INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

ENCB
BIOQUIMICA GENERAL
Bitácora Práctica 1. Determinación de aminoácidos terminales
con grupo alfa amino libre
Jiménez Caraveo Alonso GPO:4QVI SEC: 3
Sánchez Domínguez José de Jesús

Determinación del aminoácido N-terminal consiste en:

• Dinitrofenilación del aminoácido N-terminal de la proteína

• Eliminación del DNFB que no reaccionó

• Hidrólisis de la DNP-proteína

• Identificación del residuo N-terminal por cromatografía en papel

Introducción

La estructura primaria de las proteínas es la cadena de aminoácidos en forma lineal por lo

que su caracterización suele llamarse secuenciación y el primer método para llevar este
experimento a cabo fue gracias a Friedrick Sanger que comenzó a trabajar en secuenciación
de proteínas cerca del año 1943. Sus intentos se desbocaban a diseñar un método de
cuantificación de grupos amino libres como los del segmento N-terminal.

Sanger utilizó DNFB (dinitrofluorobenceno) compuesto amarillo que reacciona con los
grupos amino libres en condiciones ligeramente básicas formando derivados
dinitrofenilados amarillos sin cortar ningún enlace peptídico. Al hidrolizar el péptido se dará
una ruptura total de los enlaces peptídicos lo que nos produce los aminoácidos libres y DNP
derivados ya que su enlace es más difícil de romper. Cuando tales derivados de un péptido
se someten a hidrólisis todos los enlaces peptídicos se separan, pero el enlace es
relativamente estable frente a hidrólisis ácida, por lo que se prefiere la básica. Se tiene
evidencia de las reacciones con los gpos imidazol, fenólicos y epsiloamino lo que dará la
dinitrofenilación en cadena lateral de histidina, tirosina y lisina. Mediante cromatografía
puede identificarse por separado los productos de la hidrólisis de la proteína ya que el
aminoácido N-terminal retiene su marca, también debido a que los DNP de aminoácidos
libres no son polares se permite su separación.

Cuando se realiza la hidrólisis en medio básico, se agrega NaHCO3 que permite que los
grupos amino que pueden estar protonados puedan estar en mayor cantidad
desportonados y esto va a permitir la dinitrofenilación para que el gpo amino pueda actuar
como nucleófilo ya que tiene sus pares de electrones libres y lleva a cabo un ataque
nucleofílico atacando al carbono con carga parcial positiva del DNFB y F con carga negativa
toma un hidrógeno del amino así formando el derivado.
 A. Preparación del derivado Dinitrofenilado de la hemoglobina

Emplear papel indicador Si se observa mucho precipitado es indicativo

de que ph esta debajo del necesario

30 mg de hemoglobina Añadir 2 ml de sol. DNFB 1% Ajustar ph < 3 con Extraer 4x 5ml la

más 2.4 ml de NaHCO3 al , agitar 1 hr. , 8<ph<9, si es aprox. 12 gotas de suspensión de
4.2 %, disolver proteína. necesario NaHCO3 al 4.2 % éter con soln aq
HCL 3N.
de FeSO4.

Desechar fase acuosa

Agregar al tubo 5 ml H2O Añadir 5 ml HCL 6N. Colocar en baño maría

Centrifugar a 3000
dest. Realizar 3 lavados con Marcar y calentar en tubo con proteína
RPM por 15 min y
5 ml de éter. Llevar fases autoclave 3 hr, 15 lb de dinitrofenilada, agitar
etéreas a un vaso pp. eliminar sobrenadante.
presión hasta evaporar éter.

Calentar extracto etéreo

en parrilla a sequedad, Realizar
enfriar y disolver en .5 ml cromatografía.
de acetona o alcohol abs.
 B.Cromatografía en papel de aa. Dinitrofenilados tipo 2 y la muestra problema

Cortar papel Wathman Sobre línea de 8 cm En los primeros 4 En el quinto punto

No.1 de 22x50 cm marcar con lápiz 5 colocar de 7 a 9 colocar de 40-50
trazar 3 líneas ancho de puntos equidistantes y aplicaciones de aplicaciones de
2.5,6 y 8 cm doblar circulo de 5 mm de derivados muestra problema.
primera línea hacia diámetro sobre cada dinitrofenilados de aa: Secar
enfrente y segunda uno. DNP-Phe,DNP-
hacia atrás
Asp,DNP-Val y DNFB.

Para intensificar amarillo

someter a vapores de NH3.

Sacar cromatogramas, Desarrollar en forma Colocar cromatograma

Medir distancias para marcar con lápiz el descendente con el en cámara con solvente
calcular Rf. frente del solvente, mismo solvente de 4.5 de ac. Cítrico y citrato
dejar secar, marcar los a 5 hrs. de sodio .1 molar ph
derivados 6.4 x 2 hr.
Bibliografía
• péptidos y proteínas, Facultad de química, recuperado el 15 de
marzo de 2021 de:
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/UNIDADII_AMINOACIDOS_PE
PTIDOS_PROTEINAS_21268.pdf

• Kennelly P.J., Murray R.K.,Roudwell V.W., Weil P.A.,(2009),

Harper bioquímica ilustrada, Mc Graw Hill, 28a edición, Ciudad de
México, pp 21-23.