Biología Celular y Molecular

Fase 4

Técnicas Moleculares

Código: 203017_8

Especialización En Biotecnología Agroambiental

Diana Marcela Pulido Gamba

Estudiante

Carlos Eduardo Barragán

Tutor

1 de julio del 2021

Universidad Nacional Abierta y a Distancia UNAD

Confrontación de técnicas moleculares: qPCR y PCR-RFLP para un caso de investigación de tejido
vegetal basados en el gen BnPIP1 usando cebadores.

Una pequeña empresa productora de semillas le ha enviado a su laboratorio una muestra de

cultivo celular que está pensando en caracterizar, debido a que esta nueva variedad de planta
contaría con una mutación que le permite germinar con menos cantidad de agua que la variedad
que actualmente comercializa. Junto con la muestra celular, usted recibe el siguiente resultado
preliminar que ellos obtuvieron mediante PCR convencional, utilizando cebadores específicos para
el gen BnPIP1.

Imagen 1. Electroforesis de tejido vegetal.

La electroforesis que le envían muestra en las líneas 4 y 7 los amplímeros del cultivo celular en
estudio. Las líneas 9 a 11 son variedades previamente caracterizadas que son heterocigotas con
alelos expandidos para el gen de interés.

Teniendo en cuenta que en el laboratorio de análisis de esta empresa no cuentan con

equipamiento más sofisticado para continuar con la caracterización de la nueva variedad, solicitan
a su equipo que les presenten un portafolio de técnicas que ustedes pueden ofrecer para hacer
genotipificación de semillas con esta característica de interés.

Su propuesta inicial fue diseñar PCR-RFLP para reconocer los genes, sin embargo, uno de sus
colaboradores ha sugerido emplear PCR en tiempo real porque puede resultar en una técnica más
rápida y eficiente.

1. Explique por cuál de estas dos técnicas se inclinaría su grupo, explicando muy bien la
fundamentación biológica en la que se basaría su propuesta y analizando los resultados
preliminares.
El gen BnPIP1 esta involucrado con la producción de acuaporinas en vegetales, las cuales estas
relacionadas con el transporte de agua necesario para el metabolismo enzimático de los
nutrientes de almacenamiento en las primeras etapas de la germinación de la semilla.

De lo anterior podemos suponer que las aseveraciones de la empresa en cuanto a la reducción de

absorción de agua de la variante murada son ciertas, por tanto, es importante realizar una
amplificación de los genes para corroborar la existencia de este gen (BnPIP1) en particular en las
plantas que ellos pretenden usar.

La pregunta a resolver es si usar una PCR de Polimorfismo de longitud de fragmento de restricción

o una PCR en tiempo real.
El fundamento de las técnicas es el mismo pero las secuencias analizadas y la sensibilidad cambia
drásticamente, siendo la qPCR más sensible para detectar irregularidades genómicas en un
individuo, que para este caso seria el material vegetal que podría aportar la empresa, por otro
lado, la PCR-RFLP nos mostraría polimorfismos, secuencias diana de enzimas de restricción, esta
técnica nos podría demostrar la existencia de homocigotos.

Según el diagnostico previo resultante de la electroforesis efectuada por la empresa (imagen 1), se
ha detectado la existencia de alelos expandidos en las líneas 9 y 11, los cuales están ligados al
aumento de tripletas en la secuencia normal de DNA, en pocas palabras puede originar una
mutación genética que puede verse reflejada en el fenotipo del agente biológico investigado.

* Mutación: cambio en la secuencia genómica. El término se usa habitualmente para variaciones

genéticas que causan enfermedad.

Esquema 1. Rango de detección de la técnica de qPCR.

Según Hoffmann en 2008, el análisis qPCR puede detectar las variaciones genotípicas en una
muestra procedente de un organismo vivo.
De la imagen 1 también es destacable la fila 4 y 7 donde existen amplímeros, los cuales pueden se
cuantificados con la técnica de qPCR, para poder realizar curvas de calibración.

Por lo tanto, y según la teoría la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real sería la mejor
técnica a usar en este caso para detectar una mutación y un aumento en la producción de
acuaporinas mediante el gen de interés, que puede causar que la planta usada pueda germinar
con menos agua, situación que se deberá probar in situ.

2. Señalarlas ventajas y desventajas de su propuesta frente a la PCR que actualmente está

desarrollando esa empresa.

La empresa propone realizar pruebas de PCR mediante la técnica de PCR-RFLP, mi propuesta

radica en realizar pruebas de PRC en tiempo real debido a su efectividad para detectar mutaciones
debido a su efectividad, que para este caso es necesario realizar un correcto protocolo para esta
técnica, lo cual podría ser una desventaja para la empresa debido a sobrecostos que puede
suponer establecer tanto el protocolo como desarrollar la técnica.

Otra desventaja radica en que con la técnica de PCR-RFLP podemos conocer un mayor número de
genotipos debido a que esta técnica identifica una mayor cantidad de alelos.

Referencias bibliográficas

1. Gao, Y. P., Young, L., Bonham-Smith, P., & Gusta, L. V. (1999). Characterization and
expression of plasma and tonoplast membrane aquaporins in primed seed of Brassica
napus during germination under stress conditions. Plant molecular biology, 40(4), 635–
644. https://doi.org/10.1023/a:1006212216876.
2. Dominguez, MV, Bastos, EP, Silva, SD, & Rossi, BM. (2009). Molecular research methods in
the detection of germinal mutations in hereditary colorectal cancer. Revista de
Gastroenterología del Perú, 29(3), 247-253. Recuperado en 02 de julio de 2021, de
http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1022-
51292009000300007&lng=es&tlng=es
3. Fong, W. Y., Ho, C. C., & Poon, W. T. (2017). Comparison of Direct Sequencing, Real-Time
PCR-High Resolution Melt (PCR-HRM) and PCR-Restriction Fragment Length Polymorphism
(PCR-RFLP) Analysis for Genotyping of Common Thiopurine Intolerant Variant Alleles
NUDT15 c.415C>T and TPMT c.719A>G (TPMT*3C). Diagnostics (Basel, Switzerland), 7(2),
27. https://doi.org/10.3390/diagnostics7020027