Tesis - Miriam de Lourdes Martinez Moran

S.E.P.
TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE
TUXTEPEC
Departamento de Ingeniería Química y Bioquímica
Evaluación de viabilidad y perfil

microbiológico del queso tipo panela
adicionado con Lactobacillus reuteri libre o
encapsulado.
TESIS
(Titulación integral)
Para obtener el título de

INGENIERO BIOQUÍMICO
PRESENTA
MIRIAM DE LOURDES MARTÍNEZ MORÁN
ASESOR
M.C. ERNESTINA PAZ GAMBOA
CO-ASESOR
DRA. ARACELI PÉREZ SILVA
San Juan Bautista Tuxtepec, Oaxaca. Enero 2022

ii
DEDICATORIA
Con mucho amor a Jehová Dios, a mis padres Cirila Morán y Oliverio Martínez, a
mi tío Gonzalo Martínez, a mi querido hermano, a mis abuelas, a mi familia, a
mi pareja y a mi amada hija…
RECONOCIMIENTOS
Al Tecnológico Nacional de México (TecNM) por haber proporcionado el
financiamiento para la realización de este trabajo de investigación.
iii
AGRADECIMIENTOS
Agradezco infinitamente a Dios por permitirme estar hasta ahora compartiendo con
los que más quiero un logro más en mi vida, y por todas las bendiciones que me ha
brindado, por ser tan justo y maravilloso, y por amarme a pesar de todo.
A mis padres y hermano por todo su amor incondicional, por ser mí ejemplo en
todos mis conceptos y valores, por toda la confianza que han puesto en mí al brindarme
la mejor herencia que es el estudio y por estar conmigo siempre. Los amo.
A la MC. Ernestina Paz Gamboa quien con sus conocimientos y paciencia me guió
durante el desarrollo de este proyecto, me ayudó y asesoró en los problemas que se
presentaron y me animó a seguir adelante; gracias por confiar en mí.
A Aurora Chávez Montaño por su amistad y consejos, por permitirme colaborar en

su trabajo de maestría y ayudarme a llevar a cabo el presente proyecto.
Al equipo de trabajo de laboratorio de Desarrollo de Nuevos Productos, ingenieros

y futuros ingenieros bioquímicos Sajith Cruz, Zurideysi Terrero, Maritza Isabel Martínez,
Silviano Carlos y al futuro licenciado en administración José Luis Santiago, quienes
hicieron los días de mis residencias menos pesados y me brindaron amistad y apoyo.
A Mariana Guerrero Martínez por enseñarme que la amistad si existe, por no

dejarme caer cuando sentía no poder más, y por acompañarme desde el primer día de la
carrera hasta el final.
A mis amigos Luis, Abel, Daniel, Javier y docentes que me aconsejaron durante la
carrera y me enseñaron el valor de la amistad, y a no darme por vencida para alcanzar
mis metas a pesar de los obstáculos que pudieran presentarse.
iv
RESUMEN
Miriam de Lourdes Martínez Morán. Ingeniería Bioquímica. Instituto Tecnológico de

Tuxtepec, “EVALUACIÓN DE VIABILIDAD Y PERFIL MICROBIOLÓGICO DEL QUESO
TIPO PANELA ADICIONADO CON Lactobacillus reuteri LIBRE O ENCAPSULADO”.
Asesor(a): M.C. Ernestina Paz Gamboa, Co-Asesor(a): Dra. Araceli Pérez Silva.
Este proyecto tuvo como objetivo evaluar el perfil microbiológico de quesos tipo panela
adicionados con Lactobacillus reuteri en forma libre o encapsulada, durante un periodo
de 21 d de almacenamiento a 4 ± 1°C. Para la elaboración de quesos tipo panela se
utilizó leche bronca de vaca obtenida del rancho Santa María de Guadalupe, Tuxtepec,
Oaxaca; la cual se estandarizó a 2% de grasa y pasteurizó a 63°C/30 min, la elaboración
fue según la metodología de Paz et al., (1997), obteniéndose tratamientos con diferentes
concentraciones de L. reuteri (0.5, 1.0 y 1.5%) en forma libre y en forma encapsulada
(solución alginatoNa-goma xantana), y muestra control (sin adición de L. reuteri).
Asimismo, se analizó microbiológicamente dos quesos tipo panela comerciales y uno
artesanal a las mismas condiciones de almacenamiento, los cuales mostraron
crecimiento bacteriano fuera de los rangos establecidos por la NOM-243-SSA-2010. Los
quesos con probiótico libre mostraron un descenso de viabilidad del Lactobacillus reuteri,
reportando 8.35, 8.45 y 8.47 Log UFC/g al día 21. Quesos con probiótico encapsulado
reportaron 9.25, 9.37 y 9.44 Log UFC/g durante el periodo de almacenamiento mostrando
un ascenso de viabilidad y mejorando la supervivencia de L. reuteri; encontrándose
dentro de la concentración viable para considerarse probiótico (6 Log UFC/g). De acuerdo
al perfil microbiológico, quesos con el sistema libre se mantuvieron dentro de los límites
máximos permisibles por la NOM-243 para Mesofílicos aerobios, S. aureus, mohos y
levaduras y, en cuanto a Coliformes totales superaron el rango de ≤100 UFC/g
establecido por la norma obteniéndose 718, 600 y 678 UFC/g a 21 d. Con el sistema
encapsulado se obtuvieron recuentos superiores a los límites máximos permisibles a
partir de 7 d para Coliformes totales y a partir de 14 d para S. aureus y levaduras. Se
concluye que quesos con sistema libre son ideales para disminuir el desarrollo de
microorganismos patógenos, ya que Lactobacillus reuteri cuando se encuentra fuera de
capsulas favorece la inhibición de estos, siendo el sistema con 1.5% de concentración
(L3), el mejor tratamiento en cuanto a viabilidad de L. reuteri e inhibición de patógenos,
mostrándose como un queso probiótico e inocuo.
Palabras clave: Lactobacillus reuteri, queso panela, viabilidad, encapsulado.
v
ABSTRACT
Miriam de Lourdes Martínez Morán. Biochemical Engineering. Instituto

Tecnologico de Tuxtepec, "EVALUATION OF VIABILITY AND MICROBIOLOGICAL
PROFILE OF PANELA-TYPE CHEESE ADDED WITH FREE OR ENCAPSULATED
Lactobacillus reuteri". Advisor: M.C. Ernestina Paz Gamboa, Co-Advisor: Dra. Araceli
Pérez Silva.
The following study aimed to evaluate the microbiological profile of panela-type

cheeses added with different concentrations of free or encapsulated Lactobacillus reuteri
during a storage period. For the production of panela type cheeses, we used raw cow's
milk obtained from the Santa María de Guadalupe ranch, Tuxtepec, Oaxaca, which was
standardized to 2% fat, finally pasteurized at 63°C/30 min and processed according to the
method of Paz et al. (1997), obtaining treatments with different concentrations of L. reuteri
(0.5, 1.0 and 1.5%) in free form and in encapsulated form (alginate-Na-xanthan gum
solution), a cheese without added L. reuteri and two commercial cheeses and one
artisanal cheese were used as controls. They were analyzed during 21 days of storage at
refrigerated temperature (4 ± 1°C) considering NOM-243-SSA-2010. The commercial
cheeses showed bacterial growth outside the established ranges, while the cheeses
containing the free probiotic showed a decrease in viability of Lactobacillus reuteri,
reporting 8.35, 8.45 and 8. 47 Log CFU/g at day 21, while the cheeses containing the
encapsulated probiotic reported 9.25, 9.37 and 9.44 Log CFU/g during the storage period
showing an increase in viability and improved survival of L. reuteri; which in turn remained
within the viable concentration of the microorganism (6 Log CFU/g). According to the
microbiological profile, the cheeses with the free system remained within the maximum
permissible limits established by NOM-243 for aerobic mesophilic bacteria, S. aureus,
molds and yeasts, and total coliforms exceeded the range of ≤100 CFU/g established by
the standard, ending with 718, 600 and 678 CFU/g after 21 days. On the other hand, with
the encapsulated system, counts above the maximum permissible limits were obtained
from day 7 for total coliforms and from day 14 for S. aureus and yeasts. It can be
concluded that cheeses with free system are ideal to reduce the development of
pathogenic microorganisms, since the Lactobacillus reuteri when found outside the
capsules favors the inhibition of these, being the system with 1.5% concentration (L3), the
best treatment in terms of its viability of L. reuteri and inhibition of pathogens, showing
itself as a probiotic and innocuous cheese.
Key words: Lactobacillus reuteri, panela cheese, viability, encapsulation.
vi
ÍNDICE
RESUMEN .................................................................................................................................. v
ABSTRACT ................................................................................................................................. vi
CAPÍTULO I ................................................................................................................................ 1
1 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 2
FUNDAMENTO TEÓRICO .......................................................................................................... 3
1.1 LECHE.......................................................................................................................... 3
1.1.1 COMPONENTES DE LA LECHE .............................................................................. 3
1.2 PRODUCTOS DERIVADOS DE LA LECHE .................................................................. 4
1.2.1 QUESO .................................................................................................................... 5
1.3 ALIMENTOS FUNCIONALES ....................................................................................... 9
1.4 PROBIÓTICOS ........................................................................................................... 10
1.4.1 CLASIFICACIÓN DE PROBIÓTICOS ..................................................................... 12
1.5 ENCAPSULACIÓN ..................................................................................................... 13
1.5.1 MÉTODOS DE ENCAPSULACIÓN ........................................................................ 14
1.5.2 COMPONENTES UTILIZADOS EN ENCAPSULACIÓN ......................................... 16
CAPÍTULO II ............................................................................................................................. 18
2.1 ANTECEDENTES ............................................................................................................ 19
2.2 JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 19
2.3 OBJETIVOS..................................................................................................................... 20
2.3.1 OBJETIVO GENERAL............................................................................................... 20
2.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................... 20
vii
CAPÍTULO III ............................................................................................................................ 21
3 METODOLOGÍA ................................................................................................................. 22
3.1 MATERIA PRIMA ........................................................................................................ 22
3.1.1 CEPA MICROBIANA .............................................................................................. 22
3.1.2 LECHE BRONCA ................................................................................................... 22
3.2 DESNATADO Y ESTANDARIZACIÓN DE LA LECHE ................................................. 22
3.3 PASTEURIZACIÓN DE LA LECHE ............................................................................. 23
3.4 ACTIVACIÓN Y PROPAGACIÓN DE LA CEPA DE L. reuteri NRRL-14171 ................. 24
3.4.1 PREPARACIÓN DEL MEDIO MRS ........................................................................ 24
3.4.2 ACTIVACIÓN ......................................................................................................... 24
3.4.3 PROPAGACIÓN DEL MICROORGANISMO ........................................................... 25
3.4.4 OBTENCIÓN DEL PAQUETE CELULAR................................................................ 25
3.5 OBTENCIÓN DE LOS ENCAPSULADOS DE L. reuteri ............................................... 26
3.6 ELABORACIÓN DE QUESO TIPO PANELA ADICIONADO CON Lactobacillus reuteri
LIBRE O ENCAPSULADO ................................................................................................................. 27
3.7 EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE L. reuteri EN LOS QUESOS. ........................... 28
3.8 CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DE LOS QUESOS OBTENIDOS................ 28
3.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................... 30
CAPÍTULO IV ............................................................................................................................ 31
4 RESULTADOS Y DISCUSIONES ....................................................................................... 32
4.1 EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE QUESOS TIPO PANELA DE MARCAS
COMERCIALES Y ARTESANALES. .................................................................................................. 32
4.2 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LA LECHE ............................................... 38
viii
4.3 EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE Lactobacillus reuteri EN LOS QUESOS TIPO
PANELA ELABORADOS.................................................................................................................... 39
4.4 CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DE LOS QUESOS TIPO PANELA
ELABORADOS. ................................................................................................................................. 42
4.4.1 CONTEO DE MESOFÍLICOS AEROBIOS .............................................................. 42
4.4.2 CONTEO DE COLIFORMES TOTALES ................................................................. 44
4.4.3 CONTEO DE Staphylococcus aureus ..................................................................... 46
4.4.4 CONTEO DE MOHOS Y LEVADURAS .................................................................. 47
4.4.5 CONTEO DE Salmonella spp ................................................................................. 51
5 CONCLUSIONES ............................................................................................................... 53
6 FUENTES DE INFORMACIÓN ........................................................................................... 54
ix
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
Figura 1: Marcha para elaborar queso panela. Fuente (Villegas, 2012). ....................................... 8
Figura 2. Producción de quesos por tipo (2018). Fuente (INEGI, 2016). ...................................... 9
Figura 3. Representación gráfica de alimentos funcionales ........................................................ 10
Figura 4. Probióticos .................................................................................................................. 11
Figura 5. Lactobacillus reuteri. ................................................................................................... 13
Figura 6. Proceso de encapsulación .......................................................................................... 14
Figura 7.Esquema de los diferentes procesos de microencapsulación. Fuente (Sierra y Guillen,
2017; Parra, 2011). ................................................................................................................................ 15
Figura 8. Desnatado parcial natural de la leche bronca .............................................................. 23
Figura 9. Pasteurización de la leche bronca ............................................................................... 23
Figura 10. Activación de Lactobacillus reuteri............................................................................. 24
Figura 11. Propagación del probiótico L. reuteri ......................................................................... 25
Figura 12. Obtención del paquete celular ................................................................................... 25
Figura 13. Obtención de los encapsulados con L. reuteri ........................................................... 26
Figura 14. Proceso de elaboración del queso tipo panela adicionado con L. reuteri libre o
encapsulado .......................................................................................................................................... 27
Figura 15. Incubación por vertido en placa en agar MRS ........................................................... 28
Figura 16. Proceso del análisis microbiológico del queso panela................................................ 30
Figura 17. Comportamiento de Mesofílicos aerobios presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y
M3 en un periodo de 21 días de almacenamiento................................................................................... 33
Figura 18. Comportamiento de Coliformes totales presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y
M3 en un periodo de 21 días de almacenamiento................................................................................... 34
Figura 19. Comportamiento de Staphylococcus aureus presentes en los quesos tipo panela M1,
M2 y M3 en un periodo de 21 días de almacenamiento. ......................................................................... 35
Figura 20. Comportamiento de Mohos presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y M3 en un
periodo de 21 días de almacenamiento. ................................................................................................. 36
x
Figura 21. Comportamiento de Levaduras presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y M3 en un
Figura 22. Comportamiento de la viabilidad de Lactobacillus reuteri en los quesos elaborados
durante 21 días de almacenamiento....................................................................................................... 41
Figura 23. Comportamiento de Mesofílicos aerobios en los quesos elaborados con Lr. libre o
encapsulado .......................................................................................................................................... 44
Figura 24. Comportamiento de coliformes totales en los quesos elaborados con Lr. libre o
encapsulado .......................................................................................................................................... 45
Figura 25. Comportamiento de S. aureus en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado 47
Figura 26. Comportamiento de Mohos en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado .... 49
Figura 27. Comportamiento de Levaduras en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
.............................................................................................................................................................. 51
Tabla 1. Composición química de la leche de diferentes razas de vacas (%) ............................... 3
Tabla 2. Clasificación de quesos según la NOM 121-SSA1-1994. ................................................ 6
Tabla 3. Principales probióticos usados en la terapéutica humana. ............................................ 12
Tabla 4. Parámetros establecidos para una leche de calidad ..................................................... 22
Tabla 5. Perfil microbiológico de quesos tipo panela de marcas comerciales y artesanales en un
Tabla 6. Análisis fisicoquímico de la leche bronca ...................................................................... 38
Tabla 7. Viabilidad en 1 g de capsulas ....................................................................................... 39
Tabla 8. Estrategia experimental de los tratamientos de quesos tipo panela. ............................. 39
Tabla 9. Evaluación de la viabilidad de Lactobacillus reuteri libre o encapsulado adicionado a
quesos tipo panela. ................................................................................................................................ 39
Tabla 10. Límites máximos de contenido microbiano en quesos frescos .................................... 42
Tabla 11. Conteo de Mesofílicos aerobios en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
representados en UFC/g ........................................................................................................................ 43
xi
Tabla 12. Conteo de coliformes totales en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
Tabla 13. Conteo de S. aureus en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado representados
en UFC/g ............................................................................................................................................... 46
Tabla 14. Conteo de Mohos en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado representados
en UFC/g ............................................................................................................................................... 48
Tabla 15. Conteo de Levaduras en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
Tabla 16. Recuento de Salmonella spp 25 g de queso ............................................................... 52
xii
CAPÍTULO I
1
1 INTRODUCCIÓN
En México el consumo de quesos se da en todos los niveles socioeconómicos,

en cada rincón del país el queso es un alimento que compartimos en nuestras mesas.
Evidentemente, el poder adquisitivo es determinante en las decisiones de compra, por
lo que hay una gran variación en el tipo de quesos, marcas y presentaciones según el
gusto del consumidor. El queso panela es uno de los quesos que más se consumen
en nuestro país y es considerado una de las opciones lácteas más recurrentes dentro
de los regímenes alimentarios. Por su proceso de fabricación, es de esperar que
cualquier queso panela sea un producto con alto contenido de agua, por lo que se
define como un alimento altamente perecedero, lo que conlleva al crecimiento de
microorganismos que afectan la vida de anaquel y puede ser dañino para quien lo
consume, por lo que el presente trabajo es evaluar al Lactobacillus reuteri de forma
libre y encapsulada como agente antimicrobiano y probiótico en la adición al queso
panela.
Los probióticos como el Lactobacillus reuteri son beneficiosos a la salud por que
mejoran la flora intestinal. Para poder generar estos beneficios al consumidor los
probióticos deben no solo llegar hasta el intestino sino también hacerlo en una
concentración viable (106 UFC/g de producto). La mayoría de los alimentos que
contienen probióticos no tienen la concentración viable al ser consumidos, debido a
muchos factores que pueden presentarse desde su elaboración hasta su consumo,
como el pH y temperatura, los cuales aceleran la mortalidad de estos
microorganismos. Uno de los métodos que existen para mejorar la supervivencia de
los probióticos en los alimentos es la encapsulación, lo que consiste en encapsular
sólidos, líquidos o gases en materiales como polímeros, en este caso el Alginato y
goma xantana. Dichas capsulas hacen más resistentes a los probióticos a cambios de
temperatura y pH, lo que conlleva a que el microorganismo se mantenga con vida
dentro del alimento y se liberen las capsulas junto con los probióticos dentro del
organismo.
2
FUNDAMENTO TEÓRICO
1.1 LECHE
La leche es el fluido biológico que segregan las hembras de los mamíferos,

cuyo papel es aportar la energía y los nutrientes necesarios para el crecimiento y
desarrollo del recién nacido de la especie correspondiente durante los primeros meses
de vida (Hernández, 2010).
La leche es una fuente esencial de proteínas, grasas, minerales y vitaminas, así como
de nucleótidos y poliaminas, entre otros micronutrientes. Dentro de estos destacan el
calcio y la vitamina D, que por su elevada presencia y su alta biodisponibilidad, no
igualada por ningún otro alimento, garantizan las ingestas diarias recomendadas
(FINUT, 2015).
1.1.1 COMPONENTES DE LA LECHE
Los sólidos totales (grasa y sólidos no grasos) representan del 11 al 15% de su

composición y varían de acuerdo con muchos factores, tales como raza (Tabla 1) y
edad de la vaca, tipo y frecuencia de la alimentación, estado de lactación, temperatura
ambiente, enfermedades, época del año, hora del día de la ordeña, etcétera (NOM-
155-SCF1-2012).
Tabla 1. Composición química de la leche de diferentes razas de vacas (%)
Raza Agua Grasa Proteínas Lactosas Cenizas
Holstein 88.1 3.4 3.1 4.6 0.71

Ayshire 87.3 3.9 3.4 4.4 0.73
Suiza café 87.3 3.9 3.3 4.6 0.72
Guernsey 86.3 4.5 3.6 4.7 0.75
Jersey 85.6 5.1 3.7 4.7 0.74
Fuente: (Badui, 2006)
3
1.2 PRODUCTOS DERIVADOS DE LA LECHE
Existen un sin fin de productos derivados de leche de vaca que a continuación se

describirán los más comunes y más consumidos:
 LECHES EN POLVO Y LA NATA (CREMA) EN POLVO
La leche en polvo es la leche totalmente deshidratada, cuyo contenido en agua es igual

o inferior a un 5% en peso del producto final. Se obtiene mediante la deshidratación
de la leche natural entera, total o parcialmente desnatada (Hernández, 2010).
 YOGUR
El yogur se define como el producto de leche coagulada obtenida por la fermentación

láctica producida por la acción de las bacterias Lactobacillus bulgaricus y
Streptococcus thermophilus. Para poder utilizar el término yogur, los microorganismos
productores de la fermentación láctica deben ser viables y estar presentes en el
producto terminado en una cantidad mínima de 107 UFC por gramo o mililitro (Panahi
et al., 2017).
 LECHE EVAPORADA
Producto lácteo fabricado mediante la extracción de aproximadamente 60% del agua

para concentrar y esterilizar la leche, y evitar su descomposición (Vélez-Ruiz, 2017).
 MANTEQUILLA
Es el producto obtenido de la grasa de la leche o grasa de la crema la cual ha sido

pasteurizada, sometida a maduración, fermentación o acidificación, batido pudiéndose
o no adicionar con sal. Técnicamente la mantequilla es una emulsión del tipo “agua en
aceite”, obtenida por batido de la crema, y que contiene no menos del 80% de materia
grasa y no más del 16% de agua (García 2016).
4
 CREMA
Crema de leche: o nata es la crema sustancia o elemento graso que se forma en la

superficie de la leche cuando se encuentra en su estado natural y puro, de consistencia
espesa, su tonalidad es blanca o amarillenta y salada (Pineda, 2014).
 LECHES CONDENSADAS
Es una forma de leche concentrada en la que se ha eliminado aproximadamente el

60% del contenido de agua, después de lo cual se añade azúcar antes de su envasado
(40% a 45% de azúcar). Se le conoce como leche condensada o como leche
condensada azucarada. La leche condensada es rica y espesa, con un color caramelo
y un sabor súper dulce (CODEX, 2015).
Otros de los productos derivados de la leche que no puede faltar en la mesa es el

queso que mayormente es consumido en la región y el país:
1.2.1 QUESO
Los quesos son una forma de conservación de los dos componentes insolubles
de la leche: la caseína y la materia grasa; se obtienen por coagulación de la leche
seguida del desuerado, en el curso del cual el lactosuero se separa de la cuajada. El
lactosuero contiene la mayor parte del agua y de los componentes solubles de la leche,
quedando una pequeña parte aprisionada en la cuajada. La definición legal del queso
precisa que “el producto puede estar o no fermentado”, de hecho experimenta por lo
menos una fermentación láctica. El queso desnatado se obtiene a partir de la leche
desnatada.
Por lo general, el queso es un sólido que se logra en base a la leche cuajada de

mamíferos como la vaca, la oveja, la cabra, la búfala y la camella, entre otros. La leche,
según indican los expertos en esta materia, es impulsada a cuajarse a partir de una
combinación de cuajo y un cierto nivel de acidificación. Para este fin se emplean
5
bacterias, cuya misión es ácido la leche y de definir la textura y el sabor que tendrá
cada queso. Algunos también pueden presentar mohos en la superficie interna o
externa (Porto & Gardey, 2012).
El queso es el producto que resulta de la precipitación de las caseínas, que deja como
residuo el llamado suero de la leche; para llevar a cabo este proceso, se emplean
básicamente dos métodos: por medio de la renina o cuajo, o bien, acidificar en el punto
isoeléctrico de las caseínas (pH 4.6). Los pasos fundamentales para su elaboración
incluyen la coagulación de la leche, el cortado del coágulo, la eliminación del suero
(desuerado), el salado, el prensado y la maduración (si se requiere). Hay quesos de
los llamados “frescos”, que son los más consumidos en México, que no son madurados
y se consumen solamente salados o sazonados con especias (Badui, 2006).
1.2.1.1 CLASIFICACIÓN DE QUESOS EN MÉXICO
La norma mexicana (NOM 121-SSA1-1994) recoge 14 tipos de quesos mexicanos, sin

embargo, existen otros tipos de quesos que no se encuentran mencionados en dicha
norma. En la Tabla 2 se muestran la clasificación de quesos mexicanos según la
norma mencionada.
Tabla 2. Clasificación de quesos según la NOM 121-SSA1-1994.

FRESCOS TIPO DE QUESO
Frescales Panela, Canasto, Sierra, Ranchero, Fresco, Blanco,
Enchilado, Adobado.
De pasta cocida Oaxaca, Asadero, Mozzarella, Morral, Adobado.
Acidificados Cottage, Crena, Doble crema, Petit Suisse, Nuetchatel.
MADURADOS
Madurados prensados de Añejo, Parmesano, Cotija, Reggianito.
pasta dura
Madurados prensados Cheddar, Chester, Chihuahua, Manchego, Brick, Edam,
Gouda, Gruyere, Emmental. Cheshire, Holandés, Dambo,
Patagrás, Havarti, Provolene, Port Salut, Tilsiter, Bola, Jack.
De maduración con Azul, Cabrates, Camembert, Roquefort, Danablu, Limburgo,
mohos Brie.
PROCESADOS
Fundidos y para untar Amarillo.
Fuente: (NOM 121-SSA1-1994).
6
Existen diversas clasificaciones de los quesos, sin embargo, en este trabajo
abordaremos sobre el queso panela.
1.2.1.2 QUESO PANELA
El queso panela es un fresco, de pasta blanda, autoprensado, elaborado con

leche pasteurizada de vaca (ocasionalmente de vaca/cabra) entera o parcialmente
descremada. Como todos los quesos frescos mexicanos su composición incluye un
porcentaje elevado de agua (hasta 58%) y por ello es altamente perecedero, de ahí
que tiene que conservarse bajo refrigeración desde el momento de su elaboración. Se
presenta en el mercado como un queso blanco de forma troncónica invertida, en piezas
que van desde 0.5 hasta 2 kg, aproximadamente. En realidad puede hacerse piezas
más grandes, pero debido a su consistencia tan blanda tendería a deformarse por su
peso.
Uno de los rasgos característicos de este queso es el moldeo de la cuajada en típicos

cestos o canastos de mimbre, palma o carrizo (aunque actualmente ya se hace
también en cestos de plástico), en donde adquiere su forma característica por
autoprensado durante varias horas. En dicho autoprensado (y desuerado por
exudación) las piezas se voltean una o más veces.
La elaboración del queso panela es realmente sencilla como se muestra en la Figura

1; podría decirse que aun los queseros artesanales lo elaborarían sin grandes
problemas. No obstante, el hecho de emplear leche pasteurizada, fermentos lácticos
y aditivos (especialmente nitrato de potasio y cloruro de calcio), lo hace un producto
elaborado por empresas con cierto nivel tecnológico y material (Villegas, 2012).
7
PROCESO DE ELABORACIÓN DE QUESO PANELA
CONTROLES PASOS OBSERVACIÓN

Parcialmente descremada
Leche pasteurizada (v. g. a 2.5 %-2.8 %)
Adición de CaCl2 y KNO3 15 g/100 l de cada uno
Actividad y Cultivo mesófilo (L. lactisssp.

cantidad de lactis y cremoris), 0.5% (v/v)
cultivo Adición de cultivo láctico (puede omitirse)
TC 32 °C
Fijación de temperatura
Con cuajo líquido, 15 ml
de cuajo/100 l; fuerza
Fuerza de Cuajado 1/10 000; en cubitos de
cuajado, T, 1.5 a 2 cm de lado
cantidad de (aproximadamente)
cuajo, t.
Cortado
10 min a 32 °C
Velocidad e Trabajo del grano
intensidad
Retirar 60 a 80% de
Retiro parcial del suero volumen de leche
Cantidad de sal
y reparación Salado Aplicar sal en suero con
grano
Depositar la cuajada en cesto

Moldeado típico, capas
Volteo de piezas Dejar desuerado varias horas

regularmente Desuerado y prensado (4 a 6 h) volteando la pieza en
el cesto
Refrigeración A temperatura menor de 6 °C
Figura 1: Marcha para elaborar queso panela. Fuente (Villegas, 2012).
8
1.2.1.3 PRODUCCIÓN DE QUESO PANELA EN MÉXICO
Según INEGI (Instituto Nacional de Estadística y Geografía) en 2018 la industria de

quesos en México produjo 454 mil toneladas.
De los cuales las principales variedades fueron:
 Fresco (19.0%)
 Doble crema (16.0%)
 Panela (12.0%)
En la Figura 2 se describen los porcentajes de producción por tipos de quesos en

México en el año 2018.
Figura 2. Producción de quesos por tipo (2018). Fuente (INEGI, 2016).
1.3 ALIMENTOS FUNCIONALES
Se considera funcional, un alimento en su estado natural, o un alimento al cual se han

adicionado, removido o modificado uno o más de sus componentes. Aunque no se ha
logrado una definición del término alimentos funcionales que sea aceptada
globalmente, el concepto general es que son alimentos o componentes alimenticios
9
cuyo consumo además de una nutrición básica, genera beneficios para la salud y/o
reduce el riesgo de enfermedad (Roberfroid, 2002). De acuerdo con la definición que
otorga la ILSI estable que un alimento puede ser considerado funcional si se ha
demostrado que posee un efecto beneficioso sobre una o varias funciones específicas
en el organismo, más allá de los efectos nutricionales habituales y el bienestar o la
reducción de riesgo de enfermar. De acuerdo con ILSI, un alimento funcional puede
ser; un alimento natural, un alimento que se le ha agregado o eliminado un componente
por alguna tecnología o biotecnología, un alimento donde la naturaleza de uno o más
componentes ha sido variada, un alimento en el cual la biodisponibilidad de uno o más
de sus componentes ha sido modificada o cualquier combinación de las anteriores
(FECYT, 2005).
Figura 3. Representación gráfica de alimentos funcionales
1.4 PROBIÓTICOS
El término “probióticos” fue introducido por primera vez en 1965 por Lilly Stillwell;
a diferencia de los antibióticos, los prebióticos fueron definidos como factores de origen
microbiano que estimulan la proliferación de otros organismos. En 1989, Roy Fuller
destacó el hecho que, para considerarse probiótico, el microorganismo en cuestión
debía estar presente en estado viable, e introdujo la idea de su efecto beneficioso
sobre el huésped (WGO, 2011).
10
Los probióticos son microbios vivos que pueden agregarse a la fórmula de muchos
diferentes tipos de productos, incluyendo alimentos, medicamentos y suplementos
dietéticos. Las especies de Lactobacillus y Bifidobacterium son las usadas más
frecuentemente como probióticos, pero la levadura Saccharomyces cerevisiae y
algunas especies de E. coli y Bacillus también son utilizadas como probióticos. Las
bacterias ácido lácticas, entre las que se incluye la especie Lactobacillus que ha sido
utilizada para la conservación de alimentos por fermentación durante miles de años,
pueden tener una doble función, actuando como agentes para la fermentación de
alimentos y además potencialmente confiriendo beneficios a la salud. En términos
estrictos, sin embargo, el término “probiótico” debería reservarse para los microbios
vivos que en estudios controlados en humanos han demostrado conferir beneficios a
la salud (WGO, 2011).
Figura 4. Probióticos
También hay ciertos criterios que un probiótico debe tener para ser considerado eficaz.
Estos incluyen la capacidad de sobrevivir en el tracto gastrointestinal, una alta
resistencia a los ácidos gástricos, la falta de genes de resistencia a antibióticos
transferibles y la capacidad de ejercer claros beneficios en el huésped (Montalban-
Arques et al., 2015)
11
1.4.1 CLASIFICACIÓN DE PROBIÓTICOS
En la Tabla 3 se identifican la clasificación de probióticos más utilizados, todos siendo

la mayoría bacterias ácido lácticas.
Tabla 3. Principales probióticos usados en la terapéutica humana.
Lactobacillus Bifidobacterium Saccharomyces

L. rhamnosus GG B. infantis S. boulardii
L. acidophillus B. adolescentis S. cerevisae
Lat 11/83 B. longum
L. bulgaricus B. lactis
L. casei B. bifidum
L. casei Shirota B. breve
L. salivarius
L. johnsonii La 1
L. reuteri
L. plantarum Enterococos Otros
L. lactis cremoris E. faecium Lactococcus
L. keflir E. faecalis Lacis, cremoris, diacetylasis
L. brevis Bacillus subtilus
L. buchneri Coagulans
L. gasseri Streptococcus Leuconostoc spp
L. sakei S. thermophillus Escherichia coli Nissle 1917
L. fermentum S. salivarius Pediococcus acidilactici
L. crispatus Propionibacterium
freudenreichii
L. cellobiosus
L. curvatus
Fuente: (Mariño et al., 2016)
1.4.1.1 Lactobacillus reuteri
En cualquier caso, para la bioconservación son utilizadas las Bacterias Acido

Lácticas (BAL) que comprende de un número elevado de bacterias gram-positivas
cuya característica común es la producción de ácido láctico en los alimentos. Los
microorganismos que influyen son, cocos de géneros: Lactococcus, streptococcus,
pediococcus, leuconostoc y bacilos de los géneros Lactobacillus y Carnobacterium
(Urrego Velásquez et al., 2005).
12
Figura 5. Lactobacillus reuteri.
El Lactobacillus reuteri es una BAL heterofermentativa, habitante autóctona del tracto

gastrointestinal de humanos y animales (Valeur et al., 2004) L. reuteri fue aislada
originalmente de heces humanas e identificada como L. fermentum Biotipo II (Lerche
et al., 1962) reclasificándose años más tarde como L. reuteri por Gerhard Reuter
después de diversos estudios a nivel molecular (Kandler et al., 1980). Los L. reuteri
crecen en anaerobiosis y tiene una temperatura óptima de crecimiento de 35-38 °C,
siendo capaz de desarrollarse a valores de pH entre 5 - 7.5. Es capaz de fermentar
carbohidratos como glucosa, fructosa, arabinosa, ribosa, sucralosa, lactosa, maltosa,
melbiosa, rafinosa y gluconato (Gerez et al., 2008).
Utiliza la ruta de la fosfocetolasa o de Warburg-Dickens para la fermentación de los

carbohidratos (principalmente glucosa) a lactato, ácido acético, etanol o dióxido de
carbono (Sinkiewicz, 2010). Esta ruta tiene un bajo rendimiento energético que puede
ser compensado por un aceptor externo de electrones como el glicerol, que permite a
L. reuteri como bacteria heterofermentativa conseguir ATP del acetil fosfato (acetil
fosfato + ADP produciendo acetato + ATP), antes de la reducción del acetil fosfato a
etanol y la consecuente pérdida de energía de transformación, obteniendo así un
mayor rendimiento en presencia de glicerol (Talarico et al., 1990).
1.5 ENCAPSULACIÓN
La encapsulación es un método mediante el cual se protege un componente

bioactivo de factores medioambientales al ser recubiertos por una matriz protectora.
Pueden ser preservados por diferentes técnicas de encapsulación donde se mantienen
13
aislados del entorno hasta su liberación (López, 2012). Entre las técnicas de
encapsulación utilizadas se encuentran: la emulsión, el secado por aspersión, la
coacervación compleja, la gelificación iónica y la liofilización.
La encapsulación es un proceso aplicado para proteger, mediante un material de

recubrimiento o material pared, la estabilidad, biodisponibilidad y conservación de los
componentes bioactivos y así mismo la viabilidad en microorganismos (Fritzen-Freire
et al., 2012). Para la selección de un adecuado material pared se deberán considerar
aspectos como grado alimenticio, costos y propiedades físico-químicas como la
solubilidad, peso molecular, transición vítrea / fusión, cristalinidad, difusividad,
formación de películas y propiedades emulsionantes (Gharsallaoui et al., 2007)
biodegradabilidad y capacidad para formar una barrera entre el interior de la cápsula
y sus alrededores.
Figura 6. Proceso de encapsulación
1.5.1 MÉTODOS DE ENCAPSULACIÓN
La encapsulación ha sido aplicada a diversos campos (medicina, industria alimentaria,

industria farmacéutica, agricultura, cosmética, etc.). Los métodos de mayor aplicación
en la industria de alimentos son: lácteos, jugos, aromas, aceites esenciales,
saborizantes, colorantes, etc. y se clasifican según Sierra y Guillen (2017) en:
14
 Métodos físicos: Secado por aspersión, enfriamiento por aspersión, liofilización,
recubrimiento por lecho fluidizado, extrusión, co-extrusión, extrusión-fusión,
cocristalización.
 Métodos físico-químicos: Coalescencia, inclusión molecular, encapsulación por
liposomas.
Figura 7.Esquema de los diferentes procesos de

microencapsulación. Fuente (Sierra y Guillen, 2017; Parra, 2011).
1.5.1.1 EXTRUSIÓN
El método de encapsulación que se ocupara en este trabajo es un método

mecánico: extrusión. Es la técnica más estudiada y antigua para producir cápsulas
con polisacáridos como el alginato debido a su bajo costo y simplicidad. Consiste en
preparar una solución hidrocoloide, adicionar los microrganismos y hacer pasar dicha
solución por una aguja que va a formar gotas que al dejarlas caer sobre una solución
de iones divalentes se gelifican. Cuando se trabaja a escala de laboratorio se utiliza
una jeringa, cuando se trabaja a escala piloto se utiliza un dispositivo extrusor de
tamaño y velocidad de conteo controlada. El tamaño de las perlas puede controlarse
con la variación del diámetro de la aguja o de la boquilla del dispositivo extrusor lo que
da origen a varios sistemas de extrusión. Varios estudios han demostrado que esta
15
técnica no causa daño celular por lo que asegura una alta viabilidad de los
microorganismos probióticos, además de que puede realizarse bajo condiciones
aeróbicas y anaeróbicas y no utiliza solventes tóxicos. Una de las mayores
desventajas de la técnica es la baja capacidad de producción y el gran tamaño de las
partículas que se obtienen (Araújo et al., 2015).
1.5.2 COMPONENTES UTILIZADOS EN ENCAPSULACIÓN
El material protector debe reunir ciertas propiedades que dependen de las

características químicas del material encapsulado, la aplicación, las condiciones de
almacenamiento y del proceso al cual será expuesto.
Las características de un recubrimiento ideal para encapsular son: baja viscosidad a

altas concentraciones, baja higroscopicidad para facilitar su manipulación y evitar la
aglomeración, capacidad de emulsificar y estabilizar el material central, insoluble y no
reactivo con el material central, máxima protección al material central contra
condiciones adversas como: luz, pH, oxígeno, humedad y otros ingredientes, reactivos.
(Pérez, 2013).
Entre los componentes encapsulantes tenemos:
 Lípidos: dentro de los principales componentes encapsulantes de carácter

lipídico están: grasa láctea, lecitinas, ceras, ácido esteárico, monoglicéridos,
diglicéridos, parafinas, aceites hidrogenados como el aceite de palma, algodón
y soya; son excelentes formadores de películas capaces de cubrir las partículas
individuales, proporcionando una encapsulación uniforme (Yáñez et al., 2002).
 Polisacáridos: son utilizados frecuentemente para la encapsulación de
materiales para la industria alimentaria. Los más utilizados son la celulosa, el
almidón y sus derivados como la amilosa, amilopectina, maltodextrosa, entre
otros (Hernández-Torres et al., 2016).
 Gomas: son generalmente insípidas, pero pueden tener un efecto pronunciado
en el gusto y sabor de alimentos, son solubles, de baja viscosidad, poseen
16
características de emulsificación y es muy versátil para la mayoría de los
métodos de encapsulación. Como ejemplos se tienen goma de algarrobo, guar,
goma de tamarindo, goma gelana y xantana (Parra, 2011).
 Proteínas: las proteínas de leche como la caseína, las gelatinas y el gluten,
también son otros materiales que se pueden utilizar para la encapsulación de
sustancias ya que son capaces de formar emulsiones estables (Aghbashlo,
2013).
 Carbohidratos: los carbohidratos que comúnmente son utilizados como
agentes encapsulantes son: almidones, maltodextrinas, quitosano, sacarosa,
glucosa, etilcelulosa, acetato de celulosa, alginatos, carrageninas, etc.
(Guevara y Jiménez, 2008).
1.5.2.1 ALGINATOS
El alginato es un material encapsulante no tóxico utilizado en la encapsulación de

sustancias debido a su capacidad de formar geles, esferas, micro y nanopartículas y
la capacidad para prolongar la vida útil en productos (Lupo y González, 2012). El
alginato puede interactuar con cationes divalentes que actúan como agente de
reticulación. El alginato ha sido utilizado en diferentes industrias, entre ellas la industria
alimentaria. Sin embargo, el alginato tiene muy poca estabilidad física en presencia de
agentes quelantes. A valores bajos de pH se desintegra rápidamente de las cápsulas,
permitiendo la liberación del producto encapsulado, lo cual ha llevado a buscar
alternativas para prolongar la liberación de las sustancias encapsuladas a pH bajos,
como ha sido cubrir las microcápsulas de alginato con quitosán para mejorar la
estabilidad química y mecánica de las cápsulas e incrementar la efectividad de esta
(Hernández-Torres et al., 2016).
17
CAPÍTULO II
18
2.1 ANTECEDENTES
Gonzalez-Montiel, (2015) Determinó la composición de la microbiota del queso

de Aro que se comercializa en el municipio de Teotitlán de Flores Magón, Oaxaca,
México. Cuantificó el contenido de: mesófios aerobios, psicrófilos, coliformes totales,
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella, Enterococcus, Streptococcus,
bacterias ácido lácticas, mohos y levaduras. Los resultados mostraron que el queso
de Aro contiene microorganismos alterantes, patógenos y de importancia industrial.
Ninguna muestra analizada cumplió con la NOM-243-SSA1-2010.
Défaz y Moreira, (2017) Evaluaron la encapsulación de L. plantarum como

método para mejorar su supervivencia en el yogurt sin sabor. Calcularon la viabilidad
del microorganismo, la cual consistió en realizar conteos microbiológicos a lo largo de
la vida útil del yogur y comparar como se reducía la concentración del probiótico libre
y encapsulado.
Rodríguez-Pérez et al., (2016) Evaluaron el efecto de un multi-compuesto

polimérico (alginato de sodio-goma xantana y quitosano de BPM y MPM a 0.2 y 0.4%)
utilizado en la coencapsulación por extrusión de Lactobacillus reuteri con un extracto
del concentrado de fibra de bagazo de carambola (ECFBC) sobre la viabilidad de este
sometido a condiciones extremas de temperatura. Se calculó la eficiencia de
encapsulación (relación entre lo encapsulado y la concentración inicial de bacteria).
2.2 JUSTIFICACIÓN
La microbiología de los quesos es una parte importante de su caracterización y puede

servir como indicador de su calidad higiénico-sanitaria. El queso panela es uno de los
quesos con mayor producción en México, es considerado saludable por su bajo
contenido en grasa y alto contenido en humedad, siendo este último factor de la
reproducción de bacterias, afectando así la vida útil de estos. La adición de
Lactobacillus reuteri al queso panela como organismo probiótico puede contribuir a la
inhibición de otros microorganismos patógenos que pueden desarrollarse en el
19
producto. Sin embargo los probióticos pueden ser afectados por factores
medioambientales al encontrarse libres en el queso, por lo que dicho proyecto busca
realizar la encapsulación de L. reuteri con alginato de sodio y goma xantana y así
prolongar su viabilidad al agregarlos a los quesos a elaborar; como también se busca
disminuir el crecimiento de bacterias patógenas que pueden afectar al consumidor.
2.3 OBJETIVOS
2.3.1 OBJETIVO GENERAL
 Evaluar el perfil microbiológico del queso tipo panela adicionado con diferentes
concentraciones de Lactobacillus reuteri libre o encapsulado durante un periodo
de almacenamiento.
2.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Evaluar microbiológicamente queso tipo panela de marcas comerciales

registradas y artesanales durante un periodo de 21 días de almacenamiento.
 Realizar la encapsulación de Lactobacillus reuteri por el método de extrusión.
 Elaborar quesos tipo panela bajos en grasa adicionado con Lactobacillus reuteri
libre o encapsulado a diferentes concentraciones.
 Evaluar la viabilidad de Lactobacillus reuteri libre o encapsulado en los quesos
tipo panela durante un periodo de 21 días de almacenamiento.
 Caracterizar microbiológicamente los quesos tipo panela adicionados con
Lactobacillus reuteri libre o encapsulado durante un periodo de 21 días de
almacenamiento.
20
CAPÍTULO III
21
3 METODOLOGÍA
3.1 MATERIA PRIMA
3.1.1 CEPA MICROBIANA
Como bacteria probiótica se utilizó Lactobacillus reuteri NRRL-14171 obtenida de la

Unidad de Investigación y de Desarrollo de Alimentos del Instituto Tecnológico de
Veracruz.
3.1.2 LECHE BRONCA
La leche de vaca se obtuvo de un solo proveedor en el rancho Santa María de

Guadalupe ubicado en Palmilla, Tuxtepec, Oaxaca. La leche se recolectó en bidones
de plástico con capacidad de 15 L y se transportó al Laboratorio de Desarrollo de
Nuevos Productos del Instituto Tecnológico de Tuxtepec. Enseguida la leche se filtró
con una manta de malla No 40, se determinó acidez titulable, pH, densidad, alcohol,
grasas y proteínas, tomando como referencia los parámetros de diferentes normas que
se encuentran en la Tabla 4.
Tabla 4. Parámetros establecidos para una leche de calidad

Análisis Norma Parámetros establecidos
Acidez (g/L de ácido NOM-155-SFCI-2012 1.33-1.7 g/L de ácido láctico
láctico)
pH NMX-F-446-1984 6.6-6.8
Densidad (g/mL) NOM-155-SFCI-2012 1.029-1.032 g/mL
Alcohol NOM-243-SSA1-2010 Negativo
Grasa (g/L) NOM-155-SFCI-2012 30 g/L
Proteína (g/L) NOM-155-SFCI-2012 30 g/L
3.2 DESNATADO Y ESTANDARIZACIÓN DE LA LECHE
Se procedió hacer el proceso de desnatado parcial natural de la leche en tinas de

aluminio, dejando en reposo por 24 h hasta que la nata precipitó por diferencia de
densidades y se retiró con una espátula de madera. Se desnataron 10 L de leche
22
bronca y se ajustó a 2% de grasa utilizando el cuadro de PEARSON. El porcentaje de
grasa se determinó por el método de Gerber.
Figura 8. Desnatado parcial natural de la leche bronca
3.3 PASTEURIZACIÓN DE LA LECHE
La leche se sometió a un proceso de pasteurización, en ollas de acero inoxidable y se

calentó a baño María a una temperatura de 63°C por 30 minutos, transcurrido el tiempo
se dejó enfriar a temperatura ambiente.
Figura 9. Pasteurización de la leche bronca
23
3.4 ACTIVACIÓN Y PROPAGACIÓN DE LA CEPA DE L. reuteri NRRL-14171
3.4.1 PREPARACIÓN DEL MEDIO MRS
Se utilizó el medio de cultivo MRS (De Man Rogosa y Sharpe) preparado con diferentes
reactivos en distintas cantidades, el cual debe tener un pH de 5.5 para que el probiótico
se desarrolle. Se esterilizó a una temperatura de 120 °C a 15 Lb durante 15 min.
3.4.2 ACTIVACIÓN
Para la activación del L. reuteri se prepararon tubos con 9 mL de medio MRS,

previamente esterilizados (120°C, 15Lb, 15 min), se procedió a inocular los tubos con
agar en posición inclinada (pico de flauta), utilizando dos asadas de la cepa de L.
reuteri, las asadas se distribuyeron por estría, los tubos obtenidos se incubaron a 37°C
en anaerobiosis por un tiempo de 18 h.
Una vez obtenidos los tubos con L. reuteri, se adicionó 1 mL de agua destilada estéril,
este mililitro se transfirió a un segundo tubo que contenía 9 mL de caldo MRS, se
incubó por 21 h a 37°C. Del tubo anterior se tomó 1 mL y se adicionó a otro tubo con
9 mL de caldo MRS y se incubó por 10 h a 37°C, nuevamente se tomó un mililitro y se
inoculó a otro tubo con 9 mL de caldo MRS y se incubó por 8 h a 37°C.
Figura 10. Activación de Lactobacillus reuteri
24
3.4.3 PROPAGACIÓN DEL MICROORGANISMO
De los últimos tubos obtenidos se utilizó 1 mL por cada 100 mL de caldo MRS en
matraces Erlenmeyer previamente esterilizados, se incubaron a 37°C en anaerobiosis
por 14 h.
Figura 11. Propagación del probiótico L. reuteri
3.4.4 OBTENCIÓN DEL PAQUETE CELULAR
Para la obtención del paquete celular (pellets), se centrifugó el medio MRS obtenido
en la propagación del L. reuteri a 3000 rpm/20 min a una temperatura de 4°C usando
una centrífuga refrigerada marca Rotina® 310. Los pellets obtenidos fueron lavados
con una solución de peptona de caseína al 1% con un pH 7. El paquete celular obtenido
se mantuvo en refrigeración para su utilización.
Figura 12. Obtención del paquete celular
25
3.5 OBTENCIÓN DE LOS ENCAPSULADOS DE L. reuteri
La técnica de encapsulación se realizó según Rodríguez-Pérez et al., (2016),

utilizando alginato de sodio (AlgNa) al 2% como sustancia encapsulante, el cual se
preparó con 50 mL de agua destilada en combinación con goma xantana al 0.015%.
Se utilizó CaCl2 0.2 M esterilizado como agente entrecruzante para la obtención de las
capsulas. El CaCl2 fue refrigerado hasta alcanzar una temperatura de 16 °C.
En vasos de precipitado de 250 mL se adicionó por separado 0.5, 1.0, 1.5% del
paquete celular (L. reuteri) con una concentración de 1010 UFC/mL. Los cuales fueron
mezclados con 50 mL de la solución de AlgNa-goma xantana. Enseguida fue vertido a
un recipiente al cual se colocó una punta calibre 21Gx32 mm para goteo, dicho
recipiente se colocó en un soporte universal, en el cual se obtuvieron las capsulas por
extrusión. Sobre un termoagitador se colocó un matraz erlenmeyer con 150 mL de
CaCl2 (0.2M) con agitación constante a 420 rpm y con una distancia de 15 cm entre la
punta de goteo y el CaCl 2. Se mantuvo en agitación por 30 min. Posteriormente las
capsulas se almacenaron en una bolsa con zipper a 4 °C hasta su utilización.
Figura 13. Obtención de los encapsulados con L. reuteri
26
3.6 ELABORACIÓN DE QUESO TIPO PANELA ADICIONADO CON Lactobacillus
reuteri LIBRE O ENCAPSULADO
Los quesos tipo panela fueron elaborados con leche que contenía 2% de grasa de
acuerdo a la metodología de Paz et al. (1997); la leche previamente pasteurizada se
dejó enfriar a 42 °C, se le adicionó CaCL2 (20 g/100 L de leche) y se enfrió a 37 °C, se
obtuvieron 7 lotes de 2 L de leche en tinas de acero inoxidable. Se adicionó el cuajo
marca CUAMEX (15 mL/100 L) y se mantuvo en reposo por 30 min. Cuando la cuajada
se encontró firme, se cortó de manera horizontal y verticalmente para obtener cuadros
de aproximadamente 1 cm2, la cuajada se agitó por 5 min, posteriormente se calentó
a 39 °C incrementando 1 °C por cada minuto, se agitó lentamente y se desueró ¾
partes del suero obtenido, una vez desuerada la cuajada, se adicionó el NaCl (7 g de
sal/L de leche) y cada lote fue adicionado con Lactobacillus reuteri libre en
concentraciones de 0.5, 1.0 y 1.5 % y con Lactobacillus reuteri encapsulado de 5, 10
y 15 g de capsulas por litro que representan el porcentaje de concentración anterior,
se mezcló perfectamente y se sometió a un moldeado y refrigerado durante 2 h,
posterior a este tiempo se volteó la cuajada y se refrigeró (4 °C ± 1 ° C) durante 24 h.
Finalmente se procedió al desmoldado para sus posteriores análisis.
Figura 14. Proceso de elaboración del queso tipo panela adicionado con L. reuteri libre o
encapsulado
27
3.7 EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE L. reuteri EN LOS QUESOS.
La cuantificación de L. reuteri se realizó por duplicado de acuerdo al método de

vertido en placa en agar MRS, para el recuento de unidades formadoras de colonias
(UFC/g) en cajas Petri. La viabilidad se evaluó durante los días 1, 7, 14 y 21 de
almacenamiento a temperatura de refrigeración. Se utilizaron 10 g de queso que se
homogenizó con 90 mL de agua peptonada estéril (1% de peptona y 0.5% de NaCl,
pH 7). Se tomó 1 mL de las diluciones 106, 107, 108 y se vertió en cajas Petri para
después verter aproximadamente 20 mL de agar MRS. Una vez solidificado el medio,
las cajas Petri fueron incubadas en anaerobiosis durante 48 h a 37°C.
Figura 15. Incubación por vertido en placa en agar MRS
3.8 CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DE LOS QUESOS OBTENIDOS.
Los análisis microbiológicos se le realizaron a todos los quesos que fueron

obtenidos, de acuerdo con las especificaciones de la Norma Oficial Mexicana NOM-
243-SSA1-2010 por conteo de unidades formadoras de colonias (UFC/g) en placas.
Las determinaciones que se realizaron fueron Mesofílicos aerobios, Coliformes totales,
Staphylococcus aureus, Salmonella, Mohos y levaduras, donde se tomó en
consideración los límites permisibles según la NOM.
28
La preparación de las muestras y diluciones se realizaron de acuerdo con la
NOM-110-SSA1-1994, se tomó 25 g de muestra y se homogeneizó en 225 mL de agua
peptonada. Siguiendo la NOM-092-SSA1-1994 se realizó el conteo de Mesofílicos
aerobios utilizando el Agar para Métodos Estándar (PCA). De la dilución anterior se
depositó 0.1 mL sobre la superficie de las placas de agar PCA y se distribuyó con
varillas de vidrio estériles en ángulo recto. Posteriormente se invirtieron las cajas y se
incubaron por 48 h a 35 ± 2°C; las colonias de bacterias aerobias se presenta de un
color blanquecino, de forma puntiforme y extendidas. Para el recuento de Coliformes
totales, se utilizó el medio de cultivo Agar Bilis y Rojo Violeta (VRBA) de acuerdo a la
NOM-113-SSA1-1994, inoculando de igual forma 0.1 mL sobre la superficie de las
cajas e incubándolas de forma invertida a una temperatura de 35 ± 2°C por 24 h; las
colonias se presentan de color rojo claro o rosa, su morfología es semejante a lentes
biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2 mm. Para la cuantificación de Staphylococcus
aureus se empleó la NOM-115-SSA1-1994, utilizando el medio Agar Sal y Manitol,
inoculando 0.1 mL sobre la superficie de las placas; se invirtieron las cajas y se
incubaron de 45 a 48 h a 35 ± 2°C para el conteo de colonias, las cuales se presentan
en color amarillo, circulares y de 1 a 2 mm de diámetro. Bajo la NOM-114-SSA1-1994
se determinó la presencia de Salmonella spp, utilizando caldo lactosado en el pre-
enriquecimiento incubándose por 24 h a 35 ± 2°C, después se pasó 1 mL de la mezcla
anterior a 10 mL de caldo tetrationato para el enriquecimiento y se incubó de 18 a 24
h a 35 ± 2°C, enseguida se transfirió a placas con agar sulfito de bismuto para el
aislamiento incubándose por 24 h a 35 ± 2°C, finalmente para la determinación
bioquímica, se seleccionaron las colonias típicas que se encontraban aisladas para
inocular por punción en el fondo en tubos con agar triple hierro y azúcar, los cuales
fueron incubados a 35 ± 2°C por 24 h; reportando presencia o ausencia de Salmonella
spp en 25 g de muestra. La determinación de Mohos y Levaduras se realizó de acuerdo
a la NOM-111-SSA1-1994, utilizando como medio de cultivo el Agar Dextrosa y Papa,
las placas se incubaron a 25 ± 1°C durante 5 días.
29
Figura 16. Proceso del análisis microbiológico del queso panela
3.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados obtenidos por duplicado se analizaron mediante un Análisis de

Varianza (ANDEVA) en Minitab versión 17 y una prueba de comparación de medias
de Tukey con α=0.05.
30
CAPÍTULO IV
31
4 RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1 EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE QUESOS TIPO PANELA DE MARCAS

COMERCIALES Y ARTESANALES.
Se evaluaron microbiológicamente según la Norma Oficial Mexicana NOM-243-SSA1-
2010, dos quesos tipo panela comerciales de marcas registradas (M1, M2) y uno
artesanal (M3) que fue adquirido en la zona céntrica de San Juan Bautista Tuxtepec,
Oaxaca. Teniendo los siguientes resultados que se muestran en la tabla:
Tabla 5. Perfil microbiológico de quesos tipo panela de marcas comerciales y

artesanales en un periodo de 21 días de almacenamiento.
EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA
Mesofílicos aerobios
MARCA Día 1 Día 7 Día 14 Día 21
M1 4.132±0.019bB 4.325±0.035bB 4.944±0.011aA 5.060±0.085bA
M2 4.107±0.013bD 4.307±0.014bC 4.900±0.004bB 5.061±0.034bA
M3 4.283±0.010aD 4.491±0.002aC 4.929±0.000aB 5.325±0.008aA
Coliformes totales
M1 3.296±0.006cD 4.335±0.008bC 5.318±0.000bB 6.149±0.029bA
M2 3.476±0.021bD 4.136±0.020cC 5.181±0.002cB 6.001±0.009cA
M3 4.338±0.003aD 5.232±0.001aC 5.750±0.013aB 6.283±0.007aA
Staphylococcus aureus
M1 3.515±0.024cD 4.149±0.007cC 4.853±0.007bB 5.184±0.013bA
M2 3.892±0.009bD 4.346±0.015bC 4.712±0.001cB 5.105±0.007bA
M3 4.363±0.008aD 5.176±0.005aC 5.950±0.011aB 6.055±0.034aA
Mohos
M1 2.694±0.092aD 3.543±0.014aC 4.446±0.024aB 4.929±0.001aA
M2 2.299±0.046bD 3.174±0.053bC 3.998±0.009cB 4.507±0.005cA
M3 2.297±0.077bD 3.476±0.030aC 4.145±0.022bB 4.729±0.005bA
Levaduras
M1 3.698±0.028bD 4.361±0.005bC 4.528±0.016bB 5.119±0.008bA
M2 3.601±0.024cD 3.715±0.009cC 3.857±0.014cB 4.015±0.008cA
M3 3.999±0.010aD 4.662±0.000aC 5.131±0.002aB 5.432±0.002aA
Salmonella spp
M1 -- P r e s e n c i a --
M2 -- P r e s e n c i a --
M3 -- P r e s e n c i a --
Los resultados son el promedio ± la desviación estándar del análisis por duplicado. Las letras minúsculas en
la misma fila indican que hay diferencias significativas entre los quesos y las letras mayúsculas indican
diferencias significativas respecto al tiempo.
32
Los resultados son presentados en Log UFC/g de queso panela, debido a que estas
cantidades superaron el rango establecido por la NOM antes mencionada.
En la Tabla 5 se observa notablemente diferencias significativas en el crecimiento de

bacterias patógenas en el transcurso del tiempo de almacenamiento; el queso tipo
panela artesanal presentó mayor cuenta microbiana que el resto de los quesos,
asimismo el queso de la marca M2 presentó menor cuenta microbiana al finalizar los
21 días. A los tres quesos se le determinó presencia de Salmonella spp desde el primer
día de análisis.
5.4
5.2
Log UFC/g de Mesofílicos aerobios
5.0
4.8
4.6
4.4
4.2
4.0
D1 D7 D14 D21
DÍAS DE ALMACENAMIENTO
M1
M2
M3
Figura 17. Comportamiento de Mesofílicos aerobios presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y M3
en un periodo de 21 días de almacenamiento.
En la Figura 17 observamos que los tres quesos analizados superan los 4.1 Log UFC/g
de Mesofílicos aerobios desde el primer día de su obtención, sobrepasando los límites
permisibles que la NOM-243-SSA1-2010 establece, siendo este límite de 4 Log UFC/g;
33
alcanzando a los 21 días más de 5 Log UFC/g. Observamos que el queso con mayor
cuenta bacteriana es el queso M3.
6.5
6.0
Log UFC/g de Coliformes totales
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
D1 D7 D14 D21
M1
M2
M3
Figura 18. Comportamiento de Coliformes totales presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y M3
en un periodo de 21 días de almacenamiento.
En cuanto a coliformes totales los quesos superaron extremadamente los límites

permisibles el primer día de análisis, por lo que se considera según la NOM un alimento
no aséptico para el consumo. Teniendo una cuenta inicial mayor de 4 Log UFC/g el
queso M3 supera la cuenta microbiana de los otros quesos como se muestra en la
Figura 18.
34
6.5
6.0
Log UFC/g de S. aureus
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
D1 D7 D14 D21
M1
M2
M3
Figura 19. Comportamiento de Staphylococcus aureus presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y
M3 en un periodo de 21 días de almacenamiento.
La contaminación de los quesos por S. aureus puede ocurrir directamente desde la

obtención de la leche, o puede resultar de la manipulación o manejo inadecuado de
estos durante su procesado, almacenamiento o comercialización. El queso M3 tanto
como los comerciales presenta un exagerado conteo de estas bacterias, desde el día
de obtención de los quesos hasta los 21 días de almacenamiento superando las 6 Log
UFC/g de cuenta microbiana.
35
5.5
5.0
4.5
Log UFC/g de Mohos 4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
D1 D7 D14 D21
M1
M2
M3
Figura 20. Comportamiento de Mohos presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y M3 en un
periodo de 21 días de almacenamiento.
6.0
5.5
Log UFC/g de Levaduras
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
D1 D7 D14 D21
M1
M2
M3
Figura 21. Comportamiento de Levaduras presentes en los quesos tipo panela M1, M2 y M3 en un
periodo de 21 días de almacenamiento.
36
El queso es un producto alimenticio con alto valor nutritivo el cual resulta un sustrato
para el crecimiento de mohos y levaduras. En la Figura 20 y 21 se muestran el
comportamiento de estos microorganismos en los quesos analizados de los cuales el
que presentó mayor crecimiento de mohos fue el queso de la marca M1 con casi 5 Log
UFC/g a los 21 días de almacenamiento; en cuanto a levaduras el queso M3 fue el de
mayor producción con 5.4 Log UFC/g, sobrepasando los límites permisibles según la
norma.
37
4.2 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LA LECHE
La leche bronca que se utilizó en este proyecto fue evaluada respecto a sus
propiedades fisicoquímicas obteniendo los resultados que se muestran en la Tabla 6,
encontrándose todas las determinaciones dentro de los parámetros establecidos.
Tabla 6. Análisis fisicoquímico de la leche bronca

Análisis Leche bronca
Acidez (g/L de ácido láctico) 1.38±0.05
pH 6.42±0.01
Densidad (g/mL) 1.03±0.002
Alcohol Negativo
Grasa (g/L) 40±0.1
Proteína (g/L) 4.1±0.13
Se procedió a la elaboración de los quesos panela y a sus respectivos análisis de

viabilidad del Lactobacillus reuteri en forma libre y encapsulada, así como también su
perfil microbiológico.
38
4.3 EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE Lactobacillus reuteri EN LOS QUESOS
TIPO PANELA ELABORADOS.
A las capsuladas obtenidas por extrusión se les evaluó la concentración inicial de
viabilidad del L. reuteri, en la Tabla 7 se muestran los datos obtenidos por 1 g de
capsulas.
Tabla 7. Viabilidad en 1 g de capsulas

Encapsulados Cantidad Peso de una Diámetro (mm) Viabilidad
(g) (unidades) de capsula (g) (Log UFC/g)
1 69±0.8 0.010±0.0003 2 9.19±0.1
Se realizaron 3 quesos con Lactobacillus reuteri libre y 3 quesos con encapsulados de

la misma bacteria probiótica con concentraciones de 0.5, 1.0 y 1.5% como se muestra
a continuación:
Tabla 8. Estrategia experimental de los tratamientos de quesos tipo panela.

TRATAMIENTO DESCRIPCIÓN DEL TRATAMIENTO
E1 Cuajada + L. reuteri encapsulado [0.5%]1 (5 g/L)2
L1 Cuajada + L. reuteri libre [0.5%]1 (5 mL/L)2
1 Concentración del probiótico
2 Cantidad de probiótico por volumen de leche
A los quesos obtenidos se les evaluó la viabilidad de la bacteria probiótica por vaciado
en cajas con agar MRS en un tiempo de 21 días de almacenamiento, obteniendo los
siguientes resultados:
Tabla 9. Evaluación de la viabilidad de Lactobacillus reuteri libre o encapsulado

adicionado a quesos tipo panela.
TRATAMIENTOS DÍA 1 DÍA 7 DÍA 14 DÍA 21
E1 8.693±0.099bC 8.920±0.040bcBC 9.143±0.070bAB 9.258±0.054aA
E2 8.900±0.011abB 9.094±0.103abAB 9.292±0.021abA 9.374±0.100aA
39
E3 9.075±0.077aC 9.228±0.023aBC 9.416±0.038aAB 9.443±0.051aA
L1 8.694±0.018bA 8.583±0.056dA 8.507±0.085cAB 8.352±0.013bB
L2 8.846±0.117abA 8.630±0.071dAB 8.511±0.009cB 8.458±0.085bB
L3 9.010±0.092abA 8.776±0.051cdAB 8.717±0.064cAB 8.471±0.154bB
Los resultados son el promedio ± la desviación estándar del análisis por duplicado. Las letras minúsculas en la
misma fila indican que hay diferencias significativas conforme a los tratamientos y las letras mayúsculas indican
diferencias significativas respecto al tiempo.
En la Tabla 9 se observa que los tratamientos que contenían encapsulados de

Lactobacillus reuteri mostraron un incremento en la viabilidad del probiótico en el
periodo de almacenamiento, existiendo una diferencia significativa respecto al tiempo
(p<0.05) pero no entre los tratamientos; esto debido a que en las capsulas donde se
encuentra el microorganismo se genera un microambiente que brinda protección a
cambios externos que pueden afectar su desarrollo, obteniendo así al día 21 para E1,
E2 y E3 un conteo de 9.25, 9.37 y 9.44 Log UFC/g respectivamente, sobrepasando la
concentración viable de 6 Log UFC/g, por lo que se considera como un alimento
probiótico; asimismo los tratamientos que contenían Lactobacillus reuteri libre
presentaron un descenso en la viabilidad del microorganismo durante el
almacenamiento pero no se observó una diferencia estadística significativa respecto
al tiempo (p<0.05), obteniendo una cuenta que inició con 8.69, 8.84 y 9.01 Log UFC/g
para L1, L2 y L3 respectivamente en el primer día y, finalizando al día 21 con 8.35,
8.45 y 8.47 Log UFC/g, considerándose aun así como un queso probiótico.
40
9.6
9.4
Log UFC/g de L. reuteri

9.2
9.0
8.8
8.6
8.4
8.2
D1 D7 D14 D21
E1
E2
E3
L1
L2
L3
Figura 22. Comportamiento de la viabilidad de Lactobacillus reuteri en los quesos elaborados durante
21 días de almacenamiento.
La Figura 22 nos muestra el comportamiento de la bacteria probiótica en los

tratamientos, siendo notable el ascenso de viabilidad en los quesos con encapsulados,
de los cuales el tratamiento con 1.5% de L. reuteri encapsulado resultó el de mayor
viabilidad durante el periodo de almacenamiento. Asimismo los quesos que contenían
la bacteria probiótica libre mostraron un descenso en su viabilidad, siendo el
tratamiento con 0.5% de L. reuteri el de menor viabilidad. Todos los quesos fueron
considerados un alimento probiótico al mantenerse en las 10 6 UFC/g del Lactobacillus
reuteri. La supervivencia entre el microorganismo encapsulado fue significativamente
superior a la del microorganismo libre, evidenciando que la encapsulación si logró
mejorar la supervivencia del microorganismo.
41
4.4 CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DE LOS QUESOS TIPO PANELA
ELABORADOS.
Al mismo tiempo a los quesos tipo panela elaborados se le realizaron análisis para
determinar la calidad microbiológica según la Norma Oficial Mexicana NOM-243-
SSA1-2010 así como su estabilidad durante la vida útil. La presencia de los
microorganismos en el queso va a depender de la contaminación microbiana de la
leche, las condiciones extrínsecas del proceso y conservación (temperatura y tiempo)
y las intrínsecas del queso. Para la realización de los análisis, los quesos se
mantuvieron en refrigeración hasta el momento que se hicieron las pruebas. En la
Tabla 7 se muestran los límites máximos permisibles de conteo microbiano en quesos
frescos según la norma.
Tabla 10. Límites máximos de contenido microbiano en quesos frescos

MICROORGANISMO LÍMITE MÁXIMO
Mesófilos aerobios 10,000 UFC/g
Coliformes totales ≤100 UFC/g
Staphylococcus aureus ≤100 UFC/g
Mohos y Levaduras 500 UFC/g
La presencia de bacterias lácticas en la fabricación de los quesos podría restringir en

el desarrollo de otras bacterias, ya sea por competencia o por la producción de
sustancias antimicrobianas como lo hace Lactobacillus reuteri.
4.4.1 CONTEO DE MESOFÍLICOS AEROBIOS
En la Tabla 11 observamos el comportamiento de las bacterias mesofilícas que en los

tratamientos encapsulados y libres mostraron una diferencia significativa (p<0.05)
respecto al tratamiento control y respecto al tiempo, encontrándose los tratamientos
encapsulados hasta el día 21 de análisis, dentro de los límites permisibles establecidos
(10,000 UFC/g), reportando 853, 671 y 668 UFC/g para E1, E2 y E3 respectivamente.
42
Por otro lado los tratamientos libres reportaron 30, 227 y 201 UFC/g para L1, L2 y L3,
mostrando un conteo dentro del rango establecido, menor a los tratamientos
encapsulados. El tratamiento libre con 0.5% de L. reuteri (L1), tuvo un comportamiento
distinto a los demás, en el primer día tuvo una cuenta de 82 UFC/g, disminuyendo 47
UFC/g al día 7 y, reportando finalmente 30 UFC/g en el día 21.
Tabla 11. Conteo de Mesofílicos aerobios en los quesos elaborados con Lr. libre o
encapsulado representados en UFC/g
C1 148.00±67.90aD 881.00±43.80aC 1478.00±187.00aB 2195.00±14.10aA
E1 18.00±0.00cC 62.00±7.07Cc 325.00±33.90bB 853.00±26.90bA
E2 34.00±2.83bcB 98.00±5.66bcB 303.50±58.70bcB 671.00±137.20bA
E3 81.00±18.40abcB 150.00±11.31bB 311.00±18.40bcB 668.00±172.00bA
L1 82.00±8.49abcA 35.50±27.60cA 14.00±12.73cA 30.00±17.00cA
L2 136.00±8.49abB 151.00±12.73bB 185.00±24.00bcAB 227.50±10.61cA
L3 49.50±2.12abcC 109.00±15.60bcBC 127.00±29.70bcB 201.50±4.95c A
Los resultados son el promedio ± la desviación estándar del análisis por duplicado. Las letras minúsculas en la misma fila
indican que hay diferencias significativas conforme a los tratamientos y las letras mayúsculas indican diferencias
significativas respecto al tiempo.
Recuentos altos de Mesofílicos aerobios pueden indicar un almacenamiento

inadecuado, muchos de estos microorganismos son responsables de las
modificaciones organolépticas del queso. González-Montiel (2015) reportó un recuento
máximo de 9 Log UFC/g y un mínimo de 7 Log UFC/g en el queso de aro sobrepasando
los límites establecidos por la NOM-243-SSA1-2010. La Figura 23 representa el
comportamiento del desarrollo de los Mesofílicos aerobios durante un periodo de 21
días de almacenamiento, donde los tratamientos con el Lactobacillus reuteri libre
mostraron el menor crecimiento de bacterias, en comparación con los tratamientos
encapsulados y el control.
43
2500
UFC/g de Mesofílicos aerobios 2000
1500
1000
500
0
D1 D7 D14 D21
C1
E1
E2
E3
L1
L2
L3
Figura 23. Comportamiento de Mesofílicos aerobios en los quesos elaborados con Lr. libre o
encapsulado
4.4.2 CONTEO DE COLIFORMES TOTALES
En general los quesos mostraron una alta carga de coliformes totales a partir del día 7
como se puede observar en la Tabla 12, existió una diferencia estadística significativa
(p<0.05) entre el tiempo y los tratamientos; encontrándose en los quesos panela con
encapsulados el mayor conteo de estas bacterias.
Tabla 12. Conteo de coliformes totales en los quesos elaborados con Lr. libre o
C1 178.00±25.5aC 312.50±10.61aBC 515.00±24.00aB 2086.00±140.00aA
E1 48.00±17.00bB 191.50±16.30bB 369.50±40.30bB 1095.00±200.00bcA
E2 45.50±14.80bC 178.00±15.60bBC 217.00±22.60cB 1525.00±66.50abA
E3 53.50±23.30bB 182.00±26.90bB 309.00±17.00bcB 1540.00±260.00abA
L1 13.50±6.36bC 152.00±8.49bBC 210.50±20.50cB 718.50±91.20cA
L2 37.00±12.73bC 153.50±21.90bB 225.00±19.80cB 600.50±19.10cA
44
L3 34.00±5.66bB 154.50±17.70bB 217.00±32.50cB 678.50±87.00cA
Los coliformes habitualmente son residentes de los intestinos de animales y humanos,

cuando estas bacterias llegan a los alimentos suelen multiplicarse significativamente,
resultado de malas prácticas de higiene en la manufactura de los quesos e inclusive
por la materia prima con que se elabora. Los resultados son más bajos en comparación
con González-Montiel (2015), quien reportó 6.74 Log UFC/g como media de sus
resultados. La Figura 24 nos muestra el crecimiento de coliformes durante el
almacenamiento de los quesos.
2500
2000
UFC/g de Coliformes totales
1500
1000
500
0
D1 D7 D14 D21
C1
E1
E2
E3
L1
L2
L3
Figura 24. Comportamiento de coliformes totales en los quesos elaborados con Lr. libre o
encapsulado
45
4.4.3 CONTEO DE Staphylococcus aureus
Los Staphylococcus aureus están presentes en los alimentos, especialmente en

derivados lácteos como lo es el queso panela. Según la NOM-243-SSA1-2010 los
límites máximos permisibles de S. aureus en quesos frescos son de <100 UFC/g. La
Tabla 13 muestra una diferencia significativa (p<0.05) entre todos los tratamientos
durante los análisis; para los quesos con encapsulados existió una diferencia
estadística significativa respecto al tiempo, mientras que para los quesos con el
microorganismo libre no hubo diferencia estadística.
Tabla 13. Conteo de S. aureus en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
representados en UFC/g
C1 8.00±1.41aB 35.00±7.07bB 188.00±60.80aB 605.00±103.20aA
E1 2.50±2.12bB 36.50±0.70bB 64.50±20.50bB 141.00±25.50cdA
E2 1.00±1.41bC 91.00±2.83aC 245.50±34.60aB 377.50±29.00bA
E3 0.50±0.70bD 81.00±11.31aC 181.50±16.30aB 281.50±33.20bcA
L1 0.00±0.00bA 2.00±0.00cA 1.50±2.12bA 2.50±3.54dA
L2 1.50±0.70bA 0.50±0.70cA 0.00±0.00bA 0.00±0.00dA
L3 4.50±0.70abB 19.50±2.12bcA 0.00±0.00bB 0.00±0.00dB
La presencia de S. aureus indica una contaminación a partir de la manipulación del

alimento, por el material, el equipo de trabajo y la materia prima, como la leche de vaca
contaminada por mastitis. Los quesos evaluados en este proyecto no presentaron un
conteo por encima de los valores permitidos por la norma. En la Figura 25 observamos
que los tratamientos C1, E2 y E3 se encuentran dentro del rango de S. aureus para
quesos hasta el día 7, mientras que E1 se encuentra en el rango hasta el día 14. Los
tratamientos con el microorganismo libre L1, L2 y L3 se mantuvieron sin una cuenta
microbiana de S. aureus durante su almacenamiento.
46
800
600
UFC/g de S. aureus
400
200
0
D1 D7 D14 D21
C1
E1
E2
E3
L1
L2
L3
Figura 25. Comportamiento de S. aureus en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
4.4.4 CONTEO DE MOHOS Y LEVADURAS
La presencia de mohos y levaduras en los quesos son de importancia sanitaria en su

producción; los mohos son hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la
superficie de alimentos se reconoce fácilmente por su aspecto aterciopelado y a veces
pigmentado, las levaduras por su parte son hongos no filamentosos, se encuentran de
forma abundante en suelos, vegetales y otros alimentos. La composición de los
quesos, así como las condiciones de su almacenamiento, constituyen como sustrato
ideal para el desarrollo de estos hongos.
La Tabla 14 nos muestra el resultado de la cuantificación de mohos en los quesos

panela elaborados, donde observamos una diferencia estadística (p<0.05) entre los
47
tratamientos y respecto al tiempo, encontrándose todos los quesos dentro de los
límites máximos permisibles hasta el día 21 de su almacenamiento.
Tabla 14. Conteo de Mohos en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
representados en UFC/g
C1 7.00±1.41aC 11.50±2.12aC 20.00±1.41Ab 35.50±2.12aA
E1 0.00±0.00bA 0.00±0.00bA 0.00±0.00bA 2.00±2.83bA
E2 0.00±0.00bB 2.50±0.70bA 0.00±0.00bB 0.00±0.00bB
E3 0.00±0.00bA 0.00±0.00bA 0.00±0.00bA 1.00±0.70bA
L1 1.50±0.70bAB 0.50± 0.70bB 3.00±1.41bAB 16.00±7.07bA
L2 1.50±0.70bB 0.00±0.00bB 2.00±1.41bB 11.00±2.83bA
L3 1.00±0.00bA 0.50±0.70bA 1.50±0.70bA 11.50±7.78bA
Los hongos pueden causar un deterioro en los quesos, cambios en sus características
sensoriales, así como la producción de micotoxinas que pueden convertirse en un
riesgo para la salud del consumidor. La Figura 26 muestra el desarrollo de estos
microorganismos durante su almacenamiento, siendo notable que los tratamientos con
Lactobacillus reuteri encapsulado no mostraron una producción de mohos durante la
cuantificación, mientras que el tratamiento control y los tratamientos con el probiótico
libre si reportaron conteos de estos hongos, encontrándose dentro del rango
establecido por la NOM. Los resultados que González-Montiel en 2015 reportó
superaron el máximo permisible con 2.97 Log UFC/g, siendo excesivamente mayores
a los resultados reportados en este proyecto.
48
40
30
UFC/g de Mohos
20
10
0
D1 D7 D14 D21
C1
E1
E2
E3
L1
L2
L3
Figura 26. Comportamiento de Mohos en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
Las levaduras actúan como contaminantes en los productos lácteos, en los quesos
causan alteraciones como lo son; el sabor, la textura, formación de gas, aumento de
acidez, decoloración y crecimiento superficial (González-Montiel, 2015). Las levaduras
no producen enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), pero si causan deterioro
en el producto. Los quesos con los probióticos de forma encapsulada se encontraron
dentro de los límites permisibles hasta el día 14 de su análisis, mientras que los
tratamientos con L. reuteri libre se mantuvieron dentro de los valores permitidos por la
norma como se muestra en la Tabla 15, existiendo una diferencia estadística (p<0.05)
entre los tratamientos y respecto al tiempo.
49
Tabla 15. Conteo de Levaduras en los quesos elaborados con Lr. libre o
C1 58.00±5.66aD 390.00±127.30aC 1255.00±21.20aB 1906.00±69.30aA
E1 10.00±5.66bcC 96.00±28.30bC 550.00±73.50bB 1335.00±191.00abA
E2 18.00±9.90bcB 81.00±11.31bB 488.00±127.30bB 1484.00±317.00abA
E3 10.00±1.41bcC 83.00±8.49bC 719.50±58.70bB 1240.00±198.00bA
L1 21.00±0.00bB 84.00±38.20bAB 41.00±4.24cB 156.00±17.00cA
L2 1.50±2.12cC 7.50±0.70bC 72.00±5.66cB 177.50±2.12cA
L3 17.50±0.70bcC 157.00±38.20bAB 96.50±10.61cBC 207.00±14.10cA
Los resultados son el promedio ± la desviación estándar del análisis por duplicado. Las letras minúsculas en la misma
fila indican que hay diferencias significativas conforme a los tratamientos y las letras mayúsculas indican diferencias
Las levaduras están presentes en distintas variedades de quesos, frecuentemente en

alto número. Contribuyen en el proceso de maduración o por el contrario, pueden
producir alteraciones en ellos. Su presencia es atribuida a sus diferentes
características tecnológicas, como la habilidad para desarrollarse a bajas
temperaturas, resistencia a altas concentraciones de sal y a sanitizantes, y la habilidad
de tolerar bajos valores de aw y pH (Cardoso et al., 2015).
En la Figura 27 se puede observar notoriamente la diferencia del desarrollo de estos

microorganismos entre los tratamientos, siendo los sistemas con el Lactobacillus
reuteri libre los de menor crecimiento durante su almacenamiento, esto pudiéndose
deber a que el probiótico puede actuar en contra de microorganismos no deseados
cuando se encuentra libre en los quesos. En el proyecto de González-Montiel en el
2015, se obtuvo resultados que superaron los límites máximos permisibles de la norma
con un recuento de 3.59 Log UFC/g, menciona que la presencia de hongos en queso
fresco se debe a que el ambiente de trabajo, los equipos, utensilios y el
almacenamiento presentan deficiencias higiénicas.
50
2500
2000
UFC/g de levaduras
1500
1000
500
0
D1 D7 D14 D21
C1
E1
E2
E3
L1
L2
L3
Figura 27. Comportamiento de Levaduras en los quesos elaborados con Lr. libre o encapsulado
4.4.5 CONTEO DE Salmonella spp
La presencia de microorganismos patógenos en los quesos depende del tratamiento

térmico de la leche, de la limpieza en general, del manejo de la cuajada durante la
elaboración y de la temperatura de almacenamiento; todo esto es importante debido a
que el queso panela tiene un alto nivel de humedad que facilita la proliferación de
microorganismos patógenos como Salmonella. Cabe mencionar que la salmonelosis
es una de las enfermedades más importantes, y que los quesos se han visto
involucrados en su brote.
Los quesos panela aquí elaborados no reportaron presencia de este patógeno durante
los 21 días de almacenamiento, como se puede observar en la Tabla 16 todos los
51
tratamientos se encuentran dentro de la NOM-243-SSA1-2010, en comparación con
González-Montiel (2015) quien reportó presencia de los quesos analizados durante su
almacenamiento, esto atribuido a una falta de control durante el proceso de
elaboración, o la utilización de leche cruda contaminada.
Tabla 16. Recuento de Salmonella spp 25 g de queso

TRATAMIENTOS DÍA 1 DÍA 7 DÍA 14 DÍA 21 LÍMITES
MÁXIMOS
E1 -- AUSENTE --
E2 -- AUSENTE --
E3 -- AUSENTE --
AUSENTE
L1 -- AUSENTE --
L2 -- AUSENTE --
L3 -- AUSENTE --
52
5 CONCLUSIONES
 Los quesos comerciales y el queso artesanal obtenido en la región, reportaron

conteos que superaron excesivamente los límites máximos permisibles
establecidos por la NOM-243-SSA1-2010, durante su almacenamiento. Siendo
no aptos para el consumo.
 Los tratamientos con Lactobacillus reuteri encapsulado mostraron una mayor
viabilidad del probiótico durante su almacenamiento, existiendo un crecimiento
en cada análisis realizado; esto debido a que el sistema de las capsulas actúan
como un ambiente que protege al probiótico de factores externos que afectan
su desarrollo.
 Todos los quesos son considerados alimentos probióticos al encontrarse arriba
de las 106 UFC/g del microorganismo.
 Los tratamientos con sistema libre reportaron una mayor eficacia en cuanto a la
inhibición de patógenos en los quesos. Siendo los quesos con el Lacobacillus
reuteri libre, quesos probióticos e inocuos.
53
6 FUENTES DE INFORMACIÓN
Agudelo Gómez, D. A., & Oswaldo, B. M. (2005). Composición nutricional de la

leche de ganado vacuno . Revista Lasallista de Investigación .
Alimentarius, C. (2015). codex Stan 192, 1995. Norme générale Codex pour les
additifs alimentaires.
Dergal, S. B., Rodriguez, H. B., & Morales, A. A. (2006). Química de los
alimentos (No. 04; TX354 B3 2006.). Pearson educación
Fundación Iberoamericana de Nutrición (FINUT). La leche como vehículo de
salud para la población. 2015.
González-Montiel, L., & Franco-Fernández, M. (2015). Perfil microbiológico del
queso de aro consumido en la Cañada Oaxaqueña. Brazilian Journal of Food
Techonology, 18(3), 250-257.
Haro García, A. (2016). La mantequilla: Un alimento altamente energetico.
Granada, España.
Hernandez, A. G. D. (2010). Tratado de nutricion/Nutrition Treatise:
Composicion y Calidad Nutritiva de los Alimentos/Composition and nutritional quality
of foods (Vol. 2). Ed. Médica Panamericana.
Julián Pérez Porto y Ana Gardey. Publicado: 2008. Actualizado: 2012.
Lewus, C., & Montville, T. (1991). Detection of bacteriocins produced by lactic
acid bacteria. J. Microbiol Meth, 145-150.
NMX-F-387-1982. (1982). Alimentos. Leche fluida determinación de grasa
butírica por el método de Gerber. Foods. Fluid milk determination of butterfat by the
Gerber method. Normas Mexicanas. Dirección general de normas.
NMXF-F-446-1984. (1984). Alimentos para humanos. Leche pasteurizada.
NOM-155-SCFI-2012, N. (2012). Leche- denominaciones, especificaciones
fisicoquímicas información comercial y métodos de prueba.
NOM-243-SSA1-2010, N. O. (27 de Semtiembre de 2010). Productos y
servicios. Leche, fórmula láctea, producto lácteo combinado y derivados lácteos.
Disposiciones y especificaciones sanitarias. .
54
NORMA OFICIAL MEXICANA - NOM. NOM-092-SSA1-1994: bienes y
servicios. Método para la cuenta de bacterias aerobias en placa. México, D.F., 1994a.
servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos
para su análisis microbiológico. México, D.F., 1994b.
servicios. Preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis
microbiológico. México, D.F., 1994c.
servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. México, D.F.,
1994d.
servicios. Método para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa.
México, D.F., 1994e.
servicios. Método para la determinación de Salmonella en alimentos. México, D.F.,
1994f.
servicios. Método para la determinación de Staphylococcus aureus en alimentos.
México, D.F., 1994g.
NORMA OFICIAL MEXICANA - NOM. NOM-243-SSA1-2010: leche, fórmula
láctea, producto lácteo combinado y derivados lácteos. Disposiciones y
especificaciones sanitarias. Métodos de prueba. México, D.F., 2010.
Panahi S, Fernandez MA, Marette A, Tremblay A. Yogurt, diet quality and
lifestyle factors. Eur J Clin Nutr 2017;71(5):573.
Paz, E., Montero, M., Angulo, O., & García, H. (1998). Preparation of a low fat
fresh-type cheese. Milchwissenschaft, 81-83.
Pineda Portugal, M. M. (2014). Importancia de la leche y productos Lácteos.
Rodríguez-Pérez, K., Vivar-Vera, M., Rodríguez-Miranda, J., & Paz-Gamboa, E.
(2016). Efecto de un multi-compuesto polimérico en la coencapsulación de
55
Lactobacillus reuteri expuesto a altas temperaturas. Avances y Perspectivas en
Biotecnología y Ciencias Agropecuarias, 31-49.
Sinkiewicz, G. (2010). Lactobacillus reuteri in health and disease. Malmo
University Health and Sociesty Doctoral Dissertation .
Ulrich, K., & Eppinger, S. (2013). Diseño y desarrollo de productos (5ª edición
ed.). México, D.F.: Mc Graw Hill.
VÉLEZ-RUIZ, J.F. Apuntes de Tecnología de Alimentos de Origen Animal
(Lácteos). Cholula, Puebla, México: Universidad de las Américas Puebla, Inéditos,
2017.
56

Tesis - Miriam de Lourdes Martinez Moran

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S.E.P.

TECNOLÓGICO NACIONAL DE MÉXICO

Evaluación de viabilidad y perfil

Para obtener el título de

San Juan Bautista Tuxtepec, Oaxaca. Enero 2022

mi tío Gonzalo Martínez, a mi querido hermano, a mis abuelas, a mi familia, a

mi pareja y a mi amada hija…

Al Tecnológico Nacional de México (TecNM) por haber proporcionado el

financiamiento para la realización de este trabajo de investigación.

A Aurora Chávez Montaño por su amistad y consejos, por permitirme colaborar en

Al equipo de trabajo de laboratorio de Desarrollo de Nuevos Productos, ingenieros

A Mariana Guerrero Martínez por enseñarme que la amistad si existe, por no

Miriam de Lourdes Martínez Morán. Ingeniería Bioquímica. Instituto Tecnológico de

Palabras clave: Lactobacillus reuteri, queso panela, viabilidad, encapsulado.

Miriam de Lourdes Martínez Morán. Biochemical Engineering. Instituto

The following study aimed to evaluate the microbiological profile of panela-type

Key words: Lactobacillus reuteri, panela cheese, viability, encapsulation.

FUNDAMENTO TEÓRICO .......................................................................................................... 3

1.1.1 COMPONENTES DE LA LECHE .............................................................................. 3

1.2 PRODUCTOS DERIVADOS DE LA LECHE .................................................................. 4

1.2.1 QUESO .................................................................................................................... 5

1.3 ALIMENTOS FUNCIONALES ....................................................................................... 9

1.4 PROBIÓTICOS ........................................................................................................... 10

1.4.1 CLASIFICACIÓN DE PROBIÓTICOS ..................................................................... 12

1.5 ENCAPSULACIÓN ..................................................................................................... 13

1.5.1 MÉTODOS DE ENCAPSULACIÓN ........................................................................ 14

1.5.2 COMPONENTES UTILIZADOS EN ENCAPSULACIÓN ......................................... 16

2.1 ANTECEDENTES ............................................................................................................ 19

2.2 JUSTIFICACIÓN .............................................................................................................. 19

2.3.1 OBJETIVO GENERAL............................................................................................... 20

2.3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS...................................................................................... 20

3.1 MATERIA PRIMA ........................................................................................................ 22

3.1.1 CEPA MICROBIANA .............................................................................................. 22

3.1.2 LECHE BRONCA ................................................................................................... 22

3.2 DESNATADO Y ESTANDARIZACIÓN DE LA LECHE ................................................. 22

3.3 PASTEURIZACIÓN DE LA LECHE ............................................................................. 23

3.4 ACTIVACIÓN Y PROPAGACIÓN DE LA CEPA DE L. reuteri NRRL-14171 ................. 24

3.4.1 PREPARACIÓN DEL MEDIO MRS ........................................................................ 24

3.4.2 ACTIVACIÓN ......................................................................................................... 24

3.4.3 PROPAGACIÓN DEL MICROORGANISMO ........................................................... 25

3.4.4 OBTENCIÓN DEL PAQUETE CELULAR................................................................ 25

3.5 OBTENCIÓN DE LOS ENCAPSULADOS DE L. reuteri ............................................... 26

3.6 ELABORACIÓN DE QUESO TIPO PANELA ADICIONADO CON Lactobacillus reuteri

LIBRE O ENCAPSULADO ................................................................................................................. 27

3.7 EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD DE L. reuteri EN LOS QUESOS. ........................... 28

3.8 CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DE LOS QUESOS OBTENIDOS................ 28

3.9 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................... 30

4 RESULTADOS Y DISCUSIONES ....................................................................................... 32

4.1 EVALUACIÓN MICROBIOLÓGICA DE QUESOS TIPO PANELA DE MARCAS

COMERCIALES Y ARTESANALES. .................................................................................................. 32

4.2 CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DE LA LECHE ............................................... 38

4.4 CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DE LOS QUESOS TIPO PANELA

4.4.1 CONTEO DE MESOFÍLICOS AEROBIOS .............................................................. 42

4.4.2 CONTEO DE COLIFORMES TOTALES ................................................................. 44

4.4.3 CONTEO DE Staphylococcus aureus ..................................................................... 46

4.4.4 CONTEO DE MOHOS Y LEVADURAS .................................................................. 47

4.4.5 CONTEO DE Salmonella spp ................................................................................. 51

6 FUENTES DE INFORMACIÓN ........................................................................................... 54

Figura 3. Representación gráfica de alimentos funcionales ........................................................ 10

Figura 4. Probióticos .................................................................................................................. 11

Figura 5. Lactobacillus reuteri. ................................................................................................... 13

Figura 6. Proceso de encapsulación .......................................................................................... 14

Figura 7.Esquema de los diferentes procesos de microencapsulación. Fuente (Sierra y Guillen,