PRIMER PREVIO DE ENZIMOLOGIA

PROTOCOLOS EXTRACION DE ENZIMAS:

ANIMALES, VEGETALES, MICROBIANO.

Profesor:

ANDRES FERNANDO BARAJAS SOLANO.

Biólogo

UNIVERSIDAD FRANCISO DE PAULA SANTANDER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE

INGENIERIA BIOTECNOLOGIA

SAN JOSE DE CUCUTA

2018

PROTOCOLO DE EXTRACION ENZIMA DE CELULAS ANILAMES

ENZIMA COLINESTERASA

La colinesterasa es un término que se refiere a una de las dos siguientes enzimas:

• La acetilcolinesterasa,también llamada Colinesterasa de glóbulo rojo (CGR),
colinesterasa eritrocítica, o (más formalmente) acetilcolina acetilhidrolasa, se
encuentra principalmente en sangre y sinapsis nerviosas.
• La pseudocolinesterasa,también conocida como colinesterasa sérica, butirilcolinesterasa, o
(más formalmente) acilcolina acilhidrolasa, se encuentra principalmente en el hígado.

La acetilcolinesterasa es una enzima situada en las hendiduras sinápticas y allí va a hidrolizar a la

acetilcolina, después de que ésta haya realizado su función mediante la unión a sus receptores,
permitiendo así que las sinapsis colinérgicas transmitan los impulsos nerviosos. La reacción
catalizada es la hidrólisis de la acetilcolina hasta colina y acetato:

• La acetilcolinesterasa es una esterasa tipo B y tiene un resto de SER en el centro activo y

cursa con un mecanismo de acción catalítica del tipo "catálisis covalente", con la generación
de un intermediario covalente.
• En el centro activo de la enzima se distinguen dos dominios, denominados esteárico, donde
reside el resto de SER, y aniónico donde tiene un GLU que le proporciona carga negativa,
adecuada para la aproximación y orientación del sustrato con su carga positiva.

La acetilcolinesterasa produce la inactivación de la acetilcolina, con la consiguiente disminución de

la transmisión del impulso nervioso. La acción de la acetilcolinesterasa es muy rápida: se estima que
es capaz de hidrolizar una molécula de acetilcolina en ácido acético y colina en un milisegundo. La
reacción química producida en este proceso es:

En la 1ª etapa de la reacción, el resto de SER del centro activo de la acetilcolinesterasa reacciona

con la acetilcolina, generándose un intermedio acetil-enzima y la liberación de la colina.

Paso 1: Acetilcolina + enzima (Acetilcolinesterasa) ------> Colina + Acetilcolinesterasa acetilada

En la 2ª etapa de la reacción se produce la hidrólisis de la acetil-enzima, regenerándose la

acetilcolinesterasa y liberándose el acetato.

Paso 2: Acetilcolinesterasa acetilada + H2O ------> Acetilcolinesterasa + ácido acético.

La diferencia entre los dos tipos de colinesterasa está en sus respectivas preferencias por sustratos:
la primera hidroliza acetilcolina más rápido; la segunda hidroliza butirilcolina más rápido.
Figura 1 .Estructura de la enzima Colinesterasa.

Protocolo.

Se vuelve a homogenizar
en 30 toques en
EXTRACION DE soluciones en hielo o Se fraccionan y se
COLINESTERASA. frias en un aparato centrifuga (5.000 x g por
PotterElvehjem con una 30 minutos a 5 °C
cinta de teflon.

Para la extracion 4.3% de Triton X-100 y 1 El sobrenadante

utilizamos 1 g de la mol de NaCl más base L- transparente ya esta listo
muestra humedo. 1 para el uso de los
ensayos.

Se homogeniao con 20
ml de cuatro soluciones 3.1 mol deL-1 HCL mas 1
diferentes que estan en base.
frio .

1. 10 mmol de L-1 Tris- 2. 3% Triton X-100 plus

HCL en un ph de 7 mas 1 base.
PROTOCOLO EXTRACION DE ENZIMA MICROBIAL.
ENZIMA PROTEASA.
Las peptidasas o proteasas son proteínas catalíticamente activas (enzimas) que adhieren a los
enlaces peptídicos en proteínas y péptidos por hidrólisis. Las peptidasas no solo descomponen las
proteínas y los péptidos para que los aminoácidos puedan reciclarse y usarse durante el crecimiento
y la remodelación, sino que también son importantes para modificar las proteínas. Estos eventos de
procesamiento aseguran que las proteínas se envían a las ubicaciones celulares o extracelulares
correctas, se activan o inactivan cuando es necesario y se extirpan los péptidos biológicamente
importantes. Hay seis tipos catalítsadores(serina, cisteína, treonina, aspártico, glutámico y metalo).
Las peptidasas se pueden clasificar por similitudes de secuencia en aproximadamente 250 familias,
y éstas a su vez se pueden organizar en aproximadamente 60 clanes mediante la comparación de
estructuras terciarias. Las proteasas se pueden encontrar en Animalia, Plantae, Fungi, Bacteria,
Archaea y virus.
Las proteasas se encuentran presentes en todos los seres vivos en los cuales participan tanto en la
hidrólisis de proteínas no deseadas así como en la regulación de diferentes procesos fisiológicos.
Estas enzimas se clasifican en:
• Específicas de sustrato

Las proteasas son capaces de romper enlaces peptídicos específicos, de su proteína blanco. Esta
proteólisis limitada produce péptidos y es incapaz de reducir estos a sus aminoácidos constitutivos.
• Inespecíficas de sustrato

Si pueden reducir un péptido completo a aminoácidos (proteólisis ilimitada).

• Inhibición

La función de las peptidasas es inhibida por inhibidores de la proteasa. Los inhibidores de proteasas
naturales no se deben confundir con los inhibidores de proteasas usados en la terapia anti-retroviral.
Algunos virus, incluyendo al VIH, dependen de las proteasas en sus ciclos reproductivos, por eso los
inhibidores de proteasas se desarrollan como métodos antivirales.

Figura 2 . Estructura de la Proteasa

Protocolo.

El medio de cultivo ya
preparado se centrifuga a
EXTRACION DE El sobrenadante se utiliza
3200 rmp x g por 1 h y se
como solucion cruda
PROTEASA. refrigera a 4 °C0 para
enzimatica.
eliminar las micelios
fungicos y las impureas.

Se disuelve en un
Precipita gradualmente El precipitado se
volumen minino de 0,1 %
hasta al 80 % con sulfato centriguda a 3200 rmp x g
TrisHCL buffer con un ph
de amonio saturado. por 30 minutos .
de 9.

Se dialisa contra 0,1 mM El sobrenadante se

de buffer de fosfato de recolecta y ya esta listo
potasio,por 48 horas a 4°C para el uso de ensayos

PROTOCOLO DE EXTRACION DE ENZIMA VEGENTAL.

ENZIMA PEROXIDASA.

Las peroxidasas son enzimas que utiliza como cofactor el grupo hemo,que usan peróxido de
hidrógeno como aceptor de electrones para catalizar una serie de reacciones oxidativas. La
mayoría de las peroxidasas hemo siguen el esquema de reacción:
Fe3 + + H2O2 -> [Fe4 + = O] R '(Compuesto I) + H2O [Fe4 + = O] R' + sustrato -> [Fe4 + = O] R
(Compuesto II) + sustrato oxidado [Fe4 + = O] R + sustrato -> Fe3 + + H2O + sustrato oxidado.
Las peroxidasas se encuentran en bacterias, hongos, plantas y animales y se pueden ver como
miembros de una superfamilia que consta de 3 clases principales. La clase III comprende las
peroxidasas de plantas secretoras, que tienen múltiples funciones específicas de tejido, por ejemplo,
eliminación de peróxido de hidrógeno de cloroplastos y citosol; oxidación de compuestos tóxicos;
biosíntesis de la pared celular; respuestas de defensa hacia herir; catabolismo del ácido indol-3-
acético (IAA); biosíntesis de etileno; y así. El amplio espectro de actividad de la peroxidasa, junto
con la participación en diversos procesos fisiológicos, está en consonancia con su relativa falta de
especificidad para los sustratos y la aparición de una variedad de isoenzimas. Las peroxidasas
vegetales son glicoproteínas monoméricas que contienen 4 puentes disulfuro conservados y 2 iones
de calcio.
Figura 2.Estrustura de la Peroxidasa.
Protocolo
EXTRACION
PEROXIDASA
Para remover las
impuresas , como la
catalasa, se calienta a 65
°C por 3 minutos
La enzima cruda se
guarda en el refigerador y
se llava a temperatura
ambiente despues de
cada experimento.
La muestra se lava ,
cortan, muelen usando
un cilcel y mescladas con
Se filtra usando un paño
la ayuda de 2000 g de
de cincel.
buffer de fosdato con ph
7, con esto se prepara el
estracto puro.
El sobrenadante es
llevado y filtrado con un se centrifuga 8000 rmp x
filtro de papel whatmann 10 minutos , para
y se guarda como un remover pequeñas
estracto crudo en un vaso impuresas
de precipitado
Bibliografía.

-Acetilcolinesterasa. Bioquímica Ambiental. Universidad de Alcalá. Recuperado de

http://www3.uah.es/bioquimica/Tejedor/bioquimica_ambiental/tema12/tema%2012-
acetilcolinesterasa.htm
-Matos,M.,Becerra,A.,Marcião,M.,Salles,J.,Bastos,J.,Cunha ,B., Hauser,R.(2017). La importancia
de un protocolo de extracción eficiente para el uso de colinesterasas del músculo de pescado
como biomarcadores.Talatan, volumen 169,6-7.Recuperado de
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0039914017312158.
- Rawlings, N., Barrett, A.2014. Peptidases. Citable reviews in the life sciences.Recuperado de
http://www.els.net/WileyCDA/ElsArticle/refId-a0000670.html
-Omolara, O., Folagbade, A., Víctor, E., David, S.2015. Extracción, purificación y caracterización de
proteasa de Aspergillus Niger aislado de cáscaras de ñame. International Journal of Nutrition and
Food Sciences, volumen 4.126.Recuperado de
http://article.sciencepublishinggroup.com/pdf/10.11648.j.ijnfs.20150402.11.pdf
- Plant peroxidase. Protein sequence analysis & classification .InterPro.Recuperado de
http://www.ebi.ac.uk/interpro/entry/IPR000823
-Rathnamsam, S., Singh, R., Auxilia.R., Vedhahari, B.2014. Extracción de peroxidasa de varias
fuentes vegetales y sus estudios de biodegradación sobre compuestos fenólicos.
Biotechnology.Volumen 9.161.