UNIVERSIDAD POLITÉCNICA SALESIANA

Ingeniería en Biotecnología
INTEGRANTES
THOMAS LEORO
JORGE MOREANO
KAREN TALAVERA
ASLY ZAMORA
 INTRODUCCIÓN
In vitro
TRANSFERENCIA DE
GAMETOS MÉTODOS
In vivo

Ex vivo
Principios de la
década de 1960.
Se utilizan para inseminaciones o para
In vitro procedimientos de fertilización in vitro.

PROCEDIMIENTOS Y RESULTADOS DE Inyección transgénica en los

In vivo
LA TRANSFECCIÓN DE GAMETOS conductos deferentes.

Hibridación fluorescente in situ,

Localización del autorradiografía o
gen extraño inmunocitoquímica.
 INTRODUCCIÓN
Técnica que permite la
SMGT (TRANSFERENCIA DE ADN generación de animales
EXÓGENO MEDIADO POR genéticamente modificados
ESPERMA) de una manera simple y
limitando el manejo de La efectividad de la
gametos y embriones. SMGT depende
principalmente de la
La síntesis consiste en: viabilidad y motilidad
progresiva del semen.

Conversión de los
Obtención del espermatozoides Inseminación Obtención de las
eyaculado en células artificial. camadas.
transgénicas.
 MATERIALES Y MÉTODOS
PREPARACIÓN Y
TRANSFECCIÓN DE Se utilizó semen congelado de un
ESPERMATOZOIDES toro con fertilidad probada. Fracciones de 1 x 106
espermatozoides fueron incubados
durante 30 minutos con 0.5 µg de
pNunc-HcRed (ADN exógeno).

Transfectados con complejos formados

por 0.5 µg de ADN exógeno.

3 µl de Lipofectamina 2 µl de Supefect 3 µl de TurboFect

(Invitrogen) (Quiagen) (ThermoScientific)

EVALUACIÓN DE LA VIABILIDAD
ESPERMÁTICA Y CAPTURA DE ADN
PLASMIDIAL
Materiales Y Métodos
El plásmido pNunc-HcRed (Clontech)
se marcó con isotiocinato de
fluoresceína (FITC), utilizando el kit
“Nick Traslation System” (Invitrogen).
2.4 mM de yoduro de
propidio (Sigma).
Analizados mediante
Citometría de Flujo.
 Materiales y Métodos
2 µl de espermatozoides
en un portaobjetos D4C16
ANÁLISIS DE LA
MOTILIDAD Sistema de análisis espermático asistido
ESPERMÁTICA por computador (ISAS®. Proiser).

5 campos con aproximadamente

200 espermatozoides

ANÁLISIS
Software Statgraphicss ANOVA
ESTADÍSTICO
Plus 5.1.

Post-test la prueba de Scheffe, con un

nivel de significancia de P<0.05.
 Resultados

Efecto de la Transfeccion sobre la viabilidad espermática y la captura de ADN

exógeno.
 Resultados

Efecto de la Transfeccion sobre la motilidad espermática.

Discusión
 Introducción
OBJETIVOS:

1. EVALUAR EL EFECTO DE LA PRESENCIA DE ADN EXÓGENO SOBRE LA CALIDAD SEMINAL

2. EVALUAR LA EFICIENCIA EN LA PRODUCCIÓN DE EMBRIONES TRANSGÉNICOS PORCINOS
IN VIVO MEDIANTE INSEMINACIÓN INTRAUTERINA QUIRÚRGICA CON ESPERMATOZOIDES
INCUBADOS CON EL TRANSGEN.

SMGT: TRANSGÉNESIS MEDIADA POR ESPERMATOZOIDES (80% EFICACIA)

INYECCIÓN PRONUCLEAR: 0,5-4% DE EFICIENCIA

IA: INSEMINACIÓN ARTIFICIAL

ICSI: INYECCIÓN INTRACITOPLÁSMICA DE ESPERMATOZOIDES

Materiales y Métodos
ANIMALES:

- 25°C Y CONDICIONES NATURALES DE LUZ Y HUMEDAD

SEMEN: VERRACOS DE FERTILIDAD PROBADA

INSEMINACIÓN QUIRÚRGICA: 4 HEMBRAS PREPÚBERES (LANDRACE X LARGE WHITE)

MEDIO UTILIZADO PARA EL PROCESADO ESPERMÁTICO: SWINE FERTILIZATION MEDIUM (SFM)

- GLUCOSA (11,25 GR/L)

- CITRATO SÓDICO (10 GR/L)
- EDTA (4,7 GR/L)
- ÁCIDO CITRICO (3.25 GR/L)
- TRIZMA (6,5 GR/L)
- ALBÚMINA SÉRICA BOVINA BSA (6 MG/ML)
- PH: 6,8
 Construcción del ADN
GFP: PROTEÍNA VERDE FLUORESCENTE

EGFP: ENHANCED GREEN FLUORESCENT PROTEIN 35X MÁS INTENSO

PLÁSMIDO PEGFP-N1:

- PROMOTOR TEMPRANO CMV (CITOMEGALOVIRUS) Y ÉL GEN EGFP

- POLYLINKER PEGFP-N1 ELIMINADO
- ADAPTADOR BCL I-HIND III INSERTADO EN AFL II
- PLÁSMIDO SE HACE LINEAL CON AFL II
- SE PURIFICA
- SE RESUSPENDE EN TE (10MM TRIS, 0,1 MM EDTA, PH 8)
 Recogida del semen y procesado de
espermatozoides
MÉTODO MANUAL

- PRIMERA FRACCIÓN DEL EYACULADO ES ELIMINADA

- FRACCIÓN RICA EN ESPERMATOZOIDES SE RECOGE EN TERMO ESTERIL PRECALENTADO A 37°C Y
FILTRADO MEDIANTE GASAS ESTÉRILES PARA DESCARTAR SECRECIONES DE GLÁNDULA DE COWPER
- SE DILUYE 1:1 EN MEDIO SFM SIN BSA
- EN LABORATORIO SE DILUYE DE NUEVO EN MEDIO SFM 1:10 (5 ML SEMEN 1:1 + 45 ML MEDIO)
- CENTRIFUGACIÓN A 800 G DURANTE 10 MINUTOS A 25°C
- ELIMINA SOBRENADANTE Y SE RESUSPENDE EN SFM A 25°C
- CENTRIFUGACIÓN A 800 G DURANTE 10 MINUTOS A 25°C
- ELIMINA SOBRENADANTE + 1 ML MEDIO BSA A 25°C
- SE EVALÚA MOTILIDAD (SUPERIOR AL 65%)
- 108 CÉLULAS ESPERMÁTICAS/ML + 5 UG DE ADN EXÓGENO
 Evaluación de la calidad seminal
3
Integridad de la membrana.
Se evalúa con la ayuda de un • Se colocó 20uL en una solución
microscopio. stock de DCF, IP, SS y la muestra
• Se coloca 10uL de la muestra en una de semen.
1 placa térmica a 38°C. • Se incubó por 10min.

Se observo en microscopía de
fluorescencia verde, obteniendo:
• Células fluorescentes verdes
(Integridad intacta)
2
Se mide el porcentaje de movimiento • Células fluorescentes rojas
(0-100) y motilidad progresiva (0-5). (Integridad alterada).
4
 Manejo reproductivo de las cerdas prepúberes
Inducción al celo y superovulación, • 1250uL de eCG
se administró: • 72h después 750uL de
hCG

Inseminación intrauterina por En cada ampolla oviductal del cuerno

laparotomía de embriones uterino se cola la inseminación con
1,5x10*8 espermatozoides y 75uL ADN

Introducción anestésica y analgésica

preoperatorias se realizó mediante: Inseminación intrauterina Se observa que la cerda haya
quirúrgica completado el proceso de
ovulación y se determinó los
cuerpos hemorrágicos presentes.
Se plantea un plano anestésico
con isofluorano vaporizado en
oxígeno al 2-3%

En el oviducto se realiza una

incisión con una aguja roma
• Ketamina (100mg/mL) para acceder a la ampolla
• Medetomidina (1,0mg) oviductal donde se colocaron
• Midazolan (0,2mg/kg) los espermatozoides, a 37°C.
• Morfina hidrocloruro (20mg/mL)
Recogida de embriones y valoración del desarrollo embrionario

A los 6-7 días de la inseminación,

se realiza la recogida de Blastocitos en alcohol etílico por
embriones. 24h, luego te tiñen en solución
Hoescht al 1% en PBS.

Se aislaron y se dispusieron en
PBS, se midió la calidad
embrionaria según el número de
blastómeros por embrión.

Ovariohisterectomía y el tracto
reproductivo se conservó en
solución salida fisiológica. Flourescencia a 400x y un filtro uv
de 495nm de longitud de onda

Se observaron cuerpos luteos

presentes en los ovarios.
 Ventajas de la técnica SMGT Desventajas de la técnica
SMGT
1. La frecuencia de producción de animales transgénicos es del 50- Se puede generar un caos evolutivo, si las células
60% espermáticas son capaces de actuar como vectores de
secuencias genéticas exógenas. Sin embargo, se estima que
2. Los espermatozoides incubados con ADN pueden ser usados las células espermáticas con altamente resistentes a la hora
para inseminación artificial. de capturar las moléculas.
3. El costo por obtener crías es considerablemente bajo
Se tiene barreras en los espermatozoides a la hora de
capturar el ADN.
4. En los porcinos se ha determinado que se puede llegar a • Factor inhibidor (IF-1)
obtener hasta 6-14 descendentes. • Actividad nucleada endógena
 BIBLIOGRAFÍA

• ARIAS, M. E., DELGADO, A., SÁNCHEZ, R., & FELMER, R. (2015). TRANSFECTION OF BOVINE
SPERM FOR SUBSEQUENT USE IN SPERM MEDIATED GENE TRANSFER ( SMGT ). 5(1), 83–86.
• ESPONDA, P. (2005). TRANSFECTION OF GAMETES: A METHOD TO GENERATE TRANSGENIC
ANIMALS. INTERNATIONAL JOURNAL OF MORPHOLOGY, 23(3), 281–284.
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• PEÑARANDA, M., & ASENSIO, F. (2019). ANIMALES MODIFICADOS GENÉTICAMENTE -
TÉCNICAS DE OBTENCIÓN. BIOTECNOLOGÍA, I, 22–30.
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