Unidad de trabajo 2.

ÁCIDOS NUCLEICOS.CONCEPTOS.
1. LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos son macromoléculas poliméricas encargadas de almacenar, transmitir

y expresar la información genética de los seres vivos.

Estas biomoléculas son de gran importancia biológica y se encuentran en todos los seres
vivos bajo dos formas:

- El ADN (ácido desoxirribonucleico), que constituye el depósito en el que se

almacena la información hereditaria y se controla su transmisión a la
descendencia.
- El ARN (ácido ribonucleico), que se encarga de la expresión de esta información
mediante la síntesis de proteínas.

En todo este flujo de información desde el ADN hasta la última fase de su expresión, las
proteínas, toma parte una serie de enzimas específicas que lo hacen posible. El
conocimiento de estas enzimas, que han sido aisladas de todo tipo de organismos, ha
supuesto un gran avance y ha llegado a tener un papel decisivo entre las herramientas que
se usan en las técnicas de biología molecular.

1.1.ESTRUCTURA Y COMPOSICION QUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

El ADN y el ARN se diferencian en su estructura y composición química, pero ambos están

formados por largas cadenas de monómeros llamados nucleótidos.

Los nucleótidos son las unidades estructurales que se repiten en los ácidos nucleicos y que
van a intervenir en el mecanismo molecular que hace posible la transmisión de la
información genética.

Los nucleótidos tienen tres componentes:

 1. Una base nitrogenada.

2. Una pentosa (glúcido con cinco

átomos de carbono).

3. Una molécula de ácido fosfórico

en forma de anión fosfato.

Tanto la base nitrogenada como el grupo fosfato están unidos a la pentosa.

Las bases nitrogenadas con compuestos heterocíclicos planos de carbono y nitrógeno con
diferentes radicales. Pueden ser de dos tipos: bases púricas (derivan de la purina y son la
adenina y la guanina) y bases pirimidínicas (que derivan de la pirimidina y son la timina, la
citosina y el uracilo). La adenina, guanina y citosina están presentes tanto en el ADN como
en el ARN. La timina sólo se encuentra en el ADN y el uracilo sólo se encuentra en el ARN.

La pentosa es un glúcido de cinco átomos de carbono que forma parte de la estructura de

un nucleótido. Puede ser de dos tipos: D-ribosa (en nucleótidos que componen el ARN) y
2-desoxi-D-ribosa (en nucleótidos que componen el ADN).

El ácido fosfórico se encuentra en forma de anión fosfato. Tiene una estructura

tetraédrica, con un átomo de fósforo en posición central y los cuatro átomos de oxígeno
ocupando os vértices del tetraedro. Tiene carga negativa y es el responsable de que los
ácidos nucleicos también tengan carga neta negativa.
La unión de una base nitrogenada con una pentosa constituye un nucleósido. Un
ribonucleósido es la combinación de una base nitrogenada con D-ribosa y un
desoxirribonucleósido es la combinación de una base nitrogenada con 2-desoxi-D-ribosa.

La unión entre ambos se realiza mediante un enlace N-glucosídico entre el C1 de la pentosa

y el N9 de la base púrica o el N1 de la base pirimidínica, con pérdida de una molécula de
agua.

Los nucleósidos se nombran añadiendo a la base nitrogenada:

- La terminación –osina en el caso de bases púricas.

- La terminación –idina en el caso de bases pirimidínicas.
- Si la pentosa es la desoxirribosa se añade el prefijo desoxi- al nombre.

La unión de un nucleósido con una molécula de ácido fosfórico en forma de anión fosfato
mediante un enlace éster origina un nucleótido. El enlace se origina entre el C 5 de la
pentosa y el ácido fosfórico, con pérdida de una molécula de agua.
 - Los nucleótidos que contienen 2-desoxi-D-ribosa se denominan
desoxirrbonucleótidos y son los integrantes del ADN.

- Los nucleótidos que contienen D-ribosa se denominan ribonucleótidos y son los

integrantes del ARN.

Los nucleótidos se nombran eliminando la “a” final del nombre del nucleósido del que
proceden y añadiendo la terminación “5’-fosfato”.

Los nucleótidos se unen entre sí por el grupo fosfato mediante un enlace fosfodiéster
entre el C5 de un nucleótido y el C3 del siguiente nucleótido, dando lugar a cadenas lineales
polinucleotídicas que constituyen los ácidos nucleicos.
Cuando el número de nucleótidos que integran la cadena no es muy grande se habla de
oligonucleótidos.
Toda cadena de nucleótidos tiene dos extremos libres: el extremo 5’, con un grupo fosfato
unido al C5 de la pentosa del primer nucleótido y un extremo 3’, con un radical hidroxilo (-
OH) unido al C3 de la pentosa del último nucleótido.

1.2.PROPIEDADES FÍSICOQUÍMCAS

Las moléculas de ácidos nucleicos se caracterizan porque:

- Son fuertemente ácidas en solución acuosa debido a los grupos fosfato.

- Presentan una elevada viscosidad incluso a concentraciones bajas.
- Muestran un característico pico de absorción de luz ultravioleta una longitud de
onda de 260 nm. Esta propiedad resulta útil para determinar su concentración:
midiendo la absorbancia de una solución a 260 nm podremos determinar su
concentración en ácidos nucleicos.
- Las dos cadenas de nucleótidos que componen la doble hélice de una molécula
de ADN se pueden separar elevando la temperatura o aumentando el pH (pH
 alcalino). Este proceso de denomina desnaturalización y se produce por la ruptura
de los puentes de hidrógeno entre las bases nitrogenadas complementarias. La
desnaturalización es reversible, de manera que al disminuir la temperatura
lentamente o bajar el pH hasta valores neutros, se vuelven a formar puentes de
hidrógeno entre las bases complementarias y la molécula de ADN recupera su
conformación nativa en doble hélice. Este fenómeno se denomina
renaturalización.
- Dos cadenas de ácidos nucleicos con una secuencia de bases nitrogenadas
complementarias, en condiciones adecuadas de temperatura, pH y fuerza iónica,
se unen mediante puentes de hidrógeno entre bases complementarias en un
proceso que se llama hibridación.

2. EL ADN

El ácido desoxirribonucleico (ADN) almacena información genética de un individuo, la

transmite a los descendientes y dirige la síntesis de las proteínas.

En organismos eucariotas, el ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las células

como parte de los cromosomas, pero también existen pequeñas cantidades dentro de las
mitocondrias y los cloroplastos.

En procariotas la mayor parte del ADN se encuentra en un solo cromosoma y en menor

proporción en forma de fragmentos pequeños llamados plásmidos. También algunos virus
contienen ADN como material genético.
2.1.ESTRUCTURA DEL ADN

El ADN es un polímero formado por largas cadenas de desoxirribonucleótidos (la pentosa

es siempre desoxirribosa) de adenina, guanina, citosina y timina (no contiene uracilo).

Una molécula de ADN se caracteriza por:

- El tamaño, determinado por el número de desoxirribonucleótidos que contiene.

Las moléculas de ADN que forman los cromosomas son de gran tamaño,
conteniendo varios millones de pares de bases. Los plásmidos y las moléculas de
ADN mitocondrial, en cambio, tienen un tamaño de pocos miles de pares de bases.

- La composición, referida a cada nucleótido. Los ADN aislados de diferentes

especies de organismos

-La secuencia de bases nitrogenadas. Además de una proporción de nucleótidos,

en los ADN de diferentes especies también varía el orden o secuencia en que se
sitúan las bases nitrogenadas.

De hecho, una secuencia de ADN se representa abreviadamente por su secuencia de bases

nitrogenadas colocadas en dirección 5’-3’, lo que constituye la estructura primaria.

La estructura primaria es la secuencia de bases nitrogenadas en el esqueleto de su cadena

de desoxirribonucleótidos.

A pesar de las variaciones de tamaño, composición de bases y secuencia de las moléculas

de ADN de diferentes especies, todas las moléculas bicatenarias de ADN tienen una
característica común: la cantidad de adenina es igual a la de timina y la cantidad de
citosina es igual a la de guanina.

Cuando determinados nucleótidos se enfrentan se mantienen unidos mediante puentes de

hidrógeno entre los grupos polares de sus bases nitrogenadas. Esto sólo se produce entre
bases complementarias en función de su tamaño y estructura. Concretamente son
complementarias:

- La adenina y la timina, entre las que se forman dos puentes de hidrógeno (A=T).

- La citosina y la guanina, entre las que se forman tres puentes de hidrógeno (C≡G).

Ninguna otra combinación de bases presenta complementariedad en el ADN. Esto se

conoce como principio de complementariedad.

Para que la unión sea estable es necesario, además, que los dos nucleótidos que portan las
bases complementarias sitúen sus grupos fosfato en posiciones opuestas.

En 1953 Watson y Crick propusieron un modelo para describir la estructura del ADN que
permite explicar el principio de complementariedad y que sostiene que el ADN es una
doble hélice.

Esta estructura en doble hélice constituye la estructura secundaria del ADN y sostiene que
el ADN está formado por dos cadenas de polinucleótidos que forman una doble hélice
alrededor de un eje central.

Las dos cadenas polinucleotídicas que constituyen las moléculas de ADN de los seres vivos
cumplen las siguientes funciones:
 - Las dos cadenas son antiparalelas. Los enlaces 5’-3’ están orientados en sentidos
opuestos de manera que el extremo 5’ de una cadena se enfrenta al extremo 3’ de
la otra.

- La secuencia de bases de ambas es complementaria. Es decir, si se conoce la

secuencia de una de las cadenas se puede deducir la secuencia de la otra.

- Ambas cadenas se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno entre las

bases complementarias.

- Forman una doble hélice. El enrollamiento es dextrógiro (giran hacia la derecha) y

plectonémico (para separar las cadenas hay que desenrollarlas previamente). El
diámetro de la doble hélice es de 2nm.

- Las bases nitrogenadas se encuentran en el interior y en el exterior las

desoxirribosas y los grupos fosfato.

- Un giro equivale a 10 nucleótidos. La separación entre dos pares de bases (pb) es

de 0,34 nm y una vuelta= 3,4 nm.

Como excepción a este modelo se encuentra al material genético de algunos virus, como
los parvovirus, que están constituidos por ADN monocatenario.

Los virus presentan la mayor diversidad en cuanto a organización de su material genético.

En el caso de los virus de ADN presentan una única molécula que puede ser lineal o
circular, bicatenaria o monocatenaria.

En los procariotas, el ADN se encuentra en su mayor parte en un solo cromosoma

bicatenario circular y en menor proporción en forma de fragmentos pequeños llamados
plásmidos, que también son bicatenarios y circulares.

Algunas características de los plásmidos son:

- Están formados por unos pocos miles de nucleótidos.

- Su número oscila entre uno y varios cientos.
- Se replican independientemente del cromosoma bacteriano.
- Habitualmente contienen genes de resistencia a antibióticos y factores de
virulencia.

En eucariotas el ADN se encuentra principalmente en el núcleo de las células como parte

de los cromosomas (ADN cromosómico nuclear), pero también existen pequeñas
cantidades dentro de las mitocondrias (ADN mitocondrial) y en los cloroplastos (ADN de
cloroplastos).

El ADN cromosómico nuclear no se encuentra libre sino asociado a proteínas básicas que
son de dos tipos:
 - Histonas: proteínas con una función estructural.
- No histonas: proteínas muy heterogéneas con funciones estructurales,
enzimáticas y reguladoras.

El complejo formado por ADN e histonas se denomina cromatina.

Vista al microscopio electrónico la cromatina tiene aspecto de un collar de perlas en el que

cada “perla” es un nucleosoma que es la estructura cilíndrica formada por un octámero de
histonas sobre la que se enrolla la doble hélice de ADN.

La molécula de ADN asociada a las histonas se llama fibra de cromatina.

La configuración tridimensional de la molécula de ADN formado fibras de cromatina

representa la estructura terciaria del ADN.

La fibra de cromatina, a su vez, se enrolla sobre sí misma formando un solenoide. En el

momento de la división celular mitótica, las fibras de cromatina se ordenan y
experimentan varios niveles de superenrollamiento de complejidad creciente, hasta
formar el cromosoma metafásico. El número de cromosomas es característico de cada
especie de seres vivos.

El ADN mitocondrial (ADNmt) consiste en una molécula bicatenaria circular con unos miles
de nucleótidos. Algunas de sus características son:
 - Contiene genes que codifican para ARN ribosómico, ARN de transferencia y
enzimas empleadas en los procesos metabólicos que tienen lugar en la
mitocondria, por lo que se conoce también como cromosoma mitocondrial.
- Se replica independientemente del ADN nuclear
-Su número de copias por mitocondria es muy variable, pudiendo llegar a varios
cientos.
- Son siempre de herencia materna.

De manera análoga al ADN mitocondrial, las células vegetales tienen también ADN en los
cloroplastos, en forma de molécula bicatenaria circular que codifica enzimas específicas de
este orgánulo.

El ADN copia (ADNc) es un tipo de ADN especial obtenido in vitro. No existe como tal en la
naturaleza, se obtiene en laboratorio a partir de ARN aislado de una célula, mediante una
enzima denominada retrotranscriptasa que sintetiza ADN utilizando ARN como molde.

3. EL ARN

El ácido ribonucleico controla la síntesis de proteínas a partir de la información genética

contenida en el ADN.

En eucariotas se encuentra en el núcleo, en el citoplasma y en los ribosomas del

citoplasma. Algunos virus sólo contienen ARN mientras que otros sólo contienen ADN.

El ARN es un polímero formado por largas cadenas de ribonucleótidos (la pentosa siempre
es la ribosa) de adenina, guanina, citosina y uracilo (no contiene timina). Algunas
moléculas de ARN (por ejemplo los ARN de transferencia) pueden contener pequeñas
cantidades de otras bases nitrogenadas, que normalmente son derivados metilados de las
cuatro bases mayoritarias.

Salvo el caso de algunos virus, como los reovirus, cuyo material es ARN bicatenario, el ARN
de los seres vivos es monocatenario lineal. Sin embargo, algunas zonas de la molécula
pueden tener secuencias complementarias, de manera que la molécula puede plegarse
para formar regiones de doble hélice denominadas horquillas.
En el ARN las bases complementarias son adenina y uracilo (entre las que se forman dos
puentes de hidrógeno) y citosina y guanina (entre las que se forman tres puentes de
hidrógeno).

Existen varios tipos de ARN que podemos clasificar según su estructura y función:

- ARN mensajero (ARNm), ARN ribosómico (ARNr) y ARN de transferencia (ARNt),

principalmente.
- Con función reguladora de la expresión génica: ARNsi, ARNmi.
- Otros tipos: ARNhn, ARNsn, ARNsno.

El ARNm está constituido por múltiples moléculas lineales de diferentes tamaños, cada
una de las cuales porta la información para la síntesis de una proteína. Supone entre el 2 y
el 5% del ARN total de una célula.

Su secuencia de bases nitrogenadas, copia exacta de la secuencia de un gen de ADN,

determina la ordenación secuencial de los aminoácidos que constituyen la proteína (un
codón constituido por tres bases codifica una aminoácido). Así que el ARNm transmite la
información genética contenida en el ADN a la maquinaria celular de síntesis de proteínas.

Las moléculas de ARNm procariota son policistrónicas, es decir, portan información para la
síntesis de varias proteínas distintas. Por el contrario las moléculas de ARNm eucariota son
monocistrónicas, es decir, contienen información para la síntesis de una sola proteína.

El ARNr es el mayoritario en la células (aproximadamente el 80%). Combinado con

proteínas forma los ribosomas, orgánulos citoplasmáticos responsables de la síntesis de
proteínas.

Los ARNr se clasifican según su coeficiente de sedimentación:

- En las células procariotas hay tres tipos: 5S, 16S y 23S.

- En las células eucariotas hay cuatro tipos: 5S, 5.8S, 18S y 28S.

Presentas múltiples regiones complementarias, por lo que tienen una estructura

secundaria muy compleja, con numerosas horquillas y bucles.

Los ARNt transportan aminoácidos hasta los ribosomas para su incorporación en la cadena
proteica que se está sintetizando.
Consisten en cadenas cortas (70-90 nucleótidos) con una secuencia secundaria en forma
de hoja de trébol constituida por cuatro horquillas y tres bucles o lazos. Esta estructura
secundaria se pliega tridimensionalmente en una estructura terciaria en forma de L o
bumerán.

El extremo 3’ de todos los ARNt termina con la secuencia 5’-CCA-3’ y es el sitio de unión
del aminoácido que portan. Otra característica es que contienen hasta un 10% de bases
nitrogenadas distintas de las habituales, como la dihidrouridina (DHU o UH2),
metilguanosina (mG), dimetilguanosina (m2G), pseudouridina (ψ) y metilinosina (ml).
Incluso pueden contener timina.

Los tres lazos son regiones funcionales de la molécula:

- El lazo D (por contener dihidrouridina) es el sitio de unión de la enzima encargada

de unir el aminoácido correspondiente al extremo 3’.
- El lazo T (por contener la secuencia T ψ C) es el sitio de unión al ribosoma.
- El lazo anticodón contiene las tres bases complementarias del codón en el ARNm
que codifica para el aminoácido que porta.

Se conocen varios tipos de ARN que toman parte en la regulación de la expresión génica.
Son moléculas pequeñas con secuencias complementarias de regiones específicas del
ARNm. Algunas de estas moléculas son bicatenarias (ARN interferente pequeño o ARnsi) y
otras son monocatenarias con regiones complementarias que forman una horquilla
(microARN o ARNmi). Estas moléculas se unen a las regiones complementarias del ARNm y
bloquean la traducción a proteína o activan enzimas que degradan el ARNm.

El ARN heterogéneo nuclear (ARNhn) es una mezcla de largas cadenas lineales precursoras
del ARNm. Se encuentran en el núcleo de la célula y, tras un proceso de maduración, dan
lugar al ARNm, que sale al citoplasma.

El ARN pequeño nuclear (ARNsn) es un conjunto de pequeñas moléculas de ARN que se

localizan en el núcleo y se unen a proteínas, dando lugar a ribonucleoproteínas con
actividad enzimática. Concretamente intervienen en la maduración del ARNm.
El ARN pequeño nucleolar (ARNsno) se localiza en el nucléolo y es el precursor de varios
ARNr. Tiene un coeficiente de sedimentación de 45S y cuando se fragmenta da lugar a los
ARNr 5.8S, 18S y 28S.

El coeficiente de sedimentación de una partícula se calcula dividiendo su velocidad constante de

sedimentación (en m/s) por la aceleración aplicada (en m/s2). La velocidad es constante porque la
aceleración aplicada por la ultracentrífuga es compensada por la resistencia viscosa del medio a través
del cual se desplaza la partícula (normalmente agua). El resultado tiene dimensiones de tiempo y se
expresa habitualmente en svedbergs (S).

Los valores de coeficientes de sedimentación no son aditivos, debido a que dependen tanto de la masa,
como de la forma que tenga la molécula. Una partícula formada por la unión de dos partículas 5 S no
tiene un coeficiente de sedimentación de 10 S. Por ejemplo, los ribosomas procariotas están formados
por dos subunidades, una 50 S y otra 30 S. Sin embargo, el valor final del conjunto del ribosoma no es 80
S, sino 70.

De la misma manera, la subunidad grande de los ribosomas eucariotas tiene un coeficiente de

sedimentación de 60 S y la pequeña de 40 S, sin embargo, el valor final del conjunto del ribosoma no es
100 S, sino 80 S.

4. EL FLUJO DE LA INFORMACIÓN GENÉTICA

El ADN almacena la información genética de un individuo, la transmite a los descendientes

y dirige la síntesis de proteínas. Para ello son necesarios tres procesos metabólicos: la
replicación, la transcripción y la traducción.

El ADN contiene información que se debe transmitir íntegramente a la descendencia. En el

caso de las células esto implica duplicar (o multiplicar en el caso de los virus) el material
genético mediante la síntesis de nuevas moléculas de ADN con una secuencia idéntica a las
parentales. Este proceso se denomina replicación.

El ADN almacena información para la síntesis de proteínas, pero el ADN está en el núcleo
de las células y la síntesis de proteínas se produce en el citoplasma. Por lo tanto debe
existir un flujo de información desde el ADN a las proteínas.

Esto se consigue mediante dos procesos:

- Transcripción, que consiste en la síntesis de ARNm con la misma secuencia que
los genes de ADN, encargados de transportar la información al citoplasma.
- Traducción, por el que la secuencia de ARNm se transforma en la secuencia de
aminoácidos de una proteína.

Teniendo en cuenta que algunos virus de ARN son capaces de replicarlo y otros son
capaces de sintetizar ADN a partir de ARN (transcripción inversa), podemos esquematizar
el flujo de la información genética desde el ADN hasta la síntesis de proteínas de la
siguiente manera:
En la replicación la molécula de ADN se duplica dando lugar a dos moléculas hijas que
conservan la misma secuencia de la molécula inicial.

La replicación presenta varias características comunes a procariotas y eucariotas:

- Es semiconservativa: En cada cadena hija existe una hebra de la molécula original

y una nueva.
- Comienza en un origen de replicación: La replicación comienza en unos puntos de
iniciación concretos. El cromosoma de los procariotas tiene un único origen de
replicación, mientras que en los cromosomas de eucariotas hay muchos, por lo que
la replicación se inicia de manera simultánea en varios puntos.
- Es bidireccional y secuencial: A partir del origen de replicación, las dos cadenas
de ADN molde se separan y la síntesis de las nuevas cadenas se produce en ambas
direcciones, lo que da lugar a dos horquillas de replicación.
- Es semidiscontinua: La síntesis de las cadenas nuevas se produce siempre en la
dirección 5’-3’, por lo que la cadena molde tiene que leerse en la dirección 3’-5’. Al
ser bidireccional desde el origen de replicación, en uno de los sentidos la cadena
nueva puede crecer de manera continua a medida que avanza la horquilla de
replicación, puesto que la hebra molde se lee en la dirección correcta 3’-5’, pero en
el sentido contrario la cadena nueva se sintetiza de manera discontinua, en forma
de fragmentos llamados fragmentos de Okazaki.
 La hebra que se sintetiza de manera continua se llama hebra adelantada y la hebra
que se sintetiza de forma discontinua se llama hebra retardada.

En el proceso de replicación intervienen múltiples enzimas:

- Helicasa: Desenrolla y separa las dos cadenas de la doble hélice. Empieza en el

origen de replicación y contínua en ambos sentidos a medida que avanzan las
horquillas de replicación.
- Proteínas de unión a cadenas sencillas (SSBP): Se unen a las cadenas
desenrolladas evitando que se vuelva a formar la doble hélice.
- Girasa y topoisomerasa: Relajan la tensión que se genera en la doble hélice
debido al superenrollamiento que genera la separación de las cadenas en la
burbuja de replicaión, mediante cortes y empalmes.
- ADN polimerasa: Es la responsable de la síntesis de la nueva cadena, añadiendo
desoxirribonucleótidos al extremo 3’ de una cadena en crecimiento. Esta enzima
no puede iniciar una cadena, sólo puede elongar una preexistente, añadiendo
desoxirribonucleótidos a la posición 3’ libre. La secuencia que incorpora es
complementaria a la secuencia molde que se está leyendo.

En procariotas existen tres tipos de ADN polimerasas que se nombran con números
romanos (I, II y III) y el eucariotas existen 5 que se nombran con letras griegas: α, β,
γ, δ y ε.

Además de la función polimerasa, estas enzimas son capaces de eliminar

nucleótidos uno a uno desde el extremo de la cadena. Esta actividad (denominada
exoncleasa) es muy útil para corregir errores.
 - Primasa: Tiene función ARN polimerasa y sintetiza fragmentos cortos de ARN
(aproximadamente de 10 nucleótidos) denominaros cebadores o primers,
complementarios de zonas concretas de la cadena de ADN que se está replicando.
De esta manera, sobre la cadena molde se forman cortas regiones híbridas de ARN-
ADN que son reconocidas por la ADN polimerasa para iniciar su función de
elongación. Para la síntesis de la hebra adelantada o conductora se requiere un
solo cebador en el origen de replicación. Para la hebra retardada se requiere un
cebador por cada fragmento de Okazaki.
- Ligasa: Es la enzima responsable de unir los fragmentos de Okazaki entre sí y con
la hebra conductora para conseguir la continuidad de la cadena de nueva síntesis.

Aunque existen diferencias en el proceso de replicación entre procariotas y eucariotas, el

desarrollo del proceso en procariotas nos sirve para explicar las fases y sobre este modelo
explicaremos las variaciones que se producen en eucariotas.

La replicación del ADN en procariotas tiene básicamente dos fases: Iniciación y elongación.

La replicación se inicia cuando proteínas específicas reconocen el origen de replicación y se

unen a él. Esta unión activa las helicasas, que rompen los puentes de hidrógeno entre las
bases complementarias y separan las dos cadenas, con lo que se forma una burbuja de
replicación.

Las SSBP se unen a las cadenas separadas e impiden que se vuelva a formar la doble hélice.
Simultáneamente se activan las girasas y topoisomerasas que relajan la tensión de la zona
próxima a la burbuja de replicación. La acción de la helicasa permite que la burbuja de
replicación se extienda en los dos sentidos, generándose dos regiones en “Y” denominados
horquillas de replicación, en las que se van a sintetizar las nuevas cadenas.

Durante la fase de elongación la primasa sintetiza los cebadores en la dirección 5’-3’. La

primasa se separa de la hebra y entra la ADN polimerasa III que inicia la elongación del
cebador mediante incorporación de desoxirribonucleótidos en el extremo 3’ libre. A
medida que crece la cadena la ADN polimerasa III se va desplazando sobre la hebra
“leyendo” su secuencia e incorporando los nucleótidos complementarios. En la cadena
conductora, la elongación de la cadena continúa hasta que se unen ambas horquillas de
replicación (recordemos que en procariotas el cromosoma es circular). En la cadena
retardada la ADN polimerasa se separa de la cadena molde cunado la elongación de la
cadena alcanza el cebador de un fragmento de Okazaki.

La ADN polimerasa I se une a la cadena a nivel de los cebadores, los elimina mediante su
actividad exonucleasa 5’-3’ y los sustituye por ADN mediante su actividad polimerasa.

La ligasa une los fragmentos de Okazaki consecutivos, dando continuidad a la hebra

retardada.

Los posibles errores en la incorporación de bases se reparan gracias a la actividad

exonucleasa de la ADN polimerasa III.

La replicación en eucariotas a grandes rasgos es similar a la de procariotas, con algunas

peculiaridades:

- Hay múltiples orígenes de replicación, por lo que se inicia simultáneamente en

varios puntos.
- Hay 5 tipos de ADN polimerasas, que se reparten las tareas de elongación,
eliminación de cebadores y corrección de errores.
- El ADN eucariótico está unido a histonas, por lo que durante la replicación se van
estructurando también los nucleosomas.

La transcripción es el proceso por el cual se sintetiza una molécula de ARN usando como
molde una cadena de ADN.

El proceso requiere una enzima llamada ARN polimerasa-ADN dependiente o

transcriptasa:

- En procariotas sólo existe una transcriptasa.

- En eucariotas existen tres: I, II y III. La I es responsable de la síntesis de la mayor
parte del ARNr. La II es responsable de la síntesis de ARNm. La III es responsable de
la síntesis del ARNt y de la subunidad 5S del ARNr.

El proceso se realiza en tres fases: iniciación, elongación y terminación.

La transcripción se inicia cuando a ARN polimerasa reconoce una zona de la molécula de

ADN, llamada promotor – que tiene una secuencia de bases específica – y se une a ella.

La unión de la ARN polimerasa al promotor determina que las dos cadenas de la doble
hélice se separen y se pueda iniciar la síntesis de la cadena de ARN.

Durante la fase de elongación secuencialmente se adicionan ribonucleótidos. De las dos

cadenas de ADN sólo se transcribe una de ellas, llamada cadena molde o cadena
codificadora. La cadena que no se transcribe se denomina cadena no molde, informativa
o sin sentido.

La ARN polimerasa se desplaza a lo largo de la cadena de ADN en dirección 3’-5’, “leyendo”

la secuencia de bases e incorporando ribonucleótidos a la cadena mediante enlace
fosfodiéster. En consecuencia, el crecimiento de la cadena de ARN tiene lugar en la
dirección 5’-3’.

La síntesis de ARN termina cuando la ARN polimerasa alcanza una secuencia específica en
la molécula de ADN denominada señal o secuencia de terminación. Aquí, la cadena de
ARN se separa del ADN, la enzima se separa también y el ADN recupera su configuración
de doble hélice.

La maduración es el proceso que requieren las cadenas de ARN transcritas para dar lugar a
los tipos principales de ARN.

Este proceso de maduración es diferente en procariotas y en eucariotas.

- En procariotas, los ARNt y ARNr se sintetizan en forma de largas moléculas de

ARN denominadas transcritos primarios, que contienen numerosas copias de cada
uno de ellos y posteriormente son cortados por enzimas específicas.
El ARNm, sin embargo, no requiere ninguna modificación posterior. De hecho la
traducción a proteína se inicia incluso antes de que termine la transcripción, ya que
los ribosomas se pueden acoplar al extremo 5’ libre.

- En eucariotas, la maduración de los ARNt y ARNr es similar a lo que sucede en

procariotas, pero el ARNm requiere un proceso complejo antes de poderse traducir
a proteína. Esto se debe a que en la mayoría de los genes eucariotas se alternan
dos tipos de secuencias: intrones y exones.
Los exones son secuencias que se transcriben y se traducen, ya que portan información
para la síntesis de una región de una proteína.

Los intrones se transcriben pero no se traducen, porque no codifican para una cadena de
aminoácidos y se deben eliminar antes de la traducción.

El ARN sintetizado directamente mediante la transcripción se denomina heterogéneo

nuclear (ARNhn) que contiene intrones y no puede salir del núcleo para ir al citoplasma,
que es donde se encuentra la maquinaria de síntesis de proteínas.

La maduración de ARNm conlleva tres pasos:

- Adición de una caperuza en 5’. La maduración se inicia ya durante la elongación

de la transcripción, mediante la adición de una “caperuza” (en inglés “cap”) que
consiste en la incorporación de una 7-metilguanosina-trifosfato que protege al ARN
de la degradación.
- Adición de una cola poli-A en 3’. Después de que la cadena de ARN se ha
separado del ADN y de la ARN polimerasa, la enzima poli-A polimerasa añade una
cadena de poli-A al extremo 3’ de la nueva cadena. Dependiendo de la especie la
longitud de esta cola varía desde unas decenas hasta varios cientos. Esta cola
permite al ARNm maduro salir del núcleo al citoplasma.
- Eliminación de los intrones. Tiene lugar mediante un proceso de corte y empalme
denominado splicing en inglés. Aquí intervienen unas enzimas denominadas
ribonucleoproteínas pequeñas nucleares (RNPsn) que se sitúan en los extremos de
los intrones y se agrupan formando un complejo que recibe el nombre de
espliceosoma, de manera que la secuencia intrónica forma un bucle que es cortado
en su base y se empalman los exones para dar lugar al ARNm maduro.
La traducción es el proceso por el que a partir de una molécula de ARNm se sintetiza una
proteína.

Durante el proceso los aminoácidos se van incorporando secuencialmente a la cadena

polipeptídica en crecimiento de acuerdo con la información contenida en la secuencia de
nucleótidos del ARNm.

La traducción se realiza gracias al código genético que se basa en que una secuencia de
tres bases nitrogenadas codifica una aminoácido.

Cada triplete de bases que codifican un aminoácido se denomina codón. De los 64 codones
que se pueden formar con las variaciones con repetición de cuatro bases tomadas de tres
en tres, 61 codifican aminoácidos y tres son codones de terminación.

El código genético presenta las siguientes características:

- Es universal. Es el mismo para todos los organismos. Es decir, un codón específico

codifica el mismo aminoácido en un eucariota, en un procariota o en un virus.

La excepción es el código genético mitocondrial, en el que algunos codones

concretos codifican aminoácidos distintos.
- No es ambiguo. Cada codón codifica un único aminoácido.
- Es degenerado. Como hay 20 aminoácidos y 61 codones codificantes, el código
tiene redundancia, estando la mayor parte de los aminoácidos codificados por más
de una codón. Los distintos codones que codifican un mismo aminoácido se
denominan codones sinónimos.
 - Es continuo y no solapado. En la cadena de ARNm los codones se disponen de
manera secuencial uno detrás del otro sin espacios y sin compartir ninguna base.

Todas las secuencias de ARNm que se van a traducir comienzan por el codón de inicio AUG
que codifica para la metionina. Los codones UAA, UAG y UGA son de terminación.

Para que se lleve a cabo la traducción se requiere:

- Una molécula de ARNm que contiene la información de la secuencia.

- Los 20 aminoácidos.
- Los ribosomas (constituidos por ARNt y proteínas).
- Los ARNt que transportan los aminoácidos hasta los ribosomas.
- Las enzimas que catalizan la unión entre los aminoácidos.

Los ribosomas constan de dos subunidades de distinto tamaño:

- La subunidad menor, que tiene un sitio de unión al ARNm.
- La subunidad mayor, que tiene dos sitios de unión al ARNt:

El sitio peptidil o sitio P, donde se sitúa el ARNt que porta la cadena
polipeptídica en crecimiento.
El sitio aminoacil o sitio A, donde se sitúa el ARNt que porta el siguiente
aminoácido que se va a incorporar a la cadena.

Cada aminoácido se une a su respectivo ARNt gracias a la aminoacil-ARNt-sintetasa. Cada

ARNt tiene en el lazo anticodón un triplete de bases nitrogenadas (anticodón)
complementarias del codón que codifica el aminoácido que porta.

El proceso se inicia con la unión de la subunidad menor del ribosoma a un ARNm, a la

altura del codón de inicio AUG.
Luego, el ARNt con un anticodón UAC (complementario del AUG) se incorpora al conjunto
mediante la formación de puentes de hidrógeno entre bases. Este ARNt transporta el
aminoácido metionina. A este conjunto se le denomina complejo de iniciación.

Después se incorpora la subunidad grande del ribosoma, de forma que el ARNt-Met se

sitúa en el sitio P.

Comienza la incorporación al sitio A de un segundo aminoacil-ARNt que tiene un anticodón

complementario al segundo codón del ARNm.

Luego la enzima peptidil-transferasa cataliza la formación de un enlace peptídico entre

metionina (en el sitio P) y el aminoácido que se encuentra en el sitio A. Así, el ARNt del
sitio P queda sin aminoácido y el ARNt del sitio A está ahora unido a un dipéptido.

Una vez formado el enlace peptídico el ribosoma se desplaza a lo largo de la cadena de

ARNm en dirección 5’-3’, en un movimiento denominado translocación.

Cada vez que se repite el proceso se incorpora un nuevo aminoácido a la cadena en

crecimiento.

La terminación del proceso se produce cuando el ribosoma alcanza en el ARNm un codón

de terminación. En ese momento la cadena polipeptídica se libera del complejo. Luego se
disocia todo el complejo, las subunidades del ribosoma se separan y el ARNm y el ARNt se
liberan.

5. LAS ENZIMAS EMPLEADAS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

Las técnicas de biología molecular implican manipulación de ácidos nucleicos. Estas

acciones son posibles gracias a la actividad catalizadora de enzimas específicas aisladas de
todo tipo de organismos (virus, bacterias y células eucariotas). Realizan in vitro la misma
actividad que llevarían a cabo in vivo, en condiciones fisiológicas.

Las nucleasas son enzimas que cortan y degradan los ácidos nucleicos mediante hidrólisis
del enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos.

Dependiendo de sus características se clasifican de varias maneras:

- Según el tipo de ácido nucleico que atacan:

Nucleasas de ARN (ARNasa o ribonucleasa). Capaces de romper enlaces

fosfodiéster entre ribonucleótidos.
Nucleasas de ADN (ADNasa o desoxirribonucleasa). Capaces de romper
enlaces fosfodiéster entre desoxirribonucleótidos.

- Según el tipo de cadena que atacan:

Nucleasas que atacan moléculas bicatenarias, rompiendo enlaces en

ambas cadenas.
Nucleasas que atacan moléculas monocatenarias. Por ejemplo la
nucleasa S1 degrada ARN y ADN de cadena sencilla y zonas monocatenarias
 de ADN de doble cadena, como enlaces o bucles.

- Según la situación del punto de corte:

Exonucleasas: eliminan nucleótidos uno a uno desde un extremo.

Endonucleasas: que cortan en puntos intermedios de la molécula.
Algunas endonucleasas como la ADNasa I, son muy útiles cuando se usan a
baja concentración porque son capaces de producir en moléculas
bicatenarias de ADN la rotura de un enlace fosfodiéster entre dos
nucleótidos sólo en una de las cadenas. Estas roturas se denominan mellas
(Nick en inglés) y son fundamentales para un tipo de marcaje de sondas
denominado desplazamiento de mella (Nick translation).

- Según la especificidad del corte:

Nucleasas que cortan aleatoriamente.

Nucleasas que cortan en sitios concretos. Se unen a una cadena de
nucleótidos en una secuencia específica y la cortan, como es el caso de las
endonucleasas de restricción.

Las endonucleasas de restricción son endonucleasas bacterianas que reconocen

secuencias cortas de ADN bicatenario (de entre 4 y 8 pares de bases) y producen un corte
en la doble cadena en esa secuencia o cerca de ella, fragmentando la molécula.

A las secuencias de ADN específicas que reconocen estas enzimas se les denomina dianas
de restricción.

En bacterias, las endonucleasas de restricción, de alguna manera, constituyen un sistema

de defensa inmune, puesto que fragmentan ADN exógeno, principalmente de virus. Para
evitar fragmentar su propio ADN, las bacterias se progeten modificando sus dianas de
restricción por metilación de las bases nitrogenadas. De hecho, la enzima de restricción
muchas veces tiene ambas funciones: corte y metilación.

Hay tres tipos de enzimas de restricción:

- Enzimas de restricción tipo I: la enzima reconoce su diana y hace un corte en una
región anterior o posterior de la diana a una distancia de hasta 1000 pares de
bases. Estas enzimas no generan patrones específicos de fragmentos, de forma que
cada vez que cortan una misma molécula de ADN generan fragmentos distintos,
por lo que no tienen mucha utilidad en biología molecular.
- Enzimas de restricción tipo II: Reconocen la diana y cortan en puntos específicos,
generalmente dentro de la misma diana. En consecuencia, estas enzimas generan
patrones específicos y reproducibles de fragmentos, ya que siempre cortan en los
mismos puntos. Son una herramienta fundamental en biología molecular y se
llaman tijeras moleculares.
- Enzimas de restricción tipo III: Reconocen dos secuencias invertidas dentro de la
misma cadena y cortan fuera de la diana de restricción, pero a una distancia corta
(25-30 pb).
Las enzimas de restricción se nombran normalmente con tres letras y un número romano.
Las tres letras se escriben en cursiva y corresponden al nombre científico de la bacteria de
la que se han obtenido. La primera letra es la inicial del género; las otras dos, las primeras
letras de la especie. El número romano indica el orden en que se ha aislado la enzima de la
misma especie. Por ejemplo Pvu II es el nombre de la segunda enzima aislada en Proteus
vulgaris.

A veces, cuando la enzima se ha aislado de una cepa concreta de una especie bacteriana,
se añade una cuarta letra mayúscula que la representa. Así, EcoR V es el nombre de la
quinta enzima de restricción aislada de Escherichia coli, cepa RY13.

El corte realizado por una enzima de restricción puede ser:

- Extremos romos, cuando el corte de produce en el mismo puntos en ambas

cadenas, generalmente en el centro de la diana de restricción.
- Extremos cohesivos, cuando el corte se produce en puntos distintos en ambas
cadenas, normalmente en los extremos de la diana de restricción. Esto genera en
cada extremo sendas regiones monocatenarias, cortas y complementarias entre sí,
lo que hace que sean muy reactivos al poderse adherir a fragmentos de ADN que
tengas secuencias complementarias.

La propiedad de las endonucleasas de restricción de cortar dejando extremos cohesivos o

reactivos es muy útil en biología molecular para crear moléculas de ADN recombinante

El proceso es el siguiente:

- Se cortan moléculas distintas de ADN con la misma enzima de restricción.

- Cuando los extremos con fragmentos cohesivos de ambas moléculas se mezclan,
se unirán por la complementariedad de las bases.
- Finalmente, las mellas que quedan de cada cadena se unen con una ligasa y se
obtiene una molécula híbrida recombinante.
Así se puede insertar un determinado gen de un organismo – que sea responsable de la
producción de una determinada proteína – en otro diferente, con la finalidad de producirla
en grandes cantidades. Actualmente así es como se produce la insulina, gracias a la
tecnología del ADN recombinante.

Para una enzima de restricción concreta una molécula de ADN presenta un número
relativamente pequeño de dianas de restricción. Así, la digestión con esa enzima produce
un número discreto de fragmentos de distintos tamaños.

Estos fragmentos se pueden separar según su tamaño mediante una electroforesis en gel,
de manera que se obtiene un conjunto de bandas único para una ADN particular y que se
denomina patrón de restricción.

Conocer el patrón de restricción de una muestra de ADN dada tiene muchas utilidades,
como la identificación de muestras pertenecientes a un mismo individuo, la realización de
estudios filogenéticos (relación evolutiva entre organismos) y la detección de posibles
anomalías en el diagnóstico prenatal o en la detección de mutaciones (si se produce una
mutación que afecta a una diana de restricción, el patrón de restricción será diferente).
Actualmente se conocen cientos de enzimas de restricción, cada una con una diana de
restricción diferente, lo que supone un inmenso material para la realización de estudios
filogenéticos y de mutaciones.

La mayor parte de las técnicas de análisis de los ácidos nucleicos requiere una fase previa
de amplificación, es decir, obtener un número de moléculas idénticas suficientemente
grande para poder realizar los estudios. Por esta razón las ADN polimerasas son un tipo de
enzimas clave en biología molecular.

Las ADN polimerasas permiten realizar copias de moléculas de ADN mediante replicación.

La técnica base en biología molecular es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que

permite obtener millones de copias de una secuencia de interés.
Las ADN polimerasas más usadas son de los tipos I y III. Para realizar su función requieren
que en el medio de reacción haya:

- Los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato.

- Un ADN molde.
- Cebadores.
- Mg2+ como cofactor.

Actualmente se dispone de numerosas polimerasas que se diferencian en:

- La velocidad de polimerización (nº de nucleótidos incorporados por segundo).

- La fidelidad en la replicación (proporción de errores).
- La termoestabilidad (temperatura a la que se inactivan).
- La procesividad (nº de nucleótidos que pueden incorporar antes de separarse de
la cadena molde).
- La presencia o ausencia de la actividad endonucleasa además de la actividad
polimerasa.

Dependiendo de la técnica en la que se vayan a usar, interesarán unos tipos u otros.

Por ejemplo:

- En la PCR, las muestras se someten a ciclos de desnaturalización, hibridación y

polimerización. Como en la fase de desnaturalización se alcanzan temperaturas por
encima de los 90 ºC, interesa trabajar con polimerasas de gran termoestabilidad.

- En el marcaje de sondas en la técnica de desplazamiento de mella primero se

producen las mellas en el ADN que se quiere marcar con una ADNasa 1 a baja
concentración y, después, se añaden nicleótidos trifosfato marcados y una ADN
polimerasa I para reparar las mellas. La enzima va retirando nucleótidos e
incorporando los nuevos marcados, quedando marcada la cadena nueva. En este
caso se requiere que la actividad exonucleasa tenga alta fidelidad en la
polimerización para que no haya errores e incorpore los nucleótidos marcados.

Las retrotranscriptasas o transcriptasas inversas son ADN polimerasas-ARN dependientes

que sintetizan moléculas de ADN usando como molde ARN. El ADN sintetizado se
denomina ADN copia (ADNc). Se han aislado de los retrovirus , virus cuyo material
genético es el ARN, que se retrotranscribe a ADN en la célula infectada y se integra en el
genoma de la célula huésped.

El empleo de estas enzimas ha permitido:

- Realizar estudios masivos de ARN. En concreto, en combinación con técnicas de

ADN recombinante, ha posibilitado la creación de genotecas de ADNc, fiel reflejo
de la expresión génica de una célula en un momento dado.
- La amplificación de ARN. La PCR convencional no amplifica ARN, puesto que las
ADN polimerasas que se emplean son ADN dependientes. Sin embargo, un paso
previo de retrotranscripción con un cebador específico permite obtener un ADNc
de la secuencia de ARN que queremos amplificar, sobre el cual podemos aplicar
después una PCR convencional. Este tipo de PCR que amplifica ARN se denomina
RT-PCR.

La desoxinucleotidil transferasa terminal (Tdt) es una ADN polimerasa que cataliza la

incorporación de desoxirribonucleótidos al extremo 3’ de una molécula de ADN. A
diferencia de otras polimerasas no necesita cebador ni cadena molde. En presencia de una
molécula bicatenaria de ADN y desoxirribonucleótidos, sintetiza colas de ADN
monocatenario en ambos extremos 3’.

Se han asilado de células linfoides inmaduras y de células de ciertos linfomas y leucemias.

Una de sus principales utilidades es el marcaje terminal de sondas con nucleótidos
marcados.

Las ligasas unen dos moléculas de ADN mediante formación de enlaces fosfodiéster entre
los extremos 3’ de una molécula y 5’ de la otra. También pueden reparar mellas en una de
las cadenas de un ADN bicatenario mediante la formación del correspondiente enlace
fosfodiéster. Son muy útiles en tecnología de ADN recombinante para unir fragmentos de
ADN de distinta procedencia previamente cortados por la misma enzima de restricción.
Existen también ligasas de ARN que permiten circularizar moléculas monocatenarias.

Las topoisomerasas relajan la tensión de la doble hélice de ADN próximas a las burbujas
de replicación o transcripción. Se utilizan para relajar estructuras superenrolladas de ADN,
como paso previo a la aplicación de otras técnicas de biología molecular.