Cuaderno de Prácticas Virología

Grado en Biotecnología Prácticas de Virología
PRÁCTICA 1: INFECCIÓN DE PLANTAS CON EL VIRUS DEL MOSAICO

DEL TABACO
Introducción:
El virus del mosaico del tabaco (TMV: tobacco mosaic virus) es el primer virus fitopatógeno
conocido y se considera el prototipo de virus que infecta a plantas. De hecho, quizás sea el
virus más estudiado y del que se tiene más información de todos los virus. Esto se debe
fundamentalmente a dos motivos. En primer lugar el TMV tiene gran importancia en la
agricultura debido a que tiene una gran variedad de huéspedes, incluyendo el tabaco, tomate
y plantas ornamentales como alegrías, geranios, violetas africanas, etc. En segundo lugar, el
TMV es muy estable. Una vez aislado de la planta infectada se puede almacenar y mantener
para estudios de laboratorio.
El TMV pertenece al grupo de los tobamovirus, sin envoltura, con una cadena sencilla de ARN.
Su estabilidad se debe a las proteínas de la cápside fuertemente empaquetadas que hacen que
sea resistente a condiciones que destruirían a la mayoría de los virus. La infección del TMV
dificulta el crecimiento de la planta huésped y provoca la aparición de manchas claras y oscuras
en las hojas.
Objetivo:
El objetivo de esta práctica es extraer el virus del mosaico del tabaco y utilizarlo para infectar
otras plantas y describir si se produce o no efecto citopático.
Material:
- Planta de tabaco
- Cigarro o una hoja de tabaco infectada
- Cinta para marcar la hoja a infectar
- PBS (Tampón fosfato salino 1X) compuesto por 8 g NaCl, 0,2 g KH2PO4, 1,15 g Na2HPO4, 0,2
g KCl. Se pesan todos los componentes y se disuelven en 900 mL de agua. Se ajusta el pH a
7,4 y se enrasa a 1L.
- Tubos Falcon o Eurotubos
- Vortex
- Papel de lija de 600
- Probeta de 10 mL
- Filtros o Gasas
- Gradillas para tubos Falcon
- Varilla
Procedimiento:
Cada grupo tendrá que infectar una hoja de la planta de tabaco.
Nombrar la hoja con la fecha y el nombre del grupo. Abrir un cigarro y pesar 1 g del tabaco o
en su caso, de la hoja de tabaco infectada, en papel de aluminio. Pasarlo a un tubo de plástico,
añadir 10 mL de tampón PBS y machacar con una varilla. A continuación, separar el extracto
(que contiene los viriones) de los restos de la hoja mediante filtración. Para ello colocar un
filtro sobre un tubo Falcon y verter la mezcla. Elegir una de las hojas de la planta a infectar y
colocar una cinta alrededor del tallo con la hoja a infectar. Con la lija, raspar suavemente la
superficie de un área pequeña de la hoja. Con una micropipeta aplicar la suspensión del virus
sobre la zona raspada. Hacer lo mismo en otra hoja añadiendo únicamente PBS (control).
Colocar las plantas en un lugar apropiado teniendo cuidado de que estén separadas las plantas
infectadas de la planta control para evitar su co-infección. Observar las hojas de la planta cada
día y anotar y/o dibujar la evolución del efecto citopático si lo hubiera.
1
PROCEDIMIENTO :
1. Nombrar la la fecha del

hoja con
y
nombre
grupo
de tabaco Lo pasamos tubo de plástico
2. Abrir un
cigarro y pesar 1g . a un .
3. Añadimos al tubo 10mL de PBS machacamos una varilla

y
con
de los restos de la mediante filtración

4.
Separamos el extracto ( con viriones )
hoja
-
Colocamos un filtro sobre un tubo Falcón
-
Vertimos la mezcla
cinta alrededor del tallo la infectar

5.
Elegir
la
hoja infectar y colocar
a una con
hoja a .
la
6. Con una
liga raspar suavemente la superficie de
,
un área de
hoja
7. Con una micro
pipeta aplicar la
suspensión de virus sobre la zona raspada .
8. Hacer lo otra añadiendo PBS

mismo en
hoja
9. Colocar las plantas sitio separando las plantas control de las infectadas
seguro
en un ,
10 Observar
.
resultados .
RESULTADOS :
DÍA 1 TRAS LA INFECCIÓN :

28/05/2021
↳ Nuestra zona infectada
En esta estas otras dos las infectadas

imágenestabaco hojas
podemos obser En
imagen
-
podemos ver
la control del
var
hoja que
se con el virus mosaico del ,
comenzando a ver el efecto cito -
encuentra perfectamente sana .
poético .
Podemos insectos atraídos

observar pequeños ,
como
DÍA 4 TRAS LA INFECCIÓN :

31/05/2021 consecuencia de la infección .
En estas dos
imágenes
claramente
podemos apreciar
si
el efecto
citopá -
tico como consecuencia de
la infección .
↳ Nuestra zona infectada
esta otra
Esta es nuestra
hoja infectada podemos ,
En
imagen ,
en la
que aparece
ha producido aún la infección el control ha sido infectada
ver
que no se , ,
vemos
que
lo
que
vemos es la
hoja dañada por la por el virus ,
suponemos que ha sido por -
liga .
que
se ha
propagado a esa
hoja ya que
todo el
grupo
usamos la misma planta .
PRÁCTICA 2: DETECCIÓN DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO

MEDIANTE ELISA
Introducción:
La técnica ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) es la más comúnmente utilizada como

herramienta de investigación y diagnóstico para la detección del VIH. En el ELISA, una enzima
se une covalentemente a una molécula de anticuerpo, creando una herramienta inmunológica
con alta especificidad y sensibilidad. Las propiedades catalíticas de la enzima y la especificidad
del anticuerpo permanecen inalteradas. Las enzimas típicamente usadas catalizan reacciones
que producen compuestos coloreados, que pueden detectarse en muy pequeñas cantidades.
Para detectar antígenos tales como partículas virales se utiliza el ELISA directo en el cual la
muestra se añade a los pocillos de una microplaca previamente recubierta con anticuerpos
específicos para el antígeno que se va a detectar. Si están presentes en la muestra, las
partículas virales se unirán a los anticuerpos. Después de eliminar por lavado el material que
no se ha unido, se añade un segundo anticuerpo con una enzima conjugada. El segundo
anticuerpo también es específico para el antígeno, y se une a otros determinantes antigénicos
expuestos. Después de un lavado se determina la actividad enzimática del material unido a
cada pocillo, añadiendo un sustrato para la enzima. La enzima cataliza la conversión del
sustrato en un producto coloreado, que se detecta en un espectrofotómetro. El color producido
es proporcional a la cantidad de antígeno presente.
Objetivo:
Detectar mediante ELISA la presencia del virus del mosaico del tabaco en una hoja infectada.
Reactivos:
- Anticuerpo primario, IgG de conejo diluída 1:1000 en tampón de cobertura.

- Anticuerpo secundario, IgG-AP conjugada de conejo diluída 1:1000 en tampón de bloqueo.
- Sustrato PNP: 10 mg p-nitrofenil fosfato diluído en 10 mL de tampón de sustrato
Tampones y soluciones necesarias (proporcionadas por los profesores):
- Tampón de cobertura. Disolver 1,59 g Na2CO3, 2,93 g NaHCO3, 0,2 g NaN3 en 900 mL de
agua, ajustar el pH a 9,6 y enrasar a 1 L.
- PBS. Disolver 8,0 g de NaCl, 0,2 g de KH2PO4, 1,15 g de Na2HPO4, 0,2 g de KCl y 0,2 g de
NaN3 en 900 mL de agua, ajustar el pH a 7,4 y enrasar a 1 L.
- PBS-Tween (PBST). PBS+0,5 mL de Tween 20 por litro
- Tampón de extracción de la muestra. PBS + 2% PVP (Serva PVP-15 polivinilpirrolidona)
- Tampón de bloqueo. PBST +2 % PVP + 0,2 % BSA (albúmina de suero bovino)
- Tampón de sustrato: 12,1 g Tris-base, 5,84 g NaCl, 1,02 g MgCl2·6H2O para 1 litro, ajustar
a pH 9,6 con HCl.
Equipamiento
- Incubador a 37 ºC
- Eppendorf estériles
- Centrífuga de eppendorf
- Microtubos de 0,2 ml
- Gradillas
- Puntas estériles
- Micropipetas
1
Procedimiento:
Día 1
1. Añadir 0,12 mL de IgG diluida en tampón de cobertura a tres microtubos.
2. Incubar a 37 ºC durante 2-4 h.
3. Lavar los microtubos 3 veces con PBST (200 uL cada vez), dejarlos durante varios
minutos y repetir el lavado dos veces. Volcar los microtubos sobre un papel. Darle
pequeños golpes para retirar el líquido.
4. Añadir 0,12 mL de agua estéril a un microtubo que servirá como control negativo.
5. Trasvasar 1 mL de la muestra problema (obtenida por la extracción de una hoja

infectada con PBST+2% PVP) a un Eppendorf y centrifugar (5000rpm, 4min.). Añadir
0,120 mL del sobrenadante a otro microtubo.
6. Añadir 0,120 mL del control positivo a otro microtubo.
7. Incubar toda la noche a 4 ºC en un ambiente húmedo.
Día 2
1. Lavar los microtubos tres veces como en el paso 3.
2. Añadir 0,120 mL del anticuerpo secundario diluido.
3. Incubar a 37 ºC durante 2-4 h.
4. Lavar tres veces como en el paso 3 del día 1.
5. Añadir 0,120 mL de tampón de sustrato con PNP (p-nitrofenil fosfato) a cada microtubo.
Incubar a temperatura ambiente durante 30-60 min. El test positivo vendrá dado por la
coloración amarilla.
6. Anotar los resultados en el cuaderno y justificarlo.
2
DÍAI
1-1 [}
Control G)
> control (→
Muestra
problema
Microtubos ( los colores reales incoloros )
con
IgG no son ,
son .
y lavados
☐_
¡ |
1. Control (t )
Control Resultado (Amarillo)

positivo
2
2 C- )
/
.
3. Muestra problema → Resultado

negativo ( Incoloro )
RESULTADOS :
Estos son nuestros resultados del ELISA :
Muestra
( (t ) Cf ) Problema
como podemos
incolora
observar ,
nuestra muestra
el control
problema
esto
ha dado un resultado
negativo
contiene el virus del
pues es como
negativo ,
significa que no
mosaico del tabaco .

PRÁCTICA 3: TITULACIÓN DE BACTERIÓFAGOS
Introducción:
En virología, en muchas ocasiones es necesario cuantificar las partículas víricas en suspensión.

Aunque se pueden contar los viriones con ayuda de un microscopio electrónico, en una
suspensión es más fácil cuantificarlos midiendo los efectos citopáticos en el hospedador. Con
este método observamos que una unidad infecciosa de virus es la unidad más pequeña que
causa un efecto detectable cuando se añade a un hospedador susceptible. Al determinar la
cantidad de unidades infecciosas por volumen de líquido se puede obtener una medida de la
cantidad de virus llamada título.
Cuando un virión empieza una infección en una capa de células hospedadoras que están
creciendo sobre una superficie plana, se puede ver una zona de lisis como un área más clara
en el césped de células hospedadoras. Esta aclaración se denomina calva o placa de lisis, y se
supone que cada calva se origina a partir de la replicación de un solo virión.
Objetivo:
El objetivo de esta práctica es titular una suspensión de fago T4 que infecta a Escherichia coli.
Material:
- Puntas
- Vaso precipitado
- Micropipetas
- Eppendorf estériles
- Eurotubo
- Gradilla de Eppendorf
- Mechero de alcohol
- Falcon de 15 mL estériles (5/grupo)
- Gradilla de tubos
- Placas Petri (5/grupo)
- Botellas de vidrio (3/grupo)
Cultivos
- Escherichia coli cepa wild type K12
- Solución de T4
Medios y tampones
- T-broth (10 g triptona, 5 g NaCl en 1 L de agua).

- Agar nutritivo con MgSO4 (10 g de triptona, 5 g extracto de levadura, 5 g NaCl, 5 mM MgSO4
, 15 g agar 1000 mL de agua)
- Agar de cobertura con MgSO4 (10 g de triptona, 5 g extracto de levadura, 5 g NaCl, 5 mM
MgSO4 , 7,5 g agar 1000 mL de agua)
- PBS 1X (1,6 g NaCl, 0,04 g KCl, 0,22 g fosfato sódico dibásico, 0,04 g fosfato potásico
monobásico em 100 mL de água)
Equipamiento
1
- Baño de agua a 48-50 ºC

- Incubador a 37ºC
- Microondas
Procedimiento:
Día 1.
- Anotar cada placa de agar nutritivo con el factor de dilución (entre 10-1 y 10-5)
- Preparar diluciones seriadas (desde 10-1 a 10-5) de la muestra del bacteriófago, desechando
el contenido de la punta y utilizando otra nueva para transferir la alícuota al siguiente tubo de
la serie.
Se rotulan 7 tubos Eppendorf a los que se le añade 0,9 mL de solución de PBS estéril. Para
÷EE←i
Ée←ÉÉÉÜÍEEEÜÜÉÜÜ
llevar a cabo las diluciones seriadas se transfieren 0,1 mL de la suspensión del fago al tubo 1
y se mezcla. Se transfieren 0,1 mL de la muestra del tubo 1 al tubo 2 y mezclar. Se repite este
proceso con todas las diluciones.
- Se transfierenBANCODEDILUCIONES
0,1 mL de la dilución correspondiente (entre 10-3 y 10-5) a tubos Eppenforf
:
ÉÉ ÜÉÉaLÍ
numerados del 3 al 7.
- Se añaden 0,5 mL de cultivo fresco de Escherichia coli a cada uno de los tubos Eppendorf
anteriores.
- Incubar 10 min a 37 ºC en el incubador.10-3

pfff 10-5
10-4 DESECHO
- Preparar 5 tubos con 4 mL de agar de cobertura que se encuentra en el baño entre 48-50
ºC.
- Plaquear el contenido de cada Eppendorf de la siguiente manera. Adicionar el contenido de

cada Eppendorf con fago y bacteria a un tubo de agar de cobertura. Mezclar rápido pero
suavemente para evitar la aparición de burbujas y verterlo sobre la placa Petri que contiene
agar nutritivo. Inmediatamente extender el agar de cobertura sobre la superficie del agar
inclinando la placa.
Este procedimiento se repite para cada una de las diluciones. Anotar cada placa con el factor
de dilución e incubarlas invertidas a 37 ºC, una vez solidificadas, durante 24 h.
Para el recuento utilizar la dilución que tenga entre 25 y 250 placas para determinar el número
de fagos en 1 mL de la muestra original enriquecida.
PFU 1 1
n º placas
mL dilución volumensiembra
2
RESULTADOS :
4 5
En estas ha ido aumentando la concentración

imágenes podemos ver claramente como de bacterias (Escherichia coli )
conforme la concentración de menor como consecuencia de las diluciones
fagos
era .
Para realizar los cálculos vamos a utilizar esta
placa .
CÁLCULOS :
Pm¥ Éi VÍA
=
n° placas . _
PFU =
51 .
¥ .
¥ =
5100 PFUIML
PRÁCTICA 4: CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE UN SOLO PASO DEL

BACTERIÓFAGO T4
Introducción:
La replicación vírica se puede dividir en cinco etapas:
1. Unión (adsorción) del virión a una célula hospedadora susceptible

2. Penetración (entrada, inyección) del virión o su ácido nucleico en la célula
3. Síntesis del ácido nucleico y las proteínas del virus por el metabolismo celular redirigido
por el virus
4. Ensamblaje de las cápsides (y los componentes de la membrana en los virus recubiertos)
y empaquetamiento de los genomas víricos en nuevos viriones. Este proceso, en conjunto,
se llama maduración.
5. Liberación de los viriones maduros de la célula
El experimento de multiplicación en un paso desarrollado por Ellis y Delbrück en 1939

permite seguir los acontecimientos que tienen lugar durante la multiplicación de los fagos.
Para ello se mezcla un cultivo de bacterias susceptibles con partículas de bacteriófago, y se
deja transcurrir un breve periodo de tiempo para que los fagos se unan a sus células
huésped. A continuación, se diluye notablemente el cultivo para que las partículas liberadas
tras la lisis de las células huésped no infecten de inmediato nuevas células. Esta estrategia
funciona porque los fagos carecen de un sistema de búsqueda de células huésped, y deben
establecer contacto con ellas durante su desplazamiento aleatorio por la solución que los
contiene. Posteriormente, se determina a diversos intervalos el número de partículas
infecciosas liberadas de las bacterias mediante un recuento de calvas.
En los primeros minutos tras la infección el virus sufre lo que se conoce como eclipse.
Durante este periodo las partículas infecciosas no pueden ser detectadas en el medio de
cultivo. Esta etapa empieza tan pronto como las partículas infecciosas desaparecen del
entorno por adsorción a las células hospedadoras. Una vez unidos, los viriones ya no están
disponibles para infectar otras células. A esto le sigue la entrada del ácido nucleico vírico (o
el virión intacto) en la célula hospedadora. Si en este momento la célula infectada permite la
entrada, el virión deja de existir como entidad infecciosa, ya que no tiene el genoma vírico
dentro de su cápside. La maduración empieza cuando las nuevas moléculas de ácido nucleico
recién sintetizadas son empaquetadas en las cubiertas proteicas. Durante la fase de
maduración el título de viriones activos dentro de la célula aumenta drásticamente. No
obstante, las nuevas partículas víricas no pueden detectarse a menos que las células sean
lisadas artificialmente para liberarlas. Puesto que los nuevos viriones sintetizados aún no se
encuentran en el exterior celular; los períodos de eclipse y maduración reciben el nombre
conjunto de periodo de latencia.
Al final de la maduración, los viriones maduros son liberados, bien como resultado de la lisis
celular o por gemación o excreción, según el virus. El número de visiones liberados, llamado
tamaño de la explosión, varía en función del virus y la célula hospedadora concretos y puede
ir de unos pocos a varios miles. Como la liberación de los virus es más o menos simultánea,
la replicación vírica se caracteriza normalmente por una curva de crecimiento de una sola
etapa.
Objetivo:
Construir una curva de multiplicación de un solo paso de la infección de Escherichia coli con
el bacteriófago T4 y distinguir las distintas etapas.
1
Material:
- Puntas estériles
- Micropipetas
- Falcon de 15 mL estériles (10/grupo)
- Gradilla de tubos
- Placas petri
- Termómetro
- Eurotubos
- Eppendorf estériles de 1,5 mL y 2 mL
- Gradilla de eppendorf
- Placas petri (10/grupo)
- Vortex
-Cloroformo
Cultivos
Escherichia coli (K12)
Suspensión del fago T4 (107 PFU/mL)
Medios
- T-broth (10 g triptona, 5 g NaCl en 1 L de agua)
- Agar nutritivo con MgSO4 (10 g de triptona, 5 g extracto de levadura, 5 g NaCl, 5 mM
MgSO4 , 15 g agar 1000 mL de agua
- Agar de cobertura con MgSO4 (10 g de triptona, 5 g extracto de levadura, 5 g NaCl, 5 mM
Equipamiento
- Centrífuga de eppendorf
- Vortex
- Microondas
- Baño de agua a 50 ºC
- Incubador a 37ºC
Procedimiento:
Día 1.
- Repartir el agar de cobertura en 10 tubos estériles (5mL por tubo). Estos últimos se
mantienen en un baño a 48-50ºC para que el medio permanezca licuado.
- Preparar 3 Eppendorf de 2 mL en los que se realizará las diluciones de la mezcla del

fago y la bacteria. Para ello, añadir a cada uno de ellos 1,980 mL de T-broth (tubos
1, 2 y 3).
- Se rotula en 20 Eppendorf, t1, t1, t1´,t1´, t2, t2, t2´,t2´, t3, t3, t3´, t3´ t4, t4,
t4´,t4´, t5, t5, t5´ y t5´.
- En un Eppendorf estéril mezclar 0,9 mL del cultivo de Escherichia coli con 0,1 mL de
suspensión del fago T4. En este mismo instante se activa el cronómetro y será
considerado el tiempo 0 (tubo t0). Se incuba la mezcla a 37 ºC durante 5 min en el
incubador para que se produzca la infección.
- Se mezcla bien el contenido del eppendorf en el vortex y se realizan diluciones de 10-

2, 10-4 y 10-6 que evitarán que los fagos liberados tras la lisis no infecten
inmediatamente nuevas células. Para ello se transfieren 20 L del tubo t0 al tubo 1.
2
Mezclar bien en el vortex el contenido del tubo 1 y añadir 20 L del mismo al tubo 2
y lo mismo para el tubo 3 (durante este tiempo el cronómetro no se para).
- Se añden 400 L de la dilución 10-6 a cada uno de los 5 eppendorf rotulados como
t1, t2, t3, t4 y t5 y se incuban a 37 ºC en incubador. Cuando el cronómetro marca
10 min, se saca el Eppendorf t1, a los 20 min t2, a los 30 min t3=30 min, a los 40
min t4 y a los 50 min t5. Si no se sacan los Eppendorf a los tiempos señalados,
anotar los tiempos reales para su representación en la curva de un solo paso.
- Tras la incubación, dos pasos se tienen que realizar a la vez. Cuando se saca el
Eppendorf t1 del incubador, se toman 200 uL que se transfieren a un eppendorf t1´el
cual se centrifuga a 6000 rpm durante 5 min (colocar los Eppendorf de la misma
forma en la centrífuga para saber donde quedará el pellet). Mientras se centrifuga el
Eppendorf t1´, se añaden 100 L de cloroformo al tubo t1 y se espera a tener dos
fases. A continuación, se coge la superior, que contiene los fagos totales, y se
transfiere al otro tubo t1. A continuación se añaden 100 L del cultivo de Escherichia
coli del día anterior. Se mezcla bien el contenido y se transfiere a un tubo con agar
de cobertura. Se agita la mezcla y se vierten rápidamente sobre una placa de agar
nutritivo.
- Tras la centrifugación de t1´, los restos celulares quedan en el fondo y el

sobrenadante, que contiene los fagos extracelulares, se transfiere al otro eppendorf
t1´. A continuación, se añaden 100 L del cultivo de Escherichia coli del día anterior,
se mezcla bien el contenido y se transfiere a un tubo con agar de cobertura. Se agita
la mezcla y se vierte rápidamente sobre una placa de agar nutritivo. Para cada
tiempo se tendrán, por tanto, dos placas petri, una correspondiente a la muestra sin
centrifugar (fagos totales) y otra a la muestra centrifugada (fagos extracelulares).
Este mismo paso se repite para los tubos t2, t3, t4 y t5.
- Dejar que solidifique el agar de cobertura e incubar las placas invertidas a 37 ºC en

el incubador.
- Al día siguiente hacer el recuento de las placas formadas en cada placa Petri y
calcular el PFU/mL.
- Finalmente representar el PFU/mL frente al tiempo tras la infección de las células en

min e interpretar los resultados.
3
PROCEDIMIENTO :
1. Repartir el agar de cobertura en 10 tubos 5mL
(Mantener en el baño a 48 -50°C )
2. Preparar 3 eppendorf de 2mL Añadimos .

1480mL ( 1980µV de T broth
-
€ T Broth
# # E
1980µL
§
-
E
Rotulanos eppendorf
t1-á,tz-á,t;t¿-4,t4',ts,t5'_
3. 20 :
4. Preparamos la mezcla de E. Coli el 1-4

con
fago
:
" mi
ÉE? Fago -14
ñññTixmxE
↳ Incubar 5min a 37°C
"
5. Mezclamos bien el eppendorf to en el vortex realizamos diluciones de 10-2,10 10 ?
y y
ESE""
e El cronómetro no se
para
E
- -
v v v Mezclar bien en el vortex

10-2 " s
to po
. -
po
•
Añadimos 400µL la dilución los eppendorf ti ta ts tu
-
6. de 10 a ts :
y
, , ,
ÉÜÉÜ
" '
- - -
¥ ¥ Incubar a 37°C
Cuando el cronómetro 10min SÉ Es

marque
>
20min - ta
30min - Es
40min - tu
50min - ts
7. Mientras transcurriendo el tiempo

sigue
:
Sacamos el Eppendorf Es del incubado r transferimos 200µL a un

eppendorf ti
-
200 ML
oro
µ µ
✓ U
_
centrifuga
5min
nos a 600 rpm
te tí
Éntrase centrifuga ti
y Cogemos
> la de arriba ( contiene
fagos
)
Añadimos al eppendorf te 100µL de cloroformo

y esperamos
a
que tenga dos fases :
Añadimos 100µL E. Coli .

Mezclar
¡
E- J El otro te
Es
Transferimos el contenido del ta tubo de cobertura lo vertemos rápidamente placa nutritivo

a un con
Agar y
sobre una con
Agar
-
FTFI
E E
te AGAR
COBERTURA
8. Tras la de tí
Sobrenadante centrifugación ,
cogemos
el sobre nadante (
que
contiene
fagos y
) los transferimos al otro
eppendorf tú .
de cobertura
% .
Añadimos 100µL de E. Coli
y
se transfiere a un tubo con
Agar .
Verter en una
placa .
]g Repetir lo
El otro ti
mismo
para los tubos ts Es ti,
. .
y
Es .
qq
ti
ti + E. Coli
µ
u
9.
Dejar solidificar e incubar las placas invertidas a 37°C
11 Hacer el recuento de placas calcular PFUIML

y
.
12 .
Representar PFUIML frente al tiempo tras la infección de las células en min e interpretar resultados
TIEMPOS OBTENIDOS :
£1 → 10:36 min =
11min
Es → 21:00 min = 21 min
Es → 33 50min : =
34min
tu → 47 00min
: = 47min
Es →
55 20min : =
55min
RESULTADOS :
Estos son nuestros resultados , es cierto

que a contraluz se verían
mejor pero igualmente en nuestro caso no se ve
ninguna placas de lisis posiblemente incubación ha estado todo de 16h

en
, por una
prolongada pues un fin de semana en vez .
¿ Cómodeberíanhabersidolosresultados ?
PFUIML • Fagos totales
• Fagos extracelulares
t
al exterior precipitan
rompe la célula para
sino
El cloroformo
que salgan
*
,
En las dos
primeras placas debería haber crecido nada
(
no .
En las de cloroformo deberíamos haber visto la cantidad de totales ( la

fagos porque rompe
' " EN " '

membrana
plasmática ) .
< "
Eneas de haber visto los
centrifugación deberíamos externos
-
rayos
.
Deberíamos haber visto en las

primeras placas fagos totales habrá pasado
porque
no
PERIODO DE ECLIPSE
< y
tanto tiempo rompiera la célula salieran los externos
luego ya
-
como
para que
se
y
;
y
las Últimas si debería haber visto externos al el cloroformo
fagos
en
porque ya
se usar
ACUMULACIÓN ETAPA DE LIBERACIÓN
< >< ,
habría habido lisis celulares

bacteriófagos
_
'
multiplicación
' '
• '
Tiempo cmin ) de
to y
.
PRÁCTICA 5: INDUCCIÓN DEL PROFAGO POR RADIACIÓN

ULTRAVIOLETA
Introducción:
Como ya sabemos los virus son parásitos intracelulares obligados, es decir, se multiplican
únicamente dentro de células vivas. Los bacteriófagos pueden ser líticos o virulentos,
lisogénicos o atenuados y en el caso de los cianófagos también crónicos. En el primer tipo
tras la infección, el ácido nucleico del fago se replica y transcribe dentro de la bacteria
huésped originando nuevas partículas fágicas que son liberadas al lisarse la célula (ciclo
lítico). En los fagos lisogénicos, como el profago lambda, el ácido nucleico tras la infección
puede integrarse en el cromosoma de la bacteria, lo que se denomina profago, y replicarse
en sincronía con él, manteniéndose con estado latente (ciclo lisogénico y crónico). Las
bacterias que contienen un profago insertado en su cromosoma se denominan bacterias
lisogénicas, y son inmunes a la superinfección por el mismo fago.
El fenómeno que consiste en el paso del estado de profago al ciclo lítico se conoce como
inducción. Este proceso puede iniciarse espontáneamente por causas genéticas accidentales
(lo cual sucede con una frecuencia muy baja, de aproximadamente 1·10-6) o bien puede ser
provocado artificialmente y de forma simultánea en casi todas las células lisogénicas de un
cultivo, mediante la exposición a diferentes radiaciones ionizantes o a sustancias químicas
carcinogénicas. La inducción del profago es fácilmente observable si sometemos a un cultivo
de bacterias lisogénicas a una moderada dosis de radiación ultravioleta (UV). La progenie de
fagos infectantes liberados de la lisis puede entonces detectarse mediante una cepa
bacteriana indicadora sensible al fago y no lisogénica.
Objetivo:
Observar, mediante la inducción con luz ultravioleta, la activación del ciclo lítico de un fago
lisogénico insertado en forma de profago en el cromosoma bacteriano.
Material:
- 5 placas/grupo de LB agar (10 g triptona, 5 g extracto levadura, 10 g NaCl, 25 g agar para
1 L)
- Puntas estériles
- Micropipetas
- Asa de siembra
- Lámpara de luz ultravioleta bactericida (UV; longitud de onda 240-265 nm)
- Incubador a 37ºC
- Profago lambda
- Cultivo de Escherichia coli K12 (cepa lisogénica para el fago )
Procedimiento:
- Encender la lámpara de luz UV 30 min antes de comenzar el ensayo con el fin de que
se estabilice la intensidad de la emisión.
- Marcar las 5 placas de LB-agar numerándolas del 1 al 5. Hacer una señal en la base
de cada placa donde se realizará la siembra del cultivo de Eschericha coli.
- Inocular en cada una de las placas la bacteria con un asa de siembra estéril. Para
ello realizar una estría, sin dañar la superficie del agar, de lado a lado de la placa.
Efectuar estas operaciones cerca de la llama del mechero de alcohol.
1
- Inocular en cada una de las placas la cepa lisogénica con un asa de siembra estéril
con una estría cruzando a la anterior de lado a lado de la placa. Efectuar estas
operaciones cerca de la llama del mechero.
- Irradiar las placas inoculadas sin tapa con luz UV. La luz debe incidir verticalmente
sobre las placas. Abrirlas el tiempo necesario para que se irradie la superficie
inoculada. Trabajar con rapidez, evitando en todo momento la exposición prolongada
de las manos y brazos a la luz UV y no mirar nuca al foco emisor directamente. Los
periodos de irradiación sugeridos pueden ser los siguientes: placa 1, control sin
irradiar, placa 2, 2 segundos, placa 3, 5 segundos; placa 4, 10 segundos; placa 5, 15
segundos.
- Incubar las placas a 37 ºC durante toda la noche.
2
Sembrar así :
Emma E. Coli
.
RESULTADOS :
1- 2 3
4 5
podemos observar , nuestros resultados similares todos los posiblemente

Como
haber mantenido la luz

son
suficiente
muy
en casos ,
haya
sido por no
bajo UV tiempo o
porque el profago no estuviera en buenas condiciones .
A continuación podemos ver los resultados de unos compañeros :
tás esto lo debería de haber salido debido el

objetivo era el centro tenía crecer
que que
no
o menos es , a
que
en
que
nada debido el prof debía estar activado haber atacado la E. Coli
que ago y
a a .
PRÁCTICA 6: AISLAMIENTO Y TITULACIÓN DE BACTERIÓFAGOS DE

Escherichia coli EN AGUAS RESIDUALES
Introducción:
Los bacteriófagos se pueden aislar de diferentes ambientes. Debido a que crecen y se

reproducen dentro de las bacterias, podríamos esperarlos en lugares con una larga
concentración de bacterias. Por ejemplo, en el tracto intestinal de animales de sangre caliente
se pueden encontrar altas concentraciones de E. coli, por lo que el estiércol y las aguas de las
desembocaduras de los ríos o aguas residuales tratadas y sin tratar son una excelente fuente
de colifagos. Debido a que la concentración de bacteriófagos específica para un huésped en
particular puede ser relativamente baja, el primer paso en el aislamiento es el enriquecimiento.
Cuando la muestra se incuba con una población del huésped apropiado, los fagos específicos
para esa bacteria se multiplicarán enormemente en número. Los fagos son, por tanto, mucho
más fáciles de aislar por estar presentes en grandes cantidades.
Para la eliminación de los restos celulares bacterianos se lleva a cabo la filtración en

membrana. Cualquier bacteria que pueda permanecer en el cultivo enriquecido puede ser
lisada mediante tratamiento con cloroformo. El filtrado que contiene los bacteriófagos puede
ser almacenado en el frigorífico durante meses. Los virus individuales del filtrado pueden
aislarse mezclándolos con cultivos de la bacteria huésped. Tras la infección, las bacterias se
lisarán liberándose nuevas partículas fágicas al medio. Para calcular el número de partículas
virales se mezcla una determinada dilución de la suspensión fágica con un cultivo exponencial
de la bacteria huésped, y se coloca sobre la superficie de una placa de agar. Después de la
incubación se observa un césped bacteriano sobre el que aparecen pequeñas áreas circulares
claras que corresponden a las denominadas placas o clavas de lisis. Estas placas de lisis
representan áreas de producción de fagos procedentes de la lisis de bacterias infectadas en
esa área. Puesto que cada placa es el resultado de la infección por una partícula fágica
funcional, se podrá determinar el número de unidades formadoras de placas por mililitro de
suspensión (UFP/mL) mediante el recuento de dichas placas de lisis.
Objetivo:
El objetivo de esta práctica es aislar bacteriófagos de Escherichia coli de aguas residuales y

determinar su título.
Material:
- Filtros de jeringa de 0,45 um

- Jeringa
- Eurotubos
- Vaso de precipitado
- Puntas
- Micropipetas
- Eppendorf
- 6 Placas petri (por grupo)
- Botellas de vidrio para esterilizar los médios
- Probetas
Cultivos
- Agua residual centrifugada
- Escherichia coli
1
Medios y tampones
- T-broth (10 g triptona, 5 g NaCl en 1 L de agua)

- T-broth 10x
- Agar nutritivo con MgSO4(10 g de triptona, 5 g extracto de levadura, 5 g NaCl, 5 mM MgSO4
, 15 g agar 1000 mL de agua
- Agar de coberturacon MgSO4 (10 g de triptona, 5 g extracto de levadura, 5 g NaCl, 5 mM
- PBS (1,6 g NaCl, 0,04 g KCl, 0,22 gfosfato sódico dibásico, 0,04 g fosfato potásico
monobásico em 100 mL de água)
Equipamiento
- Centrífuga de Eurotubos
- Baños de agua
- Incubador a 37ºC
- Microondas
Procedimiento:
Día 1.
1. Añadir 1,5 mL de T-broth 10x a un Eurotubo con 12,5 mL de agua residual.
2. Inocular el tubo anterior con 1 mL de un cultivo fresco de E. coli.
3. Inocular un Eurotubo con 15 mL de T-broth con 1 mL de un cultivo fresco de E.coli.
4. Incubar ambos cultivos a 37 ºC durante 24 h.
Día 2.
1. Rotular 6 placas Petri con agar nutritivo con números del 1 al 6.
2. Pasar 1,5 mL del fago y la bacteria (agua marina) a un Eppendorf y centrifugar a 2000 rpm
durante 5 min. Los restos bacterianos quedarán en el fondo y los fagos en el sobrenadante.
3. Filtrar el sobrenadante con una jeringa y un filtro de 0,45 um y recoger el filtrado en un

Eppendorf. Esta suspensión de fago puede conservarse a 4ºC durante varios meses.
4. Preparar diluciones seriadas de la muestra enriquecida en el bacteriófago, una vez filtrada,

desechando el contenido de la punta y utilizando otra nueva para transferir la alícuota al
siguiente tubo de la serie. Se rotulan 6 tubos Eppendorf a los que se le añade 0,9 mL de
solución de PBS estéril. Para llevar a cabo las diluciones seriadas se transfieren 0,1 mL de la
suspensión del fago al tubo 1 y se mezcla. Se transfieren 0,1 mL de la muestra del tubo 1 al
tubo 2 y mezclar. Se repite este proceso con todas las diluciones.
5. Numerar otros seis Eppendorf del 1 al 6, y añadir 0,1 mL de cada una de las diluciones del
fago. Si se trabaja desde el menos diluido al más diluido, se puede utilizar la misma pipeta.
Tapar los tubos y mezclarlos bien.
6. Añadir 0,5 mL del cultivo fresco en E. coli a cada uno de los Eppendorf.
7. Incubarlos a 37 ºC durante 10 min para que los fagos se absorban en las bacterias.
2
8. Una vez transcurridos los 10 min, preparar 6 tubos con 4 mL de agar de cobertura.
9. Añadir el contenido del Eppendorf 1 a uno de los tubos de agar de cobertura, mezclar bien
el contenido y verterlo sobre una de las placas Petri asegurándose que cubre toda la superficie.
Este procedimiento se repite para cada una de las diluciones.
10. Dejar enfriar las placas durante aproximadamente 10 min. Una vez ha solidificado el agar
de cobertura, incubar las placas a 37 ºC durante 24 h.
11. Para el recuento utilizar la dilución que tenga entre 25 y 250 placas para determinar el
número de colifagos en 1 mL de la muestra original enriquecida.
12. Calcular las UFP/mL y anotar en el cuaderno.
3
RESULTADOS :
Estos son nuestros resultados Como

podemos observar , esimposible contar aquí ya han crecido demasiadas
.
que
bacterias esto puede debido el filtro hemos usado estuviese contaminado
adecuadamente
funcionase
que que
ser
que
, a o no
tal
agitado pues ha estado incubandose todo el fin de
haber
adecuadamente
por
,
prolongada
una
el
incubación
por semana o vez no
eppendorf .
nuestros resultados válidos hemos los resultados de otros compañeros valorar los
Como
resultados :
no son
cogido para poder
En esta han formado

imagen podemos
ver como se
claramente las de lisisplacas :
Pmftl =
n°
placas .
f.fj-oj.us?em-ra= 60 .
¥ ¥
. = 6 . IÓPFU 1mL
Podemos ver que se L

han formado
precipitados
de
Fagos .
PRÁCTICA 7: MICROENCAPSULACIÓN DE FAGOS
Introducción:
La terapia oral con bacteriófagos ha demostrado ser una herramienta factible y eficaz para el
control de infecciones causadas por diferentes patógenos bacterianos. Sin embargo, el bajo
pH del estómago, y el efecto de la bilis y las enzimas del tracto intestinal limitan su eficacia en
terapia fágica. Estrategias como la encapsulación han demostrado ser útiles para la protección
de los bacteriófagos contra estos efectos adversos, aumentando así la efectividad de la terapia
fágica oral.
La utilidad de un método de encapsulación en matrices de alginato/CaCO3 ha demostrado ser

adecuado para encapsular bacteriófagos con diferentes morfologías y con eficacias de
encapsulación de alrededor del 100%. Aunque el alginato ha sido utilizado anteriormente como
material para encapsular bacteriófagos, se obtienen mejores resultados con la encapsulación
de bacteriófago en alginato/CaCO3 en terapia fágica oral.
Objetivo:
El objetivo de esta práctica consiste en la encapsulación de fagos y ver su posterior eficiencia

y resistencia en un fluido gástrico simulado.
Material:
- Alginato cálcico
- CaCO3
- MgSO4
- CaCl2 (preparada por el profesorado, 150 mL).
- Pepsina bovina (Sigma Aldrich)
Cultivos
- Solución de fago T4
Equipamiento
- Bomba peristáltica
Procedimiento:
Día 1.
- Añadir 100 µL de una suspensión de Fago T4 proporcionada por el profesorado a una solución
de 40 mL de MgSO4 10 mM en un tubo Falcon.
- Para la inmovilización del fago, se agregan 500 mg de CaCO3 (1%) y 900 mg de alginato
cálcico (1,8%) a los 40 ml de la suspensión de bacteriófagos en 10 mM de MgSO4. Agitar bien
para permitir su homogeneización adecuada.
1
- Una vez homogenizada la mezcla se bombea en un baño que contiene 150 ml de CaCl2 al
1,8%. Se emplea una bomba peristáltica a bajas revoluciones. Es importante que la distancia
entre la salida de la gota y la superficie de la disolución de CaCl2 sea corta (aprox. 1 cm).
- Las cápsulas gelificadas se dejan endurecer en el baño durante 90 minutos. Se retiran de la

disolución y se dejan en MgSO4 10 mM a un volumen final de 40 ml.
- A continuación, se recolectan las esferas, se escurren en un colador, se colocan en papel

secante envueltas y se almacenan a temperatura ambiente hasta el día posterior.
Día 2.
- Para la simulación del fluido gástrico (pH 2,8) se añaden 20 µL de una solución de pepsina
bovina (4 mg de pepsina en 1 mL de agua estéril) en 40 ml de una solución de agua con 0,9% de
NaCl.
- Para determinar la estabilidad del fago encapsulado en el fluido gástrico se pesan las esferas
desarrolladas el día anterior (anotar peso y tiempo inicial en el cuaderno), posteriormente
introducir las esferas en un tubo Falcon con la solución salina con pepsina a pH 2,8 y dejar en
estático durante 60-90 minutos (duración de una digestión).
- Una vez transcurrido el tiempo, escurrir las esferas con un colador y secar en papel secante y
volver a pesar (anotar peso y tiempo final en el cuaderno)
- Calcular el rendimiento en porcentaje de las esferas y anotar en el cuaderno. Comparar con las
de los compañeros en la pizarra del laboratorio.
2
PESOS MICROESFERAS :
1) Peso antes de introducir solución pH 23130g

en 218 : durante 1h
2) Peso después de introducir en solución pH 28 18188g

: durante 75min
CÁLCULOS :
Calculamos el rendimiento :
'
.
100=80 93%
23130g
IMÁGENES DE LAS MICROESFERAS :
En cada

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Grado en Biotecnología Prácticas de Virología

PRÁCTICA 1: INFECCIÓN DE PLANTAS CON EL VIRUS DEL MOSAICO

Cada grupo tendrá que infectar una hoja de la planta de tabaco.

1. Nombrar la la fecha del

3. Añadimos al tubo 10mL de PBS machacamos una varilla

de los restos de la mediante filtración

cinta alrededor del tallo la infectar

8. Hacer lo otra añadiendo PBS

DÍA 1 TRAS LA INFECCIÓN :

↳ Nuestra zona infectada

En esta estas otras dos las infectadas

encuentra perfectamente sana .

Podemos insectos atraídos

DÍA 4 TRAS LA INFECCIÓN :

tico como consecuencia de

↳ Nuestra zona infectada

PRÁCTICA 2: DETECCIÓN DEL VIRUS DEL MOSAICO DEL TABACO

La técnica ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) es la más comúnmente utilizada como

- Anticuerpo primario, IgG de conejo diluída 1:1000 en tampón de cobertura.

1. Añadir 0,12 mL de IgG diluida en tampón de cobertura a tres microtubos.

2. Incubar a 37 ºC durante 2-4 h.

5. Trasvasar 1 mL de la muestra problema (obtenida por la extracción de una hoja

6. Añadir 0,120 mL del control positivo a otro microtubo.

7. Incubar toda la noche a 4 ºC en un ambiente húmedo.

1. Lavar los microtubos tres veces como en el paso 3.

2. Añadir 0,120 mL del anticuerpo secundario diluido.

3. Incubar a 37 ºC durante 2-4 h.

4. Lavar tres veces como en el paso 3 del día 1.

6. Anotar los resultados en el cuaderno y justificarlo.

Control Resultado (Amarillo)

3. Muestra problema → Resultado

Estos son nuestros resultados del ELISA :

mosaico del tabaco .

PRÁCTICA 3: TITULACIÓN DE BACTERIÓFAGOS

En virología, en muchas ocasiones es necesario cuantificar las partículas víricas en suspensión.

- T-broth (10 g triptona, 5 g NaCl en 1 L de agua).

- Baño de agua a 48-50 ºC

- Incubar 10 min a 37 ºC en el incubador.10-3

- Plaquear el contenido de cada Eppendorf de la siguiente manera. Adicionar el contenido de

En estas ha ido aumentando la concentración

Para realizar los cálculos vamos a utilizar esta

PRÁCTICA 4: CONSTRUCCIÓN DE LA CURVA DE UN SOLO PASO DEL

1. Unión (adsorción) del virión a una célula hospedadora susceptible

El experimento de multiplicación en un paso desarrollado por Ellis y Delbrück en 1939

- Preparar 3 Eppendorf de 2 mL en los que se realizará las diluciones de la mezcla del

- Se mezcla bien el contenido del eppendorf en el vortex y se realizan diluciones de 10-

- Tras la centrifugación de t1´, los restos celulares quedan en el fondo y el

- Dejar que solidifique el agar de cobertura e incubar las placas invertidas a 37 ºC en

- Finalmente representar el PFU/mL frente al tiempo tras la infección de las células en

1. Repartir el agar de cobertura en 10 tubos 5mL

(Mantener en el baño a 48 -50°C )

2. Preparar 3 eppendorf de 2mL Añadimos .

4. Preparamos la mezcla de E. Coli el 1-4

v v v Mezclar bien en el vortex

Cuando el cronómetro 10min SÉ Es

7. Mientras transcurriendo el tiempo

Sacamos el Eppendorf Es del incubado r transferimos 200µL a un

Añadimos al eppendorf te 100µL de cloroformo

Añadimos 100µL E. Coli .

Transferimos el contenido del ta tubo de cobertura lo vertemos rápidamente placa nutritivo

11 Hacer el recuento de placas calcular PFUIML

Es → 21:00 min = 21 min

Estos son nuestros resultados , es cierto

ninguna placas de lisis posiblemente incubación ha estado todo de 16h