EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN

LOS EXTRACTOS OBTENIDOS POR CO2 SUPERCRÍTICO

DE DOS ESPECIES VEGETALES Plantago major
(PLANTAGINACEAE) Y Arnica montana L (ASTERACEAE)

LORENA ROCIO GÓMEZ RUIZ

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

Facultad de Ciencias y Educación
Proyecto Curricular Licenciatura en Química
Bogotá, 2017
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EN LOS EXTRACTOS OBTENIDOS
POR CO2 SUPERCRÍTICO DE DOS ESPECIES VEGETALES Plantago major
(PLANTAGINACEAE) Y Arnica montana L (ASTERACEAE)

UNIVERSIDAD DISTRITAL FRANCISCO JOSÉ DE CALDAS

Facultad de Ciencias y Educación
Proyecto Curricular Licenciatura en Química

Presentado por:
LORENA ROCIO GÓMEZ RUIZ

Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de

Licenciada en Química

Director:
Josué Anselmo García Ortiz
Químico (Universidad Nacional de Colombia)
Co-Director:
Ricardo Alfonso Barbosa Cornelio
Químico (Universidad Nacional de Colombia)
Bogotá, 2017
Nota

Nota de aceptación.
_____________________________
_____________________________
_____________________________
_____________________________

Firma del jurado.

____________________________

Firma del jurado.

__________________________

Firma Director

__________________________
 Dedicatoria
A Dios.
Por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme dado salud para lograr mis objetivos, además de su infinita bondad y amor.
A mi madre y mi padre.
Por haberme apoyado en todo momento, por sus consejos, sus valores, por la motivación constante que me ha permitido ser una persona
de bien, pero más que nada, por su amor,
A mi hija Ana Sophia.
Gracias porque me escogiste y cambiaste mi vida, gracias por ser el motor que me empuja día a día ser el mejor regalo de mi vida, ser
madre de ti me hace sentir la mujer mas feliz del mundo, te mereces cada uno de mis esfuerzos, alegrías y éxitos.
A mis hermanos Fercho y Nana.
Por ser importante en mi vida y por ser un ejemplo de desarrollo profesional, por llenar mi vida de alegría y amor cuando más lo he
necesitado.
A mi amigo del alma Christian Sánchez.
Por motivarme a seguir adelante en los momentos de desesperación, por ser mi guía académica y ante todo agradezco a Dios por
permitirme encontrar una amistad tan pura, verdadera y productiva para mi vida, siendo un amigo incondicional que puedo contar con él,
con cada consejo que me llena de felicidad y de alegría
A mi profesor y director Josué García.
Por la paciencia y colaboración durante todos los años de mi carrera, quien ha sido guía con sus consejos y palabras que me permitieron
crecer profesionalmente.
A mi Co-director Ricardo.
Por cada enseñanza, por todo el tiempo dedicado, por su comprensión, por llegar a ser una persona esencial en la culminación de éste
trabajo, además doy gracias llenas de alegría por haber estado apoyándome y guiándome profesionalmente y permitir llegar a cumplir mis
logros.
 Agradecimientos.

A la Universidad Distrital Francisco José de Caldas y a todos sus docentes, ya que el conocimiento
que me brindaron sirvió como base fundamental para mi formación académica y personal.

Al Laboratorio de Química Bioorgánica de la Universidad Militar Nueva Granada donde se

realizaron las extracciones con fluidos supercríticos y los perfiles cromatográficos de las especies a
estudiar y sus integrantes: Daissy e Ivonne en las largas jornadas de apoyo y acompañamiento para la
culminación este trabajo.

Al profesor Ericsson Coy por su colaboración, por su amabilidad, confianza y generosidad, quien fue la
persona que abrió las puertas de su laboratorio y me permitió desarrollar gran parte de este trabajo.
 NOTA ACLARATORIA

La universidad no se hace responsable de las ideas, ni del contenido del presente trabajo debido a que
estas hacen parte única y exclusivamente de sus autores.

Cap., XV, artículo 117, acuerdo 029, Consejo Superior de la Universidad Distrital Francisco José de
Caldas. Junio de 1988.
 Índice General

1.ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN. 5
2. OBJETIVOS 6
3. ESTADO ACTUAL DEL TEMA 7
3.1 Familia PLANTAGINACEAE 7
3.1.1 Características morfológicas de la familia PLANTAGINACEAE 7
3.1.2 Distribución de la familia PLANTAGINACEAE. 8
La familia PLANTAGINACEAE es originaria de Europa y de Asia central. En América con frecuencia se
encuentra en Argentina con 22 géneros y 103 especies. En la Figura 3.1.2-1 muestra la distribución general
de la familia. Está formada por 90 géneros y aproximadamente 1700 especies, en las cuales la mayoría son
pertenecientes al género Plantago. (Stevens, 2001) 8
3.1.3 Usos de la familia PLANTAGINACEAE 9
3.1.4 Actividades biológicas de la familia PLANTAGINACEAE. 9
3.1.5 Quimiotaxonomía de la familia PLANTAGINACEAE 10
3.2 Género plantago. 10
3.2.1 Caracteristicas morfológicas del género Plantago 10
3.2.2 Distribución del género Plantago. 11
3.2.3 Usos del género Plantago 11
3.2.4 Actividad biológica del género Plantago. 12
3.2.5 Quimiotaxonomía del género Plantago 12
3.3 Especie Plantago major. 12
3.3.1 Características morfológicas de la especie Plantago major. 13
3.3.2 Distribución y habitat de la especie Plantago major 14
3.3.3 Usos de la especie Plantago major 14
3.3.4 Actividad biológica de la especie Plantago major 15
3.3.5 Quimiotaxonomía de la especie Plantago major 15
3.4 FAMILIA ASTERACEAE 15
3.4.1 Características morfológicas de la familia ASTERACEAE 15
3.4.2 Distribución de la familia ASTERACEAE 16
3.4.3 Usos de la familia ASTERACEAE 17
3.4.4 Actividades biológicas de la familia ASTERACEAE 17
3.4.5 Quimiotaxonomía de la familia ASTERACEAE 17
3.5 Género Arnica 17
3.5.1 Características morfológicas del género Arnica 18
3.5.2 Distribución y hábitat del género Arnica 18
3.5.3 Usos del género Arnica 19
3.5.4 Actividad biológica del género Arnica 20
3.5.5 Quimiotaxonomía del género Arnica 20
3.6 Especie Arnica montana L. 20
 3.6.1 Características morfológicas de la especie Arnica montana L 20
3.6.2 Distribución de la especie Arnica montana L 21
3.6.3 Usos de la especie Arnica montana L 22
3.6.4 Actividad biológica de la especie Arnica montana L 22
3.6.5 Quimiotaxonomía de la especie Arnica montana L 22
3.7 Métodos de extracción. 22
3.7.1 FLUIDOS SUPERCRÍTICOS. 23
3.7.2 Extracción líquido – líquido (L/L) 25
3.7.3 Extracción sólido – líquido (S/L) 26
3.7.4 Métodos de extracción con disolventes 26
3.8 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 26
3.8.1 Los antioxidantes 27
Los antioxidantes terciarios son los encargados de la reparación de las biomoléculas dañadas. Se incluyen
las enzimas endonucleasa apurinica/apirimidínica y polimerasa β, reparadoras del ADN y la metionina
sulfóxido redutasa (Page et al., 2009). 28
3.8.2 Método DPPH (2,2- difenil-1-picrilhidrazilo) 28
3.8.3 Método DMPD (dicloridrato de N,N-Dimetil-p-fenilendiamina) 29
3.8.4 Método FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power assay), o CRHF (Capacidad para Reducir el
Hierro Férrico) 30
3.8.5 Método ABTS (azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) 31
3.9 CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC-MS). 32
4. METODOLOGÍA 32
4.1 Revisión bibliográfica 32
4.2 Recolección de la muestra (especie vegetal Plantago major y Arnica montana L) 33
4.3 Marcha fitoquímica preliminar 33
4.4 Extracción con CO2 supercrítico (SFE) 35
4.5 Evaluación De la Actividad Antioxidante 36
4.5.1 Capacidad captadora del radical DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo) 36
4.5.2 Capacidad reductora de ion férrico FRAP. 37
4.6 Perfilado de los extractos SFE por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS).
37
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN. 38
5.1 ANÁLISIS FITOQUÍMICO PRELIMINAR. 38
5.1.1 Obtención del extracto etanólico. 38
5.1.2 Alcaloides 39
5.1.3 Flavonoides 40
5.1.4 Taninos 41
5.1.5 Antraquinonas y Naftoquinonas. 42
5.1.6 Saponinas 44
5.1.7 Triterpenos, Esteroides y Carotenoides 45
5.1.8 Cumarinas 45
5.1.9 Glucósidos cardiotónicos 46
5.2 Extracción con CO2 supercrítico de las especies vegetales Arnica montana L y Plantago major. 48
 5.3 DETERMINACIÓN ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE 49
5.3.1 Método DPPH. 49
5.3.2 Metodo FRAP. 51
5.4 ANÁLISIS CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA DE MASAS. (GC-MS). 54
5.4.1 Análisis del perfil cromatográfico de las especies vegetales Arnica montana L (SECA), Arnica
montana L (FRESCA), Plantago major (SECA), Plantago major (FRESCA). 54

6. CONCLUSIONES 56
7. RECOMENDACIONES 57
8. BIBLIOGRAFÍA 58

ANEXO 1. Perfil cromatografico de la especie vegetal Arnica montana L (seca) 68

ANEXO 2. Perfil cromatografico de la especie vegetal Arnica montana L (fresca) 70
ANEXO 3. Perfil cromatografico de la especie vegetal Plantago major (fresca) 72
ANEXO 4. Perfil cromatografico de la especie vegetal Plantago major (seca) 75
 Índice de figuras
8
Figura 3.1.1-1 Características morfológicas de la familia PLANTAGINACEAE
8
Figura 3.1.2-1 Distribución geográfica de la familia PLANTAGINACEAE
10
Figura 3.2.1-1 Características morfológicas de especies del género Plantago
11
Figura 3.2.2-1 Distribución geográfica del género Plantago
13
Figura 3.3.1-1 Características morfológicas de la especie Plantago major
14
Figura 3.3.2-1 Distribución y hábitat de la especie Plantago major
16
Figura 3.4.1-1 Características morfológicas de la familia ASTERACEAE
16
Figura 3.4.2-1 Distribución geográfica de la familia ASTERACEAE
18
Figura 3.5.1-1 Características morfológicas de especies del género Arnica
19
Figura 3.5.2-1 Distribución geográfica del género Arnica
21
Figura 3.6.1-1 Características morfológicas de la Especie Arnica montana L
21
Figura 3.6.2-1 Distribución geográfica de la Especie Arnica montana L
28
Figura 3.8.1.2-1 Estructuras correspondientes a los antioxidantes secundarios de los mecanismos de defensa en el organismo humano
29
Figura 3.8.2-1 Estructura química del radical libre metaestable DPPH
31
Figura 3.8.4-1 Fundamento del método FRAP, mostrando la reducción de 2,4,6-Tripiridil-Triazina Férrica (TPTZ)
31
Figura 3.8.5-1 Estructura química del ABTS
34
Figura 4.3-1 Metodología Marcha Fitoquímica Preliminar para las Hojas de las especies Arnica montana y Plantago major
35
Figura 4.4-1 Equipo de extracción por fluidos supercríticos SFT-110.
36
Figura 4.5.1-1 Ecuación para calcular el porcentaje de actividad antioxidante de los extractos para el ensayo DPPH.
49
Figura 5.3.1-1 Curva de calibración de la solución Stock de DPPH 100 mM utilizada para la preparación de la solución de trabajo.
Porcentaje de actividad antioxidante mediante el método DPPH de la SFE de las especies vegetales Arnica montana 51
Figura 5.3.1.3-1
L y Plantago major (seca y fresca)
52
Figura 5.3.2-1 Curva de calibración de Trolox utilizada para la preparación de la solución de trabajo.
Porcentaje de en eq- Trolox mediante el método FRAP de la SFE de las especies vegetales Arnica montana L y 53
Figura 5.3.2-2
Plantago major (seco y fresco)
55
Figura 5.4.1-1 Estructura molecular (5α, 6α)-4,5-epoxi-N-metil-morfinan-6-ol
 Índice de tablas
Tabla 3.1.4-1 Actividad biológica de algunas especies de la familia PLANTAGINACEAE 9

Tabla 3.2.4-1 Actividad biológica de algunas especies del género Plantago 12

Tabla 3.3-1 Clasificación de la especie vegetal Plantago major 13

Tabla 3.7-1 Fluidos supercríticos y propiedades 23

Tabla 5.1.1-1 Controles positivos para la identificación de los metabolitos secundarios de las dos especies vegetales en estudio 38

Tabla 5.1.2-1 Análisis de alcaloides presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica montana L 39

Tabla 5.1.2-2 Análisis de alcaloides presentes en la muestra vegetal Plantago major 40

Tabla 5.1.3-1 Análisis de flavonoides presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica montana L 41

Tabla 5.1.3-2 Análisis de flavonoides presentes en la muestra de la especie vegetal Plantago major 41

Tabla 5.1.4-1 Análisis de taninos presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica montana L 42

Tabla 5.1.4-2 Análisis de taninos presentes en la muestra de la especie vegetal Plantago major. 42

Tabla 5.1.5-1 Análisis de antraquinonas o naftoquinonas presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica montana L 43

Tabla 5.1.5-2 Análisis de antraquinonas o naftoquinonas presentes en la muestra de la especie vegetal Plantago major 43

Tabla 5.1.6-1 Análisis de saponinas presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica montana L 44

Tabla 5.1.6-2 Análisis de saponinas presentes en la muestra de la especie vegetal Plantago major 44

Tabla 5.1.7-1 Análisis de triterpenos, esteroides y carotenoides presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica montana L 45

Tabla 5.1.7-2 Análisis de triterpenos, esteroides y carotenoides presentes en la muestra de la especie vegetal Plantago major 45

Tabla 5.1.8-1 Análisis de cumarinas presentes en la muestra vegetal Arnica montana L 46

Tabla 5.1.8-2 Análisis de cumarinas presentes en la muestra vegetal Plantago major 46

Tabla 5.1.9-1 Análisis de glucósidos cardiotónicos presentes en la muestra vegetal Arnica montana L 47

Tabla 5.1.9-2 Análisis de glucósidos cardiotónicos presentes en la muestra vegetal Plantago major 47

Tabla 5.2.1 Cantidad de muestra extraída con CO2-SF de las especies vegetales Plantago major y Arnica montana L 48

Tabla 5.3.1-1 Absorbancia de distintas soluciones de DPPH a 515 nm, en función de su concentración. 49

Resultados de ensayo DPPH en porcentaje de población inhibida de cada una de las muestras de Ext. vegetal a una
Tabla 5.3.1.3-1 50
concentración de 1000 ppm.
Resultados de ensayo FRAP en eq-Trolox de cada una de las muestras de Ext. vegetal a una concentración de 1000
Tabla 5.3.2-1 52
ppm.
 LISTA DE ABREVIATURAS
Área de Libre Comercio de las Américas ALCA

2,2´-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico) ABTS

2, 2−difenil−1−picrilhidracilo DPPH

N,N-dimetil-p-fenilendiamina DMPD

Capacidad para Reducir el Hierro Férrico CRHF

Capacidad Antioxidante CA

Complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina TPTZ

Cromatografia de gases GC

Cromatografía de gases acoplada a espectroscopia de masas GC-MS

detector de espectrometría de masas MSD

Diámetro interno di

Dióxido de Carbono CO2

Etanol EtOH

Especies Reactivas de Oxígeno ERO

Espesor de película df

Extractos Ext.

Extracción con Fluidos Supercríticos SFE

Espectroscopia de masas MS

Ferric reducing/ antioxidant power assay FRAP

Fluidos Supercríticos SF

Grado Celsius °C

Gramos g

Glutatión peroxidasa GPX

Half maximal inhibitory concentration IC50

Impacto electrónico EI

Longitud L

Material Mat.

Micro-litros µL

Minutos min

Mililitros mL
Mili-molar mM

Nano-metro nm

Organización Mundial de la Salud OMS

Principios Activos AP

Partes por millón ppm

Single electrón transfer SET

Superóxido dismutasa SOD

Trolox Equivalent Antioxidant Capacity TEAC

Tratado de Libre Comercio TLC

Unidades de masa atómica u.m.a

Volumen Vol
 RESUMEN

En los últimos años los estudios científicos, se han interesado en la obtención de productos
naturales ya que contribuyen a preservar la salud humana. En este análisis fitoquímico se realizó
el estudio de las hojas y flores de dos especies vegetales: Plantago major y Arnica montana L
donde se obtuvieron metabolitos secundarios de extractos obtenidos por fluidos supercríticos;
haciendo uso de dióxido de carbono (CO2) en condiciones de fluido supercrítico, posteriormente
se realizó la determinación de la actividad antioxidante mediante los métodos de FRAP y DPPH.

A partir del material vegetal recolectado en la zona de Zipaquirá identificado preliminarmente in-
situ y posteriormente por el Herbario Nacional del Instituto de Ciencias Naturales de la Universidad
Nacional de Colombia, se molieron hojas y flores de cada una de las especies vegetales donde se
obtuvieron los extractos mediante la técnica de extracción con CO2-SF. La marcha preliminar
fitoquímica presentó positivo para metabolitos secundarios como: flavonoides, taninos, cumarinas,
monoterpenos y sesquiterpenos, responsables de las actividades antioxidantes de las especies
vegetales. En la investigación se evaluó y comparó cada extracto obtenido por los dos métodos de
extracción, determinando cuál de las dos especies vegetales es la más favorable para continuar un
estudio más riguroso en la ciencia.

1
 INTRODUCCIÓN

El ser humano en su necesidad de comprender y curar diversas enfermedades, ha usado gran

variedad de especies vegetales las cuales han sido denominadas plantas medicinales. Además, la
implementación de técnicas industriales en la extracción de esencias y aceites ha aumentado
notablemente la utilización y comercialización de plantas ricas en terpenos. El estudio e
investigación de éstas dos especies vegetales ha crecido considerablemente en los últimos años.
Dada la gran diversidad de flora presente sobre la superficie terrestre, continúa siendo un problema
abierto que requiere responder a la pregunta: ¿Qué uso medicinal y aromático posee cada planta?
A lo largo de los años el hombre ha logrado identificar familias y géneros de plantas medicinales
y aromáticas, estableciendo en qué órganos de las plantas se encuentran compuestos químicos tales
como: polifenoles, terpenoides, alcaloides, lípidos, lactonas, esteroides, quinonas, carotenoides,
heterósidos y grasas. Estos metabolitos secundarios son denominados principios activos (AP) en
las especies vegetales (Lusardi, 2010).

Los AP varían según la especie vegetal y del órgano especializado a estudiar. Adicionalmente los
AP son usados con frecuencia en estudios fitoquímicos, en la elaboración de fragancias, pigmentos
y sabores, ampliamente utilizados en la agroindustria alimentaria y no alimentaria, en la industria
farmacéutica y cosmética (Gennaro, 1990), en donde se aprovechan sus propiedades que son
benéficas para los organismos vivos y para el tratamiento de diversas enfermedades (Díaz, 2003;
Roig, 1992). La necesidad de manipular, extraer y sintetizar AP de las especies vegetales ha
generado un crecimiento en el desarrollo de técnicas experimentales escalables a nivel industrial.
Uno de los métodos más eficaces para la obtención de AP es la extracción con fluidos supercríticos
(SFE). El alto poder de solvatación de los fluidos supercrıticos (SF) fue investigado por primera
vez por J. Hannay en 1879 (Hannay, 1879). Zosel en 1969, demostró que la SFE puede ser utilizada
para aplicaciones de uso industrial. En la década de los años 1970 se realizó un estudio de los
productos naturales mediante la utilización de dióxido de carbono en estado supercrítico (CO2-SF).
El CO2-SF tiene varias características importantes como lo son: temperatura crítica, propiedades
disolventes, ausencia de toxicidad, inflamabilidad o corrosión (Brunner, 2005; Rozzi, 2002).

2
La implementación de CO2-SF se fundamenta en la utilización de temperaturas moderadas y
presiones elevadas para evitar deterioro de las características de los terpenos en extracción.
Además, estudios han comprobado la capacidad que posee la SFE en aislar compuestos químicos
pesados y menos volátiles como los monoterpenos y los sesquiterpenoides (Mangold, 1983). En la
extracción por el método SFE utilizando CO2-SF, se conservan eficazmente los componentes a
base de antioxidantes presentes en las especies vegetales (Gallego, 2004), mostrando mejores
resultados que los métodos convencionales de extracción, los cuales a nivel industrial utilizan
disolventes orgánicos como: alcoholes, hexanos, éteres, etc. Estos compuestos son nocivos para la
salud debido a que presentan propiedades de inflamabilidad, liposolubilidad, volatilidad, toxicidad
y riesgo de explosión. Los métodos convencionales usan altas temperaturas provocando una
disminución de la capacidad antioxidante y otras propiedades nutracéuticas del extracto. Dado que
nuestro principal interés es extraer AP de forma eficiente y además conservando sus propiedades
antioxidantes, haremos uso en esta investigación del método de extracción CO2-SF.

En este estudio se utilizaron dos plantas: el primer espécimen de interés cientıfico es la especie
vegetal Plantago major, importante en la industria farmacéutica debido a que su uso para la
prevención del aborto, tratamiento de la inflamación del abdomen, amigdalitis, dolor de cabeza,
llagas en la boca, principios de cáncer, gripe, infecciones en la piel, enfermedades de los pulmones,
infecciones ligadas al útero e inflamaciones crónicas de los riñones (Hoffmann y Pamplona, 2004).
Adicional a estos usos etnobotánicos, el surgimiento de nuevos avances en la ciencia evidencian
relaciones con actividades biológicas como: actividad antibacteriana, antihistamínica, antialérgica,
antiinflamatoria, antioxidante, antihemolíticas, antidiarréicas y efectos anti-VIH. Así mismo, estas
propiedades indican la presencia de AP como: fenilpropanoides, flavonoides, saponinas, ácido
cıtrico, ácido oxálico, y tirosinasas, también contiene el glucósido aucubina (rhinantina),
cumarinas, lactonas (loliolide), polifenoles, baicaleína, escutellareina, ácido benzoico, ácido
cinámico, ácido fumárico, ácido clorogénico, tirosol, el ácido 3, 4−hidroxicinámico, ácido
pentacíclico triterpenoleárico, ácido salicílico, compuestos azufrados y alcaloides (noscapina),
importantes en el tratamiento de enfermedades (Hoffmann y Pamplona, 2004).

La segunda planta de interés en este estudio es la especie vegetal Arnica montana L. Algunas de
sus propiedades farmacéuticas incluyen: estimulación del apetito, ayuda a combatir enfermedades

3
cutáneas, reducción de verrugas, depuración de la sangre, prevención del cáncer de matriz o
estomacal, trastornos ginecológicos e infecciones vaginales. También se conocen algunas
actividades biológicas como: actividad antiespasmódica, debida a la presencia de triterpenos y
flavonoides; actividad antihistamínica, antiinflamatoria, antibacteriana, antiartrítica y
antineurálgica por acción de lactonas sesquiterpénicas y actividad colerética, relacionada con
aceites esenciales, flavonoides, ácidos fenólicos (Jiménez, et al 2007). Con base en la revisión
bibliográfica que se ha realizado sobre la etnobotánica, AP y propiedades biológicas de cada una
de las especies vegetales, se realizó la extracción de los metabolitos secundarios mencionados
anteriormente, utilizando un método novedoso y eficaz, aprovechando las propiedades de un gas
inorgánico CO2 en su estado supercrítico, para posteriormente evaluar la actividad antioxidante
mediante el método de coloración DPPH y el método de reducción de metales FRAP.

4
 1.ANTECEDENTES Y JUSTIFICACIÓN.

Las plantas constituyen un recurso valioso en los sistemas de salud de los países en vía de
desarrollo. Aunque no existen datos precisos para evaluar la extensión del uso global de plantas
medicinales, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha estimado que más del 80 % de la
población mundial utiliza diariamente la medicina tradicional para satisfacer sus necesidades en la
salud, y que gran parte de los tratamientos tradicionales implica el uso de extractos de plantas o sus
principios activos (Olivera, 2005).

Los compuestos químicos se han destacado por poseer actividades biológicas. En América Latina,
especialmente en Colombia existe una gran diversidad de especies vegetales pertenecientes a
diferentes familias y géneros, que presentan AP muy útiles como fuente vital de antioxidantes
naturales (Berit, 2000).

Este estudio se fundamentó en la investigación de dos especies vegetales ampliamente distribuidas

en América Latina Plantago major y Arnica montana L. Ambas especies ya han sido estudiadas
anteriormente, dejando en claro la presencia de una gran variedad de AP. Es por ello que esta
investigación se fundamentó en la extracción de metabolitos de interés particular: ácido ascórbico,
taninos, flavonoides y polifenoles, dado que dichos compuestos presentan propiedades
antioxidantes como lo señala Cook en 1996. Una de sus funciones es la defensa, propiedad que
involucra una mayor afinidad para las interacciones con los radicales libres o especies reactivas.
Para poder comprobar esta propiedad se utilizaron las fracciones útiles provenientes de la SFE,
usando el CO2 en su estado supercrítico como fluido. Posteriormente, se determinó la actividad
antioxidante mediante los métodos DPPH (2, 2-difenil-1-picrilhidracilo) y FRAP (ferric reducing/
antioxidant power assay) (Troncoso, 2003).

PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN.
¿Cuál será la actividad antioxidante que presentan los extractos CO2 -SF de las hojas y flores de
las especies vegetales Plantago major y Arnica montana L? ¿Qué beneficios conlleva la
extracción CO2 -SF en este caso?

5
 2. OBJETIVOS

2.1 OBJETIVO GENERAL

Evaluar las propiedades antioxidantes de los extractos etanólicos y CO2-SF de las hojas y flores de
dos especies vegetales Plantago major (PLANTAGINACEAE) y Arnica montana L
(ASTERACEAE).

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

OE.1 Obtener extractos etanólicos de hojas y flores de las especies vegetales Plantago major
(PLANTAGINACEAE) y Arnica montana L (ASTERACEAE).

OE.2 Obtener extractos CO2-SF de hojas y flores de las especies vegetales Plantago major
(PLANTAGINACEAE) y Arnica montana L (ASTERACEAE).

OE.3 Determinar la actividad antioxidante de los extractos CO2-SF usando el método de captura
de electrones DPPH (2, 2−difenil−1−picril−hidrazilo) de las especies vegetales Plantago major
(PLANTAGINACEAE) y Arnica montana L (ASTERACEAE).

OE.4 Determinar la actividad antioxidante de los extractos CO2-SF usando el método de reducción
de ión férrico FRAP (Ferric ion Reducing Antioxidant Power assay) de las especies vegetales
Plantago major (PLANTAGINACEAE) y Arnica montana L (ASTERACEAE).

OE.5 Comparar las actividades antioxidantes encontradas en los dos tipos de extractos.

OE.6 Perfilar por GC-MS (cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas) los
extractos CO2-SF de las especies vegetales Plantago major (PLANTAGINACEAE) y Arnica
montana L (ASTERACEAE).

6
 3. ESTADO ACTUAL DEL TEMA

"Hoy en día muchas especies vegetales medicinales que se encuentran en peligro de extinción o
pérdida genética severa, pero aún la información acerca de sus capacidades y propiedades es
insuficiente para el ser humano, además el TLC y el ALCA han sido factores de gran incidencia
frente a este flagelo de desconocimiento propio de metabolitos para nuestras plantas autóctonas.
Para la mayoría de las especies amenazadas no existe alguna acción para la conservación, además
en la mayoría de los países no hay aún un inventario completo de plantas medicinales. Muchos de
los conocimientos de sus usos están en manos de poblaciones tradicionales cuya existencia también
está amenazada." (Akerele, Heywood y Synge, 1991).

3.1 Familia PLANTAGINACEAE

Las especies vegetales pertenecientes a la familia PLANTAGINACEAE comprenden más 270

especies en 9 géneros. Estas especies se localizan en regiones frías o tropicales a continuación se
dará una clasificación minuciosa de cada especie a estudiar.

3.1.1 Características morfológicas de la familia PLANTAGINACEAE

Éstas plantas comúnmente se encuentran en arbustos, se caracterizan algunas veces por ser plantas
acuáticas. Presenta indumento en el cual tiene diversidad de vellosidades; sus hojas son simples
sin estípulas, curvinervadas, generalmente en roseta basal, alternas, rara vez opuestas. Presenta
inflorescencias en forma de espiga, flores usualmente hermafroditas pero más o menos
actinomorfas o algo zigomorfas en el género Plantago; los frutos presentan usualmente cápsulas
septicidas, ocasionalmente poricidas o circuncisa, pero sus semillas se caracterizan por ser
endospermadas con embrión casi siempre recto sin haber existencia de almidón; la floración ocurre
entre mayo y octubre, en zonas templadas.(Stevens, 2001)

7
 Figura 3.1.1-1. Características morfológicas de la familia PLANTAGINACEAE.
Modificado de: (http://www.llombera.es/R_llantenMn.htm)

3.1.2 Distribución de la familia PLANTAGINACEAE.

La familia PLANTAGINACEAE es originaria de Europa y de Asia central. En América con

frecuencia se encuentra en Argentina con 22 géneros y 103 especies. En la Figura 3.1.2-1 muestra
la distribución general de la familia. Está formada por 90 géneros y aproximadamente 1700
especies, en las cuales la mayoría son pertenecientes al género Plantago. (Stevens, 2001)

Figura 3.1.2-1. Distribución geográfica de la familia PLANTAGINACEAE

La señalización de los puntos amarillos hacen referencia a la distribución de la familia PLANTAGINACEAE. Tomado y modificado de:
(Trópicos, 2016)

8
3.1.3 Usos de la familia PLANTAGINACEAE

Las hojas crudas de las especies vegetales de ésta familia se usan para curar la inflamación de los
problemas digestivos, hemorroides, como diuréticas y remedios oftálmicos; las flores son usadas
para favorecer la circulación, por lo que también tiene efecto en el aumento de la intensidad y el
ritmo cardíaco. Además, benefician la nutrición del cuerpo y activan la eliminación de sustancias
de desecho (Martínez, 1981; Hill, 1965). La semilla contiene una sustancia mucilaginosa insípida
que actúa como laxante suave en el tratamiento del estreñimiento crónico su principal efecto,
además de propiedades comprobadas como: antidiarréica, demulcente, hipoglucemiante y
antiinflamatoria. Una vez extraído, el mucílago sirve como cosmético y apresto para tejidos (Hill,
1965). Las inflorescencias en forma de espiga de estas familias se han usado son laxantes y la
decocción de la raíz con unas gotas de limón se utiliza para lavar llagas de la boca y la garganta.
También se le asocian propiedades hemostáticas ya que incrementa la coagulación de la sangre en
las heridas evitando hemorragias, antidiarreicas, demulcentes, hipoglucemiantes, antioxidantes y
antiinflamatorias (Muñoz et al, 2001).

3.1.4 Actividades biológicas de la familia PLANTAGINACEAE.

Un estudio realizado en Japón demostró las actividades biológicas de sus principales compuestos,
entre las que se encuentra la actividad antibacteriana, antihistamínica, antialérgica,
antiinflamatoria, antioxidante y efectos anti-VIH (Muñoz et al, 2001). A continuación se presenta
en la tabla 3.1.4-1 un compendio de algunos estudios realizados sobre las actividades biológicas
referentes a ésta familia:

Tabla 3.1.4-1. Actividad biológica de algunas especies de la familia PLANTAGINACEAE.

Órgano de la planta y/o extracto
Especie Actividad biológica Referencias
metabolito evaluado

Ahmad Najib; Gemini Alam; Musdalifah

Plantago lanata Hojas Antiinflamatoria
Halidin (2012)

Plantago australis Elisa A Lapenna M, Gerardo E Medina

Hojas Antimicrobiana
Lam Ramírez (2003)

Actividades
Plantago major Hojas Berit (2000).
inmunoestimuladoras

9
3.1.5 Quimiotaxonomía de la familia PLANTAGINACEAE

Las investigaciones realizadas sobre la familia PLANTAGINACEAE han revelado la presencia en

hojas, flores y tallos de compuestos químicos como: mucílagos, pectinas, flavonoides, las
alantoínas, los cuales se caracterizan por estimular la regeneración de células epidérmicas; taninos
a los que se les atribuye la propiedad de cicatrización; ácido cafeico, responsable de las propiedades
antioxidantes (Martínez, 2005).

3.2 Género plantago.

Las especies vegetales pertenecientes a éste género hacen parte del reino: Plantae, subreino:
Traqueobionta, Superdivisión: Spermatophyta; División: Magnoliophyta; Clase: Magnoliopsida;
Subclase: Asteridae; Orden: Plantaginales (Rodríguez, 1996)

3.2.1 Caracteristicas morfológicas del género Plantago

Sus plantas se caracterizan por ser herbáceas, cáudice corto, más raramente pequeñas plantulas
leñosas o arbustos. Sus hojas por lo general se encuentran en forma de rosetas basales. También se
puede apreciar en algunas especies la ausencia de pecíolo claramente definido, presencia de una o
varias inflorescencias, en su mayoría en forma de espigas y normalmente muy alargadas. Sus flores
se caracterizan por su forma actinomorfa y casi siempre hermafroditas de pequeño tamaño (Ver
Figura 3.2.1-1). En su estructura posee un óvulo o varios en cada lóculo, su estigma se presenta
alargado; el fruto se caracteriza por ser encapsulado (Martínez, 2005).

Figura 3.2.1-1 Características morfológicas de especies del género Plantago.

Modificado de: (https://medlineplus.gov)

10
3.2.2 Distribución del género Plantago.

Se encuentra ampliamente distribuido en las regiones templadas del hemisferio norte y las zonas
montañosas tropicales donde se presentan climas templados o fríos. Existen aproximadamente 300
especies en todo el mundo, exceptuando las especies de hábitats acuáticos, salinos o en tierras bajas
tropicales. Éste género se encuentra distribuido en Europa, África, Asia occidental y América del
Norte; en América Latina desde México hasta Colombia, incluyendo Costa Rica, pero en mayor
proporción se encuentra en Latinoamérica como lo muestra la Figura 3.2.2-1. En Colombia
prevalece en: Puerto Nariño, Tumaco y en el Amazonas. Es muy común y fácil de hallar en zonas
de pastos, laderas, cerca de cultivos y en los bordes de caminos (Rodriguez, 1996).

Figura 3.2.2-1. Distribución geográfica del género Plantago

El color verde hacen referencia a la distribución del género Plantago (Trópicos, 2016)

3.2.3 Usos del género Plantago

Tiene numerosas aplicaciones como producto medicinal y dietario, entre ellas, sus órganos
vegetativos son utilizados como emolientes, desinflamatorios, anticatarrales y para afecciones de
las vías respiratorias. Adicional, es usado como antitusígeno, antiinflamatorio, astringente,
antibacteriano, antioxidante y antipruriginoso (Marzocca, 1997). Según Hieronymus (1882) posee
propiedades astringentes, evidentes luego de triturar y remojar las hojas en agua caliente para tratar
y curar heridas. Martinez Croveto (1981) indica que la decocción de sus hojas sirve para tratar aftas
y llagas bucales en niños y Toursarkisian (1980) le atribuye propiedades pectorales y
antiflogísticas. (Trujillo & Madrigal, 2005)

11
3.2.4 Actividad biológica del género Plantago.

Éstas especies vegetales se han caracterizado no solo por su facilidad de obtención y preparación
del material medicinal, sino por su actividad biológica (Tabla 3.2.4-1) que le acredita propiedades
antiinflamatorias, antioxidantes, antihemolíticas, bactericidas y cicatrizantes.

Tabla Nº 3.2.4-1. Actividad biológica de algunas especies del género Plantago.

Órgano de la planta y/o extracto
Especie Actividad biológica Referencias
metabolito evaluado

Plantago
Hojas, fruto y raíz Hipotérmica y diurética (Trujillo & Madrigal, 2005)
lanceolata

Plantago hirtella Hojas Embriogénesis somática (Gonzalez et al., 2006)

Antiparasitaria y
Plantago ovata Hojas (Trujillo & Madrigal, 2005)
antiulcerogénica

3.2.5 Quimiotaxonomía del género Plantago

La importancia medicinal de las especies que forman el género se relaciona con la presencia de
diversos glucósidos como la aucubina (rhinantina), sacarosa, fructosa, sorbitol, ramnosa y xilosa.
En sus hojas, tallos y semillas se presentan compuestos químicos como: fenilpropanoides,
flavonoides como luteolina, nepetina y noscapina, mucílagos. Otros PA son las saponinas, ácido
cítrico, ácido oxálico, y tirosinasas, cumarinas, polifenoles, baicaleina, escutellareina, ácido
benzoico, ácido cinámico y ácido fumárico, presentes en las hojas; ácido oleico, en las semillas;
ácido clorogenico, tirosol, el ácido 3,4-hidroxicinámico, ácido pentaciclico triterpenolearico, ácido
salicílico y alcaloides como plantagonina e indicaina, distribuidos en todos sus órganos (Trujillo
& Madrigal, 2005).

3.3 Especie Plantago major.

Son plantas herbáceas de origen Europeo que crecen en las regiones arenosas de la cuenca
mediterránea. Es cultivada en España, Marruecos, Pakistán e India. En nuestro país actualmente
donde encontramos más de 22 lugares donde está radicada (Olivera, 2007)

12
 Tabla 3.3-1. Clasificación de la especie vegetal Plantago major
Reino Plantae

División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Plantaginales
Familia Plantaginaceae
Género Plantago
Especie Plantago major
Modificado de: (www.ecured.cu/Llantén_mayor)

3.3.1 Características morfológicas de la especie Plantago major.

Ésta especie tiene características muy reconocidas ya que es una planta que se encuentra en los
caminos o pastizales descubiertos. Sobresalen sus hojas radicales y en ocasiones alternas, sin
vellosidades y coloración púrpura en la punta del pecíolo (Figura 3.3.1-1). Tiene inflorescencia en
espiga con flores tetrámeras. El fruto se presenta en cápsula transversal. (INBio, 1997)

Figura 3.3.1-1 Características morfológicas de la especie Plantago major.

Tomado y modificado de: (wildmedicinal.wordpress.com)

13
3.3.2 Distribución y habitat de la especie Plantago major

Crecen frecuentemente en suelos más o menos húmedos, ricos en abono orgánico. Es de origen
euroasiático y norteafricano. En ecosistemas tropicales es muy raro ver su cultivo. Sin embargo,
en Colombia encontramos aproximadamente 20 lugares donde cultiva, incluido: Cundinamarca,
Medellín, Ciudad Bolívar, Villa de Leyva, Mocoa y Boyacá, entre otros. En la figura 3.3.2-1 se
aprecia la localización de las zonas en las que sobresale la especie. (Berit, 2000)

Figura 3.3.2-1 Distribución y hábitat de la especie Plantago major

La señalización de color amarillo hace referencia a la localización de la especie Plantago major. Modificado de:
(http://www.biodiversidad.co/fichas/1167)

3.3.3 Usos de la especie Plantago major

En la medicina popular se ha usado para la prevención del aborto. Además, se le atribuyen

propiedades que ayudan a tratar la inflamación del abdomen, amigdalitis, dolor de cabeza, llagas
en la boca, principios de cáncer, gripe, infecciones en la piel, enfermedades de los pulmones e
infecciones ligadas al útero (Rodríguez et al, 2003). También posee cualidades astringentes,
depurativas, cicatrizantes, expectorantes y hemostáticas, administrada por vía oral en los casos de
ardor del estómago, afecciones respiratorias, diarrea, disentería e inflamaciones crónicas de los
riñones. Se recomienda en forma de enjuague bucal para tratar las inflamaciones de la boca y
garganta, gingivitis y parotiditis. Las hojas frescas y molidas, aplicadas como emplastos ayudan a
eliminar las úlceras. Las hojas del Plantago major frescas contienen las propiedades apropiadas
para desinfectar las heridas y favorecer su cicatrización. (Berit, 2000)

14
3.3.4 Actividad biológica de la especie Plantago major

Se han reportado en la literatura formas de preparar esta especie. Trujillo et al., (2005) habla del
método de extracción de una tintura que resulta a partir de hojas secas, probada con resultados
positivos como antibiótico. El extracto acuoso de las hojas de Plantago major tuvo actividad
antisecretora, y antiulcerogénica. En 1996 Rodríguez y compañía realizaron un estudio in vitro
mediante el método de difusión con discos en agar, determinando el efecto antifúngico de una
crema elaborada con las hojas de Plantago major. En 2003 Çoban ensayó con el extracto etanólico
y logró demostrar actividad antioxidante dependiente de la concentración y actividad
antibacteriana. Para el 2012, Muhammad Zubair y compañía demostraron una proliferación celular
(cicatrización) relacionada con el mismo. Al año siguiente, Carmonaa et al.,2013 reportaron que
ésta especie presenta actividad antibacteriana.

3.3.5 Quimiotaxonomía de la especie Plantago major

Las investigaciones respecto a su composición reportan mucílagos, arabinogalactanos,

ramnogalacturonanos, glucomananos y pectinas, flavonoides, taninos, un glucósido cromogénico
iridoide denominado aucubósido (Hoffmann y Pamplona, 2004). Igualmente, se encuentran
derivados del ácido benzoico como el ácido p-hidroxibenzoico, ácido protocatéquico, ácido
gentísico y ácido cafeico. De éste último, derivados como ésteres cafeilquinicos, acteoside,
principalmente la aucubina, heterósidos de luteolina y apigenina. Otros compuestos como: ésteres,
cumarinas, ácido- fenil-carboxílicos y alcaloides (Jiménez et al, 2007).

3.4 FAMILIA ASTERACEAE

Asteraceae es la familia más numerosa en nuestro país, y a ello se le suma una gran diversidad de
1700 géneros y 30.000 especies (Cabrera, 1999; Zuloaga et al, 1999)

3.4.1 Características morfológicas de la familia ASTERACEAE

Ésta familia se caracteriza porque en su mayoría, las especies vegetales son herbáceas y arbustivas.
Algunas de ellas son trepadoras o glandulares, de hojas alternas, opuestas y simples, comúnmente
verticiladas o palmadas, reducidas en escamas o espinas, usualmente simples en forma de lámina.
Sus inflorescencias se conocen como capítulos, dispuestos en racimos y agrupados en un

15
receptáculo; las flores forman una corola gamopétala con estambres epipétalos y anteras unidas
(Figura 3.4.1-1) (Greuter, 2006).

Figura 3.4.1-1. Características morfológicas de la familia ASTERACEAE

Tomado y modificado de: (https://es.wikipedia.org/wiki/Taraxacum_officinale)

3.4.2 Distribución de la familia ASTERACEAE

Las asteráceas comprenden más de 1700 géneros y unas 20.000-30.000 especies distribuidas por
todo el mundo. Como se puede observar en la Figura 1.4.2-1, ésta familia se encuentra localizada
en mayor proporción en América Latina; alrededor de 373 géneros y 3080 especies son nativas de
México, seguido de África y poca distribución en el continente Europeo; ausentes en la Antártida.
Su mayor concentración se sitúa en las regiones subtropicales, templadas, cálidas y suelen ser muy
abundantes en las regiones montañosas (Evans, 2002).

Figura 3.4.2-1 Distribución geográfica de la familia ASTERACEAE.

La señalización de color amarilla hace referencia a la distribución de la familia Asteraceae. Modificado de Trópicos
(2016).

16
3.4.3 Usos de la familia ASTERACEAE

Algunas especies pertenecientes a ésta familia son usadas en la industria farmacéutica como
estimulantes del apetito (aperitivos) y digestivos (Wagner, 1977). Así mismo, estudios reportan
usos antiinflamatorios, antihemorrágico, antiséptico, astringente para las heridas, ayuda a combatir
enfermedades cutáneas y a reducir verrugas; sirve también como depurador de la sangre,
prevención del cáncer de matriz o estomacal. Algunos campesinos las usan para tratar problemas
estomacales, trastornos ginecológicos e infecciones vaginales (Jiménez, et al., 2007).

3.4.4 Actividades biológicas de la familia ASTERACEAE

Estudios han demostrado la capacidad antioxidante de los extractos acuosos de las especies
vegetales pertenecientes a la Familia ASTERACEAE, la cual se ha evaluado midiendo su
capacidad captadora (scavenger) del radical libre estable 2,2-difenil-1-picril hidrazilo (DPPH)
(Duke, 1998).

3.4.5 Quimiotaxonomía de la familia ASTERACEAE

En general, el grupo está caracterizado por la presencia de ácidos iso- y clorogénico, iso-
flavonoides, lactonas sesquiterpénicas, alcoholes triterpénicos pentacíclicos, aceites esenciales
(con predominio de terpenoides), alcaloides (especialmente pirrolizidínicos) y diversos derivados
acetilénicos. Las semillas de Asteráceas almacenan glúcidos (particularmente como inulina),
prótidos (como proteína amorfa) y lípidos. Los aceites seminales son ricos en ácidos grasos de
cadenas cortas, sobre todo linoleico y esteárico y en menor cantidad oleico, linolénico y palmítico
(Smith, 1985).

3.5 Género Arnica

Conocida popularmente como quina de los pobres, estornudadera, guerrillera o tabaco de montaña,
la Arnica es originaria de Europa, aunque es común encontrarla en terrenos silíceos de América
Latina. Existen diferentes clases de Arnica, entre las cuales encontramos las especies Arnica
chamissonis y la Arnica montana L (Waizel, B. J. 1995).

17
3.5.1 Características morfológicas del género Arnica

La planta de Arnica alcanza hasta los 50 cm de altura; posee un tallo que parte de un rizoma,
culminando en una flor compuesta como las de las margaritas. Las hojas, dispuestas sobre la parte
inferior de la planta forman una roseta, son de color verde oscuro, pubescentes y poseen cinco
nerviaciones, mientras que el tallo floral, el cual solo aparece en verano y alcanza los 50 cm de
altura, está provisto de un capítulo floral terminal con flores tubulares de color amarillo, blanco o
morado. En la Figura 1.5.1-1 se aprecian sus órganos. La planta desprende un aroma fuerte, el cual
puede llegar a ser agradable o molesto (Blumenthal, 1998).

Figura 3.5.1-1. Características morfológicas de especies del género Arnica.

Tomado y modificado de: www.fotonatura.org

3.5.2 Distribución y hábitat del género Arnica

Se encuentra distribuido en África como lo indica la Figura 1.5.2-. Cuenta con 1700 especies
aproximadamente. Se diseminó rápidamente por Asia y América Central. Se presenta
principalmente en las regiones templadas y prados o zonas de pastos de montaña, con al menos dos
especies originarias de Eurasia: Arnica angustifolia y Arnica montana L; su hábitat son las zonas
frías desprovistas de cal, con suelos ácidos y pobres en nitrógeno. La mayoría de especies ha
evolucionado para protegerse del frío, prefiriendo zonas soleadas y resguardadas del viento (Sugier
& Gawlik-Dziki, 2013).

18
 Figura 3.5.2-1. Distribución geográfica del género Arnica.
La señalización de color verde hace referencia a la distribución de la género Arnica. Modificado de: Trópicos ( 2016).

3.5.3 Usos del género Arnica

Es reconocido en el tratamiento de: la abrasión de la piel, amigdalitis, ampollas no abiertas, anemia,

anginas, artritis, asma, aterosclerosis, atonía cardiaca, bronquitis, caquexia, chichones, coágulos en
los vasos sanguíneos, trastornos vasculares o venosos, úlceras rebeldes y várices, congestión,
conmociones cerebrales, contusión, curación de heridas, debilidad nerviosa, deficiente circulación
sanguínea, desgarres, distensiones musculares, diarrea, disfonía, dislocaciones, dispepsia, dolor al
correr, dolor de garganta, dolor muscular, dolor reumático, eczema, enfermedades estomacales,
cardiovasculares, de la columna vertebral, del hígado y oculares, equimosis, esguinces, faringitis,
gota, hematomas, hipertensión, hipotensión, ictericia, inflamación de la boca, inflamación de las
mucosas bucales, influenza, llagas bucales, llagas persistentes, malaria, malestares reumáticos,
mareo, mordeduras, neuralgia, parálisis, pérdida de cabello, periodontitis, picor vaginal, piorrea
dental, podagra, problemas cardíacos, circulatorios o de las encías, golpes, quemaduras, resfriado
común, sangrado, síncope, tos, tos ferina y tumores. Además tiene propiedades como: depurativo,
estimulante de la circulación sanguínea, inductor de la sudoración, en solución para el lavado de
ojos, limitador de infecciones, polvo estornutatorio, tónico y ungüento oftálmico (Chicourel, 1998;
Klass, 2002; Duke y Bogenschutz-Godwin, 2002; Gotfredsen, 2009; Schar, 2010; Vogel, 2013).

19
3.5.4 Actividad biológica del género Arnica

Causa enrojecimiento e irritación de las mucosas debido a la acción del aceite esencial, lactonas
sesquiterpénica). Cuenta con cualidades antiespasmolíticas, relacionadas con la presencia de
triterpenos y flavonoides. Además, gracias a las lactonas sesquiterpénicas, presenta actividad
antihistamínica, antiinflamatoria, antiartrítico, antineurálgico y la más conocida, su acción
antibacteriana. Por último presenta actividad colerética, asociada a la presencia de aceites
esenciales, flavonoides, ácidos-fenólicos. Se recomienda como afrodisíaco, analgésico, anticaspa,
anticatarral, anticonvulsionante, antidematosis, antiespasmódico, amtimicrobiano, antiséptico,
diurético (Maciel, 2006).

3.5.5 Quimiotaxonomía del género Arnica

Los compuestos químicos están distribuidos en toda la planta donde contienen derivados de timol
como: astragalósidos, quercetol, glucogalacturónido e isoquercitrócido, lactonas sesquiterpénicas
(helenalina, dihidrohelenalina, arnifolina y arnicolida), triterpenos pentacíclicos, taninos; ácidos
fenil-carboxílicos; cumarinas como: umbeliferona, escopoletina, polisacáridos heterogéneos de
alto peso molecular; carotenos responsables de la coloración de la flor, fitosteroles, colina (0,1%)
(Lyss et al., 1997).

3.6 Especie Arnica montana L.

3.6.1 Características morfológicas de la especie Arnica montana L

Es una planta aromática perenne, perteneciente a la familia de las compuestas, caracterizada por
presentar una altura entre 20 y 60 cm; su tallo es erguido, hueco tomentoso, con pocas ramas, en
cuya base se ubica una roseta de hojas lanceoladas, extendidas sobre el suelo, simples y derechas,
hirsutas por el haz, glabra por el envés. Las flores son de color amarillo, linguladas las periféricas
y fluoscosas; las demás, ubicadas en un capítulo terminal, haciendo su aparición a mediados de
verano y principios de otoño. El fruto es un aquenio color pardo. Flores y raíz de sabor ocre
aromático y olor fuerte que hace estornudar (Waizel, 1995; Plants for the future, 2012).

20
 Figura 3.6.1-1. Características morfológicas de la Especie Arnica montana L.
Tomado y modificado: (www.sarahockwell-smith.com/)

3.6.2 Distribución de la especie Arnica montana L

Ésta especie se encuentra distribuida principalmente en Europa central y meridional, Asia central
y Latinoamérica. Su hábitat abarca altitudes desde los 700 hasta los 2.500 m.s.n.m, encontrándose
en algunas zonas soleadas, montañas, praderas y tuberas. Se ubica preferentemente sobre suelos
ácidos, arenosos y ricos en humus (Botanical, 2014); así mismo, se ha observado en México, en
cuyo caso podría tratarse de plantas cultivadas (Conabio, 2011).

Figura 3.6.2-1 Distribución geográfica de la Especie Arnica montana L.

La señalización de color amarillo hace referencia a la distribución de la especie Arnica montana L. Modificado de: Trópicos

(2016).

21
3.6.3 Usos de la especie Arnica montana L

La especie Arnica montana L es una planta aromática muy popular entre los pastores y campesinos,
que la utilizaban tradicionalmente en forma de tintura para uso externo o fumando sus hojas para
aliviar la tos y la bronquitis. Antiguas tribus germánicas ya conocían las propiedades medicinales
de ésta planta. Es útil para su uso en gargarismos, apósitos y baños. Actualmente, determinados
preparados utilizan extractos de Arnica para estimular la circulación y el corazón. Su flor posee
sustancias que son utilizadas por sus propiedades antiinflamatorias para aliviar contusiones,
torceduras, traumatismos y dolores musculares o de las articulaciones, ya sea en forma de tintura
o en aceite y siempre por vía tópica. Se desaconseja totalmente el uso interno por vía oral, debido
a su efecto irritante de las mucosas y de estimulante cardíaco (Schmidt & Matthiensen, 2000).

3.6.4 Actividad biológica de la especie Arnica montana L

Estudios realizados a ésta especie vegetal muestran que posee poder analgésico, antiinflamatorio
(oral) y antibacteriano (Vogel, 2013). Otros reportes de la literatura demuestran que es un producto
natural que ayuda a restaurar el peristaltismo intestinal, dolor reumático, la osteoartritis y la
osteoartrosis en edad adulta (Maciel, et al., 2006).

3.6.5 Quimiotaxonomía de la especie Arnica montana L

Su flor es muy rica en carotenoides, arnicina, saponina, esteroles, isoquercitina. Por su parte, el
rizoma es rico en aceite esencial al 6,3 %, resina y taninos, también posee lactosas sesquiterpénicas
(0,2 a 0,8 %) del grupo del pseudoguayanólido, principalmente del grupo de la helenalina y la 11
alfa y 13 dihidrohelenalina y sus ésteres (ácido acético, isobutírico, 2-metilbutanoico, isovalérico,
alfa-metacrílico y tíglico), flavonoides (0,4 a 0,6 %) isoquercitina, astragalina, 7-0-glucosil-
luteolina y otros (Da Silva et al, 2010).

3.7 Métodos de extracción.

Los metabolitos presentes en las especies vegetales se pueden extraer mediante diferentes métodos
como lo son: el prensado, la destilación con vapor de agua, extracción con disolventes volátiles y
con fluidos supercríticos. A continuación se realizará una descripción de este último método, ya
que es el método de interés de ésta investigación.

22
3.7.1 FLUIDOS SUPERCRÍTICOS.

Al someter a un fluido a condiciones por encima de su presión y temperatura críticas, éste pasa a
su fase de fluido supercrítico. En dicha fase, las propiedades de las fases individuales líquido y gas
no están bien definidas, lo que implica la formación de una sola fase en la que el fluido tiene
propiedades intermedias entre las de un líquido y las de un gas: mientras se mantiene una gran
difusividad (propia de los gases), se consigue una alta densidad y viscosidad (cercana a la de los
líquidos) (Espinosa et al., 2014). El uso de fluidos supercríticos como disolventes para la extracción
de compuestos orgánicos, ha recibido mucha atención en los últimos años debido a que ofrece
disminución en el tiempo de extracción (comparado con otras técnicas de extracción) y la
utilización de disolventes líquidos en menor cantidad. Los fluidos supercríticos más utilizados se
pueden observar en el Cuadro 3.7-. El dióxido de carbono es el fluido supercrítico (CO2 -SF) más
utilizado debido a que no es tóxico, inflamable o corrosivo, es incoloro, de bajo costo, se elimina
fácilmente y no deja residuos; sus condiciones críticas son relativamente fáciles de alcanzar y se
consigue con diferentes grados de pureza; es posible trabajar con él a una temperatura no muy
elevada y por tanto, se pueden extraer compuestos con algo de polaridad; se puede obtener a partir
de procesos de fermentación alcohólica y ayuda a prevenir la degradación térmica de ciertos
componentes químicos del alimento cuando son extraídos (K.M. Sharif et al., 2015).
Tabla 3.7-1 Fluidos supercríticos y propiedades. Tomado y modificado de (Bruner, 2005)

Existen dos tipos de SFE: uno a presión controlada y otro a temperatura controlada; ambos
coexisten en una etapa de extracción y una etapa de separación. En el tipo de presión controlada,

23
el disolvente comprimido disuelve el soluto en un recipiente de extracción. Luego la solución es
expandida en la etapa de separación para precipitar el extracto y finalmente el disolvente es
comprimido para ser reciclado. El tipo de temperatura controlada, se diferencia del anterior en la
etapa de separación ya que en ésta el extracto es precipitado calentando la solución para disminuir
la densidad del disolvente. Ésta última se aumenta luego para reciclar mediante enfriamiento
isobárico, es decir, a presión constante. Éste tipo de proceso es altamente eficiente desde el punto
de vista energético debido a que el calor se transfiere directamente entre las etapas de calentamiento
y enfriamiento y la proximidad de condiciones isobáricas minimiza la energía de compresión
(Valcarcel et al., 1993).
La SFE presenta ventajas en procesos de extracción en comparación con disolventes
convencionales, ya que al tener propiedades disolventes similares a las de un líquido y de transporte
parecidas a las de un gas, se facilita su penetración en la matriz sólida, lo cual conduce a una mejor
separación del soluto.
Algunas aplicaciones comerciales de la extracción con los SCF en la agroindustria agroalimentaria
son: el fraccionamiento y la extracción de aceites y grasas, la extracción de antioxidantes naturales,
la extracción de alcaloides, aromas y especias. Se describen a continuación éstas aplicaciones y los
procesos típicos que se llevan a cabo.
Según la tabla 3.7-1 sin duda el fluido más utilizado, tanto a nivel de investigación como en
aplicaciones industriales, es el CO2. Se trata de un gas inocuo, abundante y barato, cuyas
condiciones críticas son relativamente bajas (31ºC, 73 atm) y por tanto fáciles de operar. La
extracción con CO2-SF resulta una alternativa interesante para el resultado de la extracción y
fraccionamiento de aceites vegetales, porque no posee los inconvenientes de los disolventes
orgánicos tradicionales, tal como se mencionó anteriormente, además de su capacidad selectiva
para extraer ciertas sustancias al realizar pequeños cambios de presión y temperatura. Existen
estudios que demuestran que el uso de CO2-SF conlleva a disminuir el consumo de energía con
respecto a procesos de separación convencionales como destilación y lixiviación, entre otros (Tilly
et al, 1990).
En el uso de CO2-SF como disolvente para la extracción de antioxidantes se han obtenido buenos
resultados. Claros ejemplos de ésto es la extracción que se le ha realizado a las semillas del cilantro
y a los residuos de la mora provenientes de la producción de jugos y de pulpa de mora , donde se
demostró efectividad de la extracción de los compuestos y actividad antioxidante presentes en los

24
residuos de la producción de jugo de mora (Florez & Forero, 2007). El método de SCF presenta
varias ventajas como alto rendimiento, compatibilidad ecológica, fácil eliminación del disolvente
e inclusive posibilidad de ser reciclado y las bajas temperaturas utilizadas para la extracción que
no cambian químicamente los componentes de la esencia. Sin embargo, el equipo requerido es
relativamente costoso ya que se necesitan bombas de alta presión y sistemas de extracción también
resistentes a las altas presiones (Bandoni, 2000).

3.7.1.1 Ventajas y desventajas del proceso

Dentro de las ventajas están: tiempo de extracción reducido, se obtienen mayores rendimientos en
la purificación, concentración y separación de mezclas complejas, aumento de la pureza del
extracto, es posible seleccionar sustancias y composición del extracto al variar los parámetros de
extracción y se requiere menos energía, homogeneidad de las fases. La principal desventaja es que
mediante SFE los compuestos de alto peso molecular y las ceras son extraídas junto al aceite
esencial, además se presenta una pérdida de compuestos termolábiles. (Florez & Forero, 2007)

3.7.2 Extracción líquido – líquido (L/L)

La extracción líquido-líquido es un método que se utiliza para separar los componentes de una
matriz líquida utilizando un disolvente extractor que no sea miscible con dicha matriz. El éxito de
este método depende principalmente de la diferencia de solubilidad del compuesto a extraer en dos
disolventes diferentes e inmiscibles -es decir, depende del coeficiente de reparto-, lo que permite
en algunos casos eliminar excesos de reactivos utilizados, así como de algunas impurezas propias
de la muestra. Es una técnica muy utilizada para la obtención de compuestos orgánicos que se
encuentran en fuentes naturales. Éste tipo de técnica se lleva a cabo usando de una fase acuosa
como: agua, cloruro de sodio en solución saturada, disoluciones acuosas ácidas, disoluciones
acuosas básicas, disoluciones acuosas de bisulfito de sodio y una fase orgánica, de modo que
generalmente el compuesto deseado suele extraerse a la fase orgánica dejando muchas de las
impurezas como los reactivos inorgánicos u orgánicos polares en la fase acuosa. Generalmente, el
compuesto orgánico deseado no suele obtenerse puro, salvo casos excepcionales, pero es un primer
paso de purificación que permite eliminar muchas de las impurezas que contiene una matriz cruda,
como un extracto líquido (Marcilla, 1999).

25
3.7.3 Extracción sólido – líquido (S/L)

Ésta extracción es una operación básica que tiene un amplio uso en el ámbito industrial, abarcando
desde la metalurgia hasta la obtención de aceites esenciales a partir de semillas. Ésta técnica puede
ser usada en forma continua o discontinua, y sirve para separar varios constituyentes solubles que
se encuentran contenidos en un sólido inerte mediante la utilización de un disolvente adecuado. En
un proceso de extracción S/L las operaciones implicadas son:
● Cambio de fase del soluto. Etapa considerada prácticamente instantánea.
● Difusión del soluto a través del disolvente contenido en los poros del sólido inerte.
● Transferencia del soluto desde las inmediaciones de la interfase S/L hasta el seno de la masa
principal de disolvente. (Marcilla, 1999)

3.7.4 Métodos de extracción con disolventes

3.7.4.1 Extracción con disolventes volátiles

En este método, la muestra seca y molida se pone en contacto con disolventes tales como alcohol,
cloroformo, etc. Los disolventes solubilizan aceites esenciales, pero también solubilizan y extraen
otras sustancias tales como grasas y ceras, obteniéndose al final un extracto de composición
compleja. Se utiliza a escala de laboratorio a nivel industrial debido a que resulta costoso por el
valor comercial de los disolventes, pues se obtienen esencias mezcladas con otras sustancias, y
además por el riesgo de explosión e incendio característicos de muchos disolventes orgánicos
volátiles. Los extractos obtenidos por este método son más oscuros ya que se llega a arrastrar otro
tipo de pigmentos (Martínez, 2003).

3.8 ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

En la literatura se encuentra ampliamente referenciada la necesidad de utilizar varios métodos para

evaluar la actividad antioxidante en extractos vegetales, los cuales se basan en su capacidad para
captar radicales libres; entre ellos se pueden mencionar el uso del 2,2-difenil- 1-picril hidrailo
(DPPH), ácido 2,2´-azino-bis(3-etilbenzotiazolin)-6- sulfónico (ABTS), la reacción con el óxido
nitroso (test NO), dicloridrato de N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD), poder de reducción del
ion férrico (FRAP) Ferric Reducing Antioxidant Power assay generación de radicales peroxilo,
superóxido e hidroxilo, y otros. Los antioxidantes pueden reaccionar en medios diferentes,
dependiendo del tipo de reacción o de la fuente de radicales libres (Montoya, 2003). Estos métodos

26
presentan condiciones de reacción y solubilidad diferentes. Con los métodos propuestos se buscó
alcanzar un amplio rango del perfil metabólico de las especies Arnica montana L y Plantago major

3.8.1 Los antioxidantes

Cardoso (2005) define un antioxidante como una sustancia que encontrándose a bajas
concentraciones respecto a la de un sustrato oxidable, actúa antes o durante una reacción en cadena
de los radicales libres, ya sea en la etapa de iniciación, propagación, terminación, descomposición
o en la subsecuente oxidación de los productos. Los antioxidantes que se encuentran naturalmente
en el organismo y en ciertos alimentos; previenen el daño derivado del estrés oxidativo generado
por diferentes sustancias que ingresan al cuerpo liberando radicales libres que afectan el
comportamiento celular. Son sustancias que tienen la capacidad de inhibir la oxidación causada
por los radicales libres, actuando algunos a nivel intracelular y otros en la membrana de las células,
siempre en conjunto para proteger a los diferentes órganos y sistemas. En los últimos años el interés
por los antioxidantes naturales se ha incrementado notoriamente, debido principalmente a tres
razones: 1) la baja seguridad que ofrece el consumo de antioxidantes sintéticos, 2) la eficacia
antioxidante de una variedad de agentes fitoquímicos, y 3) la idea generalizada de que el consumo
de ciertos agentes fitoquímicos pueden afectar de manera positiva la patología de las enfermedades
crónicas y el proceso de envejecimiento; además, la creencia de que los compuestos naturales son
innatamente más seguros que los compuestos sintéticos y por consiguiente son comercialmente
más aceptados (Dorman et al., 2004).

3.8.1.1 Antioxidantes primarios

Los antioxidantes primarios son aquellos que previenen la formación de nuevas “Especies
Reactivas de Oxígeno” (ERO) y las transforman en otras menos perjudiciales antes de que
reaccionen. En éste grupo se destacan las enzimas superóxido dismutasa (SOD), glutatión
peroxidasa (GPX), ferritina, ceruloplasmina de tipo ferroxidasa y catalasa (Katalinic et al., 2005).

3.8.1.2 Antioxidantes secundarios

Capturan los radicales y evitan las reacciones en cadena. Algunos ejemplos de ellos son la vitamina
E y C, β-caroteno y sustancias endógenas con capacidad antioxidante, entre las que se encuentran
el glutatión urato, bilirrubina, ubiquinona, albúmina y ácido úrico; las estructuras de algunas de
ellas se ilustran en la figura 3.8.1.2-1 (Doria et al., 2012).

27
 Figura 3.8.1.2-1 Estructuras correspondientes a los antioxidantes secundarios de los
mecanismos de defensa en el organismo humano. Tomado y modificado de: (Doria et al, 2012)

3.8.1.3 Antioxidantes terciarios

Los antioxidantes terciarios son los encargados de la reparación de las biomoléculas dañadas. Se
incluyen las enzimas endonucleasa apurinica/apirimidínica y polimerasa β, reparadoras del ADN
y la metionina sulfóxido redutasa (Page et al., 2009).

3.8.2 Método DPPH (2,2- difenil-1-picrilhidrazilo)

El ensayo del método DPPH• (2,2-difenil-1-picril-hidrazilo) fue enunciado por primera vez por el
científico Blois M.S. (1958) quien dio a conocer la capacidad que posee el radical libre DPPH•
para aceptar un átomo de hidrógeno (H) que provenía de una molécula de cisteína. La molécula
DPPH hace referencia a un radical libre (Ver Figura 3.8.2-1) estable, relacionado con la
deslocalización de un electrón no apareado sobre la molécula completa, por lo cual la molécula no
se dimeriza, como es el caso de la mayoría de los radicales libres. La deslocalización del electrón

28
también intensifica el color violeta intenso típico del radical, el cual absorbe en metanol a 517 nm.
Cuando la solución de DPPH• reacciona con el sustrato antioxidante que puede donar un átomo de
hidrógeno, el color violeta se desvanece. El cambio de color es monitoreado
espectrofotométricamente y es utilizado para la determinación de la propiedad antioxidante.
Después de aproximadamente tres décadas éste ensayo comenzó a utilizarse rutinariamente para la
caracterización de las propiedades antioxidantes. El procedimiento original para el ensayo DPPH•
ha sido adaptado por muchos laboratorios, y a pesar de que existan modificaciones a conveniencia,
una revisión detallada de la literatura ha revelado que la mayoría de los estudios están basados en
un tiempo de reacción de 20-30 minutos en lugar de un tiempo de reacción total de 120 minutos
requerido para alcanzar el estado estacionario y completar la reacción redox (Ojha et al., 2012).

Figura 3.8.2-1 Estructura química del radical libre metaestable DPPH.

Tomado y modificado (Alam et al., 2012)

Éste ensayo fue propuesto originalmente por Brand–Williams (1995). El DPPH• es uno de los
pocos radicales orgánicos estable. Presenta una fuerte coloración violeta y es comercialmente
disponible y no tiene que ser generado in situ como el ABTS•+. El ensayo se fundamenta en la
medición de la capacidad de un antioxidante para estabilizar el radical DPPH•. La medición puede
hacerse espectrofotométricamente siguiendo el decaimiento de la absorbancia a 517 nm. Los
resultados se suelen expresar como IC50, es decir, la concentración de antioxidante necesaria para
estabilizar un 50 % de la cantidad original de DPPH•. (Brand-Williams, 1995)

3.8.3 Método DMPD (dicloridrato de N,N-Dimetil-p-fenilendiamina)

Es un método con un mecanismo de transferencia de electrones (SET) parecido al del método

ABTS que emplea la N,N-dimetil-p-fenilendiamina (DMPD) (Huang et al., 2005). El protocolo
experimental es rápido, económico, asegura la sensibilidad y reproducibilidad en la cuantificación

29
de la actividad antioxidante de compuestos hidrofílicos (Corral-Aguayo et al., 2008), aunque
existen reportes de que también es eficaz para evaluar los liposolubles (Rodríguez- Nogales et al.,
2011). La eficacia de método DMPD en alimentos fue evaluada inicialmente en muestras de vino
italiano ya que la capacidad antioxidante (CA) de esta bebida proviene exclusivamente de la
cantidad de compuestos fenólicos presentes (Fogliano et al., 1999). Con éste método ha sido
evaluada la CA de extractos lipofílicos e hidrofílicos de vinos tintos, frutas, hortalizas, cereales,
leguminosas (Rivero-Pérez et al., 2007; Corral-Aguayo et al., 2008; Rodríguez-Nogales et al.,
2011), de extractos de plantas medicinales (Tripathi et al., 2007 ; Dorman et al., 2011), de
moléculas con actividad fisiológica y antioxidante como la melatonina, serotonina, resveratrol,
curcumina y de estructuras no comestibles como tallos, hojas y partes aéreas de cultivos
alimentarios (Gulpinar et al., 2012).

3.8.4 Método FRAP (Ferric Reducing Antioxidant Power assay), o CRHF (Capacidad para
Reducir el Hierro Férrico)

En éste método se determina la capacidad antioxidante de forma indirecta. Se basa en el poder que
tiene una sustancia antioxidante para reducir el Fe3+ a Fe2+ (Bursal et al., 2011). El complejo
férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro es transformado al complejo ferroso-2,4,6-
tripiridil-s-triazina, de color azul (Ver Figura 3.8.4-1). Se trata de un método espectrofotométrico
en el que se mide la absorbancia del complejo ferroso. Así, cuanto más antioxidante es la sustancia
objeto de estudio, mayor es la reducción y la concentración de Fe2+ y por ende más alta la señal de
absorbancia. El complejo va a poder ser reducido por productos con potenciales redox menores a
0,7 V (potencial redox del Fe3+-TPTZ) (Benzie et al., 1996).
Debido a que el potencial redox del Fe3+-TPTZ es comparable con el del ABTS se pueden analizar
compuestos similares con ambos métodos aunque las condiciones de la reacción sean distintas. El
mecanismo del FRAP es de transferencia de electrones, a diferencia de otros métodos donde se
produce captura de radicales libres; según esto, el FRAP puede ser útil, en combinación con otros
métodos, en la determinación de la capacidad antioxidante de productos que contengan distintos
tipos de antioxidantes. (Floegel et al., 2011).

30
 Figura 3.8.4-1 Fundamento del método FRAP, mostrando la reducción de 2,4,6-Tripiridil-
Triazina Férrica (TPTZ).
Modificado de : (http://repository.lasallista.edu.co/)

3.8.5 Método ABTS (azinobis 3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico)

Éste método fue reportado inicialmente por Miller y colaboradores (1993), y se fundamenta en la
capacidad de un antioxidante para estabilizar el radical catión coloreado ABTS•+, el cual es
formado previamente por la oxidación del ABTS (2,2´-azinobis (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-
sulfónico)) (Ver Figura 3.8.5-1) por metamioglobina y peróxido de hidrógeno. Los resultados son
expresados como equivalentes de Trolox o TEAC (por su nombre en inglés, Trolox Equivalent
Antioxidant Capacity). Entre las ventajas de este método está que los valores de TEAC de una
amplia gama de alimentos están reportados (Benzie, 1999) lo que permite establecer
comparaciones; adicionalmente puede ser usado en un amplio rango de pH y fuerza iónica,
sabiendo que el ABTS•+ es soluble tanto en medio acuoso como orgánico y permite la evaluación
de antioxidantes hidrofílicos y lipofílicos. Entre las desventajas están que el ABTS•+ debe ser
generado previamente, que no es un radical fisiológico y que la cinética de reacción con algunos
antioxidantes suele ser bastante lenta y, por lo tanto, el punto final de medición debe fijarse de
manera arbitraria.

Figura 3.8.5-1 Estructura química del ABTS.

Tomado y modificado de: (http://repository.lasallista.edu.co/)

31
3.9 CROMATOGRAFÍA DE GASES (GC-MS).

La cromatografía de gases es una técnica analítica que permite separar mezclas de sustancias puras
termoestables fácilmente volátiles, logrando la separación, identificación y determinación de
sustancias con puntos de ebullición entre 250-400°C. Para la separación, la muestra se introduce al
sistema cromatográfico, en donde es arrastrada por una fase móvil (un gas) a través de una fase
estacionaria fijada a una columna. Los componentes en la mezcla interactúan con la fase
estacionaria en distinta magnitud, según su presión de vapor y la temperatura del sistema, lo que
afecta su movilidad de manera diferencial. Como consecuencia de la distinta movilidad, los
componentes de la muestra se separan en bandas que pueden identificarse tanto cualitativa como
determinarse cuantitativamente a cantidades muy pequeñas de muestra. Algunas ventajas son
como: sensibilidad, velocidad y sencillez (A Hites, 2002).
La espectrometría de masas (MS) es una técnica analítica que permite la separación de iones
gaseosos haciendo uso de campos eléctricos y magnéticos, donde los clasifica de acuerdo a la
relación masa- carga. La MS brinda información cualitativa y cuantitativa acerca de la composición
atómica y molecular de materiales inorgánicos y orgánicos (A Hites, 2002).
El acoplamiento GC-MS permite combinar de manera sinérgica la alta resolución cromatográfica
con las sensibilidad y selectividad de la espectrometría de masas, para detectar cantidades de
indicador dentro de mezclas de compuestos orgánicos complejos. Al acoplar estas dos técnicas
(GC-MS), se aprovecha la detección y cuantificación de compuestos volátiles en baja
concentración dentro de una matriz compleja, como es el caso de algunos metabolitos secundarios
presentes en un extracto vegetal (A Hites, 2002).

4. METODOLOGÍA

4.1 Revisión bibliográfica

En el proceso de construcción y culminación de este proyecto de investigación, se realiza una

búsqueda minuciosa en fuentes bibliográficas de carácter primario y secundario, que sirvan como
referentes a la investigación del proyecto. Estas fuentes son libros impresos, libros digitales,
artículos científicos publicados en revistas especializadas nacionales e internacionales.

32
4.2 Recolección de la muestra (especie vegetal Plantago major y Arnica montana L)

Los especímenes se recolectaron en el municipio de Zipaquirá en la vereda Río Frío, la

identificación taxonómica se realizó en el Instituto de Ciencias Naturales, Facultad de Ciencias,
Universidad Nacional de Colombia (Bogotá), donde se envió un ejemplar de cada una de las
especies vegetales para su caracterización (Ficha de Identificación COL-512 y COL-561). Las
hojas y flores que se recolectaron fueron separadas de sus tallos, se secaron en un ambiente bajo
techo, el cual se adecuo a condiciones normales, las muestras se pulverizaron en un molino para
su extracción.

4.3 Marcha fitoquímica preliminar

Para la realización de la marcha fitoquímica preliminar (Ver Figura 4.3-1) se preparó un extracto
etanólico por maceración en frío con 100 ml de etanol y 10 g del tejido vegetal seco de las hojas y
flores de las especies vegetales Arnica montana L, y Plantago major. A partir de este extracto
etanólico se efectuó las pruebas de identificación para los diferentes grupos de metabolitos
utilizando controles positivos para confirmar la existencia o no de metabolitos. El análisis es basado
en la guía preliminar de pruebas de la (Sanabria A.1983; Loock O, 2004.)

33
Figura 4.3-1 Metodología Marcha Fitoquímica Preliminar para las Hojas de las especies
Plantago major y Arnica montana L

34
4.4 Extracción con CO2 supercrítico (SFE)

Para la obtención de los extractos vegetales con CO2 supercríticos se empleó el equipo de
extracción SFT-110 situado en la universidad Militar Nueva Granada (Ver Figura 4.4-1), que
consta de un cilindro de dióxido de carbono CO2 donde es conectado mediante una válvula de
inyección a un recipiente de extracción de acero inoxidable, de 100 mL de capacidad, el cual es
cubierto por una placa térmica protectora que aísla y regula, la temperatura de extracción 80 °C,
además posee un recipiente recolector movible con el fin de ajustarlo según la cantidad de muestra
deseada, este es inyectado mediante dos válvulas que se describen a continuación: la primer
válvula sirve de escape para el CO2 que es controlado mediante un tubo medidor de flujo de gas,
la segunda válvula es la que inyecta el extracto obtenido al frasco recolector. Al lado derecho cuenta
con un horno regulador de temperatura que controla las condiciones generadas y deseadas.

Figura 4.4-1 Equipo de extracción por fluidos supercríticos SFT-110

Para llevar a cabo las extracciones por SFE en cada una de las muestras se utilizó el siguiente
protocolo: una vez cargada y encapsulada la muestra totalmente pulverizada o triturada en el
recipiente extractor, este se saturó con CO2 supercrítico; las condiciones operativas fueron una
presión de 2000 psi y una temperatura de extracción 80 °C, dichas condiciones fueron mantenidas

35
durante el tiempo de proceso planteado (cinco ciclos, que consisten de 15 minutos de maceración
y 15 minutos de extracción), y el extracto recolectado y posteriormente conservado a -20 °C antes
de su preparación para los ensayos de actividad antioxidante.

4.5 Evaluación De la Actividad Antioxidante

4.5.1 Capacidad captadora del radical DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidrazilo)

Este método, desarrollado por (Brand-Williams, 1995), se basa en la disminución de la absorbancia

medida a 515 nm del radical DPPH, por antioxidantes. Con modificaciones el método descrito por
(Kim, 2002), se basó en la medida de la absorbancia del radical DPPH• 10 mM disuelto en EtOH
absoluto, a una longitud de onda de 515 nm, siendo previamente expuesto a un extracto vegetal.
Se añadieron 10 𝜇𝐿 de la muestra problema en concentraciones variables en el rango (31,3 - 1000
ppm) disuelta en EtOH, realizado por triplicado en una microplaca, la mezcla se homogeneizó
cuidadosamente, y se mantuvo en la oscuridad durante 60 minutos.

Como control negativo se tomó una solución de 10 mM de DPPH sin diluir, siguiendo el mismo
protocolo usado para los extractos. Además se medio el control fotométrico tomado de 200𝜇𝐿 de
EtOH (es decir, sin presencia de extracto ni de reactivo DPPH) para descartar la absorbancia de
este disolvente en las mediciones. Se calculó el porcentaje de la población de radicales DPPH•
inhibidos en el medio de reacción tomando como referencia el valor de absorbancia del control
negativo, según la ecuación:

01223 4566789:5 ;0<=>,4566789:5

% 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑜𝑥𝑖𝑑𝑎𝑛𝑡𝑒 = *100
01223 4566789:5

Donde: 𝑨𝑫𝑷𝑷𝑯 𝒄𝒐𝒓𝒓𝒆𝒈𝒊𝒅𝒐 =𝐴LMMN − 𝐴PQRN y 𝑨𝑬𝒙𝒕 𝒄𝒐𝒓𝒓𝒆𝒈𝒊𝒅𝒐 = 𝐴PVQ − 𝐴PQRN

Figura 4.5.1-1 Ecuación para calcular el porcentaje de actividad antioxidante de los

extractos para el ensayo DPPH.

36
4.5.2 Capacidad reductora de ion férrico FRAP.

Para la preparación de 25 mL reactivo FRAP se realizó una mezcla de 20,83 mL de una solución
buffer fosfato pH 3,6 con 2,08 mL de una solución de FeCl3 y 2,08 mL de una solución de TPTZ
(férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina), dejándola incubar por 30 minutos a una temperatura de 40 °C.
Una vez incubada esta solución, se utilizó para evaluar la actividad antioxidante de los extractos
de acuerdo al siguiente protocolo: a 10 𝜇𝐿 de extracto disuelto en EtOH (concentraciones variables
en el rango 31,3 - 1000 ppm) se añadieron 190 𝜇𝐿del reactivo FRAP (por triplicado), y se dejó
incubar la mezcla por 30 minutos a 40 °C en ausencia de luz; al finalizar dicho tiempo se midió la
absorbancia de cada una de las muestras a 593 nm , usando como blanco una dilución del reactivo
de FRAP con EtOH.

4.6 Perfilado de los extractos SFE por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de
masas (GC-MS).

Se analizaron los extractos obtenidos por SFE por medio de GC-MS, a fin de separar e identificar
-de manera tentativa los compuestos presentes en cada una de las muestras obtenidas. Se utilizó un
cromatógrafo de gases Trace 1300 acoplado a un detector de espectrometría de masas (MSD) con
analizador de cuadrupolo simple ISQ LT (ambos de Thermo Scientific), y la columna empleada
fue una Rxi® 5Sil MS (de Restek), de composición 5 % difenil/ 95 % dimetilpolisiloxano, con
dimensiones L= 60 m, di = 0,25 mm, df = 0,25 µm, Las condiciones operativas empleadas fueron
las siguientes: concentración del extracto 1 mg/mL. disuelto en diclorometano; inyector:
split/splitless; modo de inyección: split; volumen de inyección: 1 µL; gradiente de temperatura del
cromatógrafo: inicio 40 °C sostenida durante 1 minuto, primera rampa a 12 °C/min hasta 150 °C,
150 °C sostenida durante 3 minutos, segunda rampa a 10 °C/min hasta 290 °C, y 290 °C sostenida
durante 15 minutos; modo de ionización: impacto electrónico (EI); modo de detección: scan; rango
de detección: 50 - 800 u.m.a. Este procedimiento fue aplicado a todos los extractos obtenidos por
SFE.

37
 5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

5.1 ANÁLISIS FITOQUÍMICO PRELIMINAR.

5.1.1 Obtención del extracto etanólico.

A 100 g del material vegetal seco al ambiente y molido, cada uno de los órganos a estudiar flores
y hojas fueron sometidos conjuntamente a maceración, en un balón de fondo plano por un tiempo
de 48 horas, utilizando como disolvente de extracción etanol absoluto, en cantidad suficiente para
cubrir el material vegetal de cada una de las especies a estudiar. Posteriormente se llevó a reflujo
por una hora, se dejó enfriar a temperatura ambiente y se filtró y concentró para eliminar el
disolvente y proceder a realizar las pruebas para cada uno de los metabolitos en la tabla 5.1.1-1 se
muestra los controles positivos que se tuvieron en cuenta para realizar las pruebas de tubo que
permitió la caracterización de los compuestos presentes en la muestra.

Tabla 5.1.1-1 Controles positivos para la identificación de los metabolitos

secundarios de las dos especies vegetales en estudio
PRUEBA
METABOLITO CONTROL POSITIVO RESULTADO
QUÍMICA
Liebermann-
+
Burchard
Vainillina –
Esteroides Lupeol Ácido +
sulfúrico
Cloruro de
+
zinc
Vapores de
+
amoniaco
Flavonoides Quercetina
Cloruro
+
férrico
Cloruro
Quinonas Antrona +
férrico
Cloruro
+
férrico
Fenoles Ácido tánico Vainillina-
Ácido +
clorhídrico
Cloruro
Cumarinas 7-hidroxicumarina +
férrico

38
5.1.2 Alcaloides

La mayoría de los alcaloides se extraen de diferentes y variados métodos, sobre todo a través de la
purificación de medios con fluidos supercríticos, con excepción de los alcaloides de amonio
cuaternario y N-óxidos de amina, son solubles en disolventes orgánicos poco polares, como
cloroformo y mezclas de éste, pero pueden formar sales solubles en agua en presencia de ácidos
minerales diluidos, como el ácido clorhídrico al 5% en agua. Esta propiedad ácido-base se
aprovechó para su purificación a partir de extractos totales. Luego de este paso inicial se realizaron
pruebas de precipitación en medio ácido, utilizando para ello sales de metales pesados como el
yoduro de potasio (reactivo de Dragendorff), yoduro de potasio y mercurio (reactivo de Mayer) y
yoduro de plata y potasio (reactivo de valser), entre otros. En las tablas (5.1.2-1 y 5.1.2-2) se
muestra los diferentes resultados positivos para alcaloides en las muestras evaluadas.

Tabla 5.1.2-1 Análisis de alcaloides presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica

montana L
Positivo +
ANÁLISIS DE ALCALOIDES MUESTRA N° 1 Arnica montana L
Negativo -

Drangerdorf Se evidencia un precipitado de color marrón. +++

Se observó una solución homogénea de una tonalidad clara con ausencia de

Mayer -
precipitado de color marrón.

Valser Tonalidad marrón claro con precipitado. ++

Wagner se evidencio un precipitado de color naranja. +++

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

39
 Tabla 5.1.2-2 Análisis de alcaloides presentes en la muestra vegetal Plantago major

Positivo +
ANÁLISIS DE ALCALOIDES MUESTRA N° 2 Plantago major.
Negativo -

Drangerdorf No presentó cambios en la reacción. -

Mayer Se observó una sobrenadante con precipitado de color café. ++

Se evidencio una suspensión de color café con precipitado de color marrón

Valser +++
oscuro

Wagner Se evidencio una suspensión de color rojo con un precipitado de color café +++

*cada ensayo se realizó por triplicad + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

5.1.3 Flavonoides

Para su determinación se empleó principalmente la reacción de la cianidina, conocida también

como reacción de Shinoda. Para ello el extracto etanólico seco se extrajo con una solución etanólica
en agua (1:7) y se filtró. Este filtrado -denominado “A”-, se puso en un tubo de ensayo con 0,5 g
de magnesio en polvo. Seguidamente se añadió HCl concentrado, gota a gota, hasta el
desprendimiento de hidrógeno, Si en estas condiciones se observa la aparición de coloración rojiza,
violeta o naranja, se considera positivo para compuestos con el núcleo de la γ-benzopirona
(flavonas, flavonoles, flavanonas, flavanonoles, isoflavonoides y xantonas). También existe otro
tipo de flavonoides denominados leucoantocianidinas como se puede evidenciar en las tablas
(5.1.3-1 y 5.1.3-2), las cuales por cambio en el pH se tornan de incoloras a intensamente coloreadas
de rojo. Para detectar la presencia de este tipo de compuestos en la muestra, el filtrado “A” fue
transferido a un tubo de ensayo, se añadió HCl concentrado y se sometió a calentamiento en un
baño maría hirviendo durante 10-15 min. La aparición de coloración rojiza bajo estas condiciones
indica la presencia de leucoantocianidinas.

40
 Tabla 5.1.3-1 Análisis de flavonoides presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica
montana L.
Positivo +
ANÁLISIS DE FLAVONOIDES MUESTRA N° 1 Arnica montana L
Negativo -

Shinoda Presentó una coloración rosada clara. (flavononas) +++

Rosenheim Se observó una fase amílica de color rojizo. ++

Leucoantocianoidinas No presentó cambios. -

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

Tabla 5.1.3-2 Análisis de flavonoides presentes en la muestra de la especie vegetal Plantago

major.

Positivo +
ANÁLISIS DE FLAVONOIDES MUESTRA N° 2 Plantago major
Negativo -

Shinoda Presentó una coloración anaranjada fuerte (flavonas y flavonoles) +++

Rosenheim Se evidencio una fase amílica de color marrón ++

Leucoantocianoidinas Se observó un cambio de coloración rojo-rosado ++

*cada ensayo se realizó por triplicad + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

5.1.4 Taninos

Estos compuestos fenólicos tienen la propiedad de unirse a las proteínas y provocar su

precipitación. Por este motivo, la prueba más empleada para la detección de este grupo de
metabolitos secundarios emplea el reactivo de gelatina-sal, el cual produce un precipitado blanco

41
en presencia de taninos, luego de haber extraído el extracto etanólico total con una solución acuosa
de etanol (7:1). Estos precipitados -formados como consecuencia de la presencia de taninos- deben
ser solubles en urea 10 M y producir coloraciones verdes, azules o negras tras la adición de cloruro
férrico al 10% en agua; en las tablas 5.1.4-1 y 5.1.4-2 se reportan las tonalidades y precipitados
formados en estas reacciones.

Tabla 5.1.4-1 Análisis de taninos presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica

montana L.
Positivo +
ANÁLISIS DE TANINOS MUESTRA N° 1 Arnica montana L
Negativo -

Se observó una solución que presento cambio de color a una tonalidad azul
Tricloruro ferrico +++
(tres OH adyacentes)

Gelatina-Sal Se observó un precipitado de color blanco y turbidez ++

Acetato de plomo Formación de suspensión y precipitado de color verde claro +

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

Tabla 5.1.4-2 Análisis de taninos presentes en la muestra de la especie vegetal Plantago

major.
Positivo +
ANÁLISIS DE TANINOS MUESTRA N° 2 Plantago major
Negativo -

Tricloruro ferrico Presentó una coloración negra verdosa (dos OH adyacentes) +++

Gelatina-Sal Se evidencio un precipitado de color blanco +

Acetato de plomo Formación de sobrenadante y precipitado de color verde +++

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

5.1.5 Antraquinonas y Naftoquinonas.

Para la detección y observación de este tipo de metabolitos secundarios -cuyos resultados se

recogen en las tablas 5.1.5-1 y 5.1.5-2- se empleó la reacción de Bornträger-Kraus. Para ello, el

42
extracto etanólico seco fue extraído con una solución etanólica en agua (1:7), a la cual se le adicionó
H2O2 y H2SO4 y se procedió a calentar la mezcla a baño maría; bajo estas condiciones, se hidrolizan
los enlaces glicosídicos y se oxidan las antronas y los antranoles hasta antraquinonas, estas últimas
fueron extraídas con tolueno y agitadas en presencia de una solución de hidróxido de sodio al 5%
/hidróxido de amonio al 2%. Se detectó la presencia de nafto o antraquinonas, ya que al separarse
las fases, la capa alcalina (inferior) tornó a una coloración entre rosado a rojo intenso (esto depende
de la concentración de estos compuestos en cada una de las muestras).

Tabla 5.1.5-1 Análisis de Antraquinonas o naftoquinonas presentes en la muestra de la

especie vegetal Arnica montana L
Positivo +
ANÁLISIS DE MUESTRA NAFTOQUINONAS Y/O ANTRAQUINONAS N° 1 Arnica montana L
Negativo -

Bornträger-Kraus Presentó una coloración significativa de color rosada +++

Rodamina Cambio de color de fucsia a morado +++

Amoniaco Presenta un cambio de color de amarillo claro a verde encendido +++

Hidrosulfito de sodio Torna una coloración rojo encendido ++

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

Tabla 5.1.5-2 Análisis de Antraquinonas o naftoquinonas presentes en la muestra de la

especie vegetal Plantago major
Positivo +
ANÁLISIS DE MUESTRA NAFTOQUINONAS Y/O ANTRAQUINONAS N° 2 Plantago major
Negativo -

Bornträger-Kraus No presentó cambio en la coloración -

Rodamina Cambio de color de fucsia a morado +++

Amoniaco Presentó un cambio de color de amarillo claro a amarillo intenso +++

Hidrosulfito de sodio Se tornó una coloración rojo a naranja ++

Comportamiento ante
ácidos y donadores de No presenta cambios de coloración ya que la solución es de color amarilla -
electrones
*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

43
5.1.6 Saponinas

Son glicósidos oleosos cuya aglicona consiste en un núcleo esteroidal o triterpénico; esta
característica estructural les confiere un carácter anfótero y les permite actuar como tensoactivos.
Existen pruebas que aprovechan dichas propiedades, y entre dichos ensayos se encuentran: 1) La
reacción de Rosenthaler, en la cual la presencia de saponinas da positivo si se evidencia un cambio
de coloración al hacerse reaccionar con el extracto problema, y 2) la prueba de formación de
espuma, que consiste en agitar vigorosamente la solución acuosa (7:1) obtenida del extracto
etanólico total, en un tubo de ensayo y observar la espuma formada; esta debe ser estable en forma
de panal por lo menos 30 minutos para poder establecer la presencia de saponinas. Ambas pruebas
citadas se utilizaron para la detección de saponinas, cuyos resultados se encuentran en las tablas
5.1.6-1 y 5.1.6-2.

Tabla 5.1.6-1 Análisis de saponinas presentes en la muestra de la especie vegetal Arnica

montana L.

Positivo +
ANÁLISIS DE SAPONINAS MUESTRA N° 1 Arnica montana L
Negativo -

Se observa un panal de espuma que perdura por más

Formación de espuma +
de 10 minutos.

Rosenthaler No presenta ningún cambio en la coloración. -

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

Tabla 5.1.6-2 Análisis de saponinas presentes en la muestra de la especie vegetal Plantago

major.

Positivo +
ANÁLISIS DE SAPONINAS MUESTRA N° 2 Plantago major.
Negativo -

Se observó e identifico una espuma estable donde

Formación de espuma +
perdura por más de 15 minutos.

No se obtiene cambios en la interfase ni de

Rosenthaler -
coloración.
*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

44
5.1.7 Triterpenos, Esteroides y Carotenoides

Para su análisis preliminar la prueba más comúnmente usada es la de Liebermann-Burchard; para

realizar esta prueba, fue necesario hacer un procedimiento de separación previo en el cual se obtuvo
un extracto en éter de petróleo a partir del extracto etanólico seco, dicha fracción de éter de petróleo
se extrajo de nuevo con una mezcla de EtOH - agua 9:1, se recuperó la capa superior y se sometió
a diferentes pruebas de tubo.

Tabla 5.1.7-1 Análisis de Triterpenos, Esteroides y Carotenoides presentes en la muestra de

la especie vegetal Arnica montana L.

ANÁLISIS DE TRITERPENOS, ESTEROIDES Y CAROTENOIDES Positivo +

MUESTRA N° 1 Arnica montana L.
Negativo -

Se observó una tonalidad rojo con rosado en la

Liebermann- Buchard ++
interfase. (grupo triterpeno)

Se evidencio una coloración verde-azul que al pasar

Dienos homonucleares ++
el tiempo se torna en café oscuro.

Carotenoides Se observó en la interfase una tonalidad verde – azul. +++

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

Tabla 5.1.7-2 Análisis de Triterpenos, Esteroides y Carotenoides presentes en la muestra de

la especie vegetal Plantago major.

ANÁLISIS DE TRITERPENOS, ESTEROIDES Y CAROTENOIDES Positivo +

MUESTRA N° 2 Plantago major.
Negativo -
Aparición de coloración azul-verdosa. (grupo
Liebermann- Buchard +++
esteroide)

Dienos homonucleares Se evidenció una aparición de color azul-verdosa. +++

Carotenoides Se observó en la interfase una coloración verde. ++

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

5.1.8 Cumarinas

Son compuestos derivados de la α- benzopirona; dado que en su estructura presentan un gran

número de insaturaciones, ciertos precipitados de estos compuestos exhiben una fuerte

45
fluorescencia azul o verde al ser irradiados con luz ultravioleta. Haciendo uso de esta propiedad se
practicaron dos reacciones de precipitación de rutina que se aprovechan para su detección.
Adicionalmente, puesto que todas las cumarinas poseen en su estructura una γ-lactona, pueden
identificarse mediante las reacciones propias para lactonas. Los resultados de la detección de
cumarinas se presentan en las tablas 5.1.8-1 y 5.1.8-2.

Tabla 5.1.8-1 Análisis de cumarinas presentes en la muestra vegetal Arnica montana L.

Positivo +
ANÁLISIS DE CUMARINAS MUESTRA N° 1 Arnica montana L
Negativo -

Hidroxamato férrico Se observó una coloración verde. -

Erlich Se evidenció una solución de color anaranjada. ++

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

Tabla 5.1.8-2 Análisis de cumarinas presentes en la muestra vegetal Plantago major.

Positivo +
ANÁLISIS DE CUMARINAS MUESTRA N° 2 Plantago major
Negativo -

Hidroxamato ferrico Se observó en la interfase una coloración verde. -

Erlich No presentó cambios en la coloración. -

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

5.1.9 Glucósidos cardiotónicos

Estos compuestos poseen características estructurales similares a las de las saponinas, con una
estructura compuesta por un núcleo esteroidal glicosilado (2 desoxiazúcares) y una lactona
insaturada de 5 o 6 miembros. Para la detección de éstos pueden emplearse pruebas en tubo de
ensayo específicas para cada una de las partes que componen la molécula, o técnicas
cromatográficas. En el presente análisis fitoquímico preliminar se emplearon pruebas de tubo y sus
resultados están plasmados en las tablas 5.1.9-1 y 5.1.9-2.

46
 Tabla 5.1.9-1 Análisis de glucósidos cardiotónicos presentes en la muestra vegetal Arnica
montana L.

ANÁLISIS DE GLICÓSIDOS CARDIOTÓNICOS MUESTRA N° 1 Arnica Positivo +

montana L
Negativo -

Baljet Se observó una solución coloración rojiza. +++

Antrona Se observó una coloración azul- verdosa. ++

Tollens Se observó la formación del anillo de la plata. +++

Mollish Se observó una coloración vino tinto en la interfase. ++

*cada ensayo se realizó por triplicad + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

Tabla 5.1.9-2 Análisis de glucósidos cardiotónicos presentes en la muestra vegetal Plantago

major.

ANÁLISIS DE GLICÓSIDOS CARDIOTÓNICOS MUESTRA N° 2 Positivo +

Plantago major Negativo -

Baljet Se observó un precipitado rojo – naranja ++

Antrona Se observó una coloración azul- verdosa ++

Tollens Se observó la formación del anillo de la plata +++

Mollish Se observa una coloración verde azul en la interfase ++

*cada ensayo se realizó por triplicado + Presencia escasa, ++ presencia relativamente abundante, +++ presencia abundante, - no detectado

Los resultados de los análisis cualitativos permitieron encontrar la presencia de compuestos

fenólicos (taninos y flavonoides), carotenoides naftoquinonas y antraquinonas, glúcidos y terpenos
en hojas y flores de las especies vegetales Arnica montana L y Plantago major, lo cual dieron una
idea clara de los principales metabolitos secundarios presentes en estas especies vegetales, que
sirvieron como base para realizar el estudio biológico. Por lo tanto se considera que estas especies
vegetales contienen compuestos con potencial actividad biológica, teniendo en cuenta que la
literatura ha reportado una amplia información acerca de la capacidad antioxidante de estos grupos
de compuestos y de los extractos obtenidos de las especies investigadas en este trabajo.

47
5.2 Extracción con CO2 supercrítico de las especies vegetales Arnica montana L y Plantago
major.

En la tabla 5.2-1 se registra el rendimiento de la extracción de cada una de las muestras (hojas y
flores) de las especies vegetales Arnica montana L y Plantago major en estado seco y fresco, las
cantidades en gramos del material a extraer de cada espécimen es relativamente similar, donde se
obtuvo el mayor rendimiento en estado seco para la especie Arnica montana L, ya que se obtuvieron
68,9 mg de peso seco, equivalente al 3,10 mg/g, a partir de 22,2 g de hojas y flores, seguido del
rendimiento que obtuvo la especie Plantago major en seco donde se obtuvo 24,9 mg en peso seco,
equivalente a 1,41 mg/g, a partir de 17,6 g y en orden descendente se ubica el rendimiento que
obtuvo la especie Arnica montana L y Plantago major 1,30 y 0,66 mg/g respectivamente. Teniendo
en cuenta que las condiciones del procedimiento permiten extraer en su mayoría metabolitos
simples de baja polaridad y al estar seco el material vegetal presentaba un menor contenido de agua
en hojas y flores, y que el agua presente en una matriz sólida puede actuar a modo de barrera
durante una extracción con disolventes orgánicos bien sea por inmiscibilidad como por coeficiente
de reparto, se explicaría el mayor rendimiento de la extracción en las muestras secas, cuya
composición se encontraría enriquecida en compuestos de tipo apolar.

Tabla 5.2-1 Cantidad de muestra extraída con CO2-SF de las especies vegetales Plantago
major y Arnica montana.
Especie Vegetal Tipo Mat. vegetal a Extracto Rendimiento
extraer (g) obtenido (mg) mg/g

Arnica montana L Seca 22,2 68,9 3,10

Arnica montana L Fresca 35,2 45,8 1,30

Plantago major. Seca 17,6 24,9 1,41

Plantago major. Fresca 36,3 24,1 0,66

48
5.3 DETERMINACIÓN ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

5.3.1 Método DPPH.

5.3.1.1 Preparación de la solución de DPPH de trabajo

Para preparar la solución de DPPH adecuada para el ensayo se procedió a elaborar una curva de
calibración utilizando diluciones a partir de solución patrón Stock de DPPH 100 mM; dicha curva
se construyó con el fin de realizar una solución de trabajo que tuviera una absorbancia de a
aproximadamente 1 en la longitud de onda de 515 nm. De esta sección se obtuvieron los datos que
se relacionan en la Tabla 5.3.2-1.
Tabla 5.3.1-1 Absorbancia de distintas soluciones de DPPH a 515 nm, en función de su
concentración.
Concentración DPPH (mM) Absorbancia a 515 nm

0,05 0,392

0,1 0,733

0,125 0,879

0,15 1,045

Teniendo los datos obtenidos de las absorbancias de las distintas concentraciones a 515 nm se
realizó la gráfica (Ver Figura 5.31-1) a partir de la cual se determinaron la respectiva ecuación de
la recta y su correspondiente r2.

Figura 5.3.1-1 Curva de calibración de la solución Stock de DPPH 100 mM utilizada para la
preparación de la solución de trabajo.
49
5.3.1.2 Ecuación de la recta para el patron de Stock.

𝒀 = 𝟔, 𝟓𝟎𝟒 𝑿 + 𝟎, 𝟎𝟕𝟏𝟐 𝒓𝟐 = 𝟎. 𝟗𝟗𝟗𝟐𝟒

5.3.1.3 Extractos diluidos en EtOH.

Los rendimientos de la actividad antioxidante de este método en porcentaje de inhibición de los
extractos SFE de las especies vegetales Arnica montana L y Plantago major son reportados en la
tabla 5.3.1.3-1.

Tabla 5.3.1.3-1 Resultados de ensayo DPPH en porcentaje de población inhibida de cada

una de las muestras de Ext. vegetal a una concentración de 1000 ppm.
MUESTRA % DE POBLACIÓN
INHIBIDA

Arnica montana L * 2,00 ± 0,78

Arnica montana L ** 16,85 ± 0,70

Plantago major * 3,28 ± 1,02

Plantago major ** 16,46 ± 0,15

*Muestra seca. **Muestra fresca.

Según los reportes para la familia ASTERACEAE esta se caracteriza por poseer flavonoides,
alcaloides, terpenos, triterpenos y algunos ácidos grasos, a los cuales se les atribuye la actividad
antioxidante. El porcentaje de la actividad antioxidante por ensayo DPPH de los extractos vegetales
obtenido por SFE para la especie Arnica montana L en seco fue del 2,00 %, en comparación al
extracto obtenido del material fresco que fue del 16,85 %.

La familia PLANTAGINACEAE reporta en la literatura poseer metabolitos como: flavonoides,

ácidos cafeicos, alantoinas, plantagonina, ácido ursólico y pectinas que son los compuestos
responsables de las propiedades antioxidantes. El porcentaje de la actividad antioxidante que se
obtuvo de a partir de SFE del extracto vegetal plantago major en seco fue de 3,28 %, inferior en
comparación al valor obtenido para el extracto con material fresco que fue del 16,46%.

50
En la Figura 5.3.1.3-1 se puede observar la tendencia del poder antioxidativo con los porcentajes
de inhibición del radical DPPH que presentan los extractos en material fresco, ya que en ambas
situaciones fueron relativamente altos frente a los porcentajes de inhibición en los extractos
obtenidos a partir de material seco, esto se debe a la presencia de compuestos en los extractos con
capacidad de transferir hidrógenos con mayor facilidad; dicha actividad disminuye notablemente
de acuerdo a la presencia de metabolitos de poca polaridad.

Por otro lado, la presencia de color en los extractos debido a la oxidación de metabolitos
secundarios, provoca interferencias al momento de llevar a cabo la lectura del DPPH , esto puede
conducir a una disminución aparente porcentaje de población inhibida con el radical DPPH.

Figura 5.3.1.3-1 Porcentaje de actividad antioxidante mediante el método DPPH de la SFE

de las especies vegetales Arnica montana L y Plantago major (seca y fresca).

5.3.2 Metodo FRAP.

Los valores de FRAP se obtuvieron midiendo la absorbancia a 593 nm en mezclas de reacción de

ensayo que contenían los extractos disueltos en EtOH frente a iones ferrosos en concentración
conocida, y dichos resultados fueron calculados para ser expresados en eq- Trolox (mg Trolox/g
Ext) teniendo como base la curva de calibración de trolox. Para este fin, los datos de absorbancia
51
obtenidos al final del ensayo se interpolaron en la curva de calibración de trolox -para así calcular
la concentración equivalente en ppm- y dicho resultado se dividió entre la concentración del
extracto -expresado en g/L).

Figura 5.3.2-1 Curva de calibración de Trolox utilizada para la preparación de la solución

de trabajo.
Ecuación 𝑌 = 0,1071 𝑥 + 0.0325 y 𝑟 k = 0,9922
Tabla 5.3.2-1 Resultados de ensayo FRAP en eq-Trolox de cada una de las muestras de Ext.
vegetal a una concentración de 1000 ppm.
MUESTRA eq- Trolox (mg Trolox/g Ext)

Arnica montana L* 0,733 ± 0,089

Arnica montana L** 1,941 ± 0,273

Plantago major * 1,159 ± 0,087

Plantago major** 1,545 ± 0,121

*Muestra seca, **Muestra fresca,

De acuerdo a los resultados de la prueba FRAP realizada a los extractos SF de las especies Arnica
montana L y Plantago major. descritos en la tabla 5.3.2-1 se puede establecer que el extracto más
activo a reducir el ion férrico es el de la especie Arnica montana L fresca con un valor de 1,941 mg
Trolox/g Ext, seguido del extracto fresco de la especie Plantago major con un valor de 1,545 mg
Trolox/g Ext, y en orden descendente los extractos de las especies Plantago major y Arnica
montana L con un valor de 1,159 y 0,733 mg Trolox/g Ext respectivamente, del análisis estadístico,

52
se puede observar que existe una diferencia muy relativa de poder reductor entre los extractos
obtenidos (Ver Figura 6.3.2-1).

Figura 5.3.2-2 Porcentaje de en eq- Trolox mediante el método FRAP de la SFE de las
especies vegetales Arnica montana L y Plantago major (seco y fresco).

Los extractos SF de las especies Arnica montana L y Plantago major al presentar poder reductor,
consecuentemente tienen la capacidad de donar electrones al Fe3+ para convertirlo en Fe2+. En la
literatura se ha reportado que los extractos glicólicos, hidroglicólicos e hidroalcohólicos de las
flores de la especie Arnica montana L, presentan un poder de reducción FRAP gracias a los
flavonoides y sesquiterpenos presentes en estos extractos, en la cual ha obtenido un poder de
reducción 5,13 mg Trolox/ g Ext., comparando con el dato obtenido en la extracción con SF son
de 1,941 y 0,733 mg Trolox/g Ext para Arnica montana L fresca y seca respectivamente. Para los
extractos de la especie Plantago major existen referencias en la literatura que han reportado que el
poder reductor de los extractos SF (variabilidad de condiciones de presión y temperatura en el
método de extracción) hojas, donde obtuvieron un rendimiento máximo de 3,47 mg Trolox/g Ext
y un mínimo rendimiento de 2,074 mg Trolox/g Ext comparando con los datos obtenidos en la SFE
de la especie vegetal Plantago major en seco y fresco da un valor correspondiente a 1,159 y 1,545
mg Trolox/g Ext en la cual se evidencia la pérdida de algunos compuestos responsables de dicha
actividad. La comparación de los resultados del presente trabajo con aquellos reportados en la

53
literatura dan cuenta de que el método de extracción de fluidos supercríticos no favoreció la
obtención de los compuestos responsables de la actividad antioxidante, como sí ha sido el caso de
extracciones hechas con otro tipo de disolventes (glicólica, hidroglicólica e hidroalcohólica), cuya
polaridad ayudó a incrementar el rendimiento en la recuperación de dichos componentes
antioxidantes de las plantas.

5.4 ANÁLISIS CROMATOGRAFÍA DE GASES ACOPLADO A ESPECTROMETRÍA

DE MASAS. (GC-MS).

5.4.1 Análisis del perfil cromatográfico de las especies vegetales Arnica montana L (SECA),
Arnica montana L (FRESCA), Plantago major (SECA), Plantago major (FRESCA).

Al analizar el extracto SF a la especie Arnica montana L seca se presentó un perfil cromatográfico

con un pico sobresaliente del 52, 38% con un tiempo de retención (RT) de 28,99 min (Anexo 1),
dando un compuesto no reconocido, con ion molecular de 342,1 u.m.a. En el perfil cromatográfico
de la especie Arnica montana L fresca se obtuvo un perfilado de metabolitos de alta complejidad,
donde el pico sobresaliente del 68,02 % con un RT de 29,49 min (Anexo 2) dando como posible
compuesto del (5α, 6α)-4,5-epoxi-N-metil-morfinan-6-ol (Ver Figura 5.4.1-1), cabe anotar que se
ha reportado en la literatura el poder antioxidante que poseen los alcaloides presentes en diferentes
especies del género Arnica mediante métodos como: DPPH y ABTS (Maciel, 2006); para el perfil
cromatográfico de la especie Plantago major fresca se han identificado varios alcanos de elevados
pesos moleculares como los muestra los picos de 49,37 % y 9,26% con sus RT de 38,92 min y
33,92 min -respectivamente-, correspondientes a heptacosano y tetratriacosano (Anexo 3), en el
análisis de la especie Plantago major seca se evidencia unos picos de 24,11 y 15,15%
tetratriacontano y nonacosano, que son alcanos de pesos moleculares elevados (Anexo 4), sin
embargo no se podría atribuir las propiedades antioxidantes del extracto en fresco a dichos alcanos,
dada su baja reactividad. Teniendo en cuenta que en otros estudios se ha establecido que los
extractos SF obtenidos de Plantago major contienen ácidos grasos y ácidos triterpénicos (Trujillo
& Madrigal, 2005) -los cuales tienen algo de actividad antioxidante-, y dado que no fueron
detectados bajo las condiciones usadas en el método de GC-MS, se puede inferir que los citados
tipos de compuestos de la especie vegetal Plantago major son termolábiles y por ende, no

54
compatibles con esta técnica sin realizar un tratamiento adecuado de la muestra, como una
derivatización, por ejemplo.

Figura 5.4.1-1 Estructura molecular (5α, 6α)-4,5-epoxi-N-metil-morfinan-6-ol

55
 6. CONCLUSIONES

● En la identificación preliminar de los extractos etanólicos obtenidos de las hojas y flores de

la especie vegetal Arnica montana L se detectó la presencia de flavonoides, compuestos
fenólicos de tres grupos OH adyacentes, alcaloides, taninos, naftoquinonas y antraquinonas,
triterpenos y glúcidos, tanto en material vegetal seco y fresco.
● Mediante los resultados obtenidos de la marcha fitoquímica de los extractos etanólicos
obtenidos de las hojas e inflorescencias de la especie vegetal Plantago major se observó el
contenido de flavonoides, compuestos fenólicos de dos grupos OH adyacentes, alcaloides,
taninos, naftoquinonas y antraquinonas, esteroides y glúcidos, todos presentes en material
vegetal seco y en el fresco.
● Se logró observar que el mayor porcentaje de inhibición para el ensayo DPPH lo obtuvieron
los extractos CO2-SF de Arnica montana L y Plantago major que partieron del material
vegetal en fresco, no obstante no superaron el 20 % de actividad antioxidante a una
concentración de 1000 ppm. Por otro lado, los resultados obtenidos por el método FRAP
de las especies vegetales Arnica montana y Plantago major reflejaron la misma tendencia,
dando cuenta de que los componentes presentes en dichos extractos -aunque escasos- son
al mismo tiempo agentes reductores y captadores de radicales libres.
● Considerando la composición fitoquímica de las especies vegetales Arnica montana L y
Plantago major, y a su vez la amplia investigación que se ha hecho de la actividad
antioxidante de extractos obtenidos mediante otros métodos y los alcances de los estudios
hechos en el presente trabajo, se infiere que la extracción con CO2-SF no favorece la
recuperación de los compuestos con actividad antioxidante con buena eficiencia, y que para
tal fin podría ser necesario modificar esta técnica usando un disolvente auxiliar durante el
proceso.

56
 7. RECOMENDACIONES

● Continuar con el análisis fitoquímico detallado y antioxidante de especies de la flora

regional, puesto que la presencia de diferentes metabolitos en su composición química las
hace fuentes promisorias en la búsqueda de biomoléculas con actividades biológicas
desconocidas para la sociedad.
● Continuar con la investigación sobre los posibles efectos de extractos vegetales de las
especies examinadas en este trabajo, ya que por su contenido de flavonoides, alcaloides y
taninos generan grandes expectativas sobre su potencial antimicrobiano, antitumoral y
analgésico; y los esteroides, triterpenos, y saponinas hacen pensar en posibles efectos
antimicrobianos, antiulcerosos y anticarcinogénicos.

57
8. BIBLIOGRAFÍA

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67
ANEXO 1. Perfil cromatografico de la especie vegetal Arnica montana L (seca)

68
69
ANEXO 2. Perfil cromatografico de la especie vegetal Arnica montana L (fresca)

70
71
ANEXO 3. Perfil cromatografico de la especie vegetal Plantago major (fresca)

72
73
74
ANEXO 4. Perfil cromatografico de la especie vegetal Plantago major (seca)

75
76
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