Trabajo de Grado Seleccionado

EVALUAR LA RESISTENCIA DE LAS MEMBRANAS ESPERMÁTICAS AL
EFECTO DE CONGELAMIENTO DE LOS GENOTIPOS BRAHMAN Y GYR.
JORGE LEONARDO CAMARGO ALVAREZ
INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BARRANCABERMEJA
2017
1
EVALUAR LA RESISTENCIA DE LAS MEMBRANAS ESPERMÁTICAS AL
EFECTO DE CONGELAMIENTO DE LOS GENOTIPOS BRAHMAN Y GYR.
JORGE LEONARDO CAMARGO ALVAREZ
Proyecto presentado como requisito para optar el título de Médico Veterinario y

Zootecnista
Director:
DARWIN ANTONIO GARCIA ROJAS
Médico Veterinario Zootecnista
INSTITUTO UNIVERSITARIO DE LA PAZ

ESCUELA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
BARRANCABERMEJA
2017
2
NOTA DE ACEPTACION
---------------------------------------------
---------------------------------------------
---------------------------------------------
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Firma del Jurado
----------------------------------------------
Firma del Jurado
-----------------------------------------------
Firma del Jurado
Barrancabermeja,……………..del 2017
3
DEDICATORIA
A Dios porque siempre ha estado a mi lado y no me ha dejado desistir en ningún

momento de mis sueños y siempre me ha ayudado a ver el lado positivo de las
cosas. A mis padres Luis Fernando Camargo y Leticia Álvarez que siempre han
confiado en mí y en cualidades y siempre me han apoyado en mis decisiones por
duras que sean, porque gracias a ellos he podido alcanzar este logro que es tanto
mío como de ustedes.
A mis hermanos Luis Ricardo, Diana Carolina, Leonel Fabián que siempre me
dieron una voz de aliento cada vez que la necesite. A mi abuela Elena Rodríguez
que siempre ha estado apoyando en todas las batallas y demás familiares que de
una u otra forma me han apoyado.
A mi novia Mayra Alejandra Rodríguez, que a pesar de las circunstancias vividas

siempre ha estado ahí apoyándome y nunca ha dejado de confiar en mí. A mis
amigos Henry Suarez, Diego García, Jesús Piñeres, con los que compartimos
buenos tiempos en la universidad y con los que siempre pude confiar.
A mis profesores que a lo largo de mi carrera siempre se esforzaron porque yo

aprendiera y pudiera llegar a ser un buen profesional, como se los voy a
demostrar.
A todos mil gracias porque sin el apoyo de ustedes no hubiese alcanzado este
logro que con mucho esfuerzo estoy obteniendo.
Jorge Camargo.
4
AGRADECIMIENTOS
Primero que todo le agradezco a Dios por haberme dado la oportunidad de

estudiar y culminar mis estudios de una profesión tan bonita como lo es la
Medicina Veterinaria y Zootecnia, a mis padres, Luis Fernando Camargo Cárdenas
y Leticia Álvarez Rodríguez, por darme su apoyo incondicional para poder llevar a
cabo tan grandioso proyecto.
A mis profesores de carrera que tras la estadía en la universidad me aportaron

muchos conocimientos para poder perfilarme como un buen profesional. A mi
director de tesis Darwin Antonio García que siempre me apoyo para poder
culminar satisfactoriamente el trabajo de tesis. Al doctor Norberto Villa Duque, que
con su exigencia nos permitió realizar el trabajo de campo de una forma
responsable.
A todos mis compañeros que en el transcurso de la carrera compartimos buenos

momentos tanto de aprendizaje como de esparcimiento. Muchas gracias.
5
CONTENIDO
Pág.
RESUMEN 11
ABSTRACT 12
INTRODUCCIÓN 13
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 14

2. JUSTIFICACIÓN 16
3. OBJETIVOS 17
3.1 OBJETIVO GENERAL 17
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 17
4. MARCO TEORICO 18
4.1 INSEMINACIÓN ARTIFICIAL 18
4.2 FACTORES QUE AFECTAN LA CALIDAD DEL SEMEN BOVINO 19
4.2.1 crio-preservación 19
4.2.2 Método e colecta. 20
4.2.3 estrés térmico 20
4.2.4 edad 20
4.2.5 Genética. 21
4.3 SEMEN 22
4.3.1 Composición. 22
4.3.2 Evaluación del semen 22
4.3.3 Evaluación macroscópica 22
4.3.4 Volumen 22
4.3.5 Color y apariencia 23
4.3.6 Olor 23
4.3.7 pH 23
4.3.8 Evaluación microscópica 24
4.3.9 Supervivencia o Vitalidad 24
4.3.10 Morfología 25
4.3.11 Integridad acrosómica 25
4.3.12 Integridad y funcionalidad de la membrana plasmática 27
5. DISEÑO METODOLÓGICO 29
5.1 UBICACIÓN GEOGRAFICA DEL PROYECTO 29
5.2 MATERIALES Y METODOS 29
5.2.1 Materiales 29
5.2.2 Materiales de apoyo 29
6
5.2.3 Método 29
5.2.4 Distribución de los tratamientos 29
5.2.5 Centrifugación del semen 30
5.2.6 Variables a evaluar 30
5.3 HIPÓTESIS 31
5.3.1 Hipótesis nula H0: 31
5.3.2 Hipótesis alterna H1: 31
5.4 TRATAMIENTO DE LA INFORMACIÓN 31
6. RESULTADOS 32
7. DISCUSIÓN 40
8. CONCLUSIONES 43
9. RECOMENDACIONES 44
BIBLIOGRAFÍA 45
7
LISTA DE CUADROS
pág.
Tabla 1. Significancia y medias entre los genotipos Brahman y Gyr para

las variables evaluadas cuando se implemento el tratamiento convencional
(descongelación a 37°C durante 30s) 32
Tabla 2. Significancia y medias entre los genotipos Brahmán yGyr para las
variables evaluadas cuando se implemento la descongelación en la axila. 34
Tabla 3. Significancia y medias entre los genotipos Brahmán y Gyr para

las variables evaluadas cuando se descongelo a 37°C durante 8 minutos. 36
Tabla 4. Significancia y medias entre los genotipos Brahmán y Gyr para

las variables evaluadas cuando se sometió la pajilla a shock térmico por
extracción incorrecta 38
8
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

RMp- Tratamiento convencional (37°C durante 30s) 32
Figura 2. Comparación de medias entre los genotipos para la variable IMa.

Tratamiento convencional (37°C durante 30s) 33

RMp/IMa. Tratamiento convencional (37°C durante 30s) 33

RMp cuando se descongelo en la axila 34
Figura 5. Comparación de medias entre los genotipos para la variable IMa

cuando se descongelo en la axila 34

RMp/IMa cuando se descongelo en la axila. 35

RMp cuando se descongelo en a 37°C durante 8 minutos 36

cuando se descongelo en a 37°C durante 8 minutos 37

RMp/IMa cuando se descongelo en a 37°C durante 8 minutos 37

RMp cuando se extrajo incorrectamente la pajilla del termo de crio
preservación 38

IMa cuando se extrajo incorrectamente la pajilla del termo de crio
preservación 38

RMp/IMa cuando se extrajo incorrectamente la pajilla del termo de crio
preservación. 39
9
LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo 1. Preparación de solución host y Ort. 53

Anexo 2. Conteos de membranas en microscopio de contraste. 53
Anexo 3. Espermatozoide reactivo a solución host. 54
10
RESUMEN
La implementación de los programas de inseminación artificial, conllevan a la

utilización, en la mayoría de los casos, de semen empaquetado en pajillas y
previamente crio preservado. Proceso, que, dependiendo del genotipo, presenta
diferentes alteraciones en la estructura y funcionalidad de la célula espermática,
específicamente al momento de la descongelación. Con el objetivo de Evaluar la
respuesta del genotipo (Brahmán- Gyr) al efecto de cuatro métodos de
descongelación sobre la integridad de las membranas espermáticas se
establecieron cuatro tratamientos: T1, descongelación del semen a 37°C durante
30 segundos; T2, descongelación en la axila durante 30 segundos; T3,
descongelación a 37°C durante 8 minutos y T4, descongelación a 37°C durante 30
segundos, previa extracción incorrecta de la pajilla (shock térmico). Mediante un
diseño aleatorizado se valoraron 24 pajillas, 12 por genotipo (Brahman-Gyr), para
determinar las variables resistencia de la membrana plasmática (RMp), integridad
de la membrana acrosomal (IMa) y RMp/IMa conjuntamente. Las pruebas de
normalidad y homocedasticidad recomendaron el uso de estadísticas no
paramétricas para la valoración de las variables. La comparación de medias se
realizó mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Los resultados permitieron
evidenciar diferencia significativa entre los genotipos (p<0,05), en T1, para la RMp
y la valoración RMp/IMa y en T2 y T4 para la valoración de todas las variables.
Los resultados de este trabajo sugieren que el semen de los genotipos bovinos
responden de diferente manera y forma al efecto detrimental implícito en todo el
proceso de crio preservación, incluida, lógicamente, la descongelación de la pajilla
con el semen empaquetado.
11
ABSTRACT
The implementation of artificial insemination programs entails the use, in most

cases, of semen packed in straws and previously cryopreserved. Process,
depending on the genotype, presents different alterations in the structure and
functionality of the sperm cell, specifically at the time of thawing. In order to
evaluate the response of the genotype (Brahmán-Gyr) to the effect of four methods
of thawing on the integrity of the sperm membranes four treatments were
established: T1, thawing of the semen at 37 ° C for 30 seconds; T2, thawing in the
axilla for 30 seconds; T3, thawing at 37 ° C for 8 minutes and T4, thawing at 37 ° C
for 30 seconds, after incorrect extraction of the straw (thermal shock). Twenty-four
straws, 12 genotypes (Brahman-Gyr) were evaluated by means of a randomized
design to determine the variables plasma membrane resistance (rpH), acrosomal
membrane integrity (IMa) and rM / IMa together. The tests of normality and
homoscedasticity recommended the use of non-parametric statistics for the
valuation of the variables. The comparison of means was performed using the
Kruskal-Wallis test. The results allowed to show a significant difference between
the genotypes (p <0.05), in T1, for the rMS and the rMS / IMa and in T2 and T4 for
the evaluation of all variables. The results of this work suggest that the semen of
the bovine genotypes responds in different ways and forms to the detrimental
effect implicit in the entire cryopreservation process, including, logically, the
thawing of the straw with the semen packaged.
12
INTRODUCCIÓN
Según Foote1, la inseminación artificial (IA), es la biotecnología reproductiva de

mayor aplicación por las empresas ganaderas; su afianzamiento se debe a la
utilización de semen congelado empaquetado en pajillas de 0.25 y 0.5 ml, el cual
es depositado en el cuerpo o cuerno uterino mediante la IA, con el objetivo de
mejorar genéticamente el hato bovino, para incrementar la productividad.
Nebel2, describe que la crio-preservación del semen a -196°C interrumpe los

procesos metabólicos de la célula espermática, lo que genera una conservación
indefinida; sin olvidar que tanto en la crio preservación como en la descongelación
se pueden producir fallas, que ocasionan alteraciones en las membranas
celulares, que a la final deterioran la viabilidad del esperma, y con ello su
capacidad de fecundar.
El objetivo de este trabajo es “evaluar la respuesta del genotipo Brahmán y Gyr al

efecto de cuatro métodos de descongelación sobre la integridad de las
membranas espermáticas”, con esto busca conocer los cambios suscitados en el
proceso de descongelación, de algunos parámetros esenciales y determinantes
para la viabilidad de la célula espermáticas contenidas en pajillas utilizadas en la
inseminación artificial, para tratar de determinar la técnica de descongelación más
adecuada en la inseminación artificial, y con esto aportar una guía a los
inseminadores para que ajusten sus protocolos al momento de inseminar.
1
FOOTE, R H. The history of artificial insemination: Selected notes and notables. Journal of Animal Science,
2002; 80: 1-10
2
NEBEl, R L. Técnicas para la Inseminación Artificial de bovinos con semen congelado-descongelado. R. S.
Youngquist (ed.): Terapia actual en la theriogenology animal grande, 1997; 1: 251 - 256.
13
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La implementación de los programas de Biotecnología Reproductiva animal ha

contribuido notoriamente a mejorar, desde varias perspectivas, la producción y
rentabilidad de las empresas ganaderas. La inseminación artificial (IA), es uno de
ellos, técnicamente consiste en obtener semen del macho para luego introducirlo
fresco o congelado en el aparato reproductor de una hembra3.
No obstante, estas técnicas no están exentas de problemas. Cuando se utiliza

semen congelado, este debe pasar por un protocolo de crio-preservación, en el
cual los procesos de congelación y descongelación constituyen los eventos que
en mayor proporción ejercen detrimento de las estructuras de la célula
espermática, especialmente las de las membranas, afectándose su integridad y
consecuencialmente su funcionalidad4. La permanencia de la célula espermática
crio-preservada en nitrógeno líquido en el termo de almacenamiento no constituye
problema alguno, los inconvenientes se originan en la injuria implementada
cuando se descongela, el retorno a las condiciones fisiológicas es definitivo para
la viabilidad de las células espermáticas5. La obtención de un protocolo ideal para
descongelar semen empaquetado es dependiente del conocimiento de las
propiedades fisicoquímicas de la célula y o el tejido puesto que este proceso está
afectado por diferentes variables, como especie, tipo y estado de la célula a
congelar6. Las células tienen diferente tamaño y manejan diferente composición
de solutos y en general el éxito de la crio-preservación es inversamente
proporcinal con la complejidad de los sistemas biológicos congelados7. Se
entiende que el semen de los toros de los genotipos o razas, por lo menos las más
estudiadas, las bovinas, no respondan de igual manera a la injuria a la que es
sometido cuando se descongela para ser introducido en el aparato reproductor de
la hembra bovina8. Esta apreciación ha venido siendo experimentada y
cuantificada en diferentes trabajos realizados en el Laboratorio de Biotecnología
Reproductiva Animal del Instituto Universitario de la Paz de Barrancabermeja, ya
reportados a la comunidad científica a través de diferentes (revistas) de circulación
3
HAFEZ, E. S. E. Reproducción e inseminación artificial en animales, 7 ed. México D.C.; McGraw-
Hill Interamericana, 2002. 373 p. ISBN 970-10-3719-7.
4
WOODS, Erick y BENSON, James. Fundamental criobiology of reproductive cells and tissues
criobiology. [En línea]. 2004. [citado 15 de abril 2015) Disponible en internet:<
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15094091>
5
MAZUR, P. Freezing of living cells: mechanisms and implicatio ns. [en linea]
National Institutes of healt, 198. p.243.1989 [citado 11 marzo., 2015] Disponible en
internet: <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6383068>.
6
BOISO I. Criobiología. Revista Iberoamericana de Fertilidad 2001; 18(4)
7
AVILA, Luz. Fundamentos de criopreservación. En: Revista Colombiana de Obstetricia y
Ginecología Mayo- octubre, 2006. Vol. 57: No. 4 p.300
8
VILLA, Norberto. Evaluación del Efecto de la Técnica Instrumental Sobre la Calidad del Semen
Bovino, Congelado-Descongelado, en el Centro de Colombia. Trabajo
de Maestria. Manizales: Universidad de Caldas. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,
2010. 120p.
14
académica9. Cabe, la pregunta, acerca de ¿cuáles serán los genotipos, cuyo
semen resiste más el efecto deletéreo ejercido por la crio-preservación,
específicamente al ser descongelado para ser utilizado en la técnica de la IA?.
9
VILLA, Norberto; TOORES, Claudia Marcela; GARCIA, Darwin Antonio; NIETO, Natalia; TERAN,
Natalia. Efecto de la manipulación del semen crio preservado de bovinos Bos Taurus sobre la
integridad espermática. Revista Ciencia y Agricultura. 2015.13 (1): 9-18.
15
2. JUSTIFICACIÓN
La implementación de metodologías biotecnológicas, en aras de mejorar la

producción ganadera y la rentabilidad del hato, conlleva el manejo de protocolos
específicos, que, si bien es cierto, benefician el programa, no están exentos de
problemas. Es el caso de la IA, biotecnología que implica, cuando no se utiliza en
fresco, la utilización de semen empaquetado en pajillas previamente crio-
preservado. Entender y aplicar adecuadamente la crio-preservación de material
biológico es fundamental, pues mantener una línea celular en cultivo continuo por
largos periodos de tiempo es costosa, hay un gran riesgo de contaminación así
como la posibilidad de una alteración genética y funcional, por lo cual hay una
especial atención a la conservación de tejidos, órganos y embriones para ser
utilizados en investigación y su posterior aplicación, sea para producción o para
conservación10. El retorno de las células espermáticas a su condición isotónica
sugiere someterlas al proceso de descongelación, que si no es el apropiado puede
alterar las condiciones propias de la célula en cuestión11. Lo anterior sugiere la
necesidad de valorar continuamente los diferentes protocolos de descongelación y
el grado de alteración que puede sufrir el semen empaquetado, además de
entender cuál es la respuesta y el grado de tolerancia del semen al proceso de
cada uno de los genotipos utilizados en los programas biotecnológicos, llámese IA,
transferencia embrionaria (TE) o Fertilización in vitro (FIV). Se hace necesario
hacerlo, pues las investigaciones12, encontraron que el semen de los genotipos
bovinos responde de diferente manera a la injuria de todos los procesos implícitos
en la crio-preservación.
10
AVILA, Op. Cit., p. 148.
11
MAZUR, Op. Cit., p.245.
12
VILLA, N; Valencia, JA; Gómez, G; Henao, FJ. Efecto de los errores en la inseminación con
semen congelado sobre la morfo fisiología espermática bovina. Revista ORINOQUIA. 2016.Vol 19
(2): 46-55.
16
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Evaluar la resistencia de las membranas espermáticas al efecto de congelamiento

de los genotipos brahman y gyr.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar la respuesta del genotipo (Brahmán- Gyr) al efecto de cuatro métodos

de descongelación sobre la resistencia de la membrana plasmática del
espermatozoide.
Valorar la respuesta del genotipo (Brahmán- Gyr) al efecto de cuatro métodos de

descongelación sobre la integridad de la membrana acrosomal del
espermatozoide.
Establecer la respuesta del genotipo (Brahmán- Gyr) al efecto de cuatro métodos

de descongelación sobre la resistencia de la membrana plasmática y la integridad
de la membrana acrosomal conjuntamente
17
4. MARCO TEORICO
4.1 INSEMINACIÓN ARTIFICIAL
Se entiende por inseminación artificial el conjunto de técnicas implementadas con

el fin de lograr la fecundación de las hembras sin la intervención directa del
macho13. En términos generales es la introducción de material espermático en el
aparato genital de la hembra por métodos manuales e instrumentales en el
momento y lugar adecuados, con el fin de lograr una gestación 14. El procedimiento
implica un número de otros procesos técnicos, como son la recolección del semen,
evaluación, dilución, congelación y almacenamiento, por lo que se deberá utilizar
el término de reproducción artificial15. Para garantizar el éxito en la IA en el
procedimiento, el técnico inseminador tiene que cumplir una serie de requisitos
que permitirán llevar a cabo el objetivo principal, requisitos que obedecen a un
protocolo, ya estudiado y verificado:
Preparar y verificar que el agua del termo para descongelar este entre 35°C –
37°C, llenar el termo de descongelación con el agua a 35°C – 37°C, levantar la
canastilla sin sobrepasar el cuello del termo, extraer rápidamente con la pinza la
pajuela que contiene el semen del toro elegido depositándola de inmediato en el
interior del termo de descongelación; este procedimiento no debe sobrepasar los
15 segundos, cerrar el termo de descongelación y controlar que transcurran 30
segundos, transcurrido el tiempo de descongelación (30 segundos) extraer la
pajilla del termo, secarla con papel absorbente verificar la identidad del toro y la
posición del tapón mayor, llevar hacia atrás el émbolo de la pistola
aproximadamente unos 13,5 cm e introducir la pajilla con el tapón mayor en la
recamara de la misma, cortar la pajilla con el corta pajilla en forma recta (0.9cm).
Aplicar la funda y asegurarla firmemente con la arandela plástica o el asegurador
de la pistola, colocarse el guante protector, presionar suavemente el émbolo hasta
que aparezca una pequeña gota de semen, para garantizar que el depósito está
correctamente armado; La pajilla con la funda colocada debe sobresalir
ligeramente sobre la pistola lubricar la mano y proceder a la inseminación
propiamente dicha16. De acuerdo con el cumplimiento de estos requisitos depende
la viabilidad de la célula espermática, la cual ha sido crio preservada previamente
13
PAEZ, Edwin. Módulo de Reproducción Animal Avanzada, Universidad Nacional Abierta y a
Distancia. Tesis de Doctorado en Desarrollo Sostenible. Tunja: Universidad Nacional Abierta y a
Distancia. Facultad de ciencias Agrícolas, 2013. 30 p.
14
SECRETARIA DE GOBIERNO DE SINALOA. Inseminación Artificial del Ganado Bovino. Sinaloa,
2012. 10 p.
15
PAEZ, Op. Cit., 28p.
16
OVIEDO, Yesid. Manual práctico y moderno de inseminación. 1995. REPRODUCIR LTDA. 160p.
18
en aras de mantener la viabilidad de estas células por tiempos indefinidos. La
inseminación artificial con semen congelado ha mostrado ser la tecnología
reproductiva que más ha contribuido a acelerar el proceso genético de las
diferentes especies ganaderas especialmente del ganado vacuno, sin embargo, el
éxito de esta tecnología depende de que el semen utilizado mantenga su poder
fecundante tras su descongelación.
La obtención de un protocolo ideal de crio preservación entre los que se tiene en

cuenta la congelación y descongelación es dependiente del conocimiento de las
propiedades fisicoquímicas de la célula crio preservada y el conocimiento en sí de
la estructura que nos permita identificar si tuvo o no daño celular, o incluso si el
daño puede ser reversible o irreversible17.Requisito indispensable para el
desarrollo de la inseminación artificial es que el semen utilizado mantenga su
capacidad de fertilidad después de haber sido crio preservado18.
4.2 FACTORES QUE AFECTAN LA CALIDAD DEL SEMEN BOVINO
Los factores que pueden llegar a afectar la calidad seminal en toros son de
diferente orden, pueden afectar el plasma seminal y/o los espermatozoides; el
momento en que la afección sobre la calidad seminal se presenta puede ser de
gran orientación para entender qué ocurre, qué consecuencias en el estatus
reproductivo del toro se pueden llegar a presentar, y si la tiene, cuál sería la
solución19. la calidad del semen crio-preservado se puede ver afectada en una
mayor forma que el semen fresco, y aún mucho más cuando este semen es
requerido para tecnologías como la fertilización in vitro e inyección
intracitoplasmática (ICSI)20.
4.2.1 Crio-preservación. El semen sometido a crio-preservación está sujeto al

efecto detrimental, el cual ocasiona alteraciones en la estructura de la célula
espermática, como dilatación y rompimiento a nivel de la membrana, con cambios
de permeabilidad en la misma. Hay cambios en la estructura de fosfolípidos y
proteínas, que traen como consecuencia una reducción en su motilidad y
viabilidad espermática21. Cambios estructurales que dan como resultado una
prematura capacitación espermática, afectándose la vida media de los
17
MAZUR, Op. Cit., p.247.
18
HIDALGO, Manuel. Estudio del Efecto de la Congelación-Descongelación sobre los Parámetros
Morfométricos del Espermatozoide del Macho Cabrío. Trabajo de grado Médico Veterinario.
Córdoba: Universidad de Córdoba. Departamento de Medicina y Cirugía Animal, 2004. 43p.
19
LOZANO, H. Factores que afectan la calidad de semen en toros. Trabajo de grado Médico
Veterinario. Bogotá: Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Medicina Veterinaria y
Zootecnia, 2009. 272 p.
20
CURTIS, Amann. Testicular development and establishment of spermatogenesis in Holstein
bulls. Thesis. Canada: University of Saskatchewan, 1981. 657 p.
21
JIMENEZ, Marco, et al. Effect of semen collection method on pre- and post-thaw Guirra ram
spermatozoa. Thesis Veterinary. Valencia: Valencian Institute of Agrarian Research, Animal
Research and Technology Center, 2005.756 p.
19
espermatozoides, su capacidad fecundante acompañada de daños en cromatina
o en la integridad del ADN22.
4.2.2 Método de colecta. La calidad en la motilidad espermática y el volumen del

eyaculado puede verse afectado por el sistema de colecta, en particular por el tipo
de aparato utilizado para la electro eyaculación, por el genotipo y por el medio
ambiente; los factores que pueden afectar la calidad seminal en toros son diversos
y pertenecen a un campo de la andrología muy amplio23.
4.2.3 Estrés térmico. Algunos investigadores como Godfrey24, sugieren que

toros Bos indicus sufrieron de estrés térmico por frío, lo que se reflejó en la calidad
del semen colectado en esa época del año. El estrés calórico, sumado a la
humedad, impide que los mecanismos termorreguladores del toro sean capaces
de mantener un equilibrio que no afecte la calidad seminal; se ha reportado que la
temperatura ambiental y la lluvia están correlacionadas positivamente con el
porcentaje de anormalidades espermáticas tanto en Bos indicus como cruces con
Bos taurus a una temperatura superior a los 31 °C25. En África se ha reportado
que el volumen, la concentración espermática y la morfología normal se ven
afectados durante la época de verano en toros Bos indicus, presentándose
diferencias entre individuos en cuanto a la capacidad de tolerancia al estrés
calórico; se hace importante tener en cuenta, además de la temperatura del día
de la colecta, la temperatura promedio de los días previos y especialmente
cuando los espermatozoides se encuentran en su última fase de maduración a
nivel del epidídimo, por no decir que los 60 días anteriores que involucren todo un
ciclo de espermatogénesis26.
4.2.4 Edad. Respecto a la edad, en general, las razas Bos taurus son más
precoces sexualmente y, por tanto, su calidad seminal en animales menores de 2
años es mejor en cuanto a motilidad, morfología y concentración; la alta
prevalencia de gotas citoplasmáticas proximales en toros cebú Brahman de 2 años
de edad puede ser el resultado de inmadurez sexual de este tipo de razas
comparadas a las Bos indicus bajo condiciones tropicales; toros Holstein de 7
años de edad mostraron una mayor morfología espermática normal en
22
LOZANO, Op. Cit., p. 243.
23
CISNEROS, Jadiel. Desarrollo de un método para la determinación rápida de la concentración
espermática en eyaculados de bovino, ovino y cerdo. Trabajo de Grado Médico Veterinario.
Mexico: Universidad de Veracruzana. Facultad de Veterinaria, 2011. 1-57p.
24
GODFREY, Lunstra, et ál. Effect of location and season on body and testicular growth in
Brahman and Hereford bulls. Thesis. Thexas: University Agricultural Research and Extension
Center, 1990. 529 p.
25
CHACON, J. Assessment of sperm morphology in zebu bulls, under field conditions in the tropics.
Thesis. Uppsala: University of Agricultural Sciences. Faculty of Veterinary Medicine. Department of
Obstetrics and Gynaecology, 2001. 91 p.
26
FUERST, Waltl, et ál. Effects of age and environmental factors on semen production and semen
quality of Austrian Simmental bulls. Thesis. Austria: University of Natural Resources and Applied
Life Sciences Vienna. Department of Sustainable Agricultural Systems, 2006. 95 p.
20
comparación con grupos de la misma raza de 3 y 5 años, mientras que para los
mismos grupos no hubo diferencias significativas respecto a la motilidad
espermática27.
La nutrición es un aspecto fundamental durante toda vida reproductiva del toro.

Tanto los excesos como los defectos en la dieta se pueden ver reflejados en la
calidad del semen a nivel de los espermatozoides y del plasma seminal. De
acuerdo con Vejarano28, la calidad del alimento es factor determinante que
contribuye al desarrollo de la pubertad y a la formación espermática durante su
vida productiva; los animales que reciben dietas balanceadas van a ser más
precoces que individuos que se consideran subalimentados; el peso corporal
ayuda a predecir la edad de pubertad en razas cebuinas, donde es importante
tener en cuenta la tasa de crecimiento antes y después del destete, la cual se
determina en forma importante con base en el crecimiento esquelético. Los toros
subalimentados retrasan la pubertad debido a la disminución en la producción de
factor de crecimiento insulinico uno (IGF-1) y, en consecuencia, se retarda la
producción de hormona Luteinizante (LH) y testosterona, hormonas de gran
importancia en la madurez sexual del macho; dietas balanceadas con pastos ricos
en energía, y un adecuado porcentaje de proteína, son benéficas en el inicio de la
pubertad, pues favorecen un desarrollo testicular más rápido, especialmente
durante edades entre 10 y 15 meses29.
Son variadas las características que le pueden ocasionar estrés a los bovinos,
pero quizás las que más puedan afectar la calidad seminal son las relacionadas
con la restricción alimenticia y las medioambientales, estas son las que presentan
más baja correlación con las principales variables espermática30.
4.2.5 Genética. Existe un creciente aumento de defectos estructurales en la

morfología del espermatozoide, anomalías que se hacen más marcadas cuando
aparece una interacción entre el medio ambiente y la predisposición genética; no
es casualidad que la identificación de los defectos genéticos se haga hoy en día
más manifiesta en el toro, el ritmo de crecimiento de la biotecnología aplicada en
esta especie ha hecho que los controles sean más estrictos en ella, ya que el no
respeto por los protocolos propuestos para la implementación de estas
biotecnologías, como la inseminación artificial, ha puesto de manifiesto estos
27
CHACON, Op. Cit., p. 14.
28
VEJARANO, O. Diagnóstico de la capacidad reproductiva de toros en ganaderías de tres
municipios del alto magdalena. Trabajo de Grado Médico Veterinario. Tolima: Universidad del
Tolima. Facultad de Medicina Veterinaria, 2005. 32p.
29
DUFAU, ML. et ál. Corticotropinreleasing factor: an antireproductive hormone of the testis, thesis.
Bethesda: National Institutes of Health. ection on Molecular Endocrinology, 1993. 307 p.
30
PIETRO et al. Efecto del invierno y el verano sobre el comportamiento reproductivo de toros
cruzados. En: Rev. MVZ Cordoba. vol. 12: 2007. p.921-928.
21
defectos31. Barth and Waldner32, citan como defectos hereditarios el síndrome de
cabeza plegada, cresta nuclear, cabezas gigantes, debilidad de la membrana,
mitocondrias y separación de la membrana mitocondrial.
4.3 SEMEN
4.3.1 Composición. El semen o esperma está compuesto por espermatozoides y

plasma seminal; este es un líquido que contiene todos los elementos necesarios
para la alimentación de los espermatozoides; una pequeña parte del plasma
seminal proviene del testículo y del epidídimo; la mayor parte (80%) de las
glándulas sexuales accesorias (próstata, vesícula seminal, y glándulas de
Cowper); el plasma proveniente de las glándulas accesorias se mezcla en el
momento de la eyaculación con los espermatozoides33.
Son múltiples los factores que pueden afectar la calidad del semen y si se tiene en
cuenta la predisposición de los técnicos inseminadores a no cumplir estrictamente
con las mínimas normas establecidas en los protocolos de IA, se ha hecho
necesario la evaluación del semen a utilizarse, ya sea que se vaya a inseminar
con semen fresco o crio preservado. Todo con miras a lograr el objetivo propuesto:
la preñez de la hembra inseminada; A continuación, se discuten los principales
aspectos sobre el tema.
4.3.2 Evaluación del semen La evaluación del semen se puede realizar

macroscópica y microscópicamente.
4.3.3 Evaluación macroscópica Es la primera en realizarse, abarca el volumen,

el color (apariencia), el olor y el pH34.
4.3.4 Volumen El volumen del eyaculado varía en el mismo individuo y de un

individuo a otro por efecto de su constitución genética, de la raza, de la edad, del
método y de la frecuencia de recolección, del clima, de la nutrición y de la
excitación sexual antes de la eyaculación35. En general se admite que el volumen
31
CHENOWETH, PJ, et ál. Characterizatio of gossypol-induced sperm abnormalities in
bulls. En: Theriogenology. Septiembre-diciembre, 2000, vol. 53 no.5,. p. 203.
32
BARTH, A y WALDNER, C. Factors affecting breedings soundness classification of beef bulls
examined at the western college of veterinay medicine. Can Vet. [En línea]. 2002. p.274-284.
[citado 18 de abril, 2015] Disponible en internet:<h ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles
/PMC339235/>
33
KING, G y MACPHERSON, W. Influence of seminal vesiculectomy on bovine semen. J. Dairy Sci
52: 1838-1842. 1969. [citado 15 de Julio, 2015] Disponible en
internet:<http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022030269868505>.
34 BARTH, A., G. Bo, and H. Tribulo. 2000. Curso de evaluación de toros y control de la calidad
seminal. Universidad católica de Córdoba: 55.
35
BARTH, Op. Cit., p. 276.
22
de las razas de aptitud lechera es superior al de las razas de aptitud cárnica 36. La
eyaculación media en bovinos según Hafez37, es de 4-6 Cm3 y puede variar entre
1-12 Cm3; los toros jóvenes pueden eyacular 1-3 Cm3, mientras que los adultos
10-15 Cm3. Aunque según Boggio38, el mejor método para la recolección del
semen es la vagina artificial, el uso del electro eyaculador proporciona un mayor
volumen (25 Cm3) pero con menor concentración y aunque no se han encontrado
diferencias significativas entre el primero y el segundo eyaculado recolectados en
un corto intervalo de tiempo, la significancia aumenta al incrementarse el número
de eyaculados consecutivos39.
4.3.5 Color y apariencia Varía desde el blanco grisáceo hasta el francamente

amarillento40. Su opacidad se halla en función de la concentración espermática;
los eyaculados muy buenos tienen apariencia granulosa (750 a 1000 millones de
espermatozoides por ml); el semen es bueno cuando su aspecto es lechoso (400
a 750 millones de espermatozoides por ml); es regular cuando su apariencia es
de leche aguada (250 a 400 millones de espermatozoides por ml); el semen es
malo si es translucido y acuoso (menos de 250 millones de espermatozoides por
ml)41. No obstante, es importante tener en cuenta que estas valoraciones son
subjetivas.
4.3.6 Olor Similar al de la leche fresca, no debe tener olores desagradables; el

olor a orina indica que el semen está contaminado con esta; cuando el olor es muy
desagradable se debe sospechar de alguna enfermedad en los testículos o en otra
parte del aparato reproductivo42.
4.3.7 pH Se ha podido comprobar su importancia sobre la vitalidad, motilidad,

fructolisis, respiración y fertilidad espermática; el pH puede variar de acuerdo a la
composición del plasma seminal (interacción de los aniones y los cationes), a la
concentración espermática, al tiempo transcurrido después de la recolección, al
clima y al grado de contaminación bacteriana43. Normalmente es un poco acido, su
valor varía entre 6.4 y 6.944.
36 PAPARELLA, G. 1997. Andrología bovina. Editorial de la Universidad Centro occidental

Lisandro Alvarado, Barquisimeto.
37
HAFEZ, Op. Cit, p. 375.
38 BOGGIO, J. C. 2007. Evaluación de la aptitud reproductiva potencial y funcional del toro.
Instituto de Reproducción Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Austral de Chile.
Valdivia.
39
PAPARELLA, Op. Cit., p. 24.
40 TIBISAY, L., and R. Gatica. 2002. Puede el análisis seminal per se predecir realmente la
fertilidad potencial en toros? Revista Científica, FCV-LUZ 12: 202-208.
41
42OLIVARES, R., and R. Urdaneta. 1985. Colección, evolución y procesamiento del semen de
toros. FONAIAP DIVULGA 17.
43
44
OLIVARES, Op. Cit., p. 14.
23
Existe una correlación negativa entre el pH, la concentración espermática y el
tiempo transcurrido después de la recolección; a medida que aumenta la
concentración de espermatozoides, hay un aumento de CO2 y ácido láctico en el
eyaculado, los cuales también aumentan a medida que se incrementa el tiempo
de recolección como consecuencia del metabolismo espermático; igualmente los
gérmenes presentes en el eyaculado contribuyen a producir CO 2 y ácido láctico al
competir con los espermatozoides en la utilización de las fuentes energéticas45.
Los factores climáticos, por lo menos en toros Holstein y Pardo Suizo, cuando les
ocasionan estrés (estrés calórico o shock térmico) afectan el pH haciéndolo
acido46.
En general puede decirse que a medida que baja el pH, disminuye la motilidad, la
fructolisis y la respiración47, mientras que, cuando el pH es alcalino, se observa
una concentración pobre generalmente acompañada por una disminución de la
vitalidad y de la fertilidad48. La alcalinidad del eyaculado suele deberse, la mayoría
de las veces, a la presencia de procesos inflamatorios en el tracto genital49.
4.3.8 Evaluación microscópica. Buscando hacer más predictivo el análisis de

la calidad seminal del toro, deben realizarse varias pruebas y evaluaciones
microscópicas (concentración, motilidad, supervivencia, morfología, integridad
acrosómica, presencia de células extrañas y aglutinación), acompañadas de
pruebas complementarias (integridad y funcionalidad de la membrana
espermática, fragmentación de ADN, penetración in vitro, pruebas bioquímicas),
ya que las macroscópicas por si solas, no son lo suficientemente valederas para
calificar una muestra50.
Algunas de estas pruebas, se valoran subjetivamente, aspecto, que, desde el rigor

científico, pierden valor predictivo respecto a la fertilidad de un semen. Otras
permiten su valoración cuantitativa, aspecto que permite un análisis más objetivo.
4.3.9 Supervivencia o Vitalidad. Prueba implementada para determinar el

porcentaje de espermatozoides vivos y muertos en frotis teñidos con
45
46 Valle, A., A. Fuentes, and M. Puerta. 2005. Influencia de factores climáticos sobre las
características seminales de toros Holstein y pardo suizo nacidos en el trópico. Revista de la
Facultad de Agronomía- LUZ 22: 54-64.
47
48
OLIVARES, Op. Cit., p. 14
49 NATUPE. Examen de la calidad del semen para su uso en inseminación artificial. Ciencia
Animal. 2008. LatinPedia.
50
BART, Op. Cit., p. 276.
24
eosina/nigrosina; observándose que los espermatozoides teñidos total o
parcialmente son los muertos y los no teñidos los vivos 51.
4.3.10 Morfología. La evaluación morfológica del espermatozoide debe ser

usada como un indicador de fertilidad, pues señala la calidad del semen, de ahí la
importancia de conocer el tipo de anormalidades que afectan a los
espermatozoides, distinguiendo las primarias de las secundarias; esta clasificación
aunque aún es la más usada en la bibliografía, no por ello la más exacta 52.
Gomez53 y Paparella54 recomiendan que en la actualidad, quizás lo más adecuado
sea identificar las anormalidades por su ubicación dentro de la estructura del
espermatozoide y la relación de cada una de ellas con la fertilidad, sin dejar de
reconocer que aún se requieren muchos estudios para poderlo dilucidar
fehacientemente en todos los casos.
La evaluación morfológica puede realizarse en frotis teñidos con eosina-

nigrosina55, mediante fijación en solución salina formolada (en dilución 1:1)56 o en
muestras fijadas en una solución de glutaraldehido al 2% tamponada con
cacodilato57 para luego ser observadas en un microscopio de contraste de fase
(400X)58.
4.3.11 Integridad acrosómica. El acrosoma es un peque o deposito situado en e

e tre o apica de a cabe a de esper ato oide, tiene for a de capsu a, contiene
en i as isos icas co o a ia uronidasa a acrosina cu a funci n es e
debilitamiento y la ruptura de las distintas membranas que envuelven el ovulo; se
encuentra ubicado entre la membrana acrosomal externa, la cual esta adosada a
la membrana celular y la membrana acrosomal interna, adosada a la membrana
nuclear59.
51
TAMULI, M. K., and P. F. Watson. 1994. Use of a simple staining technique to distinguish
acrosomal changes in the live sperm sub-population. Animal Reproduction Science 35: 247-254.
52
GOMEZ, M. V., and A. L. Migliorisi. 2009. Protocolo para la evaluación de semen en rumiantes.
Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad Nacional de la Plata: 9.
53
Ibid., p. 14
54
55
TAMULI, Op. Cit., p. 127.
56
DÍAZ, O., H. Mesa, J. G. Valencia, G. Gomez, and F. J. Henao. 2009. Evaluación de la integridad
acrosomal y la funcionalidad bioquímica de la membrana espermática en cerdos reproductores con
gotas citoplásmicas persistentes. Revista Científica, FCV-LUZ 19: 500-505.
57
PURSEL, V. G., L. A. Johnson, and G. B. Rampacek. 1972. Acrosome morphology of boar
spermatozoa incubated before cold shock. Journal Animal Science 34: 278-273.
58
MADRID, N., S. Perez, M. Oter, A. Gutierrez, and J. De l Fuente. 2002. Determinacion in vitro de
la capacidad fecundante del semen descongelado de toros de la raza rubia gallega. Revista
Cientifica, FCV-LUZ 12: 699-706.
59
CROSS, N. L., and S. Meizel. 1989. Methods for evaluating the acrosomal status of mammalian
sperm. Biology of Reproduction 41: 635-641.
25
Las alteraciones del acrosoma están íntimamente asociadas a los defectos de la
cabeza, muchos de ellos suelen presentarse por errores en la técnica de
coloración o manipulación de la muestra del semen coleccionado, o errores en el
manejo del semen congelado60. Cabezas piriformes y angostas presentan la zona
acrosomal más estrecha, el acrosoma puede muchas veces estar aumentado de
tamaño, generalmente conteniendo un quiste o un cuerpo de inclusión que se
pliega en la región apical de la cabeza del espermatozoide, defecto que parece
deberse a un gen recesivo, aparentemente heredable; muchos de estos defectos
fueron observados en situaciones de estrés del animal y corregidos una vez
superado el mismo61. La integridad de la membrana acrosomal es fundamental en
el proceso de fertilización del ovocito, puesto que los espermatozoides de los
mamíferos deben someterse a una capacitación en el tracto reproductivo de la
hembra bovina antes de iniciar propiamente la reacción acrosómica 62, la cual se
caracteriza por la liberación exocitocica del contenido del acrosoma que resulta de
la fusión de ambas membranas cromosomales liberando varias enzimas
lisosomales ( Hialuronidasa, acrosina, y tripsina) que ayudan al espermatozoide,
junto con algunas glicoproteínas de la zona pelúcida a avanzar hacia el ovolema63.
La membrana acrosomal post-descongelación, también se ve afectada por el

elevado grado de contaminación con microorganismos inespecíficos, que si bien
son incapaces de provocar una enfermedad reproductiva, pueden afectar la
viabilidad de los espermatozoides al competir con ellos por el oxígeno y los
nutrientes64.
La integridad acrosomal suele evaluarse fijando los espermatozoides con

glutaraldehido al 2% (en dilución 1:1) y se clasifican en un microscopio de
contraste de fases a 400X de magnificación, en dos conteos independientes de
100 cada uno65, luego y de acuerdo con la clasificación propuesta por (Pursel et
al., 1972) se determina el porcentaje de células así: cresta apical normal (NAR),
cresta apical dañada (DAR), cresta apical perdida (MAR) y capuchón acrosómico
suelto (LAC). Igualmente se puede usar para la evaluación la tinción de Wells-
Awa (Wells and Awa, 1968). En este caso la clasificación se realiza en un
microscopio de luz convencional a 1600X de magnificación y contando 200
espermatozoides, teniendo en cuenta aquellos que presentan la cresta apical lisa
y entera como íntegros66.
60
CATENA, M., and J. Cabodevila. 1999. Evaluación del semen congelado. Taurus 1: 18-31.
61
NATUPE, Op. Cit., p. 58.
62
Bedford, J. 1983. Significance of the need for sperm capacitation. Biology of Reproduction 28:
108-120.
63
GUZMAN, L., and S. Pérez. 2007. Inducción de la reacción acrosómica en espermatozoides de
ratón mediante solubilizados de zona pelúcida de alpaca. Rev Peru biol 13: 227-229.
64
CATENA, Op. Cit., p. 22.
65
DIAZ, Op. Cit., p. 356
66
Ibid., p. 356
26
4.3.12 Integridad y funcionalidad de la membrana plasmática. La membrana
plasmática de los espermatozoides, independientemente de su composición, tiene
una estructura organizada, se compone básicamente de lípidos amfipaticos,
proteínas y un pequeño porcentaje de carbohidratos; los lípidos (colesterol y
ácidos grasos) son los componentes más abundantes67; la mayoría son
fosfolípidos (fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol, lisofosfatidilcolina, y
esfingomielina)68. Estos lípidos son los que determinan la fluidez y la resistencia
de la membrana durante los procesos de crio preservación69.
De acuerdo con Avila70, las membranas celulares son las estructuras que sufren
mayor daño en los procesos de congelación, debido a la perdida de fluidez de sus
componentes lipídicos; la transición de lípidos fluidos a sólidos se da a una
temperatura de 10 - 16°C alterando de esta manera las funciones de la
membrana, dándole un alto grado de fragilidad, afectándose según lo reconocen la
permeabilidad de su estructura, incluso cuando no se han producido cambios de
estado inducidos por la variación de la misma71. Durante la deshidratación celular,
que tiene lugar en este proceso, se puede presentar una pérdida de lípidos,
lesionando su integridad por perdida de la capacidad de expansión durante la
rehidratación al volver a condiciones isotónicas72. Los procesos de congelamiento
y crio-preservación del material seminal están ligados al comportamiento de las
membranas de los espermatozoides, en ellas influye el nivel de colesterol, cuando
la membrana tiene poco es más fluida y se rompe más fácilmente; si tiene más, es
más resistente al congelarse73; si el crio-preservante es agregado de forma
abrupta se puede observar daño en la membrana plasmática, región acrosomal y
configuración de la cola74.
Los espermatozoides de los mamíferos se caracterizan por su capacidad de

generar sustancias ROS, pequeñas moléculas que incluyen anión superóxido,
peróxido de hidrogeno y el radical hidroxilo, necesarios fisiológicamente para la
capacitación y reacción acrosómica, pero sus altas concentraciones favorecen la
perdida de la integridad de la membrana espermática y la fragmentación del
ADN75.
67
68
Pezzone, N. 2008. Análisis de la composición del semen de los animales domésticos.
LatinPedia.
69
70
Ibid., p. 148.
71
RUBIO, L., A. A. Quintero, and D. M. González. 2009. Efecto de la crio preservación sobre la
integridad de la membrana plasmática y acrosomal de espermatozoides de toros. Revista
Científica, FCV-LUZ 19: 382-389.
72
73
CISALE, H. 2008. La espermatología. Revista critica de Argentina 405.
74
75
BOUVET, B., C. Paparella, and R. Feldman. 2000. Estres oxidativo y su efecto sobre la calidad
seminal. Facultad de ciencias bioquímicas y farmacéuticas. Universidad Nacional del Rosario.
Argentina.
27
La integridad se puede evaluar con colorantes específicos, siendo los más
importantes la eosina-nigrosina y el tripan azul76; la funcionalidad bioquímica de
la membrana espermática se evalúa mediante la prueba de HOST, que es una
prueba de la permeabilidad de la membrana vía endosmosis (Hipoosmotic
Swelling Test), basada en las propiedades físicas y bioquímicas de la membrana
plasmática77. Esta prueba ha sido utilizada con éxito y con variados dilutores en
diferentes especies como la ovina, porcina, bovina, etc78. El conteo se realiza en
un microscopio de contraste de fases a una magnificación de 400X, siendo
positivos aquellos flagelos enrollados totalmente, enrollados parcialmente,
acodados o acodados tenues, expresando el resultado porcentualmente después
del conteo de 200 espermatozoides79.
Investigaciones como las de Vélez80, han sugerido que los genotipo responden,
respecto a su sexualidad, de diferente manera, dependiendo de su interrelación
con los factores agro climatológicos. Tanto el Bos indicus como el Bos taurus,
presentan características específicas y diferentes, cuando su semen es crio
preservado o cuando es sometido al efecto detrimental y a la injuria por errores en
su manipulación81.
76
77
CORREA, J., G. Heersche, and P. Zavos. 1997. Sperm membrane functional integrity and
response of frozen-thawed bovine spermatozoa during the hipoosmotic swelling test incubation at
varying temperatures. Theriogenology 47: 715-721.
78
CABRERA, P., and C. Pantoja. 2008. Influencia de los dilutores tris y ovine freezing sobre la
integridad de la membrana citoplasmatica durante la congelación de semen de ovinos en pajillas
de 0.5ml. Rev Inv Vet Peru 19: 152-159.
79
RUBIO, Op. Cit., p. 385.
80
VÉLEZ. Leonardo. -CASTAÑEDA, CLARA RUGELES-PINTO Y OSCAR VERGARA GARAY.
Efecto de la raza sobre las características reproductivas de toros manejados en sistemas
extensivos. Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XXIV, Nº 4, 341 - 346, 2014.
81
VILLA, Norberto. Evaluación del Efecto de la Técnica Instrumental Sobre la Calidad del Semen
Bovino, Congelado-Descongelado, en el Centro de Colombia. Trabajo
de Maestría. Manizales: Universidad de Caldas. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia,
2010. 120p.
28
5. DISEÑO METODOLÓGICO
5.1 UBICACIÓN GEOGRAFICA DEL PROYECTO
El trabajo se realizó en el Laboratorio de biotecnología reproductiva animal

(LABRA), en el Centro de Investigación Santa Lucia, propiedad del Instituto
Universitario de la Paz, ubicado al margen izquierdo del kilómetro 14 vía que
conduce de Barrancabermeja a Bucaramanga, vereda el Zarzal, en jurisdicción del
municipio de Barrancabermeja en el Magdalena medio santandereano con las
siguientes coordenadas geográficas: atitud norte 7° 0.3’ 48’’, ongitud oeste 73°
52’ 50’’, con una te peratura 38°C, con un pro edio de precipitaci n anua 2008
mm, humedad relativa de 77% a 85%, altitud de 75 m.s.n.m.
5.2 MATERIALES Y METODOS
5.2.1 Materiales
12 pajillas con semen del genotipo Brahmán

12 pajillas con semen del genotipo Gyr
Reactivos
Microscopio de campo claro
Microscopio de contraste de fase
Centrifuga
Baño maría
Micro pipetas
Laminas porta objetos
Laminillas
Puntas
Corta pajillas
Accesorios de limpieza de laboratorio.
5.2.2 Materiales de apoyo
Computador
Formato de registros
Elementos de oficina
5.2.3 Método
Se trabajó con un diseño aleatorizado, cuyo factor de evaluación fue el método de

descongelación. Se establecieron cuatro tratamientos.
5.2.4 Distribución de los tratamientos
29
T1: Descongelación del semen a 37°C durante 30 segundos (3 pajillas de
Brahmán y 3 pajillas Gyr)
T2: Descongelación en la axila durante 30 segundos (3 pajillas de Brahmán y 3
pajillas Gyr)
T3: Descongelación a 37°C durante 8 minutos (3 pajillas de Brahmán y 3 pajillas
Gyr)
T4: Descongelación a 37°C durante 30 segundos, previa extracción incorrecta de
la pajilla (choque térmico) (3 pajillas de Brahmán y 3 pajillas Gyr)
5.2.5 Centrifugación del semen
Con el objetivo de facilitar la valoración espermática se hizo necesario centrifugar

el semen empaquetado en pajillas con el fin de eliminar el crio preservante, el cual
dificulta la valoración microscópicamente. Se siguió el protocolo propuesto por
Brackett y Oliphan82, el semen se depositó en el tubo de ensayo con 3.5ml de PBS
atemperado a 37⁰C y se centrifugo a 1500 RPM durante 5 minutos, se extrajeron
3.5ml de sobrenadante, se depositaron nuevamente 3.5ml de PBS y nuevamente
se centrifugo la muestra a 1500 RPM durante 5 minutos, se extrajeron los 3.5ml de
sobrenadante os 500μ restantes se depositaron en un eppendorf dispuesto para
la muestra
5.2.6 Variables a evaluar
Resistencia de la membrana plasmática (RMp)

Integridad de la membrana acrosomal (IMa)
Integridad de RMp/IMa, conjuntamente
Siguiendo el protocolo propuesto por Prathalingam83, en el baño María (37⁰ C) se

colocaron durante 5 minutos, la solución ORT y la muestra de semen, cumplidos
os 5 inutos, se adicionaron 100μ de a uestra de se en a a so uci n ORT
esta se dejó en el baño maría 30 minutos más. De esta muestra (semen y solución
ORT) se tomaron 50μ se adicionaron a un tubo eppendorf para fijar la muestra.
Luego de ho ogeni ar a en e Vorte se depositaron 5μ sobre una á ina
portaobjetos, se cubrieron con una laminilla, se dejó secar por 2 minutos, luego se
realizaron 2 conteos de 100 espermatozoides vivos por variable en el microscopio
de contraste de fase (400X) para determinar la resistencia de la membrana
82
BRACKETT, Benjamin, y OLIPHANT, Gene. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro [en linea] Biology of
Reproduction, 2010 [citado 12 julio 2017]. Disponible en internet :<http://www.
biolreprod.org/content/12/2/260>. ISSN 260-274.
83
BRACKETT, Benjamin, y OLIPHANT, Gene. Capacitation of rabbit spermatozoa in vitro [en linea] Biology of
Reproduction, 2010 [citado 12 Julio 2015]. Disponible en internet:<http:/ /www.
30
plasmática (RMp), la integridad de la membrana acrosomal (IMa), y la resistencia
e integridad de ambas membranas conjuntamente.
5.3 HIPÓTESIS
5.3.1 Hipótesis nula H0: la resistencia de los genotipos a la descongelación

afecta de igual forma la integridad de las membranas espermáticas.
5.3.2 Hipótesis alterna H1: la resistencia de los genotipos a la descongelación

afecta de diferente forma la integridad de las membranas espermáticas.
5.4 TRATAMIENTO DE LA INFORMACIÓN
Desde la prueba de normalidad y homocedasticidad, se estableció el

quebrantamiento de la normalidad de datos lo que permitió definir el uso de
estadística no paramétrica, para así establecer el comportamiento por variable
entre genotipos.
La comparación entre genotipos por tratamiento se llevó a cabo mediante la

prueba de Kruskal-Wallis con el objetivo de establecer la similitud (p>0,05) o
diferencia de medias (p<0,05).
Las valoraciones se realizaron utilizando el programa IBM SPSS Statistics 21.
31
6. RESULTADOS
Tabla 1. Significancia y medias entre los genotipos (Brahmán-Gyr) para las

variables evaluadas cuando se implementó el tratamiento convencional
(descongelación a 37°C durante 30s)
Variables Significancia Lectura Medias

RMp 0,050 Rechazar la hipótesis nula Brahmán 52,33
Gyr 61,33
IMa 0,375 Retener la hipótesis nula Brahmán 59,00
Gyr 60,33
RMp/IMA 0,043 Rechazar la hipótesis nula Brahmán 44,33
Gyr 56,00
Figura 1. Comparación de medias entre los genotipos para la variable RMp-

Tratamiento convencional (37°C durante 30s)
Fuente. Jorge Camargo.
32
Figura 2. Comparación de medias entre los genotipos para la variable IMa.
Figura 3. Comparación de medias entre los genotipos para la variable RMp/IMa.

33
Como se pudo apreciar anteriormente en las figuras 1 y 3 se observó una
diferencia significativa donde se puede concluir que la raza Gyr obtuvo mayor
cantidad de células viables.
Tabla 2. Significancia y medias entre los genotipos brahmán y Gyr para las
variables evaluadas cuando se implementó la descongelación en la axila.
Variables Resultado de Lectura Medias

la significancia
RMp 0,046 Rechazar la Brahmán 18,33
hipótesis nula Gyr 37,66
IMa 0,046 Rechazar la Brahmán 18,66
RMp/IMA 0,050 Rechazar la Brahmán 14,33
Figura 4. Comparación de medias entre los genotipos para la variable RMp

cuando se descongelo en la axila
Figura 5. Comparación de medias entre los genotipos para la variable IMa cuando
se descongelo en la axila
34
Figura 6. Comparación de medias entre los genotipos para la variable RMp/IMa

cuando se descongelo en la axila.
En el método de descongelación anterior se pudo identificar que en las variables

evaluadas hubo diferencia significativa, siendo el genotipo Gyr con mayor cantidad
de células viables.
35
Tabla 3. Significancia y medias entre los genotipos Brahmán y Gyr para las
variables evaluadas cuando se descongelo a 37°C durante 8 minutos.
Variables Resultado de Lectura Medias

la significancia
RMp 0,072 Retener la Brahmán 40,66
IMa 0,077 Retener la Brahmán 35,66
RMp/IMA 0, 637 Retener la Brahmán 37,66

cuando se descongelo en a 37°C durante 8 minutos
36
Figura 8. Comparación de medias entre los genotipos para la variable IMa cuando
se descongelo en a 37°C durante 8 minutos

cuando se descongelo en a 37°C durante 8 minutos
Al realizar la descongelación a 37°C durante 8 minutos no se observó ninguna

diferencia significativa entre los genotipos.
37
Tabla 4. Significancia y medias entre los genotipos Brahmán y Gyr para las
variables evaluadas cuando se sometió la pajilla a shock térmico por extracción
incorrecta
Variables Resultado Lectura Medias

de la
Significancia
RMp 0,050 Rechazar la Brahmán 33,33
IMa 0,046 Rechazar la Brahmán 39,33
RMp/IMA 0,050 Rechazar la Brahmán 29,33
cuando se extrajo incorrectamente la pajilla del termo de crio preservación
cuando se extrajo incorrectamente la pajilla del termo de crio preservación
38
cuando se extrajo incorrectamente la pajilla del termo de crio preservación.
En el método de descongelación anterior se pudo identificar que en las tres

variables evaluadas hubo diferencia significativa, siendo el genotipo gyr con mayor
cantidad de células viables.
39
7. DISCUSIÓN
Decuadro84, dice que no son tan numerosas las investigaciones realizadas sobre
cual es realmente el efecto de estos errores en el protocolo sobre la calidad
seminal y la respuesta especifica por genotipo. Esto se refiere a las condiciones
de almacenamiento de las dosis y al protocolo de descongelación utilizado, que en
general no son tenidos en cuenta al momento de evaluar el resultado final de la
inseminación realizada. El proceso de descongelación del semen es de extremo
cuidado, porque actualmente se comercializan pajillas con semen empaquetado
de 0,50 o 0,25 cm3, envases plásticos cuya relación superficie-volumen es muy
elevado, lo que las torna altamente sensibles a cualquier cambio del protocolo;
únicamente cumpliendo de manera estricta el protocolo, podrá garantizarse que el
semen inseminado conserve la máxima calidad respecto de la original85
Estos trabajos coinciden con los de los trabajos de Rubio-Guillen86 en el 2009, que
permitieron evidenciar como los espermatozoides resisten de manera diferente los
efectos detrimentales de la crio preservación; los estudios confirman que el daño
criogénico puede ocurrir indistintamente sobre la integridad estructural y funcional
de la membrana plasmática y acrosomal, lo que afectaría la capacidad fecundante
de las muestras seminales destinadas a inseminación artificial.
Se presentó diferencia significativa (p<0,05) entre los genotipos, porcentualmente

a favor de la raza Gyr en tres de los 4 tratamientos implementados. No obstante,
con excepción del tratamiento convencional (37°C durante 30s), los resultados no
superan el 40% propuesto para la IMp y el 50% para la IMa lo propuesto por
Barth87 et al. En el 2000; Catena and Cabodevila88; Gómez and Migliorisi89 en el
2009, basados en las normas mínimas exigidas por el Departamento de Medicina
del Rodeo y Teriogenologia de la Universidad de Saskatchewan, Canadá y que se
corresponden con las de las normas ISO 9002.
Hafez90 en el 2002 asegura que Inseminar con semen descongelado con

porcentajes por debajo de los mínimos de integridad exigidos para sus diferentes
estructuras exigidos, comprometería la fertilidad y la productividad del hato en
general, si se tienen en cuenta todos los aspectos relacionados con el transporte
84
DECUADRO-Hansen G. 2010. Manejo del semen en un programa de IATF: aspectos críticos para preservar
la fertilidad (conferencia). Resúmenes 5º Jornadas TAURUS de Reproducción Bovina, Campus Nuestra
Señora del Pilar, Universidad del Salvador, Buenos Aires, Argentina.
85
BERNARDI, S F; Di Prinzio, M; Maglione, D; Rinaudo, A; Marini, P R. Efecto del protocolo de descongelación
del semen sobre el porcentaje de preñez en bovinos lecheros. Revista Veterinaria 26 (1): 2015. p. 27.
86
RUBIO Y GUILLEN, Op. Cit., p. 384.
87
BARTH, Op. Cit., p. 270
88
CATENA AND CABODEVILA, Op. Cit., p. 30.
89
GOMEZ, M. V., and A. L. Migliorisi, Op. Cit,
90
HAFEZ, op. Cit, p. 374.
40
del espermatozoide y la capacitación espermática a que están sometidas estas
células antes de alcanzar el ámpula del oviducto y ser capaz de fecundar un óvulo
Los resultados en este trabajo difieren a los encontrados por Villa et al91 en el
2015, no encontró diferencia significativa (p>0,05) entre los genotipos por efecto
de los mismos tratamientos y para las mismas variables con semen de toros
diferentes a los evaluados en este trabajo, pero similitud en lo que respecta a la
resistencia a la injuria a favor del genotipo Gyr.
Montes et al92; en el 2012, trabajando con heparina como inductor de la reacción

acrosómica en semen congelado-descongelado con genotipos Brahmán y Gyr, no
encontraron diferencia significativa (p>0,05) para las variables de movilidad y
morfología total entre ambas razas, no obstante, porcentualmente, aunque en
poca proporción, se afectó menos el semen del genotipo Gyr.
Moron y Moron93, evaluando semen en fresco no encontraron diferencia

significativa (p<0,05) para la morfología general entre los genotipos Brahmán y
Gyr en diferentes épocas del año en el Cesar (Colombia).
En este trabajo se pudo evidenciar que las muestras seminales de los toros
resisten de manera distinta el proceso de congelación- descongelación seminal,
concepto que coincide con los encontrados por Koivisto et al94 en el 2009. Iguales
conceptos encontraron Bujenene and Boussaq95, para toros del Bos Taurus. De
allí que muchas veces se puede encontrar toros destinados a IA, con excelentes
parámetros de calidad seminal en las muestras frescas y que sean catalogados
posteriormente como malos congeladores, obteniendo diferentes fertilidades a
91
VILLA, Norberto; CHAVERRA, Swelen; GARCIA, Darwin Antonio; NIETO, Natalia; ORTIZ, Jorge. Efecto de la
temperatura sobre el semen criopreservado de dos genotipos bovinos del Bos indicus. Revista CITECSA.
2015. 6 (10): 52-74.
92
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reacción acrosómica con heparina en semen congelado de toros Brahmán y Gyr. Rev. U.D.C.A Act. & Div.
Cient. 15(2): 2012. p. 435.
93
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reproductores en invierno y verano en el Departamento del Cesar. Trabajo Final Para optar al grado
académico de especialista en reproducción bovina. Universidad Nacional de Córdoba. Instituto de
reproducción animal córdoba (IRAC) Barranquilla, Colombia. 2015. P. 27
94
KOIVISTO, MB; Costa, MTA; Perry, SHV; Vicente, WRR.. The Effect of Season on Semen Characteristics and
Freezability in Bos indicus and Bos taurus Bulls in the Southeastern Region of Brazil. Reproduction in
Domestic animals. Vol 44, (4): 2009. p. 589.
95
BOUJENANE I AND BOUSSAQ K. Breed effects on semen traits of dairy and beef artificial insemination bulls.
Livestock Research For Rural Development. 26 (6) 2014.
41
nivel de campo de acuerdo con lo encontrado por Madrid-Bury96, en el 2004; y
Rubio Guillén et al97, en el 2007.
Algunos autores reportan que los toros Bos Indicus presentan siempre una menor
producción y menor calidad espermáticas, sin importar bajo qué condiciones se
encuentran en comparación con los Bos Taurus (Fields et al; 1979). Igual
concepto se encuentra en las investigaciones de Brito et al98; en el 2002, tanto
para semen fresco como congelado-descongelado.
96
MADRID-Bury, N. Relación entre los métodos de valoración seminal in vitro y la fertilidad in vivo del
semen descongelado de toros frisones. Madrid, España: Universidad Complutense de Madrid, España.
División de Estudios de Postgrado. Facultad de Veterinaria. Tesis Doctoral. 2004. 1-164 p.
97
RUBIO Y GUILLEN, Op. Cit., p. 384.
98
L. F.C. Brito, A. E.D.F. Silva, L. H. Rodríguez, F. V. Vieira, L. A.G. Deragon, J. P. Kastelic.. Effect of age and
genetic group on characteristics of the scrotum, testes and testicular vascular cones, and on sperm
production and semen quality in AI bulls in Brazil. Animal Reproduction. Volume 58, Issue 6, 2002. Pages
1177
42
8. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados estadísticos para la descongelación a 37º durante 30

segundos, el Gyr obtuvo los mejores resultados para la resistencia de la
membrana plasmática, para la integridad de la membrana acrosomal, y para las
dos juntas. En la descongelación en la axila el Gyr obtuvo los mejores resultados
para cada una de las variables evaluadas, en la descongelación a 37ºC durante
ocho minutos no hubo diferencia significativa entre tratamientos sobre los
genotipos, en las injurias causadas sobre el cuello del termo el Gyr resistió más,
obteniéndose los mejores resultados para cada una de las variables (RMP, IMA,
RMP/IMA).
Lo anterior hace pensar que el semen del genotipo Gyr tiene más resistencia a los
cambios de temperaturas al momento de la descongelación, que el semen del
genotipo brahmán, aportándole cierta ventaja al momento de realizar la
inseminación artificial.
43
9. RECOMENDACIONES
Comprobar los resultados de laboratorio con pruebas de campo en la

inseminación artificial.
Hacer evaluaciones con más variables que determinen la viabilidad seminal al

momento de la inseminación.
En la inseminación artificial se recomienda descongelar a 37ºC por 30 segundos

para asegurar un mayor número de espermas viables.
44
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51
ANEXOS
52
Anexo 1. Preparación de solución host y Ort.
Anexo 2. Conteos de membranas en microscopio de contraste.
53
Anexo 3. Espermatozoide reactivo a solución host.
Nótese la cola enrollada que marca la flecha.
54

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Figura 2. Comparación de medias entre los genotipos para la variable IMa.

Figura 3. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

Figura 4. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

Figura 5. Comparación de medias entre los genotipos para la variable IMa

Figura 6. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

Figura 7. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

Figura 8. Comparación de medias entre los genotipos para la variable IMa

Figura 9. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

Figura 10. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

Figura 11. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

Figura 12. Comparación de medias entre los genotipos para la variable

Anexo 1. Preparación de solución host y Ort. 53

La implementación de los programas de inseminación artificial, conllevan a la

The implementation of artificial insemination programs entails the use, in most

Según Foote1, la inseminación artificial (IA), es la biotecnología reproductiva de

Nebel2, describe que la crio-preservación del semen a -196°C interrumpe los

El objetivo de este trabajo es “evaluar la respuesta del genotipo Brahmán y Gyr al

La implementación de los programas de Biotecnología Reproductiva animal ha

No obstante, estas técnicas no están exentas de problemas. Cuando se utiliza

La implementación de metodologías biotecnológicas, en aras de mejorar la

3.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar la resistencia de las membranas espermáticas al efecto de congelamiento

3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar la respuesta del genotipo (Brahmán- Gyr) al efecto de cuatro métodos

Valorar la respuesta del genotipo (Brahmán- Gyr) al efecto de cuatro métodos de

Establecer la respuesta del genotipo (Brahmán- Gyr) al efecto de cuatro métodos

4.1 INSEMINACIÓN ARTIFICIAL

Se entiende por inseminación artificial el conjunto de técnicas implementadas con

La obtención de un protocolo ideal de crio preservación entre los que se tiene en

4.2 FACTORES QUE AFECTAN LA CALIDAD DEL SEMEN BOVINO

4.2.1 Crio-preservación. El semen sometido a crio-preservación está sujeto al

4.2.2 Método de colecta. La calidad en la motilidad espermática y el volumen del

4.2.3 Estrés térmico. Algunos investigadores como Godfrey24, sugieren que

La nutrición es un aspecto fundamental durante toda vida reproductiva del toro.

4.2.5 Genética. Existe un creciente aumento de defectos estructurales en la

4.3.1 Composición. El semen o esperma está compuesto por espermatozoides y

4.3.2 Evaluación del semen La evaluación del semen se puede realizar

4.3.3 Evaluación macroscópica Es la primera en realizarse, abarca el volumen,

4.3.4 Volumen El volumen del eyaculado varía en el mismo individuo y de un

4.3.5 Color y apariencia Varía desde el blanco grisáceo hasta el francamente

4.3.6 Olor Similar al de la leche fresca, no debe tener olores desagradables; el

4.3.7 pH Se ha podido comprobar su importancia sobre la vitalidad, motilidad,

36 PAPARELLA, G. 1997. Andrología bovina. Editorial de la Universidad Centro occidental

4.3.8 Evaluación microscópica. Buscando hacer más predictivo el análisis de

Algunas de estas pruebas, se valoran subjetivamente, aspecto, que, desde el rigor