria por dicroísmo circular 
se  observa  una  elevada  diferencia  en  la  estimación  de  los  porcentajes  de  hélice  α  y  de 
lámina β, siendo la estimación de lámina β el doble en el caso de utilizar el programa CCA 
que  en  el  caso  del  programa  CDNN.  Por  otro  lado,  aunque  la  estimación  es  similar  al 
utilizar  el  programa  CDNN  y  los  programas  basados  en  la  secuencia  de  la  proteína,  la 
estimación  realizada  con  el  programa  CCA  se  ajusta  más  a  los  porcentajes  de  los 
componentes de estructura secundaria observados en las penicilinas G acilasas de E. coli o 
de K. citrophila (Márquez y col., 1988; Lindsay y Pain, 1990). 

167
 Discusión 

La  secuencia  de  aminoácidos  de  SlPVA  muestra  la  presencia  de  dominios 
conservados  presentes  en  el  grupo  de  las  enzimas  penicilina  amidasas  o  penicilina 
acilasas o EC.3.5.1.11 (código NCBI pfam01804.11). Esta familia de enzimas está integrada 
por  las  penicilina  G  acilasas,  cefalosporina  acilasas  así  como  las  equinocandina  acilasas, 
grupo  de  enzimas  que  pertenecen  a  la  superfamilia  de  la  Ntn‐hidrolasas.  Una  de  las 
características  principales  de  las  Ntn‐hidrolasas  es  la  presencia  de  un  aminoácido 
nucleófilo  en  el  extremo  N‐terminal  que  actúa  en  la  catálisis  enzimática.  En  el  caso  de 
SlPVA todo apunta a que este aminoácido es la Serβ1 (Torres‐Guzmán y col., 2001a). Este 
tipo de enzimas se caracterizan también por presentar un proceso autoproteolítico que da 
lugar  a  la  forma  activa.  Por  otro  lado,  aunque  no  se  observa  homología  entre  las  Ntn‐
hidrolasas,  existe  un  motivo  estructural  común  en  todas  ellas  constituido  por  un  núcleo 
αββα (Brannigan y col., 1995; Oinonen y Rouvinen, 2000). 

Como se ha indicado anteriormente, existe homología de secuencia entre SlPVA y 
el  resto  de  β‐lactam  acilasas.  Destaca  la  gran  similitud  que  presenta  con  las 
ciclolipopéptido acilasas, y en concreto, con la ciclolipopéptido acilasa de Streptomyces sp. 
FERM BP‐5809, con la que posee una identidad del 85% y una similitud del 92% (Shibata y 
col., 2000). Con relación a la aculeacina A acilasa de A. utahensis presenta un parecido algo 
menor,  con  una  identidad  del  41%  (Inokoshi  y  col.,  1992).  SlPVA  también  presenta  una 
elevada identidad frente a otras aculeacina A acilasas, como son las de D. radiodurans y S. 
onidensiss MR‐1, con las que tiene una identidad del 41% y 32% respectivamente (White y 
col., 1999; Heidelberg y col., 2002). Cabe destacar la elevada identidad que presenta con la 
enzima  acil‐homoserina  lactona  acilasa  de  Ralstonia  sp.  XJ12B,  enzima  implicada  en  la 
desactivación  de  N‐acilhomoserin  lactosas,  moléculas  utilizadas  por  las  protobacterias 
como señales celulares y que se ha observado que no presenta actividad penicilina acilasa, 
aunque hay que indicar que sólo se ha analizado su posible implicación en la hidrólisis de 
penicilina  G,  sin  utilizar  penicilina  V  como  sustrato  (Lin  y  col.,  2003).  Al  comparar  la 
secuencia de SlPVA con la penicilina G acilasa de E. coli y con la Glutaril 7‐ ACA acilasa 
de Pseudomonas sp. el parecido es menor, conservando sólo el 23 y el 32 % de identidad, 
respectivamente  (Oh  y  col.,  1987;  Li  y  col.,  1999).  Esto  último  podría  explicar  la  poca 
actividad que presenta SlPVA cuando se utiliza la penicilina G como sustrato. 

1.3 Estudios de expresión del gen pva 

No existen muchos ejemplos de clonación y expresión de genes de Streptomyces, y 
en general de Actinomicetos, en E. coli. Así, la mayor parte de los genes de esta familia de 
microorganismos  han  sido  clonados  y  expresados  utilizando  como  hospedadores  otras 
especies  de  Streptomyces  (Gilbert  y  col.,  1995).  No  obstante,  existen  algunos  antecedentes 
en la expresión de genes de S. lavendulae en E. coli, como son los que codifican la alanina 

168
Discusión 

racemasa  (ALR),  la  D‐alanina  ligasa  (DDL),  el  cluster  de  la  complestatina  y  el  gen  argG 
(Ogawara  y  col.,  1993;  Chiu  y  col.,  2001;  Noda  y  col.,  2004).  Estos  antecedentes,  y  el 
conocimiento de la secuencia del gen pva, hacían atractiva la posibilidad de llevar a cabo 
la  clonación  y  expresión  del  gen  pva  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  en  E.  coli, 
microorganismo del que se tiene un amplio conocimiento y de fácil manipulación. 

En  un  principio,  se  abordó  la  clonación  y  expresión  del  gen  pva  en  E.  coli  como 
microorganismo  hospedador.  La  primera  estrategia  consistió  en  la  utilización  de  los 
plásmidos pIN‐III‐A3 y pIN‐III‐ompA3 como  vectores de expresión, sistemas que habían 
sido empleados con éxito en la expresión del inhibidor de subtilisina de S. albogriseolus en 
E.  coli  (Taguchi  y  col.,  1993).  Se  pretendía,  de  esta  forma,  expresar  extracelularmente 
SlPVA  utilizando  como  hospedador  E.  coli  HB101  y  mediante  la  selección  de  los  clones 
positivos por complementación de auxotrofía. Los estudios realizados con este sistema de 
clonación  y  expresión  de  proteínas  no  dieron  ningún  resultado  positivo,  ya  que  no  se 
observó la aparición de clones con el fenotipo adecuado durante el proceso de selección 
(apartado 4.1 de Resultados). 

Posiblemente  la  ausencia  de  clones  positivos  productores  de  SlPVA  sea  debido, 
como se apuntó anteriormente, a la diferencia en el uso de codones entre Streptomyces y E. 
coli. Sin embargo, antes de descartar totalmente el sistema de expresión utilizando E. coli 
como hospedador se hizo un último experimento utilizando como sistema de expresión el 
vector  pET28a  (+)  y  como  hospedador  E.  coli  BL21  (DE3).  Como  antecedentes  de  este 
sistema de expresión de proteínas de Streptomyces en E. coli destacan la expresión de las 
proteínas ALR y DDl, además del cluster de la complestatina de Streptomyces (Chiu y col., 
2001;  Noda  y  col.,  2004).  Los  resultados  obtenidos  fueron  negativos  (apartado  4.2  de 
Resultados),  al  igual  sucede  con  las  pruebas  de  expresión  en  E.  coli  HB101,  lo  que 
confirma la dificultad de la expresión del gen pva de S. lavendulae ATCC 13664 en E. coli, 
posiblemente por la diferencia, ya señalada, en el uso de codones. 

A la vista de estos resultados, se modificó la estrategia, abordando la clonación y 
expresión del gen pva utilizando S. lividans 1326 como hospedador. S. lividans 1326 es un 
microorganismo  similar  a  S.  lavendulae  ATCC  13664,  por  lo  que  su  maquinaria  de 
expresión de proteínas es parecida, lo que facilitará la expresión del gen pva. El uso de S. 
lividans 1326 presenta las ventajas de ser un sistema de clonación con un buen sistema de 
expresión  extracelular  de  proteínas,  lo  que  facilita  su  posterior  purificación,  y  produce 
muy  pocas  proteasas.  Así,  el  uso  de  S.  lividans  como  hospedador  ha  permitido  la 
clonación y expresión de infinidad de genes, tanto procariotas como eucariotas (Payne y 
col., 1990; Fornwald y col., 1993; Gilbert y col., 1995; Ruiz‐Arribas y col., 1995; Tremblay y 
col.,  2002).  Además,  existen  varios  precedentes  de  genes  de  S.  lavendulae  clonados  y 
expresados en S. lividans (Ogawara y col., 1993; Sendouda y col., 1993; August y col., 1994). 

169
 Discusión 

La  clonación  y  expresión  del  gen  pva  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  en  S.  lividans 
1326  se  ha  abordado  a  través  de  dos  estrategias  distintas.  En  una  primera,  y  utilizando 
como  vector  de  clonación  el  plásmido  pHJL401  (Larson  y  Hershberger,  1986),  se  ha 
obtenido el clon recombinante S. lividans CECT 3365, que posee el plásmido recombinante 
pPVASl0.1  y  que  permite  la  expresión  del  gen  pva  regulada  por  su  propio  promotor 
(apartado 5.1 de resultados). En una segunda estrategia con el fin de aumentar los niveles 
de  expresión  del  gen  pva,  se  ha  abordado  la  clonación  y  expresión  del  gen  pva  bajo  la 
regulación  de  un  promotor  distinto,  en  este  caso  se  ha  utilizado  el  vector  de  clonación 
pEM4 (Quiros y col., 1998), que posee un promotor fuerte y constitutivo, el PermE* (Bibb y 
col.,  1994),  derivado  del  promotor  de  la  eritromicina  (Bibb  y  col.,  1985).  Esta  segunda 
estrategia ha permitido obtener el clon recombinante S. lividans CECT 3376, que posee el 
plásmido recombinante pASL‐7 (apartado 5.2 de Resultados). 

Los  estudios  de  producción  de  SlPVA  por  S.  lividans  CECT  3365  utilizando 
diferentes  medios  mostraron  la  presencia  de  la  enzima  en  los  distintos  caldos  de 
fermentación  utilizados  a  partir  de  las  72  horas  de  cultivo  (Tabla  16).  Sin  embargo,  la 
cantidad de SlPVA producida por S. lividans CECT 3365 es muy baja, 0,02 UI/ml en medio 
TSBw/oG, muy inferior a la observada en el microorganismo parental, donde se alcanzan 
valores de 0,2 UI/ml (Torres y col., 1999). Con el fin de confirmar que la SlPVA producida 
por S. lividans CECT 3365 conservaba la capacidad de hidrolizar las penicilinas alifáticas 
naturales que posee la enzima parental (Torres‐Guzmán y col., 2002) se realizaron estudios 
de hidrólisis de estas penicilinas (penicilina K, F y dihidroF) en los caldos de fermentación 
del  microorganismo  recombinante.  Se  comprobó  de  esta  manera  que  efectivamente  la 
enzima  expresada  en  S.  lividans  CECT  3365  conserva  la  actividad  hidrolítica  sobre  estos 
sustratos (Figura 30). 

Como se ha comentado anteriormente, se ha llevado a cabo una segunda estrategia 
con el fin de aumentar los niveles de expresión del gen pva de S. lavendulae ATCC 13664 
en  S.  lividans  1326  utilizando  para  ello  el  vector  de  expresión  pEM4  que  ha  permitido 
obtener  el  microorganismo  recombinante  S.  lividans  CECT  3376,  hiperproductor  de 
SlPVA. 

El estudio de la producción de SlPVA por S. lividans CECT 3376 en los diferentes 
medios analizados permite concluir que el mejor medio de fermentación para obtener la 
enzima es TSB, donde se alcanzan valores de 0,65 UI/ml a las 96 horas de cultivo (Tabla 
17).  Esto  supone  un  incremento  de  tres  veces  en  relación  a  la  enzima  producida  por  S. 
lavendulae ATCC 13664, que es de 0,2 UI/ml y en la mitad de tiempo de cultivo (Torres y 
col., 1999). Cabe señalar que en el estudio se han analizado diversos medios, entre ellos el 
medio  leche  desnatada,  utilizado  para  la  producción  de  SlPVA  por  el  microorganismo 
parental.  En  el  caso  de  S.  lividans  CECT  3376  la  producción  de  enzima  en  este  medio  es 

170
Discusión 

nula. Además el medio TSB posee un alto contenido en glucosa, lo que parece indicar que 
no existe represión por catabolito, más bien al contrario, se observa mayor producción en 
este medio que en el mismo medio sin glucosa (TSBw/oG). Esta represión por glucosa si 
se observaba en la producción de SlPVA en S. lavendulae ATCCC 13664 (Torres‐Guzmán, 
2004).  

Se han optimizado las condiciones de fermentación para la producción de SlPVA 
por S. lividans CECT 3376. Así, se puede concluir que el tamaño de inóculo de esporas más 
adecuado para la producción de de la enzima es 2x106 esporas/ml de medio TSB (Figura 
43);  y  que  la  temperatura  óptima  de  fermentación  es 30 ºC (Figura  44).  Este  último  dato 
contrasta  con  el  observado  para  S.  lavendulae  ATCC  13664,  cuya  temperatura  óptima  de 
fermentación es 20 ºC (Torres‐Guzmán, 2004). Este hecho se debe principalmente a que la 
producción de SlPVA está relacionada con el crecimiento del microorganismo, puesto que 
está regulado por un promotor constitutivo y, por tanto, a 30 ºC, temperatura óptima de 
crecimiento de S. lividans, se dan las condiciones para una mejor producción (Kieser y col., 
2000). 

Considerando las condiciones óptimas para la producción de SlPVA por S. lividans 
CECT  3376  se  ha  realizado  un  estudio  de  seguimiento  del  crecimiento  del 
microorganismo  recombinante  con  el  tiempo  de  fermentación,  determinándose 
paralelamente la producción de enzima (Figura 45). Los resultados muestran que tras una 
fase  de  latencia  de  24  horas  S.  lividans  CECT  3376  entra  en  fase  exponencial  de 
crecimiento, alcanzando su máximo a las 72 horas momento en el que entra en una fase 
estacionaria hasta las 96 horas de cultivo en el que la cantidad de SlPVA en el medio de 
cultivo es máxima. A partir de ese punto entra en fase de muerte celular. A las 96 horas de 
fermentación se puede considerar que se alcanza el óptimo para la producción de SlPVA 
por  S.  lividans  CECT  3376.  Si  tenemos  en  cuenta  la  cantidad  de  enzima  en  relación  a  la 
proteína extracelular se  obtienen valores de más de 6 UI/mg de proteína, lo  que supone 
un  incremento  de  la  actividad  específica  de  115  veces  superior  que  el  observado  en  las 
fermentaciones de S. lavendulae ATCC 13664, aunque hay que considerar que el medio de 
cultivo  utilizado  en  este  último  es  leche,  que  de  partida  posee  una  gran  cantidad  de 
proteína  (Torres  y  col.,  1999).  Este  dato  va  a  suponer  una  gran  ventaja  en  la  aplicación 
industrial de microorganismo recombinante respecto del parental, ya que va a facilitar el 
proceso  de  purificación  de  la  enzima  al  ser  menor  la  presencia  de  otras  proteínas  en  el 
medio.  

171
 Discusión 

1.4 Purificación de SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 

Un paso crítico en el uso de enzimas por la industria biotecnológica es conseguir 
un método de purificación sencillo, que requiera un número mínimo de etapas, y que de 
lugar  a  buenos  rendimientos.  La  mayoría  de  los  procesos  de  purificación  de  proteínas 
consisten  en  una  serie  de  pasos  cromatográficos  que  dan  lugar  a  la  obtención  de  la 
proteína pura.  

La  purificación  de  la  SlPVA  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  es  muy  tediosa  y  larga 
debido sobretodo a la complejidad de la leche desnatada utilizada como medio de cultivo 
(Torres‐Guzmán, 2004). Para la purificación para la SlPVA producida por S. lividans CECT 
3376 se ha diseñado un proceso que consiste en un solo paso de purificación mediante una 
cromatografía  de  intercambio  iónico  S‐Sepharose  que  permite  la  obtención  de  la  enzima 
pura a homogeneidad (Figuras 46 y 47). 

El método desarrollado para llevar a cabo la purificación de SlPVA producida por 
S.  lividans  CECT  3376  permite  la  recuperación  el  71%  de  la  enzima  en  un  solo  paso 
cromatográfico, con un factor de purificación del 12,5. Este resultado supone una ventaja 
añadida  si  se  compara  con  el  obtenido  es  el  proceso  de  purificación  de  la  enzima 
producida por S. lavendulae ATCC 13664, donde se requieren 4 etapas y cuyo rendimiento 
final era del 26% (Torres‐Guzmán, 2004). 

1.5 Caracterización funcional de SlPVA por S. lividans CECT 3376 

Desde  el  punto  de  vista  funcional,  la  enzima  SlPVA  producida  por  S.  lividans 
CECT  3376  presenta  las  mismas  propiedades  que  la  enzima  parental,  mostrando  un  pH 
óptimo  ente  9,5  y  10,5  (Torres‐Guzmán,  2004),  valores  ligeramente  superiores  a  los 
observados  en  otras  penicilina  acilasas,  que  oscilan  entre  7  y  8  (Shewale  y  Sudhakaran, 
1997).  Hay  que  indicar  que,  aunque  SlPVA  presenta  estos  valores  de  pH  óptimo,  es 
aconsejable utilizar  valores  de  pH  inferiores  en  las  reacciones  de  hidrólisis  de  penicilina 
para obtener de 6‐APA ya que, aunque la enzima presenta una elevada estabilidad a estos 
valores de pH, el sustrato es inestable. 

Por  otro  lado,  SlPVA  producida  por  S.  lividans  CECT  3376  presenta  una 
temperatura óptima de 55 ºC igual a la observada en la SlPVA parental (Torres‐Guzmán, 
2004).  Esta  temperatura  es  ligeramente  superior  a  la  que  presentan  otras  penicilina 
acilasas, que oscilan entre los 30 ºC y 50 ºC (Shewale y SivaRaman, 1989). Aunque SlPVA 
muestra esta temperatura óptima, al considerar su estabilidad con la temperatura (Figura 
49) es conveniente llevar a cabo las reacciones de hidrólisis a temperaturas inferiores, ya 
que  la  estabilidad  de  enzima  disminuye  a  temperaturas  superiores  45  ºC. Este  resultado 

172
Discusión 

obtenido en el estudio de la estabilidad de SlPVA con la temperatura se confirma con el 
de  desnaturalización  térmica  por  dicroísmo  circular,  en  el  que  se  observa  que  a 
temperaturas mayores de 45 ºC la proteína comienza a desplegarse debido a los procesos 
de  desestabilización  térmica,  presentando  una  temperatura  de  fusión  (TM)  de  62  ºC, 
idéntica a la calculada para la enzima parental (Torres‐Guzmán, 2004). 

Del  estudio  de  la  actividad  de  SlPVA  producida  por  S.  lividans  CECT  3376  en 
función  de  la  fuerza  iónica  del  tampón,  se  desprende  que  presenta  mayor  actividad  a 
concentraciones de 0,6 M de NaCl (Figura 51), aunque no se observa mucha diferencia en 
concentraciones  de  NaCl  entre  0  y  1  M.  A  concentraciones  por  encima  de  0,6  M  la 
actividad penicilina acilasa disminuye, conservando sólo el 60% de la actividad original a 
3 M. 

Uno de los principales objetivos planteados a la hora de realizar este trabajo fue la 
clonación de la enzima SlPVA de S. lavendulae ATCC 13664 con el fin de hiperexpresarla 
de  cara  a  su  uso  en  la  industria  biotecnológica  de  producción  de  6‐APA  a  partir  de 
penicilinas naturales (penicilina V, G, K, F y dihidroF). Por tanto, una de las características 
más deseadas que debería mantener la SlPVA producida por S. lividans CECT 3376 es la 
de  conservar  su  especificidad  de  sustrato  frente  a  estas  penicilinas.  Los  parámetros 
cinéticos de SlPVA producida por S. lavendulae ATCC 13664 sobre las penicilinas naturales 
(Tabla  19)  no  muestran  diferencias  respecto  a  los  valores  observados  en  la  SlPVA 
producida por S. lavendulae ATCC 13664 (Torres‐Guzmán y col., 2002). Al igual que ocurre 
con  la  SlPVA  parental,  la  enzima  recombinante  muestra  una  elevada  eficacia  catalítica 
(244,11  mM‐1s‐1)  cuando  se  utiliza  la  penicilina  K  como  sustrato.  Este  valor  es  mucho 
mayor que el obtenido cuando el sustrato es la penicilina V (21,7 mM‐1s‐1). Este resultado 
hace  barajar  la  hipótesis  de  que,  en  realidad,  la  enzima  se  debe  denominar  penicilina  K 
acilasa, en lugar de penicilina V acilasa (Torres‐Guzmán, 2004). 

2. ACULEACINA A ACILASA DE A. utahensis NRRL 12052 EXPRESADA 

EN S. lividans 

2.1 Clonación y caracterización del gen aac de A. utahensis NRRL 12052 

Como se ha indicado anteriormente, estudios previos pusieron de manifiesto una 
elevada similitud entre la secuencia de la enzima SlPVA de S. lavendulae ATCC 13664 y la 
aculeacina A acilasa de A. utahensis NRRL 12052 (AuAAC) (Inokoshi y col., 1992). Por otro 
lado,  un  trabajo  previo  había  puesto  de  manifiesto  la  presencia  de  actividad  penicilina 

173
 Discusión 

acilasa  en  los  caldos  de  fermentación  de  A.  utahensis,  aunque  no  se  identificó  la  enzima 
responsable  (Kleinschmidt  y  col.,  1964).  Además,  si  bien  el  gen  aac  ha  sido  clonado  y 
expresado, no se han llevado a cabo estudios de caracterización molecular y funcional de 
la AuAAC.  Todo ello hizo que se plantease la posibilidad de estudiar esta enzima como 
biocatalizador en las reacciones de  hidrólisis de penicilinas para la obtención de 6‐APA. 
En  un  paso  previo,  se  ha  analizado  la  presencia  de  actividad  penicilina  V  acilasa  en  los 
caldos de fermentación de A. utahensis NRRL 12052 con un resultado positivo (apartado 9 
de Resultados). 

Con el fin de clonar y expresar el gen aac se diseñaron los oligonucleótidos AAC‐1 
y  AAC‐2  en  base  a  la  secuencia  previamente  descrita  del  gen  aac  (Inokoshi  y  col.,  1992). 
Estos  oligonucleótidos  se  han  utilizado  para  la  obtención  del  gen  aac  mediante  PCR, 
fragmento  AAC12  (Figura  59).  Este  fragmento  se  ha  clonado  en  E.  coli,  utilizando  como 
vector  el  plásmido  pGEM‐T‐Easy  vector,  obteniéndose  el  clon  recombinante  E.  coli 
pAAC12 que presenta el gen aac (Figura 61).  

La  secuencia  de  nucleótidos  del  gen  aac  presenta  un  contenido  en  guanina  y 
citosina  mayor  del  70%,  similar  al  observado  en  el  gen  pva  de  S.  lavendulae.  Este  alto 
contenido  en  G  +  C  es  característico  de  los  Actinomicetos,  grupo  al  que  pertenece  A. 
utahensis NRRL 12052.  

El  gen  aac  nativo  presenta  como  codón  de  iniciación  de  la  traducción  el  triplete 
GTG,  que  aparece  con  una  frecuencia  del  36%  en  los  Actinomicetos  (Kieser  y  col.,  2000). 
Sin  embargo,  con  vistas  a  la  clonación  y  expresión  del  gen  utilizando  E.  coli  como 
hospedador  y  con  el  fin  de  obtener  el  gen  aac,  durante  el  proceso  de  amplificación  por 
PCR se ha mutado el triplete original por ATG, mucho más común. En esa misma línea, se 
ha  mutado  también  la  secuencia  RBS  del  gen  nativo  (GGAGATG)  por  la  secuencia 
GAGGG, mucho más común en E. coli (Sambrook y col., 1989). 

2.2 Caracterización molecular de AuAAC recombinante 

La enzima AuAAC, al igual que la SlPVA, es un heterodímero constituido por una 
subunidad pequeña, α de 19 kDa, y una grande, β de 55 kDa (Takeshima y col., 1989). Al 
igual que el gen pva, el gen aac presenta una única ORF, que codifica una proteína de 787 
aminoácidos  (Figura  62)  lo  que  indica  que  la  proteína  se  va  a  sintetizar  en  forma 
inmadura (pre‐AAC) y va a sufrir un proceso de maduración postraduccional semejante 
al  observado  en  el  resto  de  proteínas  pertenecientes  a  la  familia  de  las  β‐lactam  acilasas 
(Sudhakaran y col., 1992; Kasche y col., 1999; Hewitt y col., 2000; Lee y col., 2000). 

174
Discusión 

La  pre‐AAC  presenta  en  el  extremo  aminoterminal  un  fragmento  de  34 
aminoácidos que constituyen su péptido señal, que al igual que el observado en la SlPVA, 
presenta  la  estructura  característica  que  se  da  en  las  proteínas  extracelulares  género 
Streptomyces, y por extensión en los Actinomicetos (Figura 63). El péptido señal de la pre‐
AAC presenta una región N‐terminal de pequeño tamaño y con carga positiva, una región 
central  de  carácter  hidrofóbico,  y  una  región  C‐terminal  con  la  secuencia  diana  para  la 
acción  de  una  peptidasa  (Von  Heijne  y  Abrahmsen,  1989;  Lammertyn y  Anne,  1998).  Al 
igual  que  ocurre  con  SlPVA,  no  se  observa  en  el  péptido  señal  de  AuAAC  la  secuencia 
diana Ala‐Xxx‐Ala para la enzima péptido señal peptidasa I, mayoritaria en las proteínas 
extracelulares de los Actinomicetos. 

La enzima AuAAc va a sufrir, por tanto, un proceso de maduración que va a dar 
lugar a una proteína heterodimérica con una subunidad pequeña, α de 196 residuos y una 
subunidad  grande,  β  de  557  residuos  que  constituyen  una  proteína  con  una  masa 
molecular  de  aproximadamente  80  kDa.  El  13,2%  de  sus  aminoácidos  son  residuos 
básicos, el 10,3% son residuos ácidos, el 18,3% son residuos polares y el 50% son residuos 
apolares,  de  los  que  un  7,9%  corresponde  a  residuos  aromáticos  (Tabla  21).  Como  en  el 
caso de SlPVA, AuAAC presenta un alto contenido en residuos hidrofóbicos, destacando 
el elevado porcentaje de residuos de alanina (13,8%) y glicina (9,9%), indicativos de que la 
enzima  va  a  tener  una  estructura  compacta  que  se  va  a  ver  estabilizada  por  fuerzas 
hidrofóbicas y con un alto contenido en α‐hélice. Esto último hecho se encuentra apoyado 
por  los  resultados  obtenidos  en  el  estudio  de  AuAAC  mediante  dicroísmo  circular,  que 
han permitido obtener un espectro típico de una proteína con alto contenido en α‐hélice. 
El análisis del contenido en estructura secundaria mediante el programa CDNN también 
indica que AuAAC presenta un 29% de hélice α, un 18% de lámina β, un 17% de giros β y 
un  36%  de  estructura  aperiódica  (Figura  77).  El  número  de  tirosinas  (20)  es  ligeramente 
superior al de triptófanos (14) en la secuencia de aminoácidos de AuAAC (Tabla 21), pero 
la  enzima  presenta  un  espectro  de  absorción  UV‐visible  debido  fundamentalmente  a  la 
contribución  de  triptófanos  (Figura  75).  Hay  que  indicar  que  la  enzima  presenta  unos 
espectros  de  emisión  de  fluorescencia  tras  excitación  a  275  y  295  nm  cuyos  únicos 
máximos  coinciden  a  334  nm  (Figura  76).  Este  resultado,  similar  al  que  presenta  SlPVA 
(Figura  53),  sugiere  que  los  triptófanos  de  la  enzima  se  encuentran  en  un  único  entorno 
apolar, situado en el interior de la estructura proteica.  

A partir de los datos de elipticidad molar obtenidos de la AuAAC producida por 
S.  lividans  CECT  3377,  Figura  77,  y  de  su  secuencia  de  aminoácidos,  Figura  62,  se  ha 
llevado a cabo la predicción de la estructura secundaria de la enzima, para lo cual se han 
utilizado varios métodos (Tabla 25). Como ocurre en el caso de SlPVA, se aprecia mucha 
variabilidad  en  los  resultados  obtenidos  con  cada  uno  de  los  métodos  utilizados  en  la 

175
 Discusión 

estimación  de  elementos  de  estructura  secundaria  de  AuAAC.  De  todas  formas,  a  partir 
de los datos obtenidos se puede especular que la enzima podría estar constituida por un 
25‐30% de hélice α, un 18‐20% de lámina β, un 20% de giros β, y alrededor de un 30% de 
estructura aperiódica. Estos porcentajes son similares a los que se describen para SlPVA 
destacando la elevada diferencia que existe en la estimación de los porcentajes de hélice α 
y de lámina β, en cada uno de los métodos. Así, se puede observar que la estimación de 
lámina β es mucho mayor en el caso de utilizar el programa CCA en comparación con el 
programa  CDNN.  Por  otro  lado,  los  programas  basados  en  el  cálculo  de  la  estructura 
secundaria en función de la estructura primaria presentan valores similares de cada uno 
de los componentes. 

Como  se  puede  observar,  al  comparar  la  estructura  secundaria  de  SlPVA  y 
AuAAC,  Figuras  55  y  78,  se  aprecia  un  paralelismo  en  la  distribución  de  los  motivos 
estructurales. Así, destaca que los motivos estructurales en lámina β son más abundantes 
en  los  primeros  200  nucleótidos  de  la  subunidad  β,  donde  constituyen  el  motivo 
estructural mayoritario, mientras que en el resto de la subunidad β hay un predominio en 
hélice  α.  Con  relación  a  la  estructura  secundaria  de  la  subunidad  α,  se  observa  que 
predominan los motivos estructurales en α‐hélice en ambas enzimas.  

Cabe destacar que al comparar la secuencia de aminoácidos de la enzima AuAAC 
obtenida en este trabajo con la descrita en la bibliografía, AuAAC1, (Inokoshi y col., 1992) 
se  observa  que  ambas  presentan  una  identidad  del  96%  en  lugar  del  100%  esperado 
(Figura 80ª). Esto puede ser debido a diferencias en el método de secuenciación empleado, 
ya  que  otra  posible  causa,  como  es  la  introducción  de  mutaciones  al  llevar  a  cabo  las 
reacciones  de  amplificación  por  PCR  del  gen  aac  ha  quedado  totalmente  descartada  al 
llevar  a  cabo  la  secuenciación  directa  del  fragmento  amplificado  AAC12  (Figura  59)  y 
obtenido  en  diferentes  PCRs.  Las  diferencias  de  nucleótidos  observadas  entre  las 
secuencias del gen aac descrito en este trabajo y las publicadas por Inokoshi y col. (1992) 
aparecen reflejadas en la Figura 80B. Por otro lado, si se compara la secuencia de AuAAC 
obtenida en este trabajo con la de SlPVA se observa una identidad entre ambas enzimas 
del  42,4%,  ligeramente  superior  a  la  que  presenta  la  AuAAC  descrita  en  la  bibliografía, 
que  es  del  41%.  Una  mayor  identidad  y  similitud  también  se  observa  al  comparar  la 
secuencia de la enzima descrita en este trabajo con otras acilasas. 

 
 
 
 
 
 

176
Discusión 

 
A
  1
AuAAC M-péptido señal (34 aa)-GGY-(57 aa)-PDDADVRSDLFHRKAIDDRVAERLLE 120
AuAAC1 M-péptido señal (34 aa)-GGY-(57 aa)-PDDADVRTTS-STQAIDDRVAERLLE 119
2 

AuAAC GPRDGVRAPSDDVRDQMRGFVAGYNHFLRR-(110 aa)-SNAYGLGAQA-(360 aa)-LS 602

AuAAC1 GPRDGVRAPCDDVRDQMRGFVAGYNHFLRR-(110 aa)-SNAYGLGAQA-(360 aa)-LS 601
3 4
AuAAC RFDERADLDSRGAHLFTEFALAGGIRFADTFEVTDPVRTPRRL-NTTDPRVRTALADAVQRL 664
AuAAC1 RFDERADLDSRGAHLFTEF-LAGGIRFADTFEVTDPVRTPAPFWNTTDPRVRTALADACNGS 663
5 
AuAAC AGIPLDAKLGDIHTDSRGERR-(95 aa)-YRVAQRGR 787
AuAAC1 PASPSTRSVGDIHTDSRGERR-(95 aa)-YRVAQRGR 786
 
 
 
 
 
B
                                                1
 
 
aac gatgtgcgcAGCGACCTCTTCCACCGCAAGGCGatcgac
  aac1 gatgtgcgcA CGACCTCTTCCAC GCAAG CGatcgac
 
 
 
                                              2 
  aac gcgccgTCGgacgac
 
 
aac1 gcgccgTGCgacgac
 
                                                3 
 
 
aac accgagttcGCCctcgcg
  aac1 accgagttc ctcgcg
 
 
 
                                              4 
  aac gtacgcacc CCGCGCCGT CTG aacacc
 
 
aac1 gtacgcaccCCCGCGCCGTTCTGGaacacc
 
                                                5 
 
 
aac gacGCCGTGCAACGGCTCGCCGGCATCCCCCTCGACGCGAAGC TGgga
  aac1 gacGC GTGCAACGGCTCGCCGGCATCCCCCTCGACGCGAAGCGTGgga
 
 
Figura  80.  A,  Comparación  de  las  secuencias  de  aminoácidos  de  la  aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL 
12052, secuenciada en este trabajo, AuAAC y la descrita por Inokoshi y col (1992), AuAAC1. Subrayados aparecen 
los aminoácidos que corresponden a la subunidad α de la enzima. B, Comparación en la secuencia de nucleótidos 
del gen aac secuenciada en este trabajo, aac y el descrita por Inokoshi y col (1992), aac1 en las regiones donde se 
aprecian diferencias en la secuencia de aminoácidos. En rojo se indican las diferencias en las secuencias. 

La  comparación  de  la  secuencia  de  aminoácidos  de  AuAAC  con  otras  proteínas, 
utilizando  el  programa  BLASTP  2.2.8  (Altschul  y  col.,  1997)  muestra  la  presencia  de 
dominios conservados que la incluyen en el grupo de las enzimas penicilina amidasas, o 
penicilina  acilasas  o  EC.3.5.1.11  (código  NCBI  pfam01804.11)  al  igual  que  ocurre  con 
SlPVA. Así, también se puede integrar a AuAAC en la superfamilia de las Ntn‐hidrolasas, 
con  las  que  compartiría  características  estructurales,  como  es  la  presencia  de  un 
aminoácido nucleófilo en el extremo N‐terminal que actúa en la catálisis enzimática. En el 
caso de AuAAC este aminoácido sería la serina aminoterminal de la subunidad β (Serβ1), 
igual que sucede con SlPVA y la mayor parte de las β‐lactam acilasas, salvo la PVA de B. 
sphaericus  que  presenta  como  aminoácido  catalítico  una  cisteína  (Pundle  y  SivaRaman, 
1997). 

177
 Discusión 

Como  en  el  caso  de  SlPVA,  las  proteínas  más  parecidas  a  AuAAC  son  la 
ciclolipopéptido  acilasa  de  Streptomyces  sp.  FERM  BP‐5809,  con  la  que  presenta  una 
identidad  del  43%  y  una  similitud  del  56%  (Shibata  y  col.,  2000),  y  la  acil‐homoserina 
lactona  acilasa  de  Ralstonia  sp.  XJ12B  con  la  que  tiene  una  similitud  del  41%  (Lin  y  col., 
2003).  sin  embargo,  el  parecido  con  otras  aculeacina  A  acilasas,  como  son  las  de  D. 
radiodurans y S. onidensiss MR‐1, es menor (White y col., 1999; Heidelberg y col., 2002). En 
relación a la penicilina G acilasa de E. coli y la glutaril 7‐ACA acilasa de Pseudomonas sp. el 
parecido disminuye en comparación con las equinocandina acilasas (Oh y col., 1987; Li y 
col., 1999).  

2.3 Estudios de expresión del gen aac 

El gen aac ha sido clonado y expresado en S. lividans JT46 mediante la construcción 
de una genoteca en E. coli JM108 utilizando como vector el cósmido pKU400 (Inokoshi y 
col., 1992). En la presente memoria se decidió abordar en una primera etapa la clonación y 
expresión  en  E.  coli  del  gen  aac  obtenido  mediante PCR  con  el  codón de  iniciación  de  la 
traducción mutado por ATG y la secuencia para el RBS consenso de E. coli (Figura 61). Se 
seleccionó  como  hospedador  la  cepa  E.  coli  BL21  (DE3)  y  como  sistema  de  expresión  el 
vector  pET28a  (+),  obteniéndose  el  clon  E.  coli  BL21  (pPET28AAC12)  que  presenta  el 
plásmido recombinante pET28AAC12 portador del gen aac (Figura 64), con el que se han 
realizado  estudios  de  expresión  del  gen  aac  sin  ningún  resultado  positivo.  Por  tanto,  al 
igual  que  en  el  caso  del  gen  pva  se  ha  descartado  este  procedimiento,  optándose  por 
abordar la clonación y expresión del gen aac utilizando un sistema de expresión basado en 
S.  lividans  1326  como  hospedador  y  como  vector  de  expresión  el  plásmido  pEM4,  que 
como se ha observado han dado un resultado positivo en la clonación y expresión del gen 
pva de S. lavendulae ATCC 13664. 

La clonación y expresión del gen aac en S. lividans 1326 utilizando el vector pEM4 
ha permitido obtener el microorganismo recombinante S. lividans CECT 3377 (Figura 66). 
Los estudios de expresión de la enzima AuAAC por S. lividans CECT 3377 en medio TSB 
son  positivos,  observándose  la  presencia  de  actividad  enzimática  de  hidrólisis  de 
penicilina  V  en  sus  caldos  de  fermentación,  sin  que  se  aprecie  dicha  actividad  en  los 
caldos  de  fermentación  de  los  microorganismos  control  (Tabla  22).  En  las  condiciones 
ensayadas se ha detectado una producción máxima de AuAAC a las 96 horas de cultivo 
de 0,87 UI/ml, lo que supone un incremento de 14,5 veces respecto a la observada en A. 
utahensis NRRL 12052, que era de 0,06 UI/ml. Este aumento en la expresión del gen aac y, 
por  tanto,  producción  de  AuAAC  es  mayor  que  el  detectado  en  los  estudios  llevados  a 
cabo  por  Inokoshi  y  col.,  donde  el  clon  descrito  presenta  una  producción  de  enzima  1,5 
veces  mayor  a  la  que  se  da  en  el  microorganismo  parental,  utilizando  en  este  caso  la 

178
Discusión 

aculeacina A como sustrato (Inokoshi y col., 1992). Esto puede ser debido a la diferencia en 
la cepa productora utilizada o a la diferencia en el vector de expresión. 

Se caracterizó la curva de crecimiento de S. lividans CECT 3377 y la producción de 
AuAAC  con  el  tiempo  de  fermentación  en  medio  TSB  a  30  ºC.  Los  resultados  obtenidos 
muestran que la enzima se está produciendo de forma lineal y progresiva paralelamente 
al crecimiento del microorganismo, de forma que tras una fase de latencia de 24 horas S. 
lividans CECT 3377 entra en fase exponencial de crecimiento que dura hasta las 72 horas 
de cultivo. Durante esta fase se aprecia un incremento en la presencia de la enzima en el 
caldo  de  fermentación.  Entre  72  y  96  horas,  S.  lividans  CECT  3377  desarrolla  la  fase 
estacionaria,  período  durante  el  cual  aumenta  la  producción  de  AuAAC  que  alcanza  su 
máximo a las 96 horas de cultivo. A partir de este momento comienza la fase de muerte 
celular, observándose una disminución de enzima presente en el medio de cultivo (Figura 
67). El patrón de crecimiento‐producción de AuAAC observado en S. lividans CECT 3377 
es similar al que se da en S. lividans CECT 3376 (Figura 45).  

2.4 Purificación de AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 

Se  ha  puesto  a  punto  un  método  de  purificación  que  permite  obtener  la  AuAAC 
producida por S. lividans CECT 3377 pura a homogeneidad (Figura 70). Se ha diseñado un 
método  de  purificación  que  requiere  un  mínimo  número  de  etapas,  lo  que  facilita  la 
futura  aplicación  de  AuAAC  en  la  industria.  El  método  establecido  consta  de  sólo  dos 
pasos  cromatográficos,  una  cromatografía  de  intercambio  iónico  en  S‐Sepharose  y  una 
cromatografía  de  penetrabilidad  en  Superose  12.  De  esta  manera,  se  ha  mejorado  el 
proceso  de  purificación  propuesto  para  AuAAC  en  trabajos  anteriores,  que  requería 
cuatro etapas (Takeshima y col., 1989; Inokoshi y col., 1992).  

Como  se  observa  en  la  Figura  69A  la  AuAAC  no  eluye  en  un  único  pico  tras  ser 
sometida a una cromatografía de penetrabilidad en Superose 12, en la que se aprecian dos 
picos de proteína que presentan AuAAC pura, el segundo de ellos con el doble de tiempo 
de retención. Este dato indicaría la posibilidad de que AuAAC en solución se encuentre en 
forma de dímero αβ y en forma de heterotetrámero, α2β2, constituido por dos dímeros αβ, 
como  se  ha  visto  que  ocurre  en  el  caso  de  la  glutaril  7‐ACA  acilasa  de  Pseudomonas  sp. 
(Matsuda y Komatsu, 1985; Fritz‐Wolf y col., 2002). 

El método de purificación diseñado permite recuperar el 21% de la enzima pura a 
homogeneidad  (Tabla  23).  Al  igual  que  ocurre  en  el  proceso  repurificación  de  la  SlPVA 
producida por S. lividans CECT 3376 se obtiene un factor de purificación final del 13,6, lo 
que indica el elevado grado de pureza con el que se parte de los caldos de fermentación, 
en los que AuAAC representa la proteína más abundante. 

179
 Discusión 

2.5 Caracterización funcional de AuAAC producida por S. lividans CECT 3377 

Se han realizado los estudios de caracterización funcional de la AuAAC producida 
por S. lividans CECT 3377 utilizando penicilina V como sustrato. 

La AuAAC producida por S. lividans CECT 3377, muestra intervalo de pH óptimo 
comprendido  entre  8  y  8,5  (Figura  71),  aunque  conserva  prácticamente  el  100%  de 
actividad  hasta  pH  9.  Este  valor  es  superior  al  que  exhibe  la  enzima  en  la  hidrólisis  de 
aculeacina A (pH 7), e inferior al que se observa para la SlPVA producida por S. lividans 
CECT 3376 (pH 9,5‐10,5). Estos valores de pH óptimo son similares a los que presentan la 
mayor parte de las penicilina acilasas (Shewale y Sudhakaran, 1997). La AuAAC, por otro 
lado es muy estable en las condiciones de ensayo a los diferentes valores de pH (Figura 
71), conservando el 100% de su actividad en el intervalo de pH comprendido entre 7 y 10, 
disminuyendo su estabilidad a partir de ese punto, difiriendo del que presenta cuando se 
utiliza aculeacina A como sustrato (pH 4‐8) (Takeshima y col., 1989). 

El  estudio  de  caracterización  de  la  reacción  de  hidrólisis  de  la  penicilina  V  por 
AuAAC  muestra  una  temperatura  óptima  de  75  ºC  (Figura  72),  valor  superior  al  que 
presenta cuando se utiliza aculeacina A como sustrato y a las descritas en otras penicilina 
acilasas,  las  cuales  generalmente  no  presentan  temperaturas  óptimas  superiores  a  50  ºC 
(Shewale  y  SivaRaman,  1989).  Recientemente  se  ha  descrito  una  penicilina  G  acilasa 
termoestable  producida  por  Achromobacter  xylosoxidans,  que  presenta  una  temperatura 
óptima  de  60  ºC  y  elevada  estabilidad  térmica  (Cai  y  col.,  2004),  sin  embargo  presenta 
menor  estabilidad  que  la  observada  en  AuAAC.  Estos  autores  proponen  que  la  elevada 
estabilidad térmica de esta enzima se debe a un bajo porcentaje de residuos de Gln, Asn, 
Ser y Thr y un elevado número de residuos cargados (Lys, Glu y Arg) y de Ala y Pro en su 
secuencia. En el caso de la AuAAC  producida por S. lividans CECT 3377 se observa una 
composición  de  aminoácidos  muy  similar  (Tabla  21).  Como  se  puede  observar  en  la 
Figura 72, AuAAC es estable hasta los 50 ºC, temperatura a partir de la cual comienza a 
disminuir lentamente su estabilidad térmica hasta los 75 ºC, momento en la enzima pierde 
su  estabilidad  de  forma  rápida.  Este  resultado  se  apoya  en  los  de  desnaturalización 
térmica de AuAAC por dicroísmo circular, en los que se observa que la enzima no sufre 
un desplegamiento de su estructura hasta temperaturas muy elevadas, presentando una 
temperatura de fusión (Tm) de 81,5 ºC. 

Aunque la temperatura óptima de hidrólisis de penicilina V por AuAAC es de 75 
ºC,  la  enzima  presenta  mucha  menor  estabilidad  térmica  a  esta  temperatura,  por  lo  que 
para las reacciones de hidrólisis se deben utilizar temperaturas inferiores. En este caso, es 
aconsejable temperaturas de 45‐50 ºC, en las que la enzima se muestra totalmente estable, 

180
Discusión 

quedando  establecidas  las  condiciones  óptimas  de  pH  y  temperatura  de  reacción  de 
hidrólisis de la penicilina V en pH 8 y 45 ºC respectivamente. 

El estudio de la actividad de hidrólisis de la penicilina V por la AuAAC producida 
por S. lividans CECT 3377 en función de la fuerza iónica muestra una actividad óptima a 
concentraciones de 0,6 M de NaCl (Figura 74). Estos datos coinciden con los observados 
en SlPVA, pero a diferencia de esta última, en AuAAC no se observa pérdida de actividad 
con  el  incremento  de  la  fuerza  iónica  del  medio  de  reacción,  conservando  toda  su 
actividad a concentraciones de NaCl de 2,5M. 

Uno de los objetivos de este trabajo era determinar si la enzima AuAAC presenta 
actividad  hidrolítica  frente  al  las  diferentes  penicilinas  alifáticas  naturales,  como  son  la 
penicilina  K,  la  F  y  la  dihidroF,  al  igual  que  sucede  con  SlPVA.  Si  fuera  así,  dicha 
actividad podría ser muy interesante desde el punto de vista de su aplicación industrial 
en la obtención de 6‐APA. 

Por ello, se han determinado los parámetros cinéticos de AuAAC producida por S. 
lividans CECT 3377 utilizando las diferentes penicilinas naturales como sustrato. Como se 
puede  apreciar  en  los  resultados  obtenidos  (Tabla  24),  la  enzima  es  activa  frente  a  las 
penicilinas  naturales,  destacando  su  elevada  actividad  frente  a  la  penicilina  K,  con  una 
eficacia  catalítica  de  34,79  mM‐1s‐1,  y  en  menor  medida  sobre  la  penicilina  V,  con  una 
eficacia  catalítica  de  4,55  mM‐1s‐1.  Se  observa  un  comportamiento  similar  al  de  SlPVA, 
aunque con una actividad ligeramente menor frente a las penicilinas naturales por parte 
de  AuAAC.  Como  ocurre  con  SlPVA,  esta  enzima  tiene  muy  poca  actividad  cuando  se 
utiliza la penicilina G como sustrato. Si comparamos estos resultados con los parámetros 
que presenta AuAAC sobre la aculeacina A como sustrato se puede afirmar que la enzima 
es más activa si el sustrato es una penicilina, sobre todo si es penicilina K (Takeshima y 
col.,  1989).  Esto  último,  abre  la  hipótesis,  al  igual  que  en  el  caso  de  SlPVA,  de  que  se 
debería de cambiar la denominación de la AuAAC por la de penicilina K acilasa. 

3. COMPARACIÓN DE LAS SECUENCIAS DE SlPVA Y AuAAC CON 

OTRAS ACILASAS 

En la Figura 81 se muestra la comparación de secuencias de la penicilina V acilasa 
de S. lavendulae ATCC 13664 y de la aculeacina A acilasa de A. utahensis NRRL 12052 con 
la principales  acilasas descritas en la bibliografía. 

181
 Discusión 

 
: :*:**:
SlPVA LTFRNRLRLFAVSGLALFTVSASLPPAAASGAPEARHPS--GGGLSATVRYTEYGIPHIV 58
AuAAC VTSSYMRLKAAAIAFGVIVATAAVPSPASGREHD--------GGYAALIRRASYGVPHIT 52
SfCHA MTLRNRLRLLGVAGLALFTVSASLPPATASGTQETRHPS--GSGLSAVIRYTEYGIPHIV 58
AuAAC1 MTSSYMRLKAAAIAFGVIVATAAVPSPASGREDH--------GGYAALIRRASYGVPHIT 52
DrAAC MSRSPFSSVSLPARLLLGSLLLGPLMLGGAASA---------QTYQVQIQRTAHGIPHIQ 51
RxAHLA MMQGFALRGTLAMAALAALAG-------CASSTDGRWGSLSDTGLSAEIRRTGFGIPHIR 53
SpG7ACA MLVQIRGKLRRGVGLVLLFVLTVGLGI----------GNPVWANGKTEIFWDSWGVPHIF 50
PCA MLRVLHRAASALVMATVIGLAPAVAFALAEPTSTPQAPIAAYKPRSNEILWDGYGVPHIY 60
AfPGA MQKGLVRTGLVAAGLILGWAGAPTHA----------------QVQSVEVMRDSYGVPHVF 44
EcPGA MKNRNRMIVNCVTASLMYYWSLPALA--------------EQSSSEIKIVRDEYGMPHIY 46
BmPGA MKTKWLISVIILFVFIFPQNLVFAGE---------------DKNEGVKVVRDNFGVPHLY 45
Consenso ------------------------------------------------I----YGVPHI-

. . . .. .: *.. . : * :. * .
SlPVA AKDYANLGFGTGWAQAADQVCTLADGFVTVRGERSKFFGPDAAPDFSLSSAAKNLSSDLY 118
AuAAC ADDFGSLGFGVGYVQAEDNICVIAESVVTANGERSRWFG-------ATGPDDADVRSDLF 105
SfCHA AEDYAQLGFGTGWAQAADQVCTLADGFLTVRGERSRFFGPDAATDYSLSSAATNLSSDLY 118
AuAAC1 ADDFGSLGFGVGYVQAEDNICVIAESVVTANGERSRWFG-------ATGPDDADVR-TTS 104
DrAAC ASDLGGIGYGVGYSYAQDNLCLLADQVMTVRGERSKFLGAEG-KTVVGFQPVNNLDSDVF 110
RxAHLA ANDYASLGYGMAYAYAQDNLCLLADQVVTVNGERSKTFGPEG-TVTVSFKPIPNLQSDAF 112
SpG7ACA AANETKLMEAFGWAQARGHGDLLLTLYGEARGKGAEYWG----------IDYLDNDQYVH 100
PCA GVDAPSAFYGYGWAQARSHGDNILRLYGEARGKGAEYWG----------PDYEQTTVWLL 110
AfPGA ADSHYGLYYGYGYAVAQDRLFQMDMARRSFVGTTAAVLGPGE------QDAYVKYDMQVR 98
EcPGA ANDTWHLFYGYGYVVAQDRLFQMEMARRSTQGTVAEVLG----------KDFVKFDKDIR 96
BmPGA AKNKKDLYEAYGYVMAKDRLFQLEMFRRGNEGTVSEIFG----------EDYLSKDEQSR 95
Consenso A-D---L-YG-GY--AQD-L--L--------G--SK--G--------------N------

. . . :..: * : :. .
SlPVA FRGVRDSGTVEKLLKVPAP--AGPSRDAKESMRGFAAGYNAWLRQNRD--RITDPACRGA 174
AuAAC HRKAIDDRVAERLLEGPRDGVRAPSDDVRDQMRGFVAGYNHFLRRTGVH-RLTDPACRGK 164
SfCHA FRGVRDSGTVEKLLKEPAP--AGPSRDVKETMRGFAAGYNAWIAQN----RITDPACRGA 172
AuAAC1 STQAIDDRVAERLLEGPRDGVRAPCDDVRDQMRGFVAGYNHFLRRTGVH-RLTDPACRGK 163
DrAAC FKTVIEP-------GRLQAGYRDQ-PQILALMRGYVAGVNRYLRDTPP--EQWPSACRNA 160
RxAHLA FKGIFDE-------DGLRAGYAQMSPEARELLRGYIAGFNRYLKDTPP--ANFPAACRNA 163
SpG7ACA TMNIPRR---------SEVWLNAQTPAMRRDLESFAQGINNYFQQHPD------FSQPSL 145
PCA TNGVPER---------AQQWYAQQSPDFRANLDAFAAGINAYAQQNPD------DISPDV 155
AfPGA QNFTPAS---------IQRQIAALSKDERDIFRGYADGYNAYLEQVRRR-PELLPKEYVD 148
EcPGA RNYWPDA---------IRAQIAALSPEDMSILQGYADGMNAWTDKVNTNPETLLPKQFNT 147
BmPGA RDGYSNK--------EIKKMIDGLDRQPKELIAKFAEGISRYVNEALKDPDDKLSKEFHE 147
Consenso -----D--------------------D-R--MRGF--G-N-YL-Q---------------

. *.. ..
SlPVA SWVRPVTALDVAVRGFALAVLG------------------------------------GQ 198
AuAAC AWVRPLSEIDLWRTSWDSMVRA------------------------------------GS 188
SfCHA SWVRPVTALDVAARGYALAVLG------------------------------------GQ 196
AuAAC1 AWVRPLSEIDLWRTSWDSMVRA------------------------------------GS 187
DrAAC DWVRPLTELDVMRLGEEKAIQA------------------------------------SA 184
RxAHLA AWVRPLTLGDMMRMGEEKAIQA------------------------------------SA 187
SpG7ACA RQVLPITAQDVVAHVQRLLLFE------------------------------------FV 169
PCA RQVLPVSGADVVAHAHRLMNFL------------------------------------YV 179
AfPGA FDFQPEPLTDFDVVMIWVGSMANRFSDTNLEVTALAMRQSLEKQHGPERGRALFDELLWI 208
EcPGA FGFTPKRWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALKDKYGVSQGMAVFNQLKWL 207
BmPGA YQFLPQKWTSTDVVRVYMVSMTYFMDN-HQELKNAEILAKLEHEYGTEVSRKMFDDLVWK 206
Consenso --V-PVT--DV-------------------------------------------------

. ..
SlPVA GRGIDGITAAQPPTAAPPAAGVTPKEAAAAAQRLLSTQN--------------------- 237
AuAAC GALLDGIVAATPPTAAGPASAPEAPDAAAIAAALDGTS---------------------- 226
SfCHA GRGIDGITAAQPPTAAPPAAGVTPEEAataaerllstqn--------------------- 235
AuAAC1 GALLDGIVAATPPTAAGPASAPEAPDAaaiaaaldgtS---------------------- 225
DrAAC GAMVSAITSARPPQAGASTAAPRP----DLAAFNRQYRFN-------------------- 220
RxAHLA GAMLAGIVAAQPPGRTPVAEREIPPQAVDTVALDRELQLR-------------------- 227
SpG7ACA TNPQAVASLAGQIPEAN------------------------------------------- 186
PCA ASPGRTLGEgdppd---------------------------------------------- 193
AfPGA NDTTAPTTVPAPAAEHKPQAqagtqdlahvsspvlatelerqdkhwggr----------- 257
EcPGA VNPSAPTTIAVQESNYPLKFNQQNSQTAallprydlpapmldrpakgadgallaltagkn 267
BmPGA NDPSAPTSIVSEGKPKRDSSSQSLQILSSavikasekvgkerenfvqtseelg------- 259
Consenso ---------A-PP-----------------------------------------------

182
Discusión 

..** . . ::. .*:. : .. .

SlPVA ------------------ADMGSNAVAFRGSTTANGRGLLLGNPHYPWDGGRRFWQSQQT 279
AuAAC ------------------AGIGSNAYGLGAQATVNGSGMVLANPHFPWQGAERFYRMHLK 268
SfCHA ------------------admgSNAVAFDGSTTVNGRGLLLGNPHYPWQGGRRFWQAQQT 277
AuAAC1 ------------------agigSNAYGLGAQATVNGSGMVLANPHFPWQGAERFYRMHLK 267
DrAAC -----------------DLPIGSNGWAFGSEATTNGRGLLLGNPHFPWETSNRFYQLHLT 263
RxAHLA -----------------DMPIGSNGWAFGADATANRRGVLLGNPHFPWTTTNRFYQVHLT 270
SpG7ACA ------------------VPIASNAWAIAPKQTESGHGLLLINPHLPWGGQFRLTEAQLV 228
PCA -----------------ladqgSNSWAVAPGKTANGNALLLQNPHLSWTTDYFTYYEAHL 236
AfPGA --------------gpdfapkaSNLWSTRPERVQEGSTVLINGPQFGWYNPAYTYGIGLH 303
EcPGA retiaaqfaqgganglagypttSNMWVIGKSKAQDAKAIMVNGPQFGWYAPAYTYGIGLH 327
BmPGA ----------------lplkigSNAAIVGSEKSATGNALLFSGPQVGFVAPGFLYEVGLH 303
Consenso --------------------IGSN--------T-NG--LLL-NPHFPW------YQ--L-

.. :: *.. . . . :. * .... *.. ... * * ...

SlPVA IPGELNVAGGSLLGSTTVSIGHNADVAWSHTVATGVTLNLHQLTLDPADPTVYLVDGKPQ 339
AuAAC VPGRYDVEGAALIGDPIIEIGHNRTVAWSHTVSTARRFVWHRLSLVPGDPTSYYVDGRPE 328
SfCHA IPGELNVSGASLLGATTISIGHNADVAWSHTVATGVTLNLHQLSLDPADPTVYLVDGKRE 337
AuAAC1 VPGRYDVEGAALIGDPIIEIGHNRTVAWSHTVSTARRFVWHRLSLVPGDPTSYYVDGRPE 327
DrAAC LPGQFDVMGASLGGMPVVNIGFNQDVAWTHTVSTDKRFTLAALTLVPGDPLSYVKDGQQR 323
RxAHLA VPGKLDVMGASIAAFPVVSIGFNKDVAWTHTVSTGRRFTLFELKLAEGDPTTYLVDGTPH 330
SpG7ACA APG-MDLTGAAFVGTPVPAMGFNNDLGWSLTVNYPHNVGKYALTLAEGG---YEWDGEVK 284
PCA VTPDFEIYGATQIGLPVIRFAFNQRMGITNTVNGMVGATNYRLTLQDGG---YLYDGQVR 293
AfPGA GAG-FDVVGNTPFAYPIVLFGTNSEIAWGATAGPQDVVDIYQEKLNPSRADQYWFNNAWR 362
EcPGA GAG-YDVTGNTPFAYPGLVFGHNGVISWGSTAGFGDDVDIFAERLSAEKPGYYLHNGKWV 386
BmPGA APG-FDMEGSGFIGYPFIMFGANNHFALSATAGYGNVTDIFEEKLNAKNSSQYLYKGKWR 362
Consenso -PG--DV-GAS--G-P-I-IG-N--VAWS-TVS-------HQL-L-------Y--DGK--

: * . . : .*.: .
SlPVA RMTQR----TVAVPVKGAAPVTRTQWWTRYGPVVTSLGAALPLPWTASTAYALNDPNAVN 395
AuAAC RMRAR----TVTVQTG-SGPVSRTFHDTRYGPVAVVP---GTFDWTPATAYAITDVNAGN 380
SfCHA RMTQR----TVSVPVKGGADVTRTQWWTRYGPVATSMGAGLPLPWTASTAYALNDPNATN 393
AuAAC1 RMRAR----TVTVQTG-SGPVSRTFHDTRYGPVAVVP---GTFDWTPATAYAITDVNAGN 379
DrAAC RLQRRTAVIEVKTANG-PRLHTRTVYFTPEGPLVNLP--AAGLTWTPQYAFALRDANRNN 380
RxAHLA KMTTRTVAFDVKLPDGRLERRTHTFYDTIYGPVLSMP--SGGMPWTTQKAYALRDANRNN 388
SpG7ACA SFDRRNNQVKILQGNGSYQTLQWEALESVTGIVVAQRG---------GNAYTLKIPGLDR 335
PCA PFERRQASYRLRQADGTTVDKPLEIRSSVHGPVFERAD---------GTAVAVRVAGLDR 344
AfPGA TMEQR----KERIQVRGQADREMTIWRTVHGPVMQFDY--------DQGAAYSKKRSWDG 410
EcPGA KMLSR----EETITVKNGQAETFTVWRTVHGNILQTDQ--------TTQTAYAKSRAWDG 434
BmPGA DMEKRKESFTVKGDNGEKKTVEKIYYRTVHGPVISRDE--------TNKVAYSKSWSFRG 414
Consenso -M--R-----V------------T---T-YGPV----------------A----------

.. . . .. .* . :*. * : *
SlPVA LRSADTSLGFSKARSTAGIERALHRSQGLPWVNTIAADRSGNSFFSQSQVLPRITDELAA 455
AuAAC NRAFDGWLRMGQAKDVRALKAVLDRHQFLPWVNVIAADARGEALYGDHSVVPRVTGALAA 440
SfCHA LRMADTGLGFGKARSTGDVERALHRSQGMPWVNTIAADRAGRSFFAQSQVLPRITDALAE 453
AuAAC1 NRAFDGWLRMGQAKDVRALKAVLDRHQFLPWVNVIAADARGEALYGDHSVVPRVTGALAA 439
DrAAC TRMLATWLGFAGAKSVRDIRASLN-VQGIPWVNTIAADRAGSALYADISSSPNVSAAQQQ 439
RxAHLA TRSVDSWLHIGQARDVAGIRQAIG-NLGIPWVNTIATDRNGRALFADVSTTPDVPAAELQ 447
SpG7ACA SGAISQFLHMGKAKTLEQFEAAWQ-KQQIPMFNVLYSDRQGNIFYLYNTLTPIREGSWQD 394
PCA PGMLEQYFDMITADSFDDYEAALA-RMQVPTFNIVYADREGTINYSFNGVAPKRAEGDIA 403
AfPGA YEVQSLLAWLNVAKARNWTEFLDQASKMAISINWYYADKHGNIGYVSPAFLPQRPADQDI 470
EcPGA KEVASLLAWTHQMKAKNWQEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQSGHDP 494
BmPGA TEAQSMSAYMKANWAKNLKEFENAASEYTMSLNWYYADKKGDIAYYHVGRYPVRNSKIDE 474
Consenso ------------AK-----E------Q-LP-VN-I-ADR-G---Y------P--------

. * . * .. .:*.
SlPVA RCSTPLGQA-TYPSAGLAVLDGSTSACALGSDRDAVQPGIFGPGRMPTLKNAPYVENSND 514
AuAAC ACIPAPFQP-LYASSGQAVLDGSRSDCALGADPDAAVPGILGPASLPVRFRDDYVTNSND 499
SfCHA RCSTPLGRA-TYPASGLAVLDGSRTDCALGSDPDAVRPGIFGPGRMPVLKNQPYVENSND 512
AuAAC1 ACIPAPFQP-LYASSGQAVLDGSRSDCALGADPDAAVPGILGPASLPVRFRDDYVTNSND 498
DrAAC ACTPPPLAP-LFPAAGLAVLDGSHSACDWKTDPASRVPGLRAPDKMPVLIRQDFVANSNN 498
RxAHLA RCAPSPLAGKLFKDAGLVLLDGSRGTCNWQVDPASPVPGLVAPARMPVLERDDYVANSND 507
SpG7ACA WDRLQPINR--------------SADLNSDYYIYEQLPKLTNPAS-------GWLQNSND 433
PCA FWQGLVPGD-------------SSRYLWTETHPLDDLPRVTNPP-------GGFVQNSND 443
AfPGA RVPAKGDGS----------------MEWLGIKSFDAIPKAYNPPQ------GYLVNWNNK 508
EcPGA RLPVPGTGK----------------WDWKGLLPFEMNPKVYNPQS------GYIANWNNS 532
BmPGA RIPTPGTGE----------------YEWKGFIPFKENPHVINPKN------GYVVNWNNK 512
Consenso --------------------------------P----P-I--P----------YV-NSND

183
 Discusión 

. . . .
SlPVA SAWLTNADRPLTGYER--VFGTTATQRSIRTRGAIEDVAAMAERGR------LRVTDLER 566
AuAAC SHWLASPAAPLEGFPR--ILGNERTPRSLRTRLGLDQIQQRLAGTDGLPGKGFTTARLWQ 557
SfCHA SAWLTNAERPLTGYER--VFGTIATPRSMRTRGAIEDVASMADRGR------LRVGDLQR 564
AuAAC1 SHWLASPAAPLEGFPR--ILGNERTPRSLRTRLGLDQIQQRLAGTDGLPGKGFTTARLWQ 556
DrAAC SAWLANPAAPQTGLDP--LVGEVNAPQSPRTRMGLLEIGRRLSGTDGLPGRTFDIPTLQA 556
RxAHLA SSWLTNPAQKLTGFSP--VMGSVDVPQRLRTRIGLIEIGRRLAGTDGLPGNRIDLPNLQA 565
SpG7ACA PPWTSTFPPELDAADY--PPSLAAPDLSFAPSLLRTQRSIKLLKNNS----SLTFEQFKQ 487
PCA PPWTP--TWPVTYTPK--DFPSYLAPQTPHSLRAQQSVRLMSENDD------LTLERFMA 493
AfPGA PAPDKTNTDTYYWTYG--DRMNELVSQYQQKDLFSVQEIWEFNQKASYSDVNWRYFRPHL 566
EcPGA PQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDRLLEQKPRLTADQAWDVIRQTSRQDLNLRLFLPTL 592
BmPGA PSKEWVNGEYSFYWGEDNRVQQYINGMEARGKVTLEDINEINYTASFAQLRANLFKQLLI 572
Consenso --W-----------------------Q--R-------V----------------------

. . . . . ... ...
SlPVA QQLANRAPTGDLVAADVAKWCAALPG--GTAVGSSGTPVDVSAACPVLRRWDRSVDSDSR 624
AuAAC VMFGNRMHGAELVRDDLVALCRRQP----TATASNGAIVDLTAACTALSRFDERADLDSR 613
SfCHA QQFANRAPAGDLAASEAAKWCAALPG--GTAVGSDGTPVDVSAACRVLRRWDRTVDSDSR 622
AuAAC1 VMFGNRMHGAELVRDDLVALCRRQP----TATASNGAIVDLTAACTALSRFDERADLDSR 612
DrAAC TLLRESNLTGEMYAADAAKLCQSAG----------G--AELQPACNALAAWDRRSSQESR 604
RxAHLA MIFSNANLAGQLVLGDLLAACKATP----------APDADVRDGCAALGQWNRTSNADAR 615
SpG7ACA KVFDSQMELGDRIVPLLVSAAKVLAN------------PIGIEAAEVLQAWDKQANPDSR 535
PCA LQLSHRAVMADRTLPDLIPAALIDP------------DPEVQAAARLLAAWDREFTSDSR 541
AfPGA EKLAQQLPADDSSKAALTMLLAWDGM--EQDQGGQNAGPARVLFKTWLEEMYKQVLMPVV 624
EcPGA QAATSGLTQSDPRRQLVETLTRWDGINLLNDDGKTWQQPPSAILNVWLTSMLKRTVVAAV 652
BmPGA DVLDKNKSTNGNYIYLIEKLEEWNN------------LKEDENKDGYYDAGIAAFFDEWW 620
Consenso ----N-----D-----L----------------------D-------L--WDR----DSR

. .. : . .. .. . .
SlPVA GALLFDRFWRKAAAV-----PAAELWKVPFDAADPVRTPRGLN----TAAPGVGKALADT 675
AuAAC GAHLFTEFALAGG----------IRFADTFEVTDPVRTPRRLN----TTDPRVRTALADA 659
SfCHA GALLFDRFWRKASSA-----PAAELWRTPFDPADPVRTPRGLN----TAAPVLGRALADA 673
AuAAC1 GAHLFTEFALAGG----------IRFADTFEVTDPVRTPRRLN----TTDPRVRTALADA 658
DrAAC GAALWREFWRRAR-------AIPNVYAVPFDPADPVNTPRGLNTADPAAQTALLGALREA 657
RxAHLA AAHLFREFWMRAK-------DIAQVHAVEFDPADPVHTPRGLRMNDATVRTAVFKALKEA 668
SpG7ACA GAVLFMLWALTIG--------ADKVLGGQWNPADPLNTPSGMADIN-----KFMAVLEGV 582
PCA AALLFEEWARLFAGQN---FAGQAGFATPWSLDKPVSTPYGVRD-----PKAAVDQLRTA 593
AfPGA PESHRAMYSQTGFATQQGPNPGSINLSMGTKVLLRALVLEAHPDPKRVNVFGERSSQEIM 684
EcPGA PMPFDKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEAVQGDKSPIPQAVDLFAGKPQQEVV 712
BmPGA NNLHDKLFMDELGDFYG------ITKEITDHRYGASLAYKILNKESTNYKWVNVDQEKII 674
Consenso -A-LF--F---------------------F----PV-TP-G---------------L---

. . * . . * .
SlPVA VTELKAAGIALNAPLGEHQFVVRNGKRIPVGGGTESLGIWNKIEPVWNPAAGGYTEVSAG 735
AuAAC VQRL--AGIPLDAKLGDIHTDSRGERRIPIHGGRGEAGTFNVITNPLVPGVG-YPQVVHG 716
SfCHA VAELRAAGIALDAPLGEHQFVVRNGKRLPIGGGTESLGIWNKTEPQWNAAGGGYTEVSSG 733
AuAAC1 CNGS--PASPSTRSVGDIHTDSRGERRIPIHGGRGEAGTFNVITNPLVPGVG-YPQVVHG 715
DrAAC AAALTAAGIPFDAPLGEVQGVVRGGDFISLPGGAEFEGVLDKIDFNPLAPGGYRGVVGNA 717
RxAHLA VGAVRKAGFALDAPLGTVQAAHAPDGSIALHGGEEYEGVLNKLQTLPIGPKGLPVYFG-- 726
SpG7ACA AAQVKFLYDDLAISWGEVVQMQVGNFTAPANGAPSNLGSFRVLALSTIANQRFQAVAGDS 642
PCA IANTKRKYGAIDRPFGDASRMILNDVNVPGAAGYGNLGSFRVFTWSDPDENGVRTPVHGE 653
AfPGA HTALQNAQARLSQEQGAQMARWTMPTSVHRFSDKNFTGTPQTMPGNTFAFTGYQNRGTEN 744
EcPGA LAALEDTWETLSKRYGNNVSNWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAEETRHQAEYQNRGTEN 772
BmPGA MESTNEVLAKLQSEKGLKAEKWRMPIKTMTFGEKSLIGIP--HGYGSMTPIIEMNRGSEN 732
Consenso ---L------L----G-----------I---G-----G-------------G--------

. .. : . .... ** ... . . . :
SlPVA SSYIQAVGWDN----SRCPVARTLLTYSQSSNPNSPHYSDQTRLFSGERWVTSRFCEKDI 791
AuAAC TSFVMAVELG-----PHGPSGRQILTYAQSTNPNSPWYADQTVLYSRKGWDTIKYTEAQI 771
SfCHA SSYIQAVGWDD----SRCPVARTLLTYSQSENPKSPHYSDQTRLYAGERWVTSRFCERDI 789
AuAAC1 TSFVMAVELG-----PHGPSGRQILTYAQSTNPNSPWYADQTVLYSRKGWDTIKYTEAQI 772
DrAAC SSYIQTVGFT-----DSGVQAEAVLTYSQSSNPESPYFSDQTRLFSRSEWVKLPFTQPEI 770
RxAHLA TSYIQTVTFD-----DQGPVADAILTYGESTDHASPHAFDQMRAYSGKHWNRLPFSEAAI 781
SpG7ACA YLSLVEFADR--------PRGQSILVYGNASQPDSPHNGDQLELYSKNQLRPVWRSPREI 694
PCA TWVAMIEFST-------PVRAYGLMSYGNSRQPGTTHYSDQIERVSRADFRELLLRREQV 706
AfPGA NRVVFDAKGVE----FCDAMPPGQSGFTDRNGVRSPHYEDQLKLYENFECKTMDVTHADI 800
EcPGA DMIVFSPTTSDRPVLAWDVVAPGQSGFIAPDGTVDKHYEDQLKMYENFGRKSLWLTKQDV 832
BmPGA HYIEMTPTGPS----GFNITPPGQIGFVKKDGTISDHYDDQLVMFAEWKFKPYLFNKKDI 788
Consenso ---I-------------------LL-Y—-S----SPHY-DQ--LFS---W--L---E--I

184
Discusión 

SlPVA1 ARSPQLKVVRVHERR- 806

AuAAC AADPNLRVYRVAQRGR 787
SfCHA ARSPDLRVVRVHERR- 804
AuAAC1 AADPNLRVYRVAQRGR 786
DrAAC EADPTRTVVQLSE--- 785
RxAHLA AADPALKVMRLSQ--- 794
SpG7ACA KAHLEKEEIL------ 704
PCA EAAVQERTPFNFKP-- 720
AfPGA RRNAQSSTMLLIQPQP 816
EcPGA EAHKESQEVLHVQR-- 846
BmPGA NKAAKNVSALNMSK-- 802
Consenso ----------------
 
Figura 81.Alineamiento múltiple de la secuencia de la penicilina V acilasa de S. lavendulae ATCC 13664 y de la 
aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL  12052 con  las  β‐lactam  acilasas  y  las  equinocandina  acilasas.  En  la 
parte inferior se indica la secuencia de aminoácidos consenso; (*) y en color rojo los aminoácidos conservados 
en todas las enzimas; (:) y en color azul los aminoácidos con cambios conservativos en todas las enzimas; (∙) y 
en  color  verde  los  aminoácidos  con  cambios  conservativos  en  al  menos  un  65%  de  las  enzimas.  En  negrita 
aparecen  las  secuencias  de  los  péptidos  señal.  En  minúscula  y  cursiva  las  secuencias  de  los  péptidos 
espaciadores. La flecha roja indica el inicio de la subunidad α. La flecha negra indica el inicio de la subunidad β. 
SlPVA  penicilina  V  acilasa  de  S.  lavendulae  ATCC  13664;  AuAAC,  Aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRLL 
12052 secuenciada en este trabajo; SfCHA, Ciclolipopéptido acilasa de Streptomyces sp. FERM BP‐5809 (Shibata y 
col.,  2000);  AuAAC1  Aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRLL  12052  (Inokoshi  y  col.,  1992);  DrAAC, 
Aculeacina  A  acilasa  de  Deinococcus  radiodurans  R1  (White  y  col.,  1999);  RxAHLA,  acil‐homoserina  lactona 
acilasa  de  Ralstonia  sp.  XJ12B  (Lin  y  col.,  2003);  SpG7ACA,  glutaril  7‐ACA  acilasa  de  B.  diminuta  (P.  diminuta) 
código  de  acceso  NCBI  AAF64242;  PCA,  cefalosporina  acilasa  de  Pseudomonas  sp130  (Li  y  col.,  1999);  AfPGA, 
penicilina G acilasa de A. faecalis, (Verhaert y col., 1997); EcPGA, penicilina G acilasa de E. coli (Oh y col., 1987); 
BmPGA, Penicilina G acilasa de B. megaterium (Martín y col., 1995). 
 

Como  se  puede  observar  en  la  Figura  81  todas  las  acilasas  presentan  un  patrón 
estructural  común  presentan  un  tamaño  parecido,  originándose  todas  a  partir  de  una 
única  secuencia  de  aproximadamente  800  aminoácidos,  que  tras  el  procesamiento 
postraduccional van a dar lugar a enzimas heterodiméricas que presentan una subunidad 
pequeña, α, de alrededor de 200 aminoácidos y una subunidad grande, β de alrededor de 
750 aminoácidos. 

La  SlPVA  y  la  AuAAC,  al  igual  que  el  resto  de  las  acilasas  son  enzimas 
extracelulares  por  lo  que  todas  poseen  un  péptido  señal  que  les  permite  la  migración  al 
espacio extracelular. Destaca la elevada heterogeneidad de los péptidos señal de todas las 
enzimas, con gran variedad en sus tamaños y secuencias, posiblemente debido a que los 
péptidos señal son característicos de cada especie. En este aspecto es interesante indicar la 
gran  identidad  observada  entre  el  péptido  señal  de  SlPVA  y  el  de  la  ciclolipopéptido 
acilasa de Streptomyces sp FERM 5809, enzimas que comparten una similitud del 92%. 

Entre  las  dos  subunidades  de  la  mayor  parte  de  las  acilasas  descritas  aparece  un 
pequeño péptido espaciador que es eliminado durante procesamiento postraduccional en 
el  espacio  extracelular  dando  lugar  a  las  enzimas  maduras  (Sudhakaran  y  col.,  1992; 
García y col., 1995). Al comparar la secuencia de SlPVA con la ciclolipopéptido acilasa se 
intuye  la  presencia  de  un  posible  péptido  separador  de  16  aminoácidos  entre  las 

185
 Discusión 

posiciones Ala226 y Gly241 (o Alaα188‐Glyα202). En el caso de AuAAC, Inokoshi y col. (1992) 
proponen  la  existencia  de  un  péptido  espaciador  entre  los  residuos  Ala215  y  Gly229  (o 
Alaα180‐Glyα196) aunque no aportan datos experimentales y basan la existencia del péptido 
espaciador en el análisis del tamaño de las subunidades, con el consiguiente error. 

En  la  comparación  de  las  secuencias  de  las  subunidades  α  de  SlPVA  y  AuAAC 
maduras  con  el  resto  de  acilasas  destacan  los  motivos  G(I/V)PHI,  GYxAQDxL, 
MRGFxxGxNxYL  y  PVTxxDV  conservados  en  todas  las  enzimas.  Estos  motivos 
estructurales no parecen tener ninguna relevancia desde el punto de vista funcional de las 
acilasas, pero son indicadores de que estas enzimas poseen un origen común.  

En  la  comparación  de  las  secuencias  de  las  subunidades  β  de  las  acilasas  se 
observa la presencia de numerosos motivos estructurales muy conservados, entre los que 
destacan  los  motivos  SN  (serβ1‐Asnβ2),  NPHYxW  (Asnβ21‐Trpβ26)  y  NSND  (Asnβ270‐
Aspβ273 en el caso de SlPVA y Asnβ266‐Aspβ269 en el caso de AuAAC). El aminoácido Serβ1 
totalmente conservado está descrito como el residuo catalítico en gran parte de las acilasas 
(Duggleby  y  col.,  1995;  Lee  y  col.,  2000;  Kim  y  col.,  2002;  Lin  y  col.,  2003).  En  el  caso  de 
SlPVA  se  han  realizado  estudios  previos  de  modificación  química  con  fluoruro  de 
bencilsulfonilo, modificador químico de α‐aminoácidos, que han puesto de manifiesto la 
presencia  de  un  grupo  α‐amino  en  el  extremo  N‐terminal  de  la  enzima,  lo  que  puede 
indicar que la Serβ1 es la responsable de la actividad (Torres‐Guzmán y col., 2001a; Torres‐
Guzmán, 2004).  

Otros residuos conservados en todas las acilasas son la Hisβ23 y la Asnβ272 (Aspβ268 
en  el  caso  de  AuAAC),  que  al  igual  que  la  Serβ1  poseen  una  importante  función  en  el 
mecanismo catalítico de este tipo de enzimas, de forma que la Asnβ272 estabiliza la Serβ1 
durante el proceso de catálisis, mientras que la Hisβ23 aumenta su carácter nucleófilo. Otro 
residuo descrito en la mecanismo catalítico de las penicilinas G acilasas en la Alaβ69, que 
en  el  caso  de  SlPVA  y  de  AuAAC  se  trata  de  una  valina  (Valβ70  en  ambas  enzimas), 
aminoácido  también  presente  en  el  resto  de  equinocandina  acilasas  y  glutaril‐7‐ACA 
acilasas (Duggleby y col., 1995; McVey y col., 2001; Fritz‐Wolf y col., 2002; Guncheva y col., 
2004).  Estudios  recientes  confieren  a  la  Hisβ23  junto  con  la  Serβ1  y  la  Glyβ‐1,  residuo  este 
último  también  muy  conservado,  un  papel  importante  en  el  procesamiento 
postraduccional que da lugar a la liberación del péptido espaciador de las acilasas (Kim y 
col., 2003; Mao y col., 2004).  

A  partir  de  las  secuencias  de  aminoácidos  de  las  acilasas  comparadas  se  ha 
realizado  un  árbol  filogenético  utilizando  el  programa  clustalW  mediante  el  método 
Neighbour  Joining  (http://www‐igbmc.u‐strasbg.fr/BioInfo/ClustalW/tree)  con  el  fin  de 
establecer  las  relaciones  evolutivas  entre  la  penicilina  V  acilasa  de  S.  lavendulae  ATCC 

186
Discusión 

13664  y  la  aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL  12052  con  el  resto  de  enzimas 
acilasas.  Se  observa  una  gran  proximidad  evolutiva  entre  SlPVA  y  la  ciclolipopéptido 
acilasa,  mientras  que  con  la  AuAAC  aumenta  ligeramente  la  distancia.  De  todas  formas 
entre estas tres enzimas existe una mayor proximidad que con el resto de acilasas. Así, la 
distancia  evolutiva  aumenta  con  las  cefalosporina  acilasas  y  las  glutaril  7‐ACA  acilasas, 
aumentando todavía más con las PGAs. 

El  análisis  con  el  programa  clustalW  permite  dividir  el  grupo  de  las  penicilina 
amidasas en dos subgrupos según su proximidad evolutivo. Uno estaría integrado por las 
penicilina G acilasas y el otro por las glutaril‐7‐ACA acilasas y las equinocandina acilasas. 
A  este  último  grupo  pertenecen  la  penicilina  V  acilasa  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  y  la 
aculeacina A acilasa de A. utahensis NRRL 12052, que como se postula en este trabajo se 
podría modificar su denominación pasando a llamarse penicilina K acilasa. 

3.1 Modelos  estructurales  propuestos  para  las  subunidades  β  de  las  acilasas 

expresadas en S. lividans 

Se  ha  realizado  el  modelo  de  la  estructura  terciaria  de  las  subunidad  β  de  la 
penicilina V acilasa de S. lavendulae ATCC 13664 producida por S. lividans CECT 3376 y de 
la aculeacina A acilasa de A. utahensis NRRL 12052 producida por S. lividans CECT 3377 a 
partir  de  su  secuencia  de  aminoácidos  (apartado  26.5  de  Materiales  y  Métodos).  Para  la 
modelización  de  la  estructura  terciaria  de  ambas  subunidades  se  ha  utilizado  como 
modelo la subunidad β de la enzima glutaril 7‐ACA acilasa (código pdb 1gk1) con la que 
presentan una identidad del  27,9% y 26,1% respectivamente. Los modelos propuestos se 
pueden ver en la Figura 83. 

Si  se  comparan  las  estructuras  de  SlPVA  y  AuAAC  con  la  de  la  glutaril  7‐ACA 
acilasa, se observa que se mantiene un patrón estructural común, en el que se aprecia la 
estructura en αββα típica de las Ntn‐hidrolasas y en las que el centro activo aparece en el 
núcleo de la proteína, formado por 2 grupos de láminas β que se encuentran flanqueados 
por hélices α (Oinonen y Rouvinen, 2000). En ambas enzimas se observar una concavidad 
en  cuyo  centro  queda  la  Serβ1,  que  es  el  residuo  catalítico,  al  igual  que  se  aprecia  en  la 
glutaril 7‐ACA acilasa. 

187
 Discusión 

 
A
  B
 

  C
 

 
 
 
Figura  83.  A,  Modelo  estructural  de  la  subunidad  β  de  la  penicilina  V  acilasa  de  S.  lavendulae 
ATCC 13664 producida por  S. lividans CECT 3376; B, Modelo estructural de la subunidad β de la 
aculeacina  A  acilasa  de  A.  utahensis  NRRL  12052  producida  por    S.  lividans  CECT  3377;  C, 
Estructura terciaria de la subunidad β de la glutaril 7‐ACA acilasa (código pdb 1gk1). Los modelos 
indican  los  diferentes  componentes  de  estructura  secundaria.  En  azul‐verdoso  se  representan  las 
láminas β, y en rojo las hélices α. En verde se indica en ambos modelos la posición de la Serβ1. 
 

188
 

CONCLUSIONES

189
Conclusiones 

1. Se  ha  clonado  y  secuenciado  el  gen  pva  que  codifica  la  penicilina  V  acilasa  de  S. 
lavendulae  ATCC  13664  (SlPVA),  que  presenta  una  región  codificante  o  marco  de 
lectura abierto (ORF) de 2.420 pb. 
 
2. En  gen  pva  codifica  una  única  secuencia  aminoacídica  de  806  residuos  que 
constituye la SlPVA inmadura. La pre‐PVA va a sufrir un proceso de maduración 
que va a dar lugar a la penicilina V acilasa madura, la cual es un heterodímero de 
81 kDa constituido por una subunidad pequeña, α de 21,4 kDa y una subunidad 
grande, β de 59 kDa. 
 
3. Se  ha  clonado  y  expresado  el  gen  pva  de  S.  lavendulae  ATCC  13664  en  S.  lividans 
1326, dando lugar a dos clones productores de SlPVA: S. lividans CECT 3365 y S. 
lividans CECT 3376, el segundo de ellos hiperproductor. 
 
4. Se  han  determinado  las  condiciones  óptimas  de  producción  de  SlPVA  por  el 
microorganismo recombinante S. lividans CECT 3376 en medio TSB inoculado con 
2 x106 esporas/ml de medio de cultivo e incubado durante 96 horas a 30 ºC. 
 
5. Se ha diseñado un protocolo sencillo para purificar la enzima SlPVA recombinante 
que  permite  obtener  la  enzima  pura  en  un  solo  paso  cromatográfico  mediante 
cromatografía de intercambio iónico en S‐Sepharose. 
 
6. La  enzima  SlPVA  producida  por  el  microorganismo  recombinante  S.  lividans 
CECT  3376  conserva  las  mismas  características  funcionales  y  estructurales  de  la 
enzima parental. 
 
7. Los  caldos  de  fermentación  de  A.  utahensis  NRRL  12052  presentan  actividad 
penicilina V acilasa. 
 
8. Se  ha  clonado  y  expresado  el  gen  aac  que  codifica  la  aculeacina  A  acilasa  de  A. 
utahensis  NRRL  12052  (AuAAC)  en  S.  lividans  1326,  obteniéndose  el 
microorganismo  recombinante  S.  lividans  CECT  3377  productor  de  AuAAC, 
mejorando considerablemente los niveles de producción descritos previamente. 
 
9. En  gen  aac  codifica  una  única  secuencia  aminoacídica  de  787  residuos  que 
constituye  la  AuAAC  inmadura.  La  pre‐AAC  va  a  sufrir  un  proceso  de 
maduración  que  va  a  dar  lugar  a  la  aculeacina  A  acilasa  madura,  que  es  un 
heterodímero  de  75  kDa  constituido  por  una  subunidad  pequeña,  α  de  19  kDa  y 
una subunidad grande, β de 55 kDa. 
 

191
 Conclusiones 

10. Se  han  determinado  las  condiciones  óptimas  de  producción  de  AuAAC  por  el 
microorganismo recombinante S. lividans CECT 3377 en medio TSB inoculado con 
2 x106 esporas/ml de medio de cultivo e incubado durante 96 horas a 30 ºC. 
 
11. Se ha diseñado un método sencillo de purificación para la AuAAC producida por 
S.  lividans  CECT  3377  que  permite  obtener  la  enzima  pura  en  dos  pasos 
cromatográficos,  que  consisten  en  una  cromatografía  de  intercambio  iónico  S‐
Sepharose seguida de una cromatografía de penetrabilidad en Superose 12. 
 
12. La  enzima  AuAAC  producida  por  S.  lividans  CECT  3377  presenta  actividad 
hidrolítica  frente  a  las  penicilinas  naturales  (V,  K,  F  y  dihidroF).  Se  han 
determinado las condiciones óptimas para su hidrólisis (pH 8 y 45 ºC) así como los 
parámetros cinéticos, cuyos valores son muy similares a los de SlPVA. 
 
13. La penicilina V acilasa de S. lavendulae ATCC 13664 y la aculeacina A acilasa de A. 
utahensis NRRL 12052 pertenecen al grupo de las enzimas penicilina amidasas y a 
la superfamilia de las Ntn‐hidrolasas. 
 
14. Se  propone  una  nueva  denominación  para  ambas  enzimas,  que  pasan  a 
denominarse penicilina K acilasas. 

 
 

192
 

ANEXO 1
 

193
Anexo 1 

Secuencia de nucleótidos del gen pva y de aminoácidos deducida para la 

penicilina V acilasa de S. lavendulae ATCC 13664. 

CCGCGGTGGAGACCGCCGCGTCCAGGGCGCCGTAGGTCCAGGCCCGGTCGGCGTACCGCACGGCGGTCCGTTCCG 75
GGGTGCGGCGGGCGCTGCGGGTGAGGACGCCGTCGACTGTGCTGCATGCGTACCCGGTCATGACGTGATCCTGTG 150
CGGCCGGGTCCCGGCGGGTCAAGGGGCCGTGAGGAGTGTCGGAGGGCACTGAGGCGGCTGGATACCGACCAGACG 225
GTTGACAGATCCGGGAGCGCCCTGGCTGAGTGGCGGCGTGCTGCCCGGCGGGTTCGGGCAACCTCCTTGGCCACC 300
L T F R N R L R L F A V S 13
CGCCTTGTTGGGAGGAACACCC TTG ACC TTC CGT AAC CGC CTC AGA CTG TTC GCG GTC TCC 361
14 G L A L F T V S A S L P P A A A S G A 32
GGT CTC GCC CTG TTC ACC GTG TCG GCG TCG CTG CCA CCC GCC GCA GCC TCC GGA GCG 418
α
33 P E A R H P S G G G L S A T V R Y T E 51
CCG GAG GCC CGG CAT CCG TCG GGC GGC GGC CTC TCG GCC ACC GTC CGG TAC ACG GAG 475
52 Y G I P H I V A K D Y A N L G F G T G 70
TAC GGC ATT CCG CAC ATC GTG GCG AAG GAC TAC GCG AAC CTG GGC TTC GGC ACC GGC 532
71 W A Q A A D Q V C T L A D G F V T V R 89
TGG GCA CAG GCC GCC GAC CAG GTG TGC ACG CTG GCC GAC GGG TTC GTC ACG GTA CGC 589
90 G E R S K F F G P D A A P D F S L S S 108
GGC GAG CGG TCG AAG TTC TTC GGC CCG GAC GCG GCC CCG GAC TTC TCC CTC TCC TCG 646
109 A A K N L S S D L Y F R G V R D S G T 129
GCG GCG AAG AAC CTC TCC AGC GAT CTG TAC TTC CGG GGC GTC CGG GAC AGC GGC ACC 673
130 V E K L L K V P A P A G P S R D A K E 146
GTG GAG AAG CTG CTG AAG GTC CCG GCT CCG GCG GGT CCG AGC CGG GAC GCC AAG GAG 760
147 S M R G F A A G Y N A W L R Q N R D R 165
TCG ATG CGC GGA TTC GCC GCC GGG TAC AAC GCC TGG CTC CGG CAG AAC CGC GAC CGC 817
166 I T D P A C R G A S W V R P V T A L D 184
ATC ACC GAC CCC GCC TGC CGG GGC GCC TCC TGG GTG CGC CCG GTC ACC GCG CTG GAC 874
185 V A V R G F A L A V L G G Q G R G I D 203
GTG GCG GTA CGG GGC TTC GCC CTG GCC GTG CTC GGC GGC CAG GGG CGC GGC ATC GAC 931
204 G I T A A Q P P T A A P P A A G V T P 222
GGC ATC ACC GCC GCC CAG CCC CCG ACG GCC GCA CCG CCC GCC GCC GGG GTC ACC CCG 988
223 K E A A A A A Q R L L S T Q N A D M G 241
AAG GAG GCG GCA GCG GCG GCC CAG CGG CTT CTG TCC ACG CAG AAC GCC GAC ATG GGC 1045
β
242 S N A V A F R G S T T A N G R G L L L 260
TCC AAC GCG GTC GCC TTC CGG GGG TCC ACC ACG GCG AAC GGG CGC GGG CTG CTC CTC 1102
261 G N P H Y P W D G G R R F W Q S Q Q T 279
GGC AAC CCG CAC TAT CCG TGG GAC GGC GGC CGC CGC TTC TGG CAG TCG CAG CAG ACG 1159
280 I P G E L N V A G G S L L G S T T V S 298
ATC CCG GGC GAG CTG AAC GTG GCG GGC GGA TCC CTG CTC GGC TCG ACG ACC GTC TCG 1216
299 I G H N A D V A W S H T V A T G V T L 317
ATC GGG CAC AAC GCG GAC GTG GCC TGG AGC CAC ACG GTG GCG ACC GGC GTC ACG CTG 1273
318 N L H Q L T L D P A D P T V Y L V D G 336
AAC CTG CAC CAG CTG ACC CTG GAT CCG GCC GAT CCC ACG GTC TAT CTG GTG GAC GGG 1330

195
 Anexo 1 

337 K P Q R M T Q R T V A V P V K G A A P 355
AAG CCG CAG CGG ATG ACG CAG CGC ACG GTC GCC GTG CCG GTG AAG GGC GCC GCC CCG 1387
356 V T R T Q W W T R Y G P V V T S L G A 374
GTG ACC CGG ACC CAG TGG TGG ACC CGG TAC GGC CCG GTG GTC ACC TCG CTG GGG GCG 1444
375 A L P L P W T A S T A Y A L N D P N A 393
GCG CTG CCG CTG CCC TGG ACG GCG AGC ACC GCG TAC GCG CTG AAC GAC CCG AAC GCG 1501
394 V N L R S A D T S L G F S K A R S T A 412
GTG AAC CTG CGC AGC GCC GAC ACC TCG CTC GGC TTC AGC AAG GCA CGC TCC ACC GCC 1558
413 G I E R A L H R S Q G L P W V N T I A 431
GGG ATC GAG CGG GCG CTC CAC CGG TCC CAG GGG CTG CCC TGG GTG AAC ACG ATC GCC 1615
432 A D R S G N S F F S Q S Q V L P R I T 450
GCC GAC CGG TCG GGG AAC TCC TTC TTC TCC CAG TCG CAG GTT CTG CCG AGG ATC ACG 1672
451 D E L A A R C S T P L G Q A T Y P S A 469
GAC GAG CTG GCG GCA CGC TGC TCG ACC CCG CTG GGC CAG GCC ACC TAC CCG TCG GCC 1729
470 G L A V L D G S T S A C A L G S D R D 488
GGG CTC GCG GTG CTG GAC GGA TCG ACG TCG GCC TGC GCG CTG GGG AGC GAC CGG GAC 1786
489 A V Q P G I F G P G R M P T L K N A P 507
GCG GTA CAG CCG GGG ATC TTC GGG CCG GGC CGG ATG CCG ACG CTG AAG AAC GCC CCG 1843
509 Y V E N S N D S A W L T N A D R P L T 526
TAC GTC GAG AAC TCC AAC GAC AGC GCC TGG CTG ACC AAC GCC GAC CGC CCG CTG ACC 1900
527 G Y E R V F G T T A T Q R S I R T R G 545
GGT TAC GAG CGG GTC TTC GGC ACG ACC GCC ACC CAG CGG TCG ATC CGG ACC CGG GGC 1957
546 A I E D V A A M A E R G R L R V T D L 564
GCG ATC GAG GAT GTC GCG GCG ATG GCG GAG CGC GGG CGG CTG CGT GTG ACG GAC CTG 2014
565 E R Q Q L A N R A P T G D L V A A D V 583
GAG CGC CAG CAG CTC GCC AAC CGG GCG CCG ACC GGG GAT CTG GTC GCG GCC GAC GTG 2071
584 A K W C A A L P G G T A V G S S G T P 602
GCG AAG TGG TGC GCC GCC CTG CCC GGC GGG ACC GCC GTG GGC AGC AGC GGT ACG CCG 2128
603 V D V S A A C P V L R R W D R S V D S 621
GTC GAC GTG TCG GCG GCC TGC CCG GTG CTG CGG CGG TGG GAC CGG AGC GTG GAC AGC 2185
622 D S R G A L L F D R F W R K A A A V P 640
GAC AGC CGG GGC GCG CTG CTC TTC GAC CGG TTC TGG CGC AAG GCG GCG GCG GTG CCC 2242
641 A A E L W K V P F D A A D P V R T P R 659
GCG GCC GAG CTG TGG AAG GTA CCG TTC GAC GCG GCC GAT CCG GTA CGG ACC CCG CGC 2299
660 G L N T A A P G V G K A L A D T V T E 678
GGC CTC AAC ACC GCC GCA CCC GGC GTG GGG AAG GCG CTG GCC GAC ACG GTG ACG GAG 2356
679 L K A A G I A L N A P L G E H Q F V V 697
CTG AAG GCG GCG GGC ATC GCG CTC AAC GCG CCT TTG GGT GAG CAC CAG TTC GTC GTA 2413
698 R N G K R I P V G G G T E S L G I W N 716
CGG AAC GGG AAG CGC ATC CCG GTC GGC GGC GGC ACG GAG TCG CTC GGC ATC TGG AAC 2470
717 K I E P V W N P A A G G Y T E V S A G 735
AAG ATC GAG CCG GTG TGG AAC CCG GCG GCG GGC GGC TAC ACC GAG GTG TCG GCC GGG 2527
736 S S Y I Q A V G W D N S C P V A R T L 754
TCC AGC TAC ATC CAG GCG GTC GGC TGG GAC AAC AGC CGG TGC CCG GTG GCC CGG ACG 2584
755 L T Y S Q S S R N P N S P H Y S D Q T 773
CTG CTC ACG TAC TCC CAG TCC TCG AAC CCG AAC TCG CCG CAC TAC AGC GAC CAG ACG 2641
774 R L F S G E R W V T R F C E K D I A R 792
CGG CTG TTC TCG GGT GAG CGC TGG GTG ACG TCC CGG TTC TGC GAG AAG GAC ATC GCC 2698
793 S P Q L K V V R S V H E R R * 806
CGC TCG CCG CAG CTG AAG GTG GTG CGG GTG CAC GAG CGG CGG TAG GGGGTGCAGGACGTG 2758
GTGAGCCGGGTCCGCGAGGGGGTGTCGCTCGCGGACCCGGCGTTCTACAGGGGCCGTTGGTGCCCCTCCCAGTAG 2833
GGTTCCCTCAGCCGCCGTTTGTACAGCTTGCCGTTGGGGTCGCGGGGCATCGCGGCGATGAAGTCGAGGGAGCGG 2908

196
Anexo 1 

GGGCGTTTGTAGCCGGCGAGCCGCTCCTCGCAGTGGGCGAGGATCTCGGCGGCGAGCGCGCCCCCGGGCTCGTAC 2983
CCCTCGGCCGGCTCGACGACCGCTTTGACCTCCTCGCCCCGGTCGGCGTGCGGGATGCCGAAGGCGGCGGCGTCC 3058
GCGACGGCGGGGTGGGTGAGCAGGGCGGACTCGATCTCGGCGGGGTAGATGTTCACGCCACCCGCGATGATCATG 3133
TCGATCTTGCGGTCGCGGAGGAAGAGAGAGCCGTCGGCGTCCAGCACACCGAGGTCTGCCGACGGTGAAGAAGTC 3208
TGCCGATCCGA 3219

En la secuencia de nucleótidos: 
- En amarillo: secuencias promotoras ‐35 y ‐10.  
- Subrayado en rojo: secuencia RBS. 
- En azul: codón de iniciación de la traducción (TTG). 
- En verde: codón de finalización de la traducción (TAG). 
- Flechas horizontales región palindrómica terminadora de la transcripción. 
En la secuencia de aminoácidos: 
- En rojo: péptido señal. 
- α: comienzo de la subunidad α. 
- β: comienzo de la subunidad β. 

197
 

 
 

ANEXO 2
 

199
Anexo 2 

Secuencia de nucleótidos del gen aac y de aminoácidos deducida para la 

aculeacina A acilasa de A. utahensis NRRL 12052. 

 
M T S S Y M R L K A A A I A F 15
TCTAGAGGGTATTAATA ATG ACG TCC TCG TAC ATG CGC CTG AAA GCA GCA GCG ATC GCC TTC 62
XbaI
16 G V I V A T A A V P S P A S G R E H D 34
GGT GTG ATC GTG GCG ACC GCA GCC GTG CCG TCA CCC GCT TCC GGC AGG GAA CAT GAC 119
α
35 G G Y A A L I R R A S Y G V P H I T A 53
GGC GGC TAT GCG GCC CTG ATC CGC CGG GCC TCG TAC GGC GTC CCG CAC ATC ACC GCC 176
54 D D F G S L G F G V G Y V Q A E D N I 72
GAC GAC TTC GGG AGC CTC GGT TTC GGC GTC GGG TAC GTG CAG GCC GAG GAC AAC ATC 233
73 C V I A E S V V T A N G E R S R W F G 91
TGC GTC ATC GCC GAG AGC GTG GTG ACG GCC AAC GGT GAG CGG TCG CGG TGG TTC GGT 290
92 A T G P D D A D V R S D L F H R K A I 110
GCG ACC GGG CCG GAC GAC GCC GAT GTG CGC AGC GAC CTC TTC CAC CGC AAG GCG ATC 347
111 D D R V A E R L L E G P R D G V R A P 129
GAC GAC CGC GTC GCC GAG CGG CTC CTC GAA GGG CCC CGC GAC GGC GTG CGG GCG CCG 404
130 S D D V R D Q M R G F V A G Y N H F L 148
TCG GAC GAC GTC CGG GAC CAG ATG CGC GGC TTC GTC GCC GGC TAC AAC CAC TTC CTA 461
149 R R T G V H R L T D P A C R G K A W V 167
CGC CGC ACC GGC GTG CAC CGC CTG ACC GAC CCG GCG TGC CGC GGC AAG GCC TGG GTG 518
168 R P L S E I D L W R T S W D S M V R A 186
CGC CCG CTC TCC GAG ATC GAT CTC TGG CGT ACG TCG TGG GAC AGC ATG GTC CGG GCC 575
187 G S G A L L D G I V A A T P P T A A G 205
GGT TCC GGG GCG CTG CTC GAC GGC ATC GTC GCC GCG ACG CCA CCG ACA GCC GCC GGG 632
206 P A S A P E A P D A A A I A A A L D G 224
CCC GCG TCA GCC CCG GAG GCA CCC GAC GCC GCC GCG ATC GCC GCC GCC CTC GAC GGG 689
β
225 T S A G I G S N A Y G L G A Q A T V N 243
ACG AGC GCG GGC ATC GGC AGC AAC GCG TAC GGC CTC GGC GCG CAG GCC ACC GTG AAC 746
244 G S G M V L A N P H F P W Q G A E R F 262
GGC AGC GGG ATG GTG CTG GCC AAC CCG CAC TTC CCG TGG CAG GGC GCC GAA CGC TTC 803
263 Y R M H L K V P G R Y D V E G A A L I 281
TAC CGG ATG CAC CTC AAG GTG CCC GGC CGC TAC GAC GTC GAG GGC GCG GCG CTG ATC 860
282 G D P I I E I G H N R T V A W S H T V 300
GGC GAC CCG ATC ATC GAG ATC GGG CAC AAC CGC ACG GTC GCC TGG AGC CAC ACC GTC 917
301 S T A R R F V W H R L S L V P G D P T 319
TCC ACC GCC CGC CGG TTC GTG TGG CAC CGC CTG AGC CTC GTG CCC GGC GAC CCC ACC 974
320 S Y Y V D G R P E R M R A R T V T V Q 338
TCC TAT TAC GTC GAC GGC CGG CCC GAG CGG ATG CGC GCC CGC ACG GTC ACG GTC CAG 1031
339 T G S G P V S R T F H D T R Y G P V A 357
ACC GGC AGC GGC CCG GTC AGC CGC ACC TTC CAC GAC ACC CGC TAC GGC CCG GTG GCC 1088
356 V V P G T F D W T P A T A Y A I T D V 376
GTG GTG CCG GGC ACC TTC GAC TGG ACG CCG GCC ACC GCG TAC GCC ATC ACC GAC GTC 1145
378 N A G N N R A F D G W L R M G Q A K D 395
AAC GCG GGC AAC AAC CGC GCC TTC GAC GGG TGG CTG CGG ATG GGC CAG GCC AAG GAC 1202

201
 Anexo 2 

396 V R A L K A V L D R H Q F L P W V N V 414
GTC CGG GCG CTC AAG GCG GTC CTC GAC CGG CAC CAG TTC CTG CCC TGG GTC AAC GTG 1259
415 I A A D A R G E A L Y G D H S V V P R 433
ATC GCC GCC GAC GCG CGG GGC GAG GCC CTC TAC GGC GAT CAT TCG GTC GTC CCC CGG 1316
434 V T G A L A A A C I P A P F Q P L Y A 452
GTG ACC GGC GCG CTC GCT GCC GCC TGC ATC CCG GCG CCG TTC CAG CCG CTC TAC GCC 1373
453 S S G Q A V L D G S R S D C A L G A D 471
TCC AGC GGC CAG GCG GTC CTG GAC GGT TCC CGG TCG GAC TGC GCG CTC GGC GCC GAC 1430
472 P D A A V P G I L G P A S L P V R F R 490
CCC GAC GCC GCG GTC CCG GGC ATT CTC GGC CCG GCG AGC CTG CCG GTG CGG TTC CGC 1487
491 D D Y V T N S N D S H W L A S P A A P 509
GAC GAC TAC GTC ACC AAC TCC AAC GAC AGT CAC TGG CTG GCC AGC CCG GCC GCC CCG 1544
510 L E G F P R I L G N E R T P R S L R T 528
CTG GAA GGC TTC CCG CGG ATC CTC GGC AAC GAA CGC ACC CCG CGC AGC CTG CGC ACC 1601
529 R F G L D Q I Q Q R L A G T D G L P G 547
CGG TTC GGG CTG GAC CAG ATC CAG CAG CGC CTC GCC GGC ACG GAC GGT CTG CCC GGC 1658
548 K G F T T A R L W Q V M F G N R M H G 566
AAG GGC TTC ACC ACC GCC CGG CTC TGG CAG GTC ATG TTC GGC AAC CGG ATG CAC GGC 1715
567 A E L V R D D L V A L C R R Q P T A T 585
GCC GAA CTC GTC CGC GAC GAC CTG GTC GCG CTC TGC CGC CGC CAG CCG ACC GCG ACC 1772
586 A S N G A I V D L T A A C T A L S R F 604
GCC TCG AAC GGC GCG ATC GTC GAC CTC ACC GCG GCC TGC ACG GCG CTG TCC CGC TTC 1829
605 D E R A D L D S R G A H L F T E F A L 623
GAT GAG CGT GCC GAC CTG GAC AGC CGG GGC GCG CAC CTG TTC ACC GAG TTC GCC CTC 1886
624 A G G I R F A D T F E V T D P V R T P 642
GCG GGC GGA ATC AGG TTC GCC GAC ACC TTC GAG GTG ACC GAT CCG GTA CGC ACC CCG 1943
643 R R L N T T D P R V R T A L A D A V Q 661
CGC CGT CTG AAC ACC ACG GAT CCG CGG GTA CGG ACG GCG CTC GCC GAC GCC GTG CAA 2000
662 R L A G I P L D A K L G D I H T D S R 680
CGG CTC GCC GGC ATC CCC CTC GAC GCG AAG CTG GGA GAC ATC CAC ACC GAC AGC CGC 2057
681 G E R R I P I H G G R G E A G T F N V 699
GGC GAA CGG CGC ATC CCC ATC CAC GGT GGC CGC GGG GAA GCA GGC ACC TTC AAC GTG 2114
700 I T N P L V P G V G Y P Q V V H G T S 718
ATC ACC AAC CCG CTC GTG CCG GGC GTG GGA TAC CCG CAG GTC GTC CAC GGA ACA TCG 2171
719 F V M A V E L G P H G P S G R Q I L T 737
TTC GTG ATG GCC GTC GAA CTC GGC CCG CAC GGC CCG TCG GGA CGG CAG ATC CTC ACC 2228
738 Y A Q S T N P N S P W Y A D Q T V L Y 756
TAT GCG CAG TCG ACG AAC CCG AAC TCA CCC TGG TAC GCC GAC CAG ACC GTG CTC TAC 2285
757 S R K G W D T I K Y T E A Q I A A D P 775
TCG CGG AAG GGC TGG GAC ACC ATC AAG TAC ACC GAG GCG CAG ATC GCG GCC GAC CCG 2342
776 N L R V Y R V A Q R G R * 787
AAC CTG CGC GTC TAC CGG GTG GCA CAG CGG GGA CGC TGA GGAATTCCGG 2391
EcoRI

En la secuencia de nucleótidos: 

‐ En naranja: secuencia del RBS.  
‐ En azul:codón de iniciación de la traducción (ATG).
‐ En verde: codón de finalización de la traducción (TGA).
En la secuencia de aminoácidos: 
‐ En rojo: péptido señal 
‐ α: comienzo de la subunidad α.
‐ β: comienzo de la subunidad β.

202
 

BIBLIOGRAFÍA
 

203
 

 
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