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INSTRUCTIVO DE ENSAYO
Versión : 04
DETERMINACIÓN DE NITRITOS POR COLORIMETRIA.
S.M. 4500-NO2- . B. Fecha: 21/10/2020
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1. OBJETIVO
Establecer la metodología para la determinación de nitritos por el método colorimétrico (Espectrofotometría).
S.M. 4500-NO2- B.
2. ALCANCE
Esta técnica se aplica en el Laboratorio de Calidad Ambiental para el recurso hídrico superficial, en un rango de
concentraciones entre 0.006 y 0.20 mg N-NO2-/L.
CÓDIGO DEL INSTRUCTIVO DE ENSAYO: DETERMINACIÓN DE NITRITO EN AGUAS POR MÉTODO COLORIMÉTRICO
FECHA DE INFORME DE ESTANDARIZACIÓN: 28-Junio de 2018
PARÁMETRO VALOR UNIDADES OBSERVACIÓN
LIMITE DE CUANTIFICACIÓN 0.0060 mg N-NO2- /L Corresponde al límite de cuantificación
1.88 % Std bajo 0.010 mg N-NO2 /L
PRECISIÓN EN TÉRMINOS DE % CV
0.168 % Std alto 0.10 mg N-NO2 /L
1.13 % Std bajo 0.010 mg N-NO2 /L
EXACTITUD EXPRESADO COMO %
DE ERROR RELATIVO 0.35 % Std alto 0.10 mg N-NO2 /L
9.25 % Std CALA
RANGO DE TRABAJO (Lectura
0.0060-0.20 mg N-NO2- /L Sin dilución de la muestra
Directa)
3. DEFINICIONES
• Matriz fortificada: (LFM): Es una porción adicional de una muestra a la que se añade una cantidad
conocida del analito de interés. Se utiliza para evaluar la recuperación del analito en una matriz de la
muestra. (Muestra adicionada).
• Matriz fortificada: (LFMD): Duplicado de la matriz fortificada
• mg N - NO2 – /L = miligramos de nitrógeno en la forma de nitrito por litro
• BK: Blanco
• CCV: Verificación continua de la calibración
• ICV: Verificación Inicial de la Calibración
• LCM: Limite de Cuantificación del Método.
• LDM: Limite de Detección del Método
• LIA: Límite Inferior de Alarma.
• LIC: Límite Inferior de Control.
• LSA: Límite Superior de Alarma.
• LSC: Límite Superior de Control.
• S.M.: Estándar Método.
Antes de iniciar el análisis químico, revisar el Sistema de Gestión y Seguridad en el trabajo E-SGI-ST-M001 las
hojas de seguridad.
Utilizar los implementos de seguridad, de acuerdo a lo señalado en el instructivo. En esta técnica son: bata,
pantalón, zapatos antideslizantes, gafas de seguridad, máscara con filtro para vapores ácidos y guantes de
nitrilo.
Los residuos producto del análisis de la determinación, se tratan de acuerdo al documento disposición de
muestras y residuos de análisis.
Antes de operar los equipos verificar que se encuentran en óptimas condiciones, siguiendo los instructivos de
manejo de equipos y realizando las verificaciones indicadas al respecto, como lo indican estos. Diligenciar el
formato de control diario de manejo del equipo.
5.1 Equipos
• Balanza analítica.
• Plancha de calentamiento.
• pH metro.
• Agitador magnético.
• Equipo de filtración al vacío.
• Espectrofotómetro: UV-VIS, para usar a 543 nm proporcionando un haz de luz de 1 cm o más.
Comprobar que los equipos se encuentran en óptimas condiciones, antes de operarlos. Diligenciar el formato M-
S-LC-F007 de control diario de manejo del equipo.
Código: M-S-LC-I034
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• Verificar la balanza analítica con las masas antes de realizar cualquier pesaje teniendo en cuanta los
instructivos M-S-LC-I048 Instructivo de aseguramiento metrológico y M-S-LC-I066 Instructivo de manejo
balanzas analíticas
• Permitir que el equipo se estabilice durante el tiempo recomendado por el fabricante y lo documentando en
el instructivo de uso correspondiente.
5.2 Materiales
• Micro espátula.
• Filtros de membrana de acetato de celulosa de 0.45 micras, de ser necesario utilice el pre-filtró de fibra de
vidrio.
• Balón aforado de vidrio clase A de 1L.
• Vasos de precipitados de 10, 50, 100, 200 mL.
• Balones aforados clase A de 100, y 250, 200 mL.
• Erlenmeyer de 125 mL.
• Pipetas aforadas clase A de 2,4, 5, 10, 20 y 25 mL.
• Pipetas graduadas de 5 y 10 mL.
• Probeta de 25 mL.
• Pipeta Pasteur.
• Pera de succión
• Barra agitadora.
• Celda de cuarzo de 1 cm de paso óptico.
• Papel para limpiar lentes.
5.3 Reactivos
Pesar a 0,02 g de Oxalato de sodio Na2C2O4 anhidro en vasos de precipitados de 400 ml. A cada vaso,
a su vez, se añaden 100 ml de agua destilada o ultra pura y se agita para disolver. Añadir 10 ml de
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H2SO4 1:1 y calentar rápidamente hasta 90 a 95 ° C. Titular rápidamente con solución de Permanganato
a normalizar, agite hasta que obtenga un ligero color rosado que persiste durante al menos 1 min. No
deje que la temperatura descienda por debajo de 85 °C. Si es necesario, caliente el contenido de los
vasos precipitados durante la titulación; 100 mg consumirán aproximadamente 6 mL de solución.
Ejecutar un blanco bajo las mismas condiciones anteriores con 100 mL destilada y 10 ml de H2SO4
(1:1)
g Na2C2O4
𝑁𝑜𝑟𝑚𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑑𝑒 𝐾𝑀𝑁𝑂4 =
(𝐴 − 𝐵) 𝑋 0,067
Dónde:
A = mL titulante de la muestra
B = mL titulante para blanco.
• Solución stock de nitrito, 250 mg N - NO2- /L a partir del sólido: El NaNO2 debe ser grado reactivo con
al menos el 99% de pureza. Como el NO2– se oxida fácilmente en presencia de humedad, usar un
frasco de reactivo reciente para preparar la solución patrón y guardar los frascos herméticamente
tapados cuando no estén en uso. Disolver 0.6160 g de Nitrito de Sodio (NaNO 2) y diluir a 500 mL en
balón aforado con agua ultra Pura, 1 ml = 250 mg/L. Almacene esta solución en la nevera de reactivos
y preserve con 1 ml de cloroformo (CHCl3). Este patrón tiene una vida útil de 6 meses.
La solución madre se debe mantener herméticamente cerradas libre de aire cuando no esté en uso.
Para determinar el contenido de NaNO2, añada un exceso conocido de la solución estándar de 0,05 N
de KMnO4, descargue el color del permanganato con una cantidad conocida de reductor estándar tal
como Oxalato de Sodio (Na2C2O4) 0,025 M, y titule posteriormente con solución de permanganato
estándar.
Calcular el valor del blanco a restar (G) por medio de la siguiente fórmula:
G= ((𝐵 𝑋 𝐶) − (𝐷 𝑋 𝐸 ))
Cada 1.00 ml de KMNO4 0,05 N consumido por la solución de NaNO2 Corresponde a 1725 µg de
NaNO2 o 350 µg de NO2-- N.
• Si el laboratorio cuenta con Estándar primario trazable de nitritos de 1000 mg N-NO2- /L , el paso
anterior no se requiere y las soluciones intermedias se deben preparar directamente.
6. LIMITACIONES E INTERFERENCIAS
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La incompatibilidad química hace improbable que el NO2-, el cloro libre y el tricloruro de nitrógeno (NCl 3)
coexistan. NCl3 imparte un color rojo falso cuando se añade reactivo de color. Los siguientes iones interfieren
debido a la precipitación en condiciones de prueba y deben estar ausentes: Sb +3, Au+3, Bi+3, Fe+3, Pb+2, Hg+2,
Ag+, cloro platinato (PtCl6-2) y meta vanadato (VO3-2). El ion cúprico puede causar bajos resultados catalizando
la descomposición de la sal de diazonio. Los iones de color que alteran el sistema de color también deben estar
ausentes. Eliminar los sólidos en suspensión por filtración.
Las prácticas de control de calidad se consideran parte integral de cada método, aquellos que aplican para
presente método se incluye la siguiente tabla.
X X X X X X X
Tomado del SM Tabla 4020: 3. Consulte 4020B para más requisitos de control de calidad.
• Utilizar material de vidrio al cual se le ha realizo el control de calidad y el que esta destinado para la
determinación de nitritos.
• Efectuar el análisis dentro del tiempo estipulado, asegurando la confiabilidad del resultado.
• Realizar y utilizar una curva de calibración vigente, entregar al líder de análisis para su aprobación. Verificar
que la pendiente de la curva de calibración se encuentre en un valor aproximado de 0.3.
• Tomar en cuenta los siguientes aspectos a la hora de reportar los análisis:
• Incluir al menos un blanco diario, con cada lote de 10 o menos muestras. Si el blanco de reactivo es mayor
al (LDM), los resultados son sospechosos, verificar el material de vidrio, la fuente de agua y la celda de
cuarzo la cual debe estar transparente, sin manchas; si el problema persiste se deben seguir las directrices
del Líder Fisicoquímico para el resultado de la muestra con respecto al blanco.
• Blanco del método (MB): Incluya un blanco con cada lote de muestras o sobre una base del 5%, el que sea
más frecuente. Calificar el blanco de teniendo en cuenta los siguientes criterios:
b). Sí el MB es > ½ LCM, pero <LCM y los resultados de la muestra son > LCM, califique los resultados para
indicar que se detectó el analito en el MB.
c). Sí el MB es > LCM, se tomarán medidas correctivas y la calificación es obligatoria.
• Analizar el blanco después del control de verificación de la calibración (CCV) y antes de analizar muestras.
Evaluar los resultados de reactivos en blanco para detectar contaminación; si los niveles de contaminación
son inaceptables, identificar y eliminar la fuente.
• Incluir el LCM para su verificación con cada lote de muestras o sobre una base del 5%, el que sea más
frecuente, este debe estar entre el 50 y 150% con un %RSD del 20%.
• Si el CCV está fuera de control, tomar medidas correctivas, incluido el nuevo análisis de cualquier muestra
analizada desde el último CCV aceptable.
• Incluir al menos un blanco fortificado (estándares de control) por cada lote de 10 muestras o sobre una
base del 5%. Idealmente, variar las concentraciones del blanco fortificado para cubrir el rango desde el
punto medio a la parte inferior de la curva de calibración. Calcular el porcentaje de recuperación, y
determinar los límites de control.
• Incluir un LFB con cada lote de muestras o sobre una base del 5%, el que sea más frecuente. Evalúe el LFB
con el porcentaje de recuperación comparando con los límites especificados en los gráficos de control. Sí
los resultados del LFB están fuera de control, tome medidas correctivas, incluida la preparación y análisis
de la muestra nuevamente, sí es necesario.
Nota: El analista debe rotar las concentraciones de LFB para cubrir diferentes partes del rango de calibración.
Los gráficos de control pueden ser útiles en la identificación de problemas potenciales. Asegúrese de que el
blanco fortificado, (estándares de control) cumple con los criterios de desempeño del método.
• Ejecutar mínimo una vez por semana el control denominado Matriz fortificada (LFM) y su duplicado (LFMD),
Muestra por cada lote de muestras o sobre una base del 5%, Preferiblemente utilizar la misma
concentración utilizada en el blanco fortificado (LFB), para permitir que los analistas separen el efecto de
la matriz con el rendimiento del laboratorio. La matriz fortificada se prepara adicionando una concentración
de analito conocida Se debe limitar el volumen de adición al 5% o menos del volumen de la muestra. El
criterio de aceptación de recuperación es de 80 a 120% y la diferencia porcentual relativa (RPD) entre la
muestra fortificada y el duplicado debe ser inferior al 10%. Si los resultados de la matriz fortificada (LFM)
están fuera de control, tomar las medidas correctivas para rectificar el efecto de la matriz. Registrar los
datos en las cartas de control de recuperación y de duplicados.
Para preparar una matriz fortificada (LFM), utilizar una alícuota de una solución de concentración conocida del
analito (idealmente de una segunda fuente, es decir, preparada a partir de una solución intermedia diferente a la
utilizada en la curva de calibración), la cual debe ser llevada a volumen (aforada con agua de una muestra al
azar o matriz que se está evaluando). Utilizar la siguiente fórmula y la siguiente tabla de diluciones:
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Vi x Ci: Vf x Cf
Donde:
Vi: Volumen de la alícuota del estándar de concentración conocida, que se va a utilizar en la preparación dilución
(preferiblemente de una segunda fuente).
Ci: Concentración del estándar que se va a utilizar en la preparación dilución (preferiblemente de una segunda
fuente).
Vf: Volumen final de agua de la muestra al azar o matriz que se está evaluando (con la que se va a aforar).
Cf: Concentración final de la dilución que se desea obtener, se sugieren tres (3):
0.1 mg/L, cuando al determinar la muestra al azar o matriz a evaluar, tiene un valor de concentración aproximada
entre 0.05 mg/L y < 0.09 (Lo anterior para no superar el rango de trabajo de la curva en la lectura directa, el cual
es 0.2 mg/L).
0.015 mg/L para muestras de campo que posean altas concentraciones del analito y superen el rango lineal de
la curva: prepare primero la LFM adicionándole 0.015 mg/L. Una vez preparada, realizar las diluciones que sean
necesarias con agua tipo I con la finalidad de cumplir con el rango lineal de la curva.
0.010 mg/L, cuando al determinar la muestra al azar o matriz a evaluar, presenta valores por debajo del LCM o
tiene un valor de concentración bajo (aproximadamente ≤0.05 mg/L). Lo anterior para evitar que se presente un
posible solapamiento por parte de la concentración adicionada y no se pueda evidenciar el efecto matriz.
El uso de cualquiera de las concentraciones anteriores (Cf), está sujeto a los resultados aproximados de las
determinaciones de la muestra al azar o matriz a evaluar, con el fin de evitar un posible solapamiento por parte
de la concentración adicionada o que no se pueda leer directamente la LFM; no obstante, Lo anterior garantiza
que se cumpla las directrices del SM ED 23, el cual estipula el “uso de una LFM que sea al menos 10 veces el
LDM o igual al punto medio de la curva de calibración”.
• Los testigos sirven para evaluar las condiciones de transporte y monitoreo en las que tomaron las muestras
y el almacenamiento de las mismas. El porcentaje de recuperación de los testigos debe estar entre 80 y 120
%.
• Las réplicas se utilizan para ver diferencias en el muestreo, se aceptan replicas con una diferencia no mayor
al 10%. La máxima absorbancia permitida es la obtenida para el patrón de 0.2 mg N - NO2–-/L.
• Los duplicados evalúan la precisión del método, por cada lote de muestras se debe pasar un duplicado, la
diferencia entre estos no debe ser mayor al 10%.
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• Registrar en las cartas de control todos los estándares analizados, si el resultado analítico cae fuera de los
límites de control normales, revisar los estándares de calibración, los reactivos y material de vidrio. El análisis
solo se puede reanudar cuando se corrija el problema y el líder de Físico –Química lo autorice.
• Con cada lote de muestras es necesario leer un blanco, duplicado de muestra, estándar de control bajo o
alto (estos se deben rotar cada vez), el CCV y una muestra fortificada con su correspondiente duplicado
semanalmente.
• Efectuar el análisis dentro del tiempo estipulado, asegurando la confiabilidad del resultado.
8. DESARROLLO
El nitrito (NO2-) se determina a través de la formación de un colorante azo rojizo producido a un pH de 2,0 a 2,5
por acoplamiento de sulfanilamida diazotada con dihidrocloruro de N (1-naftil)-etilendiamina (diclorhidrato de
NED). El aplicable del método para las mediciones espectrofotométricas es de 10 a 1.000 µg de NO 2--N / L.
(0,010 a 1mg/L). Las mediciones fotométricas se pueden realizar en el rango de 5 a 50 µg N / L. (0.005 a 0,050
mg/L), si se utiliza un trayecto de luz de 5 cm y un filtro de color verde. El sistema de color obedece la ley de
Beer hasta 180 µg N / L (0,180 mg/L) con un trayecto de luz de 1 cm a 543 nm. Concentraciones más altas de
NO2- se pueden determinar diluyendo una muestra.
El nitrógeno de nitritos raras veces aparece en concentraciones mayores de 1 mg/L, aun en fuentes de plantas
de tratamiento de aguas residuales. En aguas superficiales y subterráneas su concentración por lo general es
menor de 0.1 mg/L. Su presencia indica, por lo regular, procesos activos biológicos en el agua, ya que es fácil
y rápidamente convertido en nitrato.
Los nitritos en concentraciones elevadas reaccionan dentro del organismo con aminas y amidas secundarias y
terciarias formando nitrosominas de alto poder cancerígeno.
Nunca utilice preservación ácida en las muestras que se analizarán para NO2-.
Colecte la muestra en envase de vidrio ámbar o plástico y no le adicione ningún preservante. El tamaño mínimo
de muestra para determinar NO2– es de 250 mL. Se puede tomar de la muestra recibida para fósforo soluble
siempre y cuando el volumen sea suficiente para los dos analitos.
La determinación debe hacerse lo más pronto posible una vez recogida la muestra para prevenir la posible
conversión bacteriana de NO2– a NO3– o NH3. Para conservación a corto plazo durante 1 a 2 días, guardar
congelar a -20 °C o almacenar a ≤ 4 ° C.
• Antes de iniciar las lecturas, tenga en cuenta el instructivo de manejo del espectrofotómetro Uv -Vis.
• Diligencie el formato de control diario de manejo del equipo.
• Solicite las muestras, deje aclimatar la muestra a 20°C±3°C y filtre solo en el momento del análisis, a través
de membrana de acetato de celulosa de 0.45 micras. Las muestras con sólidos suspendidos abundantes,
fíltrelas primero con un pre filtro de fibra de vidrio.
• Desarrollo de color: si el pH de la muestra no está entre 5 y 9, ajuste el rango con 1N HCl o NH4OH según
sea necesario añada el reactivo de color, una vez ajustado el pH.
• Curva de Calibración. Prepare una curva de calibración cada vez que cambie de solución de coloración (lote
de reactivo), o de solución patrón de nitrito.
• Encienda el Espectrofotómetro UV-VIS con la lámpara de tungsteno, 45 minutos antes de iniciar las lecturas,
tenga en cuenta el instructivo de manejo del espectrofotómetro, cuyo diagrama de flujo está ubicado en la
pared al lado del equipo, para especificar los rangos de medición. La lectura de nitrito debe hacerse a 543
nm. Cargue la última curva de calibración.
• Verifique que la celda de cuarzo de 1cm esté perfectamente limpia, si la observa manchada de color rosado
déjela en jabón aproximadamente 15 minutos, hágale un lavado con H2SO4 al 5% y enjuáguela perfectamente
con agua desionizada.
• Cuando vaya a iniciar la lectura de la curva de calibración, transfiera una alícuota de 25,0 mL del blanco
(agua ultra pura) y los estándares a un Erlenmeyer de 125 mL y adicione 1 mL del reactivo de coloración,
deje desarrollar color y comience la lectura después de 20 minutos, pero antes de 2 horas después de su
adicción, lea el blanco como blanco y como muestra y los estándares, como estándares y como muestras,
siguiendo las instrucciones del equipo.
• Almacene los datos en la carpeta del año correspondiente, en la sub. carpeta Nitritos. Grabe la curva, los
estándares y las muestras de dicha curva de calibración, archivándola por la fecha en que se realizó, dos
dígitos para día, mes y año (dd/mm/aa), en las carpetas Curvas, Estándares y Muestras respectivamente.
Imprima el reporte en papel y entréguelo al Líder de análisis para su aprobación.
• Para iniciar las lecturas fotométricas, colocar el blanco de reactivos en la celda, leer como blanco, verificar la
observación de una línea recta horizontal en el rango de la longitud de onda de los 543 nm, inmediatamente
léalo como muestra y codifíquelo como blanco, la absorbancia debe registrar cifras exponenciales de 10-4 y
10-5, continúe con los estándares de control en orden creciente desde el de más baja concentración, léalos
como muestras.
• Registrar los resultados de los estándares con 2 cifras significativas en la carta de control, verificar que los
valores se encuentren dentro del rango de 2 (s) desviaciones estándar por encima o por debajo, respecto del
valor teórico esperado.
8.5 Formatos
Prepare una curva estándar trazando la absorbancia de los patrones frente a la concentración de NO2-- N.
Calcule la concentración de la muestra directamente en la curva.
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Escribir el resultado con dos cifras significativas, redondeando de acuerdo a los criterios establecidos en el
procedimiento de lineamientos de control de calidad analítica.
Donde:
(𝐶𝑠 − 𝐶)
𝑋 100 = % 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝐿𝐹𝑀 𝑂 𝐿𝐹𝑀𝐷
𝑆
La recuperación debe estar entre 80 y 120%; Reporte los resultados con 2 cifras significativas.
9. DIAGRAMA
Ver Anexo 1
• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association,
American Water Works Association, Water Pollution Control Federation. SM 4500 NO2 B. 23ed, New York,
2017.
• E-SGI-ST-M001 Sistema de Gestión de Seguridad y Salud en el Trabajo.
• PGIRESPEL. E-SGI-A-M002. Manual plan de gestión de residuos o desechos peligrosos.
• M-S-LC-I015. Instructivo lavado material de vidrio y plástico.
• M-S-LC-I048 Instructivo de aseguramiento metrológico.
• M-S-LC-I050 Instructivo de buenas prácticas de laboratorio e ISO 17025.
• M-S-LC- I051.Instructivo de aseguramiento de calidad analítica.
01 14/12/2017 Creación del documento con base a la nueva estructura del SGI.
Realizado por Luz Adriana Ruiz
Actualización SM 2017. Realizado por Jhonatan Danilo Uasapud
02 24/04/2019
García
Se actualiza el instructivo en los siguientes numerales: 3. Se
amplían las definiciones, se incluye el subnumeral 5.11 verificación
de equipos, en el numeral 5.3 en la preparación de reactivos se
incluye el uso de un estándar trazable, así mismo, el subnumeral
6.1 condiciones ambientales, en el numeral 7. Control y
aseguramiento de la calidad se mejoran los criterios del banco, se
03 14/05/2020 incluyen los controles del límite de cuantificación (LCM), la
verificación de la calibración (CCV), el duplicado de la muestra y la
rotación del blanco fortificado (LFB), se adiciona el subnuemral 8.5
Formatos y se amplía el numeral 10. Documentos de referencia y
bibliografía. Realizado por Adriana Dueñas.
Luz Adriana Ruiz Araujo Carlos Martín Velásquez Ramírez Jhonatan Danilo Uasapud
Contratista Grupo Laboratorio Contratista Líder Técnico Grupo García
de Calidad Ambiental Laboratorio de Calidad Ambiental Coordinador Laboratorio Calidad
Ambiental
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ANEXO 1 Diagrama
Inicio
Verificación de
los equipos.
Preparación de soluciones:
✓ Reactivo de coloración.
✓ Solución Stock de Nitrito de Sodio de 250 mg N-NO2–/L.
✓ Preparación de estándares de curva de calibración.
Verificación
del pH.
De la
página
11
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A la página
12
SI
Coloque el blanco de reactivos en la celda, léalo como blanco, verifique la observación de una línea
recta horizontal en el rango de la longitud de onda de los 543 nm, inmediatamente léalo como muestra
y codifíquelo como BLANCO, la absorbancia. Debe registrar cifras exponenciales de 10 -4y 10-5,
continúe con los estándares de control en orden creciente desde el de más baja concentración, léalos
como muestras.
Fin