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Microbiología Veterinaria 72 (2000) 277±284

Colonización de conejos con Staphylococcus

aureus tras infección experimental con
cepas de alta y baja virulencia
K. Hermansa*, P. De Herdta , LA Devriesea ,
C. Godardb ,F.Haesebroucka
un
Departamento de Patología, Bacteriología y Enfermedades Avícolas, Facultad de Medicina Veterinaria,
Universidad de Gante, Salisburylaan, 133 9820 Merelbeke, Bélgica
b
Instituto Pasteur, Engelandstraat, 642 1180 Bruselas, Bélgica

Recibido el 17 de junio de 1999; recibido en forma revisada el 20 de octubre de 1999; aceptado el 3 de noviembre de 1999

Resumen

Se inocularon en la nariz cuatro grupos de 12 conejos cada uno con cepas de las que se sospechaban
diferencias en la virulencia. En los dos grupos infectados con cepas de brotes severos, pertenecientes a una
combinación biotipo patógeno de conejo-tipo fago, 6±12 conejos resultaron positivos en los sucesivos muestreos
bacteriológicos durante un período de 28 días. En los otros dos grupos, infectados con cepas obtenidas de
criaderos sin antecedentes de estafilococosis, el número de animales positivos para Staphylococcus aureus se
negativizó rápidamente pero volvió a aumentar después de 1 semana a 1±5 animales positivos hasta el final
del experimento. Dos conejos de cada grupo inoculado con una cepa de alta virulencia desarrollaron lesiones
cutáneas purulentas, mientras que en los grupos inoculados con cepas de baja virulencia, todos los animales
permanecieron clínicamente sanos. Los resultados indican que la capacidad de colonización es un importante
determinante de la virulencia en la estafilococosis del conejo. # 2000 Elsevier Science BV Todos los derechos reservados.

Palabras clave: Staphylococcus aureus; Conejo; Colonización

1. Introducción

En conejos, la estafilococosis surge cuando Staphylococcus aureus infecta pequeñas

lesiones dérmicas e invade el tejido subcutáneo (Okerman et al., 1984). S. aureus clínico

*Autor correspondiente. Tel.: 32-9-2647431; fax: 32-2-2647494.

Dirección de correo electrónico: katleen.hermans@rug.ac.be (K. Hermans).

0378-1135/00/$ ± ver portada # 2000 Elsevier Science BV Todos los derechos reservados.
IPI: S 0378-1135(99)00179-0
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todas las infecciones en conejos individuales tienen una apariencia similar, con lesiones de pododermatitis,
abscesos subcutáneos y mastitis (Hagen, 1963; Okerman et al., 1984; Carolan, 1986; Holliman y Girvan, 1986;
Devriese et al., 1996). Esporádicamente se observan abscesos en órganos internos, predominantemente en
pulmones, hígado y útero. Esto puede conducir a un crecimiento deficiente, infertilidad y muerte. Las crías
lactantes pueden morir como resultado de agalactia en la cierva. En las manadas de conejos, se pueden
distinguir dos tipos de infecciones por S. aureus. En el primer tipo, la infección queda limitada a un pequeño
número de animales y tiene una importancia económica menor. En el segundo, la infección por S. aureus da
como resultado una propagación epidémica de la enfermedad en el criadero. Esto conduce a problemas
crónicos y una posterior disminución de la producción. No se conocen los factores de virulencia de S. aureus
que determinan esta propagación epidémica de la enfermedad en conejos.

Una investigación epidemiológica reciente sobre la prevalencia de infecciones por S. aureus en criaderos
industriales demostró que en las parvadas que experimentaban problemas crónicos de estafilococosis, los
conejos estaban generalmente más intensamente colonizados con S. aureus en comparación con los criaderos
sin signos clínicos de estafilococosis. Esto podría indicar que la capacidad de las cepas de S. aureus para
colonizar contribuye a su virulencia para los conejos. Por lo tanto, en este estudio, se examinó la colonización
de conejos con S. aureus luego de infecciones experimentales con cepas presuntamente de alta y baja virulencia.

2. Materiales y métodos

2.1. Conejos e instalaciones para animales

Se compraron conejos híbridos albinos de ocho semanas de edad (Hycole, Ribecourt-La-Tour, Francia) de
un productor comercial y se usaron para infecciones experimentales. Antes del inicio del experimento, se
tomaron muestras de las fosas nasales, el conducto auditivo, la piel interdigital, la cara medial de la pata
delantera derecha, la región cutánea axilar e inguinal, la piel alrededor de los pezones, el perineo y la vagina o
prepucio. de cada conejo experimental y examinado bacteriológicamente para detectar la presencia de S.
aureus. Todas las muestras fueron negativas. Los animales se mantuvieron individualmente en jaulas con suelo
de alambre en tres niveles. Previo al experimento, las jaulas fueron completamente desinfectadas con etanol
desnaturalizado y fumigadas con formaldehído. Los conejos recibieron alimento y agua ad libitum.

2.2. Cepas de S. aureus

Las cepas de S. aureus utilizadas en estos experimentos fueron los aislados KH 15, KH 365, KH 103 y KH
171, todos obtenidos de criaderos belgas (Hermans et al., 1999 aceptado para publicación). Para la clasificación
de estas cuatro cepas de S. aureus en biotipos, se examinó su producción de beta-hemolisina y estafiloquinasa
y su tipo de crecimiento en agar cristal violeta, como se ha descrito previamente (Devriese, 1984). La tipificación
de fagos se logró utilizando bacteriófagos del conjunto de tipificación internacional para cepas humanas de S.
aureus. Las reacciones líticas se examinaron a una dilución de prueba de rutina de 100 veces (Parker, 1962).
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La cepa KH 15 pertenecía al fago tipo 42E/81 y al biotipo humano, que es beta-hemolisina y estafiloquinasa
positivo y presenta crecimiento tipo C en agar cristal violeta. La cepa KH 365 representó el tipo de fago 52A/
53/85/ y el biotipo mixto CV-C, que es beta-hemolisina positiva, estafiloquinasa negativa y muestra crecimiento
tipo C en agar cristal violeta. Ambos aislamientos se obtuvieron de dos criaderos que no tenían antecedentes
de problemas asociados con la estafilococosis. Por esta razón, se supuso que ambas cepas eran poco virulentas
y, a partir de este momento, se las denominará cepas de "baja virulencia".

Las cepas KH 103 y KH 171 pertenecían ambas al fago tipo 3A/3C/55/71 y al biotipo mixto CV-C (beta-
hemolisina positiva, estafiloquinasa negativa y crecimiento tipo C en agar cristal violeta). Los datos de la literatura
sugieren que las cepas de esta combinación biotipo-tipo fago son altamente virulentas (Okerman et al., 1984;
Carolan, 1986; Holliman and Girvan, 1986; Devriese et al., 1996). Las cepas KH 103 y KH 171 se habían aislado
de dos criaderos de conejos diferentes que padecían problemas graves de mastitis en conejas reproductoras y
abscesos subcutáneos en conejos de engorde. Además, el criadero del que se aisló la cepa KH 171 se vio
afectado por pododermatitis estafilocócica en conejos de todas las edades y dermatitis pustulosa en conejos
recién nacidos. Estas dos cepas se presumían altamente virulentas, denominándose a partir de este momento
cepas de "alta virulencia".

Las cepas se cultivaron a 378 °C en agar Columbia (Gibco, Paisley, Reino Unido) con un 5 % de sangre
ovina en un entorno enriquecido con un 5 % de CO2 durante 24 h y se comprobó su pureza. Las bacterias se
recogieron en solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS), se centrifugaron a 1700 g a temperatura
ambiente y se resuspendieron en RPMI 1640 (Gibco, Paisley, Reino Unido) con suero de ternera fetal al 10 %.
El número de unidades formadoras de colonias (UFC) de esta suspensión se determinó sembrando diluciones
de 10 veces en placas de agar sangre Columbia. Las suspensiones bacterianas se almacenaron toda la noche
a 48C, se centrifugaron a 1700 g a temperatura ambiente, se resuspendieron en PBS estéril y se ajustaron a
una concentración de 2 1010 UFC mlÿ1 .

2.3. Diseño experimental

Los grupos de infección 1±4, cada uno compuesto por 12 conejos, se inocularon en ambas fosas nasales
con 50 ml de inóculo que contenía 1 109 CFU de las cepas KH 15, KH 365, KH 103 o KH 171, respectivamente.
Se inocularon ocho conejos con 50 ml de PBS estéril en cada fosa nasal y sirvieron como animales de control
no infectados. Los cuatro grupos de infección, cada uno con dos conejos de control negativo, se mantuvieron en
habitaciones separadas. No fue posible el contacto directo entre conejos del mismo grupo de infección.

Los días 1, 3, 5, 7, 9, 14, 21 y 28 después de la inoculación, se tomaron muestras de frotis de las narinas, el
canal auditivo, la piel interdigital, el lado medial de la pata delantera derecha, la región de la piel axilar e
inguinal. , la piel alrededor de los pezones, el perineo y la vagina o prepucio de cada coneja y examinado
bacteriológicamente para detectar la presencia de S. aureus.
Diariamente, se inspeccionaron los conejos para detectar la aparición de signos clínicos y lesiones.

2.4. Examen bacteriológico

El examen bacteriológico de todas las muestras se realizó en agar Columbia (Gibco, Paisley, Escocia)
suplementado con sangre ovina al 5%. Todas las placas se incubaron durante 24 h a 378 °C en una atmósfera
de CO2 al 5 %. Las colonias de S. aureus se identificaron sobre la base de
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características morfológicas de crecimiento, actividad de ADNasa y propiedades beta-hemolíticas (Devriese et al.,

1996).
El número de colonias de S. aureus aisladas de los diferentes sitios de muestreo se determinó
semicuantitativamente. Sobre esta base, se distinguieron cuatro categorías: 0 (sin crecimiento de S. aureus), 1
(1±10 colonias), 2 (11±50 colonias) y 3 (>50 colonias de S. aureus), y se procesaron como tales en estudios
estadísticos. análisis. Un conejo se consideró infectado cuando se aisló al menos una colonia de al menos un sitio
de muestreo.
Diecisiete aislamientos de S. aureus que se aislaron a intervalos regulares durante todo el experimento, fueron
biotipificados (Devriese, 1984) y tipificados en fagos (Parker, 1962) para verificar la identidad de la cepa.

2.5. análisis estadístico

El número de días de muestreo positivo para cada conejo desde el día 3 hasta el final del experimento se
comparó entre los cuatro grupos de infección, utilizando el análisis de varianza no paramétrico de una vía de
Kruskal±Wallis. La prueba de Kruskal±Wallis también se utilizó para comparar los resultados de muestreo
semicuantitativos de los cuatro grupos de infección, desde el Día 3 hasta el final del experimento. El nivel de
significación utilizado fue 0,05.

3. Resultados

Los animales de control no infectados permanecieron negativos para S. aureus durante todo el experimento.

El número de conejos que resultaron positivos para S. aureus en los muestreos sucesivos entre el día 1 y el 28
después de la inoculación con las cepas KH 15, KH 365, KH 103 y KH 171 se muestra en la Fig. 1. En el día 1, S.
aureus se aisló de los 12 conejos inoculados con las cepas KH 103, KH 171 y KH 365, y de 11 de los 12 conejos
inoculados con la cepa KH 15. Después del día 1, las tasas de aislamiento de S. aureus fueron similares en los
dos grupos de conejos inoculados con las cepas de "baja virulencia" KH 15 y KH 365 y diferían de los de los
conejos inoculados con las cepas de "alta virulencia" KH 103 y KH 171. En los dos primeros grupos, el número de
animales positivos para S. aureus disminuyó rápidamente para convertirse en cero en el día 5 después de la
inoculación. Sin embargo, a partir de los días 7 y 9, se volvió a aislar S. aureus en dos animales del Grupo 1 y en
un animal del Grupo 2, respectivamente.

Durante los siguientes muestreos, en ambos grupos, 1±5 animales produjeron consistentemente S. aureus. En los
Grupos 3 y 4, el número de animales positivos para S. aureus tendió a disminuir gradualmente. Al final del
experimento, seis conejos del Grupo 3 y ocho conejos del Grupo 4 estaban todavía colonizados con S. aureus.

Las puntuaciones medias de crecimiento de colonias en los diferentes sitios corporales demostraron una mayor
colonización más intensa en los Grupos 3 y 4 que en los Grupos 1 y 2 (Fig. 2).
El análisis estadístico mostró que el número de días de muestreo positivos desde el Día 3 hasta el final del
experimento fue significativamente mayor (p < 0,02) en los conejos de los Grupos 3 y 4, ambos inoculados con
cepas de S. aureus de "alta virulencia". en comparación con conejos de los Grupos 1 y 2, inoculados con cepas
de "baja virulencia". No se midieron diferencias significativas entre el Grupo 1 y el Grupo 2, o entre el Grupo 3 y el
Grupo 4. Además, las estadísticas
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Fig. 1. Número de conejos positivos a la presencia de S. aureus en los sucesivos muestreos tras la inoculación con las cepas
KH 15, KH 365, KH 103 y KH 171.

Fig. 2. Puntuaciones semicuantitativas medias de crecimiento de colonias desde el día 3 hasta el final del experimento, en
nueve sitios diferentes del cuerpo de 12 conejos por grupo inoculados experimentalmente con la cepa KH 15 de S. aureus de
"baja virulencia" (Grupo 1), "baja virulencia" cepa de "virulencia alta" KH 365 (Grupo 2), cepa de "alta virulencia" KH 103 (Grupo
3) y cepa de "alta virulencia" KH 171 (Grupo 4).
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Fig. 3. Número medio de muestreos positivos durante ocho días de muestreo entre el Día 1 y el final del experimento,
en nueve sitios diferentes del cuerpo de 12 conejos por grupo inoculados experimentalmente con "baja virulencia"
S. aureus cepa KH 15 (Grupo 1), cepa de "baja virulencia" KH 365 (Grupo 2), cepa de "alta virulencia" KH 103
(Grupo 3) y cepa de "alta virulencia" KH 171 (Grupo 4).

el análisis de las lecturas semicuantitativas del crecimiento de colonias indicó una colonización más
intensa en los Grupos 3 y 4 que en los Grupos 1 y 2 (p < 0,001). Las diferencias entre los grupos 1 y 2 y
entre los grupos 3 y 4 no fueron significativas.
Después de la inoculación, la bacteria S. aureus se propagó desde la nariz hacia los otros sitios del
cuerpo muestreados en todos los conejos de los cuatro grupos de infección. Esta propagación fue mayor
en conejos inoculados con cepas de S. aureus de "alta virulencia" que en conejos inoculados con cepas
de "baja virulencia", como se muestra en la Fig. 3.
Las cepas que se aislaron y se tipificaron de los cuatro grupos experimentales durante el experimento,
todas pertenecían a los mismos biotipos y tipos de fagos que se usaron en el inóculo.
Se observaron lesiones clínicamente aparentes en dos conejos inoculados con la cepa KH 103 y en
dos conejos inoculados con la cepa KH 171. Los animales presentaban pequeños abscesos de
la nariz, la piel, las patas y el perineo. Las lesiones se observaron por primera vez entre los días 7 y 14
después de la inoculación y duraron hasta el final del experimento. De todas estas lesiones se aisló S.
aureus. En conejos inoculados con las cepas de "baja virulencia" y en los animales de control no
infectados, no se encontraron lesiones.

4. Discusión

En este estudio, se examinó la capacidad de colonización de cepas de S. aureus de "alta virulencia" y

"baja virulencia". Un día después de la inoculación, se aisló S. aureus de 47 de los 48 conejos inoculados.
Esto no indica necesariamente una colonización a largo plazo de conejos.
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pero también puede demostrar que los mecanismos mecánicos de eliminación del huésped (Reece,
1984), como los estornudos (SpoÈrri, 1976), aún no habían sido capaces de eliminar las bacterias del
inóculo. Esto último está respaldado por el hecho de que en ambos grupos inoculados con las cepas
de "baja virulencia", el número de animales positivos disminuyó drásticamente durante los siguientes
muestreos.
Para los conejos experimentalmente infectados con las cepas de "baja virulencia" KH 15 y KH 365,
el número de animales positivos disminuyó rápidamente y llegó a cero el día 5 después de la
inoculación. En los grupos inoculados con las cepas de "alta virulencia", 10 u 11 de los 12 conejos
permanecieron positivos durante este período. Además, el número de días de muestreo positivo y el
número de colonias aisladas a lo largo del experimento fueron significativamente mayores en los
conejos inoculados con cepas de "alta virulencia" que en los grupos inoculados con cepas de "baja
virulencia". Esto indica que las cepas de "alta virulencia" tienen una mejor capacidad para colonizar al
huésped y que la capacidad de colonización puede desempeñar un papel en la virulencia de las cepas
de S. aureus en conejos.
Cuando solo se tomaron en cuenta los resultados del muestreo después del día 1, se pudo observar
que ambas cepas de "alta virulencia" colonizaron la nariz en 22 de los 24 conejos. Las cepas de "baja
virulencia" sólo se encontraron en cuatro de los 24 conejos. Esto indica que la capacidad de estas
cepas de "baja virulencia" para colonizar la nariz es baja. Sin embargo, es posible que estas cepas
sean capaces de colonizar otros sitios del cuerpo.
Además, se encontró que cuatro conejos inoculados con las cepas de "alta virulencia" KH 103 y KH
171 desarrollaron síntomas de estafilococosis, mientras que no se encontraron signos clínicos o
lesiones en conejos que habían sido inoculados con cepas de S. aureus de "baja virulencia". . Esto
puede reflejar la situación en el campo. Si la virulencia de las cepas está asociada únicamente con su
capacidad de colonización o también con otras propiedades, como la capacidad de crear o invadir
lesiones dérmicas, es necesario seguir examinando.
Como conclusión de las observaciones de campo y los resultados obtenidos en el presente estudio
experimental, se puede afirmar que los dos grupos de cepas de S. aureus de conejo utilizadas en este
experimento son de virulencia diferente. La capacidad de colonización debe considerarse como un
importante factor de virulencia.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por una subvención del Instituto Flamenco para el avance de la investigación
científica y tecnológica en la industria (IWT, Bruselas, Bélgica) a Katleen Hermans.

L. Hauttekeete, G. Deboever y A. Van de Kerckhove son reconocidos por su asistencia técnica

calificada. R. Moermans, M. Ysebaert y H. Laevens son reconocidos por su ayuda con el análisis
estadístico.

Referencias

Carolan, MG, 1986. Estafilococosis en conejos. Veterinario. rec. 119, 412.

Devriese, LA, 1984. Un sistema simplificado para biotipificar cepas de Staphylococcus aureus aisladas de diferentes
especies animales. Aplicación J. Bact. 56, 215±220.
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Devriese, LA, Hendrickx, W., Godard, C., Okerman, L., Haesebrouck, F., 1996. Un nuevo tipo patógeno de Staphylococcus
aureus en conejos comerciales. J. Vet. Medicina. B 43, 313±315.
Hagen, KW, 1963. Infección estafilocócica diseminada en conejos domésticos jóvenes. JAVMA142, 1421±
1422.
Hermans, K., De Herdt, P., Devriese, LA, Hendrickx, W., Godard, C., Haesebrouck, F., 1999. Colonización de conejos con
Staphylococcus aureus en parvadas con y sin estafilococosis crónica. Veterinario. Microbiol. 67, 37±46.

Holliman, A., Girvan, GA, 1986. Staphylococcosis in a comercial rabbitry. Veterinario. rec. 119, 187.
Okerman, L., Devriese, LA, Maertens, L., Okerman, F., Godard, C., 1984. Estafilococosis cutánea en conejos. Veterinario. rec.
114, 313±315.
Parker, MT, 1962. Tipificación de fagos y epidemiología de la infección por Staphylococcus aureus. Aplicación J. Bact. 25(3),
389±402.
Reece, WO, 1984. Respiración en mamíferos. En: Swenson, MJ (Ed.), Fisiología de los animales domésticos de Dukes.
Cornell University Press, Londres, págs. 226±254.
SpoÈrri, H., 1976. Die Regulation der atmung. En: Scheunert, A., Trautmann, A. (Eds.), Lehrbuch der VeterinaÈr Physiologie.
Verlag Paul Parey, Berlín, pág. 664.