Resistencia no específica.

Fagocitosis

INTRODUCCIÓN

En 1884, Elie Metchnikoff observó la ingestión de diversos microorganismos por

leucocitos de conejo y de humano, fenómeno que él denominó fagocitosis. También notó que
la fagocitosis aumentaba cuando los animales estaban recuperándose de alguna infección o
después de una vacunación. Posteriormente, el mismo Metchnikoff demostró la existencia de
dos tipos de leucocitos circulantes capaces de fagocitar: los polimorfonucleares (PMN) y los
macrófagos, proponiendo el término general de fagocitos para todas estas células.
La fagocitosis efectuada por los PMN se puede dividir, para su estudio, en seis etapas
relacionadas: adherencia, quimiotaxis, opsonización, ingestión, desgranulación y destrucción.
Adherencia. Para que los PMN lleguen al lugar de la infección requieren atravesar la
pared endotelial de los vasos sanguíneos. Los PMN disminuyen su velocidad, y por una
interacción de moléculas presentes en la pared endotelial (selectina E), los neutrófilos “ruedan”
sobre las células endoteliales. La interacción de éstas y otras moléculas (quimiocinas) hace que
se expresen moléculas de adhesión en ambos tipos celulares. Sobre el endotelio se expresan las
moléculas ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1 y MAdCAM-1, mientras que en la membrana del
PMN, integrinas como LFA-1, CR-3, VLA-4 y LPAM-1. Una vez que se ha llevado a cabo la
adhesión, los PMN salen al tejido por entre las uniones de las células endoteliales, fenómeno
conocido como diapédesis.
Quimiotaxis. Es el proceso mediante el cual los fagocitos son atraídos al lugar de la
invasión microbiana. Son varios los factores quimiotácticos que pueden reclutar neutrófilos en
el sitio de inflamación tisular, como moléculas derivadas de la activación del complemento
(C5a, C567), fragmentos de fibrina, fragmentos de colágena, productos derivados de la
degradación bacteriana, etcétera.
Opsonización. Las opsoninas presentes en el suero interaccionan con los
microorganismos y los hacen más susceptibles a la ingestión por los fagocitos. La
inmunoglobulina G y las fracciones C3b y C4b del complemento pueden actuar independientes
o juntas como opsoninas.
Ingestión. Los seudópodos citoplásmicos de los fagocitos se extienden al ponerse en
contacto con las bacterias, fusionándose sobre el lado distal del material que va a ser ingerido,
englobando a la partícula y formando una vesícula fagocítica denominada fagosoma, la cual es
llevada al interior de la célula.
Desgranulación. A medida que se forma el fagosoma, los gránulos lisosomales del PMN
adquieren movimiento en la proximidad del fagosoma, se fusionan con la vacuola fagocítica
vaciando su contenido al fagosoma, desapareciendo del citoplasma y formando así el
fagolisosoma.
Destrucción. En los fagocitos existen múltiples sistemas microbicidas. Estos mecanismos
antimicrobianos son diversos: la acidificación (pH 3.5-4.0), metabolitos tóxicos derivados del
oxígeno como el anión superóxido (O2-), el peróxido de hidrógeno (H2O2), el singlete de

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oxígeno (1O2), el radical hidroxilo (OH-) óxido nítrico (NO); péptidos antimicrobianos
(proteínas catiónicas) y enzimas (lisozima). Estos mecanismos se han dividido de manera
general en dos categorías: independientes de oxígeno y dependientes de oxígeno, estos últimos,
a su vez, en dependientes de mieloperoxidasa (MPO) e independientes de MPO.
Existen diferentes pruebas de laboratorio empleadas en la clínica para evaluar la función
fagocítica en pacientes con diversas enfermedades; todas estas pruebas pretenden, en su
conjunto, evaluar las seis etapas principales del proceso de la fagocitosis.

OBJETIVO

Observar microscópicamente los fenómenos de adhesión, opsonización, endocitosis y la

reducción del nitroazul de tetrazolio (NAT) derivado de los mecanismos de destrucción
oxidativos.

MATERIAL Y MÉTODO

Material por grupo

Centrífuga refrigerada.
Incubadora ajustada a 37oC
Microscopio óptico.
Portacubreobjetos para lavado.
Resina sintética.
Safranina.
1 litro de solución salina al 0.85% (SS). 1 matraz Erlenmeyer de 125 mL.
3 pipetas serológicas de 10 mL.
2 pipetas serológicas de 5.0 mL.
3 pipetas serológicas de 1.0 mL.
2 tubos de ensaye de 13 x 100 mm.
1 mL de suero humano
fresco.
Charola con solución de hipoclorito.

Material por equipo

1 jeringa desechable nueva de 10 mL con aguja de 20 x 25 mm. 1 ligadura.
1 frasco con torundas con alcohol. 5 tubos de ensaye de 13 x 100 mm.
4 cajas de Petri de 60 x 15 mm de diámetro conteniendo sendos cubreobjetos previamente
desengrasados.
3 pipetas serológicas de 5.0 mL.
3 pipetas serológicas de 1.0 mL.
2 pipetas Pasteur con bulbo de hule.
1 gradilla. 1 frasco Gerber.
1 matraz Erlenmeyer de 125 mL.
1 tubo de ensaye de 18 x 150 mm con tapón de rosca, conteniendo 9 perlas de vidrio.
1 pinza con extremos planos.

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 2 portaobjetos.
2 mL de levaduras opsonizadas y ajustadas a una concentración de 5 x 106 levaduras/ml y
2 mL de levaduras sin opsonizar a la misma concentración.
3 mL de nitroazul de tetrazolio (NAT) al 0.1% en SS.
10 mL de medio mínimo esencial (MEM) pH 6.8-7.0.
Papel absorbente.
Método
1. Colocar cuatro cubreobjetos perfectamente limpios y desengrasados dentro de cuatro cajas
de Petri, con papel absorbente húmedo en las tapas a fin de mantener una cámara húmeda.
2. Previo consentimiento informado, obtener 5.0 mL de sangre venosa sin anticoagulante y
después de retirar la aguja depositar la muestra en el tubo con tapón de rosca con perlas de
vidrio. Agitar el tubo suavemente, evitando la formación de espuma, hasta una completa
desfibrinación. Depositar aproximadamente 0.8 mL de sangre desfibrinada sobre la
superficie de los cubreobjetos usando una pipeta Pasteur.
3. Incubar las preparaciones durante 30 min a 37oC.
4. Eliminar el exceso de sangre, depositando 2 mL de SS en la caja de Petri, cuidando de no
vaciar directamente la solución sobre las preparaciones. Agitar la caja de Petri suavemente
con movimiento rotatorio. Retirar el líquido de lavado con la ayuda de una pipeta Pasteur.
Repetir este paso dos veces más.
5. Adicionar a las cuatro cajas 2 mL de MEM y 0.5 mL de NAT. A dos de ellas agregarles 107
levaduras opsonizadas, y a las otras dos el mismo número de levaduras sin opsonizar.
6. Incubar las preparaciones a 37oC durante 30 min.
7. Retirar el líquido sobrenadante de cada una de las cajas, con la ayuda de una pipeta Pasteur,
cuidando de no tocar la preparación.
8. Retirar los cubreobjetos de las cajas con ayuda de las pinzas y pasarlos al portacubreobjetos,
que debe estar sumergido en SS.
9. Agitar el portacubreobjetos con movimientos verticales y horizontales. Cambiar el líquido
de lavado por lo menos cinco veces.
10. Introducir los cubreobjetos en safranina al 0.5% durante 10 min.
11. Enjuagar perfectamente con agua las preparaciones ya teñidas para eliminar el exceso de
colorante.
12. Dejar secar los cubreobjetos y montar las preparaciones con resina sintética sobre
portaobjetos limpios.
13. Una vez que la resina haya secado, observar los fenómenos de adhesión, ingestión y
reducción del NAT en un microscopio óptico bajo objetivo de inmersión (100x).

RESULTADOS
Observar las células fagocíticas notando la diferencia en la endocitosis de levaduras
opsonizadas y levaduras no opsonizadas. Distinguir entre células que redujeron el NAT
(levaduras azules en su interior) de aquellas que no lo hicieron (solamente levaduras rojas).
El grado de endocitosis ocurrido se puede evaluar determinando el porcentaje de células
que ingirieron levaduras, y la capacidad de las células para reducir el NAT se puede evaluar
determinando el porcentaje de células que, habiendo endocitado, han reducido el colorante.

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 LEVADURAS OPSONIZADAS LEVADURAS NO OPSONIZADAS
Células que Células que
Células Células que endocitaron Células Células que endocitaron
totales/campo endocitaron y redujeron totales/campo endocitaron y redujeron
NAT NAT

% de endocitosis = % de endocitosis =
% de reducción = % de reducción =

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. STITES, D. P.; TERR, A. I., y PARSLOW, T. G., 1998. Inmunología básica y clínica. 9ª ed.
Editorial El Manual Moderno.
2. ROITT, I. M., 1997. Essential Immunology. 9ª. ed. Editorial Blackwell Scientific
Publications.
3. WEIR, D. M. and STEWART, J., 1995. Inmunología. 2ª. ed. Editorial El Manual Moderno.

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NOTAS

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