Universidad Nacional Autónoma De

Honduras
Facultad De Ciencias
Escuela De Microbiología

MANUAL DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
(IQ- 601)

Coordinadora: Lourdes Enríquez de Madrid

Primera Edición

Ciudad Universitaria, Tegucigalpa M.D.C

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE HONDURAS
Facultad de Ciencias
Decano
Ing. Nabil Kawas

Escuela de Microbiología
Directora
Dra. Ekaterina Bonilla

Coordinador Académico
Dr. Edgardo Tzoc Ramírez

Departamento de Microbiología
Jefe
Dra. Silvia Pineda

Autor
Dra. Keylin Mendoza

Revisado
Dra. Lourdes Enríquez de Madrid

Ciudad Universitaria, abril 2020

Tegucigalpa MDC
 PRESENTACIÓN

El presente manual de prácticas de laboratorio ha sido desarrollado y diseñado

para ser utilizado en la asignatura de Microbiología Industrial (IQ-601), para los
estudiantes de la carrera de Ingeniería Química con el fin de que cada uno de
los estudiantes fortalezca o adquiera nuevas habilidades y conocimientos de en
Microbiología con experiencias propias o cercanas a ello.

Además, se presenta la información general de cada práctica, así como el

objetivo general que se persigue, descripción de materiales y equipo, material
biológico, fundamento, metodología y actividades, investigaciones a resolver en
casa y la bibliografía citada según normas APA (American Psychological
Association). Cada práctica está cimentada con los conocimientos teóricos que
se van requiriendo conforme se avanza el curso.
 TABLA DE CONTENIDO

NORMAS DE BIOSEGURIDAD .................................................................. 5

PRÁCTICA 1 ............................................................................................ 12
EL MICROSCOPIO .................................................................................. 12
PRÁCTICA 2 ............................................................................................ 19
PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN EL AMBIENTE.................... 19
PRÁCTICA 3 ............................................................................................ 23
DEGRADACIÓN DE CELULOSA POR MICROORGANISMOS ............... 23
PRÁCTICA 4 ............................................................................................ 25
ESTERILIZACIÓN .................................................................................... 25
PRÁCTICA 5 ............................................................................................ 29
EXTRACCIÓN, AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS................... 29
PRÁCTICA 6 ............................................................................................ 34
PRODUCCIÓN DE PROTEASAS BACTERIANAS ................................... 34
NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Las siguientes normas de Bioseguridad, deberán ser de cumplimiento obligatorio

en el desarrollo de las prácticas de laboratorio en la Escuela de Microbiología.

Consideraciones generales

1. Portar el carnet de estudiante permanentemente

2. Usar permanentemente su mascarilla (no se aceptará el uso de mascarillas
de tela).
3. Mantener un distanciamiento físico de 1.5-2 m con otras personas y reducir lo
más que se pueda su interacción con ellas.
4. Realizar frecuentemente el lavado de manos con agua y jabón siguiendo el
protocolo de la OMS. Cuando no sea posible el lavado de manos se deberá
emplear alcohol etílico en gel al 70%.
5. Adoptar prácticas de higiene respiratoria y “etiqueta de tos”, cubriéndose la
nariz y la boca con una toalla o pañuelo desechable al toser y estornudar, y luego
descartarlo en un basurero. Se recomienda no tocarse los ojos, nariz y/o boca y
no saludar mediante un contacto físico directo.
6. Revisar detalladamente su jornada y horarios de laboratorios, ya que su
permanencia en dichos espacios físicos estará limitada a su horario.

Consideraciones previo a las prácticas de laboratorio

1. Presentar el carnet de vacunación con esquema completo de 2 dosis contra

la Covid-19 en la primera práctica de laboratorio.
2. Portar un kit de bioseguridad básico conteniendo:
• Una mascarilla adicional a la que se vaya a utilizar (N95, KN95 o
• mascarilla quirúrgica).
• Gel antibacterial a base de alcohol al 70% y/o alcohol al 70%.
• 2-3 pares de guantes de látex.
• Careta facial y/o lentes protectores si el docente lo indica de acuerdo a la
naturaleza de la asignatura.
 • Otros elementos específicos que el docente indique.
• Una bolsa plástica mediana para transportar su gabacha.

Consideraciones durante las prácticas de laboratorio

1. Seguir las indicaciones de su docente en todo momento:

• Mantener un distanciamiento físico de 1.5-2 m entre sus compañeros.
• Portar únicamente el material necesario para su práctica.
• No se aceptan alimentos ni bebidas.
• colocarse en la ubicación asignada, según la distribución indicada por el
docente. Es necesario respetar su espacio asignado.
• Prohibido el uso del celular u otros dispositivos móviles en las prácticas
de laboratorio. Se exceptúa cuando el docente lo autorice.
• No prestar ni compartir útiles de uso personal (lápices, manuales, libretas,
calculadoras, etc.).
• Trabaje en su área de trabajo. Únicamente desplácese en el interior del
laboratorio si es necesario.

2. Portar consigo el Equipo de Protección Personal (EPP) de su kit según nivel

de riesgo del procedimiento de laboratorio a realizar.
• Colocarse la gabacha dentro del laboratorio y/o área de locker, la cual trae
en una bolsa plástica.
• El uso permanente de la mascarilla es obligatorio en todas las prácticas
de laboratorio.
3. Colocar sus mochilas o bolsos en los lugares señalados por el docente.
4. Limpiar su área de trabajo asignada con papel toalla y una solución de
hipoclorito de sodio al 0.5%.
5. Realizar lavado de manos con agua y jabón por al menos 30 segundos,
siguiendo el procedimiento de la OMS, cada vez que sea necesario.
6. Use y limpie los materiales con las instrucciones proporcionadas por los
docentes.
7. Limpie los equipos de laboratorio antes y después de su uso con un paño
humedecido con alcohol al 70%.
Consideraciones al finalizar las prácticas de laboratorio y retirarse de las
instalaciones de la Escuela.

1. Una vez finalizada la práctica, limpiar su área de trabajo con papel toalla y una
solución de hipoclorito de sodio al 0.5%. Desinfecte también sus pertenencias.
2. Colocar los reactivos, materiales y equipos en los lugares indicados por su
docente.
3. Antes de salir del laboratorio, deberá retirarse el EPP según los protocolos
brindados por el docente y descartar el material desechable en los basureros
correspondientes, siguiendo las normas de segregación y bioseguridad.
4. La gabacha debe guardarla en la bolsa y colocarla dentro de su mochila o
bolso.
Queda terminantemente prohibido salir del laboratorio con la gabacha
puesta o portándola a la vista y sin estar cubierta, en especial si se
encuentra circulando por el edificio.
5. Al salir del laboratorio deberá dirigirse directamente a su hogar. No
permanecer
en espacios y entornos que no sean los laboratorios, incluyendo los pasillos,
gradas, bancas, áreas verdes, cubículos docentes, oficinas administrativas,
entre otras. Se procederá a reportar a los estudiantes que no cumplan con
esta disposición y su asistencia a futuras prácticas estará condicionada.

Otras consideraciones

1. Con el objeto de evitar la formación de aerosoles, gotas y salpicaduras,

es obligatorio:
a. El uso de pipeteadores y micropipetas.
b. Se deben emplear pipetas con tapón de algodón para evitar el
derrame y reducir la posibilidad de contaminar el dispositivo de
aspiración.
c. Seguir el procedimiento para el uso de la centrifuga.

2. No se permite:
 • El uso de pantalón corto, licras, minifaldas, pantalones con orificios,
vísceras y gorras (gorros).
• Almacenar alimentos en los refrigeradores asignados en el área de
trabajo.
• Fumar, maquillarse o peinarse en el laboratorio.
• Usar mascara de pestañas.

3. Mientras se realiza el trabajo de laboratorio, debe evitar tocarse el rostro,

ojos, nariz, boca, y tener recogido el cabello adecuadamente (no tener el
cabello en la cara) y utilizar las uñas cortas.

4. Se prohíbe la entrada a particulares en el área de laboratorio.

5. Debe realizarse una rotulación adecuada de reactivos y materiales de

acuerdo a su riesgo biológico y químico.

6. Se debe respetar la señalización existente en los laboratorios.

7. Los ácidos, álcalis y reactivos potencialmente peligrosos, cancerígenos,

deberán ubicarse adecuadamente, separándolos de acuerdo a su
naturaleza y peligrosidad, Mantener cantidades y volúmenes pequeños
dentro de laboratorio.

8. Las muestras y desechos deben ser manejados, descartados, y

transportados adecuadamente de acuerdo a su naturaleza, siguiendo el
Plan de Manejo de Desechos Bioinfecciosos de la Escuela de
Microbiología.

9. Las pipetas, puntas de micropipetas, portaobjetos, tubos de ensayo,

viales, etc. contaminados, deberán de sumergirse en desinfectante, (Cloro
al 0.5%) antes de proceder al lavado.

10. El material punzocortante (agujas, cubreobjetos) deben descartarse en

dispositivos rígidos cuyo material no sea perforable.
 11. Al descartar líquidos y reactivos diluidos puede hacerlo en el lavado, se
debe dejar correr el agua del grifo durante un tiempo de 3-5minutos
(Medida transitoria). Si las sustancias químicas son concentradas,
avocarse al comité de bioseguridad para su tratamiento y descarte.

12. Para evitar riesgo de goteo accidental de un material infeccioso recubrir

la superficie de trabajo con una hoja de papel toalla, el cual deberá
descartarse en el dispositivo de bioinfecciosos para su esterilización en la
autoclave.

13. Una vez finalizada la actividad regresar los reactivos y equipos empleados
(microscopio, mechero, etc.), limpios y de manera ordenada siguiendo el
protocolo respectivo, reporte cualquier daño de los mismos al profesor.

14. Después de cada rutina de trabajo es obligatorio revisar que los

laboratorios estén limpios y ordenados, grifos de agua cerradas, los
aparatos apagados y desconectados. Así mismo deberá lavarse las
manos con jabón siguiendo el protocolo de lavado de manos.

15. Mantener botiquines con los insumos necesarios en los laboratorios e

información de los procedimientos a seguir en casos de emergencias.

16. En caso de incidente informe a su profesor de inmediato, llenar el

protocolo respectivo, El profesor informará al Comité de Bioseguridad y
hará llegar la información precisa sobre el caso y las medidas tomadas.

MEDIDAS EN CASO DE EMERGENCIA: A continuación, mencionaremos los

pasos que se deben seguir en caso de que ocurran los siguientes incidentes, en
todos siempre informar de inmediato al profesor.

1. Derrame de material biológico sobre el cuerpo:

a) Remover la ropa inmediatamente.
 b) Lavar vigorosamente el área expuesta con agua y jabón por un
minuto.

c) Reportar el incidente al profesor.

d) Buscar atención médica si es necesario.

e) La ropa contaminada debe ser colocada en una solución

desinfectante antes de ser lavada.

2. Salpicaduras en los ojos con materiales bioinfecciosos:

a) Lavar inmediatamente el globo ocular e interior de la superficie del
párpado con abundante agua durante 15 minutos aproximadamente.
Abrir el ojo para asegurar efectivamente el lavado, comenzando por
los párpados.

b) Reportar el incidente al profesor. Buscar atención médica

inmediatamente.

3. Cortadas menores y heridas por pinchazo: Reportar el incidente

al profesor
a) Presionar y hacer sangrar un minuto, luego

b) Lavar vigorosamente la herida con agua y jabón por varios minutos.

c) Aplicar un antiséptico adecuado (tintura de yodo(yodopovidone),

clorhexidina, mertiolate)

d) Buscar atención médica inmediatamente.

4. En el caso de derrames:
1. Reportar el incidente al profesor.

2. Buscar kit de limpieza para derrames Biológico

3. Colocarse guantes y cubrir con papel absorbente el área del derrame.

4. Verter un desinfectante adecuado y dejar actuar por el tiempo

necesario.

5. Retirar el material absorbente junto al material roto recogerlo con un

recogedor con cuidado y colocarlos en un recipiente para residuos
contaminados o bolsa de desechos respectivo, el cual debe
esterilizarse junto con los guantes utilizados.

6. Limpiar y desinfectar nuevamente el área empleando nuevas toallas

de papel y desinfectante.

7. Lavarse las manos según protocolo de lavado de manos.

 PRÁCTICA 1

EL MICROSCOPIO

1. Objetivo
Conocer las diferentes partes del microscopio, así como el correcto
manejo y cuidado de este.

2. Fundamento

El microscopio nos permite observar especímenes invisibles al ojo humano, esto

se logra mediante un sistema óptico compuesto por lentes, que forman y
amplifican la imagen del objeto que se está observando. Este término surge en
el siglo XVII y deriva de las palabras griegas mikrós (pequeño) y skopéoo
(observar), donde se reconoce a Anton Van Leewenhoek (1680) como el primero
en observar microorganismos utilizando el microscopio.

Existen diversos tipos de microscopios, entre estos podemos mencionar:

● El microscopio simple o también llamado lupa, consta de una de sólo

una lente biconvexa o plano- convexa, que proporciona una amplitud
moderada del objeto.

● Microscopio compuesto: se constituye por la combinación de dos o más

sistemas de lentes convergentes: uno, próximo al ojo del observador, el
ocular y el otro próximo al objeto, denominado objetivo.
● El microscopio estereoscópico o de disección, es un microscopio
compuesto doble, en estos aparatos las imágenes conservan los relieves
que pueden observarse simultáneamente con los dos ojos.
● Los microscopios electrónicos utilizan haces de electrones en vez de
luz. Los electrones se enfocan con campos magnéticos, no con lentes.
Cuando un haz de electrones incide en el vacío sobre un objeto, las
 partículas incidentes pueden ser absorbidas, transmitidas y modificarse
de distintas formas.

El microscopio compuesto u óptico está integrado por 3 sistemas, los cuales

son:

● 1.- Sistema Mecánico

● 2.- Sistema Óptico
● 3.- Sistema de Iluminación

2.1. Sistema Mecánico:

El sistema mecánico es el esqueleto o armazón del microscopio, el cual

proporciona soporte y estabilidad al equipo.

Está integrado por:

El tubo de microscopio: El cual es de forma cilíndrica, en su parte superior

sostiene a la lente o lentes oculares y en la parte inferior se encuentra el sistema
de lentes objetivos.

Revólver: Es la parte circular en la que se encuentran atornilladas las diferentes

lentes objetivas, al girar el revólver cambian las lentes objetivas sin que se
desenfoque la preparación.

Platina: Pieza metálica cuadrada, con un orificio central sobre el que se colocan
las preparaciones a observar y por el que atraviesa el rayo luminoso.

Base o Pie: Es la base sobre la que descansa el aparato y le da estabilidad.

Brazo o columna: Es la parte que sostiene el tubo y su mecanismo de

desplazamiento vertical formado por los tornillos macrométrico y micrométrico.

2.2. Sistema Óptico:

El sistema Óptico está formado por 2 sistemas de lentes: Oculares y Objetivos.

Los lentes oculares van montados en la parte superior del tubo del microscopio.

Los lentes objetivos se encuentran en el revólver.

Hay 2 tipos de objetivos:

Los objetivos secos proporcionan poco aumento que va desde 10x, 20x,
40x.

Los objetivos de inmersión proporcionan un mayor aumento y definición,

de 100x.

2.3. Sistema de Iluminación

El sistema de Iluminación está formado por:

La fuente de iluminación consta generalmente de una lámpara

incandescente de tungsteno.

El condensador de luz está formado por un sistema de lentes cuya función

es captar los rayos luminosos y dirigirlos hacia la preparación que se va a
enfocar.
El Diafragma es una abertura que controla la cantidad de luz que debe pasar
por el condensador, que se regula por una palanca lateral.

Cuidado del microscopio

El microscopio es un valioso instrumento. Para que pueda servir eficazmente
año tras año, es necesario brindarle el cuidado adecuado. Por lo que debe seguir
las siguientes indicaciones:

● Evite mover el microscopio cuando la lámpara esté encendida, ya que el

filamento de la lámpara incandescente es extremadamente sensible.
● No toque las lentes de oculares y objetivos con los dedos, para evitar
mancharlos con su grasitud natural.
● Luego de usar el microscopio, límpielo con papel lente. Verifique que no
hayan quedado preparados sobre la platina.
● Déjelo con el objetivo de menor aumento, la platina lo más próxima posible
a él, y protegido con la cubierta correspondiente.

3. Materiales y Equipo

● Microscopio compuesto
● Porta objetos.
● Cubre objetos.
● Pipeta pasteur
● Frascos con aceite de inmersión.
● Muestra de agua.
● Láminas previamente preparadas (colonias bacterianas)
● Papel limpia lentes.
● Desinfectante Alcohol 70 %

4. Procedimiento

4.1 Colocar el nombre a las partes señaladas en el microscopio.

 4.2 Preparación en fresco.
a) Desinfectar el área de trabajo con alcohol al 70%
b) Colocar una gota de la muestra de agua en el centro de la lámina
portaobjetos.
c) Colocar sobre la gota, una lámina cubreobjetos.
d) Observar en el microscopio con el objetivo de 10X y 40X.
e) Dibujar lo observado.

10x 40x

X= Número de veces que la imagen ha sido amplificada.

4.3. Observar y dibujar los diferentes montajes en el microscopio.

100X 100X

100X 100X
Tarea:
Investigar los usos de los diferentes microscopios.

Bibliografía

Manual de laboratorio, Microbiología General MB045, revisado y actualizado

por Dra. Lourdes de Madrid MSc. y Dra. Miriam Arias MQc. Departamento de
Microbiología, UNAH.
 PRÁCTICA 2

PRESENCIA DE MICROORGANISMOS EN EL AMBIENTE

1. Objetivo
• Conocer los microorganismos presentes en el ambiente.
• Determinar la calidad microbiológica del ambiente y superficies.

2. Fundamento
Los hábitats de las bacterias, al igual que los de cualquier microorganismo, son
extremadamente diversos, estos microorganismos se encuentran presentes en todos los
ambientes: en el aire, agua, superficie de objetos e incluso sobre nuestra piel.

El aire, además de las partículas en suspensión, es portador de bacterias, hongos y sus

esporas, por ello puede ser causa tanto de contaminación de alimentos y superficie como
las infecciones en el hombre (infecciones respiratorias etc.).

Asimismo, el objetivo de los análisis microbiológicos de superficies es comprobar el

estado higiénico del ambiente.

Existen distintos métodos para el análisis de superficies: sedimentación, filtración,

extensión en superficies, entre otros.

En esta ocasión realizaremos la prueba por sedimentación en placa es uno de los

métodos más sencillos que nos orientan sobre la densidad poblacional microbiana
presente en el aire y superficies, ya que los niveles varían en función de las corrientes de
aire y del tamaño de las partículas en suspensión.

Asimismo, El método del hisopo es uno de los más utilizados, ya que sirve para evaluar
superficies planas como no planas, mediante esta prueba, determinaremos los
siguientes grupos microbianos: mohos y levaduras, Staphylococcus aureus, coliformes
totales y coliformes fecales (E. Coli).
3. Materiales y Equipos
▪ Tubos con agua peptonada 0.1 % AP
▪ Hisopos estériles
▪ Placas de Petri con los siguientes medios de cultivo
▪ Agar papa dextrosa (PDA)
▪ Agar Standard Plate Count (SPC).
▪ Agar Eosin Methyl Blue(EMB).
▪ Agar Baird Parker (BP).

▪ Plantillas de metal con área de 20 cm2 , 50 cm2 , 100 cm2

▪ Kit para coloración de Gram
▪ Peróxido de hidrogeno al 3 %
▪ Tubos con caldo simple
▪ Plasma humano fresco diluido
▪ Solución salina estéril
▪ Laminas portaobjetos
▪ Microscopio

4. Procedimiento

4.1. Análisis de ambientes. Método de sedimentación:

a) Tomar un número de placas Petri con PDA y SPC de tal manera que
abarque el lugar a evaluar.
b) Colóquelas sobre una superficie por distantes, ya sea en forma M, X O Z.
c) Destapar las placas dejándolas expuestas al ambiente durante por 15 min.
d) Cerrar las placas y llevarlas a incubar de esta manera: recuente total de
aerobios mesófilas a 35-37 °C durante 24 -48 horas y los mohos y
levaduras a 25 °C durante 5 -7 días.
e) Pasado el tiempo de incubación realizar el respectivo recuento.

B. Análisis de superficies. Método de la plantilla por hisopo

a) Tomar la plantilla estéril de 100 cm2 (u otra área conocida) y colocarla

sobre la superficie evaluar.
b) Seguidamente humedecer un hisopo estéril en agua peptonada estéril.
 c) Frotar la superficie dentro de la plantilla en tres direcciones y realizar de
inmediato la siembra masiva en superficie del respectivo agar (PDA, SPC,
EMB).
d) Llevar a incubación teniendo en cuenta el requerimiento de temperatura
para cada grupo microbiano: aerobios mesófilos a 35-37 °C durante 24 -
48 horas, los mohos y levaduras a 25 °C durante 5 -7 días y los coliformes
a 35-37 °C durante 24 -48 horas.
e) Pasado el tiempo de incubación realice el respectivo recuento.

C. Manos. Evaluación de contaminación.

a) Tome un hisopo estéril y humedézcalo en agua peptonada estéril.
b) Seguidamente tome la mano del procesador de alimentos y frote el hisopo
en la mano, uñas y espacios interdigitales.
c) Posteriormente, realice la siembra masiva en la superficie de los
respectivos agares (BP, EMB, SPC).
d) Llevar a incubación teniendo en cuenta el requerimiento de temperatura
para cada grupo microbiano: aerobios mesófilos a 35-37 °C durante 24 -
48 horas, coliformes a 35-37 °C durante 24 -48 horas y S. aureus a 35-
37°C durante 24– 48 horas.
e) Pasado el tiempo de incubación realice el respectivo recuento.

5. Fórmulas para interpretación de cálculos

5.1. Superficies

Bacterias = # de bacterias x dilución x volumen de APE utilizada

𝑐𝑚2 área (cm2) utilizada

5.2. Aire

#Bacterias/Tiempo =# de bacterias contada

5.3. Manos

# Bacterias/ Mano = # Bacterias x dilución x volumen APE utilizado

Interpretación Interpretación Máximo número de

Prueba microorganismos
UFC/ mano
Recuento Total <100
Recuento de Coliformes Totales <10
Recuento de Coliformes Fecales <10
Recuento de Escherichia coli <10
Recuento de Staphylococcus aureus <10
termonucleasa positiva

6. Referencias
Bacteriological Analytical Manual. 2001. Food and Drug Administration.
Washington, USA.
Orfao de Matos Alberto, P. L. (2011). Protocolo de Extracción de Ácidos Nucleicos. Madrid.

Rodriguez, E. T. (2018). Manual de Laboratorio de Microbiología de Aguas y Alimentos I y II.

Universidad Nacional Autonoma de Honduras, Tegucigalpa.

Serrato Díaz Alejandra, F. R. (s.f.). PCR: reacción en cadena de polimerasa. Mexico.

Vázquez, B. P.-U. (2010). Metodología de esterilización en el laboratorio microbiológico.

Reduca (Biología). Serie Microbiología, 3(5), 1-14.
 PRÁCTICA 3
DEGRADACIÓN DE CELULOSA POR MICROORGANISMOS

1. Objetivo
Observar la degradación de celulosa por los microorganismos del suelo.

2. Fundamento
La celulosa es el principal componente de la pared celular de los vegetales y de
algunos protoctistas. Se trata de uno de los polisacáridos más abundantes
existentes en la tierra, estimándose que cada año, 1015 kg de celulosa son
sintetizados y degradados. Desde el punto de vista químico se trata de un
carbohidrato complejo e insoluble formado por microfibrillas de moléculas de
glucosa unidas cola con cola. Tanto los papeles como el algodón están formados
principalmente por celulosa.

Las celulosas son enzimas extracelulares, producidas por hongos, bacterias y

protozoarios, que hidrolizan la celulosa. La asociación con microorganismos
productores de celulosa permite a las termitas y a los rumiantes la digestión de
la celulosa.

Las celulasas tienen numerosas aplicaciones: en el procesamiento del café, en

la industria textil, en la preparación de detergentes y en la producción de papel y
celulosa. Su utilización permite el uso de biomasa de celulosa como materia
prima para la producción de etanol.

Los suelos de distinta procedencia se cubren con los filtros empleados como
fuente de celulosa y se incuban. La degradación de la celulosa se detecta con
manchas coloreadas y por la formación de agujeros en la celulosa. Los
microorganismos celulíticos degradan la celulosa gracias a exoenzimas.
Duración:4-6 semanas.

3. Materiales
• Tierra de compost
• Tierra de jardín
• Filtros redondos de arena como fuente de celulosa.
• Placas Petri
• Bandeja de vidrio (20 cm) o de plástico.
• Recipientes (Fuentes) y tamices
 • Espátula o Cuchara
• Vaporizador para plantas

4. Procedimiento

• Tamizar las muestras de suelo por separado y humedecerlas ligeramente

con el vaporizador;
• Llenar cada tres placas Petri con un tipo de suelo el tipo de suelo y rotular
el tipo y fecha.
• Alisar la superficie de los suelos, colocar sobre ellos el papel filtro.
• Colocar las placas Petri en la bandeja de vidrio;
• Añadir agua a la bandeja de vidrio (cámara húmeda) hasta una altura de
5 mm.
• Colocar la cámara húmeda a temperatura ambiente o en la estufa (28°C);
• Añadir agua vaporizada.

5. Resultados
Se toman muestras de las placas cada semana. La digestión de celulosa
se detecta por la presencia de manchas coloreadas (amarilla-rojas-verde-
amarillentas) y de agujeros. En esta degradación aerobia de la celulosa
están implicados distintos grupos de microorganismos: Eubacterias
(Cellulomonas), Mixtobacterias (Cytiphaga, Sporoxytophaga, Sorangium)
y Hongos.

6. Bibliografía

Jagnow G, Dawid W. (1994). Biotecnología, Introducción con

experimentos modelos. Ed. Acribia S.A, 229.
Malajovich M.A, Guías de Biotecnología, enseñanza y divulgación. Guía 76.
https://bteduc.com/
 PRÁCTICA 4

ESTERILIZACIÓN
1. Objetivo:

Conocer los diferentes métodos de esterilización.

2. Fundamento:
La esterilización microbiológica, es la destrucción completa o eliminación total de
los microorganismos patógenos y saprófitos que se encuentran en el interior o
en la superficie de objetos y sustancias. Entre los microorganismos vivos se
incluyen bacterias, hongos, protistas, virus y sus formas de resistencia. Un objeto
esterilizado está, por lo tanto, totalmente libre de microorganismos incluyendo
sus formas de resistencia. El criterio práctico de la esterilidad es la ausencia de
crecimiento microbiano en un medio adecuado.
Tipos de esterilización:
1. La esterilización preparativa es la que se realiza para mantener libre de
microorganismos el material que vamos a utilizar antes de empezar el trabajo
en sí mismo o durante el proceso de trabajo (placas Petri, pipetas, medios de
cultivo, asas de siembra, hisopos, etc.).
2. La esterilización final sin embargo tiene como único fin destruir los
microorganismos con los que se ha estado trabajando.

Físicos Mecánicos Químicos

Vapor a presión/Calor
Filtración Gas Oxido de Etileno
húmedo
Gas y Solución de
Aire caliente/Calor seco
Formaldehído
Radiación Ionizante Ácido per acético
Autoclave: consiste en un aparato que cierra herméticamente y que en su
interior desarrolla vapor bajo presión, el cual se presuriza y eleva la temperatura,
proporcionando que el calor húmedo destruya los microorganismos.

El método de esterilización por calor húmedo, es el agente esterilizante más

frecuente, este mecanismo destruye eficazmente los microorganismos por
desnaturalización de proteínas y enzimas, y desestabilización de membranas.

Parámetro Gravitacional

Temperatura 121ºC.
Humedad 90%
Llenado de cámara 10 min
Exposición 15 min
Expulsión 10 min
Secado y enfriado 15 min
Tiempo total del ciclo 50 min

CONTROL DE LA ESTERILIZACIÓN

Los procesos de esterilización deben disponer de sistemas o mecanismos que

nos permitan garantizar y controlar que el proceso se ha realizado con éxito.
Existen diferentes mecanismos para ello:

Sistemas de control físico. Lo más básico es el control mecánico de las

temperaturas (sensor de temperatura) que permita realizar un registro de las
temperaturas alcanzadas en el interior durante todo el proceso.

Sistemas de control químico: sistemas constituidos por cintas adhesivas

impregnadas en compuestos químicos termosensible.

Sistemas de control biológico: Se refieren a la utilización de microorganismos o

esporas resistentes a distintos procesos de esterilización (Bacillus
stearothermophilus).
3. Materiales.
• Autoclave
• Cinta indicadora de autoclave
• Placa de gelosa sangre
• Suspensión de cultivo de Bacillus stearothermophilus
• Asas de bacteriológicas
• Cámara de bioseguridad
• Incubadora

4. Procedimiento

• Dentro de la cabina de bioseguridad, realizar el siguiente procedimiento

• Dividir a la mitad una placa de gelosa sangre.
• Con un asa en anillo, sembrar en una de las porciones de la mitad
mediante la técnica de estría en superficie, hacer dos asadas de la
suspensión de Bacillus stearothermophilus
• Colocar la suspensión Bacillus stearothermophilus en autoclave.
Nota: Colocar cinta indicadora a la suspensión.
Condiciones del autoclave: 20 minutos
121˚C
15lb de presión
• Una vez concluido el proceso de esterilización, abrir la autoclave,
verificar si se observan cambios en la cinta.
• A partir de la suspensión, inocular la otra mitad de la placa de gelosa
sangre e incubarla a 37°C por 24 horas.
• Pasado el tiempo, observar si hubo crecimiento en ambos lados de la
placa.
5. Tarea
1. ¿Cuáles son las características biológicas de las cepas de Bacillus que las
convierten en indicadoras de procedimientos de esterilización?
2. ¿Mencione ejemplos donde se pueden utilizar los diferentes tipos
esterilización?
3. ¿Cuál es la diferencia entre esterilización y desinfección?
4. ¿Qué tipo de radiaciones pueden ser utilizadas para la esterilización?

6. Bibliografía

Colectivo de autores. Introducción a la Salud Pública. Editorial Ciencias Médicas.

Ciudad de la Habana 2004.

Colectivo de Autores. Manual de Bioseguridad Estomatológica. Editorial Ciencias

Médicas. Ciudad de la Habana 2008.

Dirección Provincial de Salud. Centro Provincial de Higiene y Epidemiología. La

Habana. Recomendaciones para la Desinfección y Esterilización en
Clínicas y Servicios de Estomatología. 2000

Vázquez, B. P.-U. (2010). Metodología de esterilización en el laboratorio

microbiológico. Reduca (Biología). Serie Microbiología, 3(5), 1-14.
 PRÁCTICA 5

EXTRACCIÓN, AMPLIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

1. Objetivo
Conocer el procedimiento de extracción y purificación de ADN plasmídico a
partir de Escherichia coli.

2. Fundamento
2.1. Extracción de ADN

Se le llama extracción al método por el cual se obtiene el ADN a partir de material

biológico utilizando técnicas físicas, químicas incluso biológicas (enzimas). La
extracción consiste en la separación y purificación del ADN con el fin de poder
estudiarlo, analizarlo o manipularlo.

La homogeneización y la lisis celular deben ser lo suficientemente fuertes para

romper el tejido, la pared y las membranas celulares, pero ser suave para
preservar los ácidos nucleicos.
Los procesos más comunes son:
• Disrupción mecánica, por ejemplo, la molienda, ruptura hipotónica, o
congelación-descongelación.
• Tratamiento químico, por ejemplo, la lisis con detergentes o agentes
caotrópicos.
• Digestión enzimática, por ejemplo, con proteasas, lisozima o mutanolisina.

Métodos:

➢ CTAB (Bromuro de cetil trimetil amonio), detergente catiónico que tiene la

propiedad de precipitar ácidos nucleicos y polisacáridos ácidos en
soluciones de baja concentración iónica. En soluciones de alta
concentración iónica el CTAB forma complejos con las proteínas y
polisacáridos pero no precipita ácidos nucleicos.
 ➢ Hervido:

2.2. Amplificación de ADN

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica sensible y muy útil
para obtener y generar muchas copias de secuencias específicas de ADN de
una muestra compleja de ADN con una diversidad y abundancia diferencial de
secuencias; a este proceso se le conoce como: amplificación del ADN. Para
llevar a cabo este proceso, se requiere de la utilización de una enzima llamada
Taq Polimerasa.

3. Materiales
Cepa Bacteriana (Escherichia coli)
Master Mix
CTAB

4. Procedimiento
4.1. Extración de ADN
• Preparación de la cepa:
a) De una colonia aislada, inocular en un tubo de caldo Luria
Bertani (LB). (12ml aprox)
b) Incubar por 24 horas a 37°C.

• Centrifugar a 4000 rpm/10 minutos. (Centrifugar 5 minutos extra sino se

forma pellet)

• Descartar el sobrenadante con cuidado de no perder el pellet formado.

• Resuspender el pellet con 1ml de agua libre de nucleasas (ALN) y trasvasar

a un tubo de 1.5ml.

• Por cada 100 mg, utilizar 500 µl de tampón de extracción CTAB. Mezclar
por vortex. Transferir el homogenizado a un baño María a 60°C durante 30
minutos.

• Luego de la incubación, centrifugar el tubo por 5 minutos a 13,000 rpm.

 • Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo. (opcional: ARNasas).

• Agregue un volumen igual de Fenol y Solución CIA (cloroformo / alcohol

isoamílico (24: 1)) proporción 1:1. Agitar durante 5 segundos y luego
centrifugar la muestra durante 1 minuto. a 13,000 rpm para separar las
fases.

• Transfiera la fase superior acuosa a un nuevo tubo.

• Transfiera la fase acuosa superior a un nuevo tubo. Precipite el ADN

agregando 0,7 volúmenes de isopropanol frío e incube a -20 ° C durante 15
minutos.

• Centrifugue la muestra a 13,000 rpm durante 10 minutos. Decantar el

sobrenadante sin alterar el pellet y luego lavar con 500 µl de etanol al 70%
helado. Decantar el etanol. Eliminar el etanol residual mediante secado a
temperatura ambiente.

• Seque el pellet el tiempo suficiente para eliminar el alcohol, pero sin secar
completamente el ADN. Disuelva el ADN en 20 µl de tampón TE (Tris 10
mM, pH 8, EDTA 1 mM). El sedimento puede necesitar calentamiento para
disolverse.

4.2. Amplificación de ADN

1. Prepare los tubos que habrá de utilizar para su PCR en una gradilla.

2. Realice los cálculos de para preparar las reacciones necesarias.

Reactivo Concentración Concentración Volumen Volumen

Inicial deseada (25µl) total
Master Mix* 2x 1X 12.5 x

Primer Forward 100µM 5 µM 1.25 x

Primer Reverse 100µM 5 µM 1.25 x

Agua libre de --- --- 9 x

nucleasas
Molde ---- --- 1 x
*MasterMix: Taq polimerasa, dNTPs, MgCl2
3. En un vial, agregar master mix, primer forward, primer reverse, agua
libre de nucleasas, homogenizar, agregar el molde.
Pasos Temperatura Tiempo Ciclo
Desnaturalización inicial 94°C 5min 12.5

Desnaturalización 94°C 30 seg

Hibridación 38-65°C 45 seg 30-35

Extensión/Elongación 72°C 1/kb

Extensión final 72°C 5 min 1

4.3. Electroforesis

1. Para preparar un gel de agarosa al 1% se debe pesar 1g de agarosa y

este se disuelve en 100 mL de buffer TAE 1X o TBE 1X (ver tabla de
Comparación de buffers).

2. Caliente la mezcla contenida en un matraz ex profeso, en un horno de

microondas dando pulsos de 30 segundos hasta lograr una mezcla
homogénea. NOTA: evite la ebullición violenta de la mezcla.

3. Coloque la bandeja en el caster gel y gire la palanca de levas. Cerciórese

de que cierra herméticamente. NOTA: se debe nivelar el “gel caster” antes
de colocar la bandeja

4. Agregue 3 µl de Bromuro de etidio (0.625 mg/ml) por cada 100ml de

agarosa y mezcle bien. Se deja enfriar hasta que polimeriza el gel.
 5. Se colocan de 2-20 µg/µL de muestras de ADN en cada pozo con buffer
de carga.

6. Se corre el gel a 70 volts por una hora o una hora y media. NOTA: el
tiempo y el voltaje requerirán de una estandarización. Se retira el gel y se
observa en el transiluminador.

5. Tarea.

1. ¿Qué papel juega cada uno de los reactivos que conforman el master mix?

2. ¿Ejemplifique en que caso utilizamos el método del hervido y en qué casos

utilizamos el método CTAB?

6. Referencias

Orfao de Matos Alberto, P. L. (2011). Protocolo de Extracción de Ácidos

Nucleicos. Madrid.
Serrato Díaz Alejandra, F. R. (s.f.). PCR: reacción en cadena de polimerasa.
Mexico.
 PRÁCTICA 6

PRODUCCIÓN DE PROTEASAS BACTERIANAS

1. Objetivo
Relacionar la producción de metabolitos de interés industrial y el crecimiento en
una curva de crecimiento a partir de un cultivo controlado de Bacillus spp.

2. Fundamento

El incremento poblacional que resulta de la multiplicación celular es un

componente esencial de la función microbiana, y con él se asocian, tanto el
crecimiento celular, como la generación metabólica. En condiciones adecuadas
las bacterias se duplican constantemente, mediante una serie de reacciones
cuya finalidad es la formación de macromoléculas necesarias para el ensamblaje
de las nuevas estructuras celulares de sus descendientes.

El conocimiento de las características de crecimiento de un microorganismo

permite reproducir los procesos metabólicos en condiciones controladas y
trasladarlo a nivel industrial, además analizar los factores que aumenten los
rendimientos propios de los procesos generadores de metabolitos específicos.

En cultivos de producción, el aumento en la masa celular como consecuencia

del cambio en el número de células se puede evaluar mediante metodologías
que faciliten establecer una curva típica de crecimiento, con sus diferentes fases:

▪ Latencia.
▪ Exponencial.
▪ Estacionaria.
▪ Muerte Celular.

De igual manera se asocia a la generación de metabolitos primarios y

secundarios; los primarios son aquellos que se producen durante la etapa de
crecimiento exponencial y además se forman como parte del metabolismo
energético de las células, mientras que los secundarios se producen al final de
la fase exponencial de crecimiento y son compuestos que no hacen parte del
metabolismo energético de la célula, se producen en condiciones en las cuales
se han agotado los nutrientes del medio de cultivo y se han acumulado
subproductos del metabolismo.

3. Material y equipo

• Agar leche
• Agar Yema de Huevo
• Agitador de matraces
• Agua destilada estéril
• Asas bacteriológicas
• Cabina de bioseguridad
• Caldo nutritivo (C.N.)
• Centrifuga
• Cultivo puro de Bacillus spp.
• Erlenmeyer bafleado
• Espectrofotómetro
• Filtros 0.22 µm
• Incubadora a 37°C
• Mechero bunsen, trípodes y gradillas para tubos
• Micropipetas con capacidad de 10- 100 y de 100- 1000 µl
• Placas Petri estériles
• Puntas estériles
• Solución salina fisiológica
• Viales Eppendorf
 4. Procedimiento

4.1. Inocular con 7ml del cultivo de Bacillus spp, el Erlenmeyer que
contiene 130 ml de caldo nutritivo, colocarlo en agitación
permanente, a temperatura ambiente 25°C.

4.2. Tomar muestra en los tiempos establecidos: 0 horas (inoculación),

4 horas, 8 horas, 24 horas, 48 horas, 56 horas, 72 horas y 96 horas.

4.3. Parámetros para evaluar:

4.3.1. Determinación de Actividad de Proteasas
• Tomar 1ml del inoculo en agitación, en un vial estéril
• Centrifugar a 13,000rpm durante 30 minutos (equiparar con un vial con
agua destilada)
• Filtrar la muestra, tomar el sobrenadante con una jeringa, con el cuidado
de no tocar el botón formado, se filtra por una membrana de 0.22 µm de
porosidad.
• Se toma una alícuota de 10 – 20ul, y se inocula en el agar leche y agar
yema de huevo (realizar un pocillo en el centro de la placa, en donde se
inocula)
• Incubar las placas, a temperatura de refrigeración, 4°C, por 24 horas
• Realizar una segunda incubación a 37°C por 24 horas.
• Observar las placas, si se formara un halo, tomar la medida de dicho halo
(Una unidad de proteasa (U) se define como equivalente a 1mm2 de área
de hidrólisis).

4.3.2. Determinación de la densidad óptica directa, indirecta y

crecimiento microbiano

Densidad óptica directa

• Tomar 2 ml del caldo en agitación y colocarlo en una celda para

espectrofotómetro
• Realizar la lectura del caldo a 660nm
 • Restar las absorbancias obtenidas de la medición del cultivo en agitación
de la absorbancia obtenida del caldo nutritivo sin inocular.

Densidad óptica indirecta

• Tomar 5 ml del caldo en agitación y colocarlo en un tubo estéril

• Centrifugar a 6000 rpm por 10 minutos
• Descartar el sobrenadante y recuperar el pellet con 1 ml de solución
fisiológica
• Realizar el mismo procedimiento de lectura que en Densidad óptica
directa.

5. Resultados

Reporte de resultados, según tiempo, crecimiento microbiano y actividad de

proteasa.
Tiempo Absorbancia Actividad de proteasa
0 horas
4 horas
8 horas
24 horas
48 horas
56 horas
72 horas
96 horas

6. Para investigar

1. Elaborar la curva de crecimiento microbiano de acuerdo con los resultados y

la curva de actividad proteolítica en ambos medios de cultivo (tamaño del halo
vs Tiempo).
2. Realizar una curva de crecimiento comparando las absorbancias de los dos
métodos de medición y evaluación de crecimiento mediante espectrofotometría
3. Explique el fundamento de utilizar espectrofotometría como método de
evaluación de crecimiento microbiano.
4. Liste al menos cinco aplicaciones industriales de las proteasas microbianas y
los microorganismos productores.
5. Investigar otros metabolitos secundarios utilizados en la industria, aplicaciones
y que microorganismo lo produce.

7. Referencia

Manual de laboratorio de biotecnología I (MB-350), revisado y actualizado por

Dra. Lourdes de Madrid MSc. (2017). Departamento de Microbiología, UNAH.