Unidad de trabajo 4

LAS TÉCNICAS DE PCR

1. REACIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

La reacción en cadena de la polimerasa o PCR (del inglés “Polimerase Chain Reaction”) en

una técnica in vitro de amplificación de fragmentos de ADN.

La PCR es un proceso enzimático, catalizado por una ADN polimerasa, basado en la

replicación de ADN.

La técnica fue ideada en 1983 por Kary

Mullis, bioquímico norteamericano, con
la idea original de repetir
secuencialmente ciclos de replicación del
ADN para obtener múltiples copias a
partir de una única molécula de ADN. Por
esta invención recibió el premio nobel de
química en 1993.

Las nuevas copias obtenidas en cada ciclo son el molde para sintetizar otras nuevas copias
en los ciclos siguientes, con lo que conseguimos un aumento exponencial del número de
copias en cada ciclo de replicación sucesivo.

Para conseguir realizar este proceso hay que solucionar dos problemas:

- ¿Cómo conseguir que en cada - ¿Cómo conseguir que la ADN

ciclo se copie sólo el fragmento polimerasa no se inactive por las
que nos interesa? altas temperaturas alcanzadas en
la fase de desnaturalización?
La solución al primer problema fue el diseño de cebadores específicos que permiten la
amplificación exclusiva de un fragmento de ADN concreto.

La solución al segundo problema fue el descubrimiento de las ADN polimerasas

termoestables.

Los cebadores (o primers en inglés) son oligonucleótidos (cadenas de nucleótidos de

menos de 50 pares de bases) con una secuencia de bases nitrogenadas complementaria a
las regiones que bordean el fragmento que se quiere amplificar. Se diseñan siempre por
parejas y cada uno es complementario de una secuencia adyacente a la región de interés
pero en cadenas opuestas.

- El cebador que se va a unir a la hebra molde que tiene dirección 3’→5’ se

denomina cebador F (de forward, en inglés: adelante).

- El cebador que se va a unir a la hebra molde con dirección 5’→3’ se denomina

cebador R (de reverse, en inglés: hacia atrás).

El sustrato ideal para la ADN polimerasa es ADN monocatenario con una pequeña región
en doble hélice (que haga de cebador) a la que la ADN polimerasa se une e incorpora
nucleótidos complementarios a la hebra molde.

Por lo tanto, la pareja de cebadores delimita la región de la molécula de ADN que se va a

amplificar y que será la región comprendida entre ambos cebadores.
Los cebadores hacen posible la amplificación exclusiva de un fragmento de ADN de entre
una mezcla compleja de moléculas. Por supuesto, la secuencia debe ser única en el ADN
que se estudia.

Para el diseño de los cebadores es necesario conocer la secuencia de bases de las dos
regiones que bordean el fragmento que se desea amplificar. En condiciones ideales debe
cumplir una serie de requisitos:

- Su longitud debe estar comprendida entre 18 y 30 bases. Se considera que el

tamaño mínimo del cebador para que sea específico es de 16 bases. Los cebadores
de más de 30 bases dan más especificidad a la técnica pero tienden a unirse peor al
ADN molde. Aun así a veces se llegan a usar cebadores de hasta 40-45 bases.

- Los mejores resultados se obtienen con cebadores con contenidos en G+C

comprendido entre 40 y 60%. La distribución de los dominios ricos en A/T y G/C
debe ser equilibrada.

La región más importante del cebador es el extremo 3’ porque si esta región se une
al ADN molde (aunque no lo haga del todo el extremo 5’) la ADN polimerasa puede
iniciar la replicación. Por eso se recomienda que el extremo 3’ del cebador no
contenga secuencias de tres o más G/C seguidas, para evitar que puedan unirse de
forma estable e inespecífica a cualquier punto del ADN molde con tres o más G/C
seguidas.

- Los cebadores no deben

contener secuencias
complementarias intra- e
intermoleculares.

- Si hay secuencias cebador (bien consigo mismo o

complementarias bien con el cebador de la otra
intramoleculares, dentro del cadena), disminuyendo su
cebador, se pueden formar concentración efectiva en la
estructuras secundarias en el mezcla de reacción.
cebador, como horquillas, que
impidan la unión del cebador con
el ADN molde.

- Si hay secuencias repetidas

intermoleculares se puede
producir la dimerización
(formación de dímeros) del
 La ausencia de complementariedad entre cebadores es especialmente importante
en el extremo 3’ de ambos, para evitar la formación de dímeros que bloquean la
unión de estos extremos al ADN molde.

- La temperatura de fusión (Tm) de los cebadores debería estar en el rango entre 52

y 65 ºC. En todo caso la diferencia entre la Tm de ambos cebadores no debe ser
superior a 5 ºC para que su eficiencia de unión al ADN molde a una temperatura
dada sea similar.

Cada ciclo de la PCR debe comenzar por una fase de desnaturalización para que la ADN
polimerasa tenga el sustrato monocatenario que necesita para poner trabajar. Esto
supone tener que aumentar la temperatura, pero las ADN polimerasas convencionales se
inactivan a altas temperaturas.

En los primeros experimentos para diseñar la técnica esto se superaba añadiendo nueva
ADN polimerasa en cada ciclo, pero esto hacía que la técnica fuera muy costosa, larga, con
alto riesgo de contaminación y difícilmente automatizable.

Pero aparecieron las ADN polimerasas termoestables, aisladas de un grupo especial de

arqueobacterias termófilas.
Estas enzimas funcionan de la misma manera que las ADN polimerasas convencionales,
pero tienen dos diferencias que las hacen ideales para su uso en la PCR:

- Su temperatura óptima para trabajar está entre 70 y 75 ºC, lo que permite

hibridar los cebadores al ADN molde a temperaturas relativamente altas, para
maximizar la especificidad de la reacción.

- Mantienen su actividad polimerasa tras tiempos prolongados de incubación a

95ºC (por encima de 40 minutos), lo que garantiza que la enzima no se inactive
durante las fases de desnaturalización del ADN.

Las ADN polimerasas termoestables se clasifican en función de sus características:

- Actividad exonucleasa 5’-3’ pero sin actividad exonucleasa 3’-5’. Además de la

actividad polimerasa tienen actividad exonucleasa 5’-3’ pero no la otra, con lo que
no pueden corregir errores. Es el caso de la Taq ADN polimerasa cuya tasa de error
es, aproximadamente, de 1 por cada 100.000 nucleótidos.

- Actividad exonucleasa 5’-3’ y actividad exonucleasa 3’-5’. Tienen actividad

correctora ya que detectan cuando se incorpora un nucleótido erróneo, lo eliminan
y continúan la elongación de la cadena incorporando el nucleótido correcto. Su
tasa de error es del orden de 1 por cada 1.000.000 de nucleótidos incorporados.
Esto las hace especialmente útiles para PCR que requieren alta fidelidad.

- Actividad transcriptasa inversa. Algunas ADN polimerasas termoestables tienen

capacidad para usar ARN como molde en presencia de iones Mg 2+, por lo que
pueden usarse para sintetizar ADNc a partir de ARN.
Cada ciclo de la PCR consta de tres fases:

- Desnaturalización del ADN molde.

- Hibridación de los cebadores con el ADN molde.
- Extensión de los cebadores.

El resultado final de cada ciclo es la síntesis de una cadena nueva da ADN por cada
fragmento de ADN molde presente en la mezcla de reacción que, a su vez, servirá de
molde en el siguiente ciclo.

1. La fase de desnaturalización debe ser lo suficientemente larga y a una temperatura

suficientemente elevada para garantizar la desnaturalización completa del ADN molde, sin
prolongarse excesivamente para evitar la inactivación de la ADN polimerasa. Por ejemplo,
la Taq polimerasa pierde su actividad al someterse a 95ºC por más de 40 minutos.
Normalmente la fase de desnaturalización se realiza a 94-95 ºC durante 15-30 segundos.

2. La fase de hibridación de los cebadores con el ADN molde (annealing, en inglés) se

realiza habitualmente a una temperatura entre 50 y 65 ºC. El valor concreto depende de la
Tm de los cebadores y suele estar comprendido en el rango Tm ± 5 ºC. Si la temperatura de
hibridación es mayor que la Tm de los cebadores la especificidad es mayor pero el
rendimiento es menor. Si la temperatura de hibridación es menor que la Tm de los
cebadores el rendimiento de la hibridación es mayor pero la especificidad es menor y
pueden aparecer productos de amplificación no deseados por hibridación inespecífica de
los cebadores.

La temperatura óptima de hibridación se debe fijar experimentalmente para cada pareja

de cebadores. El tiempo estándar para la fase de hibridación oscila entre 30 y 60 segundos.

3. La fase de extensión o elongación de los cebadores por la ADN polimerasa se realiza a la

temperatura óptima de la ADN polimerasa concreta. En el caso de la Taq polimerasa es de
72 ºC.

El tiempo de esta fase está condicionado por la velocidad de la enzima y la longitud del
fragmento a amplificar. La Taq polimerasa, por ejemplo incorpora 60 nucleótidos por
segundo. Para esta enzima se recomiendan tiempos de extensión entre 30 y 45 segundos
para amplificar fragmentos menores de 1Kb, un minuto para fragmentos entre 1 y 1,5 Kb y
dos minutos para fragmentos entre 1,5 y 3 Kb. Para enzimas correctoras el tiempo de
extensión debe ser más prolongado, aproximadamente de 2 minutos por cada fragmento
de 1 Kb.

Tras un número n de repeticiones del ciclo básico de la PCR se obtienen varios productos
de amplificación, unos deseados y otros no, pero en proporciones muy distintas.

Mientras que el número de fragmentos no deseados aumenta aritméticamente, el número

de fragmentos deseados aumenta exponencialmente. (Enlace web:
http://medmol.es/tecnicas/13/).

2. TIPOS DE PCR

2.1.PCR estándar o convencional

Es la forma más simple de PCR, en la que se amplifica un único fragmento de ADN, con un
único par de cebadores. Para entenderla debemos estudiar cuatro aspectos:

- La composición de la mezcla de reacción.

- La preparación de la mezcla.
- La programación del termociclador.
- Análisis de los productos de la reacción.

La mezcla de reacción contiene todos los reactivos necesarios para la replicación del ADN.
Consiste en un tampón adecuado que tiene disueltos todos los reactivos necesarios. El
tampón aporta el pH y la concentración salina adecuados para la óptima actividad de la
ADN polimerasa con un máximo de fidelidad.

Suelen ser tampones a base de Tris con cloruro potásico (KCl), a un pH entre 8,3 y 9,0.
Normalmente el tampón se suministra en forma concentrada (2x, 5x ó 10x) conjuntamente
con la ADN polimerasa. Los reactivos que se disuelven en el tampón son principalmente:
cloruro de magnesio, desoxinucleótidos trifosfato, cebadores, ADN polimerasa y ADN
molde.

El cloruro de magnesio se necesita porque las ADN polimerasas termoestables necesitan

iones de magnesio (Mg2+) como cofactor para desarrollar su actividad. Estos iones se
aportan a la mezcla de reacción en forma de cloruro de magnesio (MgCl 2).

Cada ADN polimerasa tiene una concentración óptima de Mg2+ libre para su buen
funcionamiento. Por ejemplo, como referencia, la concentración final estándar de MgCl 2
en la mezcla de reacción para la Taq polimerasa es de 1,5 mM.

La mezcla de reacción debe contener los

4 desoxinucleótidos que componen las
moléculas de ADN en forma de
desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) para
que la ADN polimerasa pueda usarlos
como sustrato para incorporarlos a las
cadenas de ADN en crecimiento.
Los 4 dNTP deben estar presentes en la
misma concentración, pues en caso
contrario disminuye la fidelidad de la
enzima. La concentración final estándar
en la mezcla de reacción de cada dNTP es
200 μM.

Los cebadores son la clave para realizar una amplificación específica con éxito. La
concentración final de cada cebador en la mezcla de reacción debe ser la misma y debe
establecerse de forma experimental para cada pareja de cebadores.

Como referencia, concentraciones finales de entre 200 y 400 μM de cada cebador suelen
dar buenos resultados.
La ADN polimerasa es otro reactivo clave. La elección de la ADN polimerasa depende de la
fidelidad requerida en la amplificación, de la longitud del fragmento que se va a amplificar
y, a veces, de la secuencia que se va a amplificar.

La concentración óptima de trabajo de estas enzimas oscila entre 1 y 2,5 unidades para un
volumen de reacción final de 50 μM. El uso de concentraciones elevadas de ADN
polimerasa no supone ninguna mejora en el rendimiento de la reacción, pero sí un
considerable incremento del coste.

El ADN molde es un componente imprescindible ya que contiene el fragmento de interés

que se quiere amplificar. Normalmente se usa ADN purificado. Para que la PCR se
desarrolle de manera óptima hay que tener en cuenta tanto la calidad como la cantidad
del ADN molde:

- La calidad se refiere a un alto grado de integridad (alto peso molecular, no

degradado ni fragmentado y sin mellas), cociente A260/A280 entre 1,7 y 2,0 (lo
que garantiza que no está contaminado con proteínas) y libre de contaminantes
que puedan inhibir el proceso (bien por inactivación de la ADN polimerasa o por
secuestro de los iones Mg2+).
 - La cantidad idónea para obtener los mejores resultados depende de la
complejidad del ADN que se estudia. En el caso de ADN genómico humano,
cantidades de entre 100 y 300 ng suelen dar buenos resultados. Cantidades
demasiado pequeñas de ADN molde se traducirán en bajo rendimiento de la
reacción y cantidades demasiado grandes pueden potenciar la aparición de
productos no deseados.

A veces se usan potenciadores de la PCR que aumentan el rendimiento de la reacción o

disminuyen la aparición de productos no deseados. Estos aditivos tienen diferentes
mecanismos de acción y no siempre ejercen efectos beneficiosos, por lo que su uso se
debe limitar a los casos problemáticos, estudiando su efecto de forma experimental.

La preparación de las muestras requiere:

- Ajustar el volumen de la reacción. Decidiendo el volumen final de la mezcla, que

suele estar entre 25 y 50 μl. Luego se calculan los volúmenes de cada reactivo
dependiendo de la concentración final que deseemos. La diferencia entre la suma
de los volúmenes de cada uno de los reactivos y el volumen final de la mezcla se
completa con agua estéril grado PCR.

- Elaborar la mezcla “máster”. Las cantidades van a ser muy pequeñas (entre 0.5 y
5 μl), por lo que la probabilidad del introducir error en el pipeteo es muy elevada.
Si además se realizan múltiples reacciones simultáneamente, los posibles errores
cometidos en cada tubo son distintos. Para evitar esto y conseguir que la
composición de la mezcla de reacción sea homogénea para todas las pruebas que
se hagan al mismo tiempo, es preferible preparar una única mezcla de reacción,
denominada mezcla máster (en inglés “master mix”), que incluye todos los
componentes excepto el ADN molde.

La cantidad de cada componente se calcula multiplicando la cantidad necesaria

para una reacción por el número de muestras que se van a procesar al mismo
tiempo +1 (“mejor que sobre que no que falte”), teniendo en cuenta que en el
número de muestras hay que incluir los controles positivo y negativo.
 - Establecer los controles positivo y negativo. Además de la muestra problema, en
la que tendrá lugar la PCR, en cada tanda se prepara un control positivo y uno
negativo.

El positivo es un tubo de mezcla máster al que se añade ADN molde control que
contiene el fragmento que se quiere amplificar.

El control negativo o blanco es un tubo con mezcla máster en el que se sustituye el

ADN molde por un volumen igual de agua de grado PCR, de modo que no habrá
ADN presente en la mezcla para que se produzca la PCR.

2.2.Programación del termociclador

El termociclador es el aparato que lleva a cabo la PCR. Permite programar ciclos repetitivos
con varias temperaturas y tiempos de incubación para que la reacción se produzca de
forma automatizada. Una PCR estándar incluye tres etapas principales que terminan con
una incubación final de mantenimiento de los productos de reacción hasta su retirada de
la máquina:

- Desnaturalización inicial. Es la etapa que inicia la reacción. Se calienta la mezcla

de reacción a 94-95 ºC durante varios minutos para asegurar la completa
desnaturalización de todas las moléculas de ADN bicatenario presentes en la
mezcla.

- Ciclos de replicación. Se programan las temperaturas y los tiempos de incubación

de cada una de las fases del ciclo básico de PCR: desnaturalización, hibridación de
cebadores y extensión. Y también se programa el número de veces que se va a
repetir el ciclo (es decir el número de ciclos de replicación), que depende del
número inicial de copias del fragmento que se quiere amplificar.

Cuanto más abundante es el fragmento menos número de ciclos de replicación

serán necesarios. Típicamente el número oscila entre 25 y 35. Por encima de 40
ciclos existe una alta probabilidad de obtener productos no deseados y la ADN
polimerasa pierde actividad por el tiempo acumulado a temperaturas de
desnaturalización.

- Extensión final. Consiste en la incubación a la temperatura óptima de la ADN

polimerasa durante 5-10 minutos para asegurarnos de que todos los productos de
la PCR están completos y en forma de doble hélice.

- Mantenimiento. Se produce una última incubación a 4 ºC sin límite de tiempo

para mantener las muestras hasta que se retiran del termociclador, anulando la
actividad de la enzima.

3. Análisis de los productos amplificados

Una vez finalizada la PCR se recuperan las muestras del termociclador y se analiza el
resultado mediante una electroforesis en gel, normalmente de agarosa, 0,5 – 2,0%, junto
con un marcador de tamaños.
La presencia de una única banda del tamaño adecuado indica que la PCR ha funcionado
correctamente.

Si observamos varias bandas de distinto tamaño indica la presencia de productos

amplificados no deseados y, si eso ocurre, habrá que repetir la reacción variando la
programación del termociclador o la composición de la mezcla de reacción hasta conseguir
un resultado específico.

3.1.Resultado positivo

Cuando la PCR se realiza con fines exclusivos de detección, la observación de una banda
específica es suficiente para afirmar que la secuencia diana está presente en la muestra.
Pero si hay problemas de contaminación ¿cómo sabemos que no se trata de un falso
positivo? Para ello se hace, en cada tanda de PCR, un control negativo o blanco, en el que
el ADN molde se sustituye por agua de grado PCR. En la electroforesis la calle
correspondiente al blanco debe aparecer limpia, sin bandas.

3.2.Resultado negativo

La ausencia de una banda específica indica, en principio, que la muestra no contiene la

secuencia diana. Pero realmente esto no es condición suficiente para afirmar que el
resultado es negativo, porque algún reactivo empleado puede no haber funcionado
correctamente. Por eso se hace un control positivo de la técnica. Si todos los reactivos
funcionan bien, en el control positivo se observará una única banda específica. En caso
contrario hay algún problema con la mezcla máster y se invalida la tanda.

Cuando la PCR se usa con fines de amplificación para usar el amplicón en otras técnicas
(secuenciación, clonación…), una vez confirmado el resultado positivo de la PCR se
procede a purificar el amplicón, bien desde el gel o bien desde la mezcla de reacción para
posteriores usos.

4. Modalidades de la PCR estándar

La PCR estándar se usa mayoritariamente con fines diagnósticos, amplificando secuencia

menores de 3,5 kb, para lo que las condiciones descritas hasta ahora suelen dar buenos
resultados, pero el intento de minimizar la formación de productos no deseados o la
necesidad de amplificar fragmentos de gran tamaño o con gran fidelidad para otras
aplicaciones ha hecho que se desarrollen variantes de la PCR estándar. Algunos ejemplos
son:

- PCR con inicio en caliente. (Hot Start PCR, en inglés) En el periodo de preparación
de la mezcla de reacción, su transporte hasta el termociclador y hasta que se
alcanza por primera vez la temperatura de desnaturalización, se pueden generar
productos de amplificación no deseados. Por lo tanto de lo que se trata es de evitar
la actividad de la enzima a bajas temperaturas. Esto se puede lograr de diversas
maneras, como:
 Preparando la mezcla de reacción sin ADN polimerasa. Una vez las
muestras en el termociclador y alcanzados los 65 ºC se añadiría la enzima
individualmente en cada muestra. Esta técnica es engorrosa y aumenta el
riesgo de contaminación.

Aislando la ADN polimerasa del resto de los componentes de la mezcla.

Por ejemplo, esto se puede conseguir incluyendo la enzima en esferas de
cera de modo que cuando se alcancen temperaturas elevadas en la
desnaturalización inicial, la cera se funde y se libera la enzima.

Suministrando la ADN polimerasa inactiva. Bloqueándola con un

anticuerpo específico o bien modificándola químicamente mediante unión
termolábil a un grupo bloqueante, de forma que al alcanzar la temperatura
de desnaturalización inicial la enzima recobra su actividad.

- PCR de grandes fragmentos. El rendimiento de la PCR estándar suele disminuir

drásticamente al amplificar fragmentos mayores de 5 kb debido a la acumulación
de productos truncados debido, probablemente, a la incorporación de nucleótidos
erróneos que ralentizan o detienen la polimerización. La PCR de grandes
fragmentos permite aumentar el rendimiento al amplificar fragmentos entre 5 y 35
kb. El diseño de estas PCR afectan a la composición de la mezcla de reacción (se
usa una mezcla de dos ADN polimerasas termoestables, una de ellas con actividad
correctora) y a la programación del termociclador (aumentando el tiempo de
extensión de cada ciclo, hasta 25 minutos, y acortando los tiempos de
desnaturalización).

- PCR de alta fidelidad. Se realizan en condiciones especiales para evitar introducir

mutaciones puntuales en los amplicones por incorporación de nucleótidos
erróneos. En estos casos se usan ADN polimerasas termoestables con actividad
correctora y se ajustan bien las condiciones de la PCR, especialmente pH y
concentración de iones Mg2+.

5. Otras técnicas de PCR

- PCR anidada (nested-PCR). Consiste en la realización de dos PCR acopladas, de

modo que la segunda usa como ADN molde los productos de amplificación de la
primera.

Se usa para aumentar la sensibilidad en casos en que el rendimiento de la PCR

estándar es bajo (poca cantidad de producto amplificado) o para aumentar la
especificidad cuando no es posible evitar el acúmulo de productos no deseados
con una PCR estándar.

Los cebadores que se usan en ambas PCR son distintos: en la primera se usan
cebadores que amplifican una secuencia más larga (se llaman cebadores externos)
y en la segunda se usan cebadores que hibridan en el interior del fragmento a
amplificar (se llaman cebadores internos).
- PCR múltiple (Multiplex PCR). Consiste en la amplificación de varias secuencias
diana simultáneamente, en el mismo tubo, en una sola PCR. Se usan varios juegos
de cebadores que deben cumplir varios requisitos.

La temperatura óptima de todos los cebadores para hibridar con su

diana debe ser similar, puesto que se va a usar un único programa en el
termociclador.

Los amplicones generados tienen que tener un tamaño suficientemente

diferente para poder separarse por electroforesis y visualizarse como
bandas individuales.

Se deben diseñar de forma que no puedan hibridar entre ellos.

- PCR con transcripción inversa (RT-PCR). Permite amplificar y analizar moléculas

de ARNm. Para ello se necesita primero sintetizar ADNc mediante una
retrotranscriptasa y luego, que la ADN polimerasa use ese ADNc como molde u lo
amplifique.

- PCR a tiempo real. Todos los tipos de PCR que hemos visto anteriormente se
consideran reacción de punto final, es decir que no se conoce su resultado hasta
que la reacción ha terminado y se analizan los productos mediante electroforesis.

En la PCR a tiempo real se monitoriza la amplificación empleando productos

fluorescentes detectando los amplicones ciclo a ciclo.

Las ventajas de la PCR a tiempo real son:


Mayor rapidez en la detección cualitativa de secuencias diana en una
muestra, ya que el resultado se puede obtener incluso antes de terminar la
PCR.

Resultados más fidelignos, puesto que la detección instrumental de la

fluorescencia es más objetiva y sensible que la tinción con bromuro de
etidio de un gel de electroforesis.

Minimiza los problemas de contaminación, ya que tanto la amplificación

como la detección se realizan en el mismo tubo cerrado.

Permite la cuantificación, tanto de los amplicones producidos como del

ADN diana presente en la muestra.