DETERMINACIÓN SIMULTÁNEA DE SIETE ALDEHÍDOS ENDÓGENOS EN SANGRE HUMANA MEDIANTE

CROMATOGRAFÍA DE GASES DEL ESPACIO DE CABEZA Y ESPECTROMETRÍA DE MASAS

RESUMEN

Los aldehídos endógenos (EAs) formados por la reacción mediada por radicales libres se consideran marcadores
biológicos potenciales de varias enfermedades. En este trabajo, se desarrolló un método analítico automatizado y sin
disolventes para el análisis cuantitativo de siete EAs (C1-C7) en sangre humana mediante cromatografía de gases-
espectrometría de masas acoplada con un muestreador generador de espacio de cabeza (HS-GC-MS). Se introdujo una
dilución 1:4 (sangre: agua) y el estándar interno de 1,2-dibromopropano para reducir la influencia del efecto de la matriz
de los fluidos biológicos complejos. Los pasos de preparación de la muestra se simplificaron. Se estudiaron varios
parámetros experimentales para la derivación y las condiciones de extracción, como la temperatura y el tiempo de
extracción del HS, la cantidad de reactivo de derivación, el pH y el efecto salino. En estas condiciones óptimas, se
separaron y analizaron siete aldehídos de baja masa en 10 minutos. Además, este método logró límites de detección en
el rango de 0.0692-0.864 μg / L, una excelente linealidad con coeficientes de correlación superiores a 0.9996 y valores
de repetividad y reproducibilidad apropiados (RSD <12% en niveles bajo, medio y alto). El método HS-GC-MS se aplicó
para medir las concentraciones de los siete aldehídos en la sangre de pacientes con cáncer de vejiga (n = 15) y sujetos
control (n = 15). En comparación con los sujetos control, los niveles de butanal (p <0,01), formaldehído, acetaldehído,
propanal, pentanal, hexanal y heptanal (todos p <0,001) aumentaron significativamente, lo que indica que el
MANUSCRITO ACEPTADO MANUSCRITO ACEPTADO 3 EA puede ser útil como biomarcadores En el diagnóstico precoz del
cáncer de vejiga.

Palabras clave: Aldehídos endógenos; Cromatografía de gases-espectrometría de masas; Técnica de espacio de cabeza
estático; Sangre; Cáncer de vejiga.

1. INTRODUCCIÓN

Los aldehídos endógenos (EAs) se forman por el metabolismo de los aminoácidos, carbohidratos, lípidos, aminas
biogénicas, vitaminas y esteroides [1]. El proceso de peroxidación lipídica en el que una variedad de especies reactivas
de oxígeno / nitrógeno (ROS / RNS) atacan los residuos de ácidos grasos poliinsaturados de los fosfolípidos es una fuente
importante de aldehídos endógenos, lo que demuestra que la reacción mediada por radicales libres se produce durante
la formación de EAs [ 1,2]. Las células tumorales humanas producen grandes cantidades de radicales que conducen a un
aumento en la concentración de aldehído [3,4], y se encontraron niveles notables de aldehído en la sangre y la orina de
pacientes con cáncer [5,6]. Por lo tanto, varios aldehídos se pueden considerar como biomarcadores potenciales de
cáncer, y se espera que la cuantificación precisa de EAs en fluidos biológicos sea una parte importante del diagnóstico
clínico precoz de enfermedades en el futuro.

Las técnicas de separación cromatográfica se han utilizado comúnmente para la determinación de aldehídos. Es
necesaria una etapa de derivación antes de la extracción y el análisis cromatográfico, ya que los aldehídos son altamente
polares, químicamente inestables, volátiles y no contienen cromóforos ni fluoróforos [7]. La dinitrofenilhidracina (DNPH)
es el reactivo de derivación utilizado con mayor frecuencia para la separación por cromatografía de líquidos (LC),
seguido de la selección de diodos o espectrometría de masas (MS) [8-12]. Sin embargo, varios inconvenientes impiden el
uso de DNPH en la determinación de compuestos aldehídos; por ejemplo, el formaldehído no se puede cuantificar con
precisión debido a la alta incertidumbre de las señales MS de su derivado de DNPH [11], y el metilglioxal requirió más de
12 horas para reaccionar con DNPH [13]. La cromatografía de gases / espectrometría de masas (GC-MS) se ha aplicado
ampliamente al análisis de aldehídos de baja masa molecular [14-17] debido a su rápido análisis y alta sensibilidad. Se
han reportado varios reactivos de derivación utilizados en GC, tales como 2,3-diamino-2,3-dimetilbutano (DDB) [18],
2,4,6-triclorofenilhidracina (TCPH) [19], pentafluorofenilhidracina (PFPH) [20] y O-2,3,4,5,6- (pentafluorobencil)
hidroxilamina (PFBHA) [15,16,21-24]. Debido a que los aldehídos producen oximas estables y volátiles a temperatura
ambiente por reacción con PFBHA, los métodos de análisis GC-PFBHA se consideran una alternativa útil al análisis LC-
DNPH.

Debido a la presencia de diversas interferencias y trazas de aldehídos en muestras biológicas, se adoptan

procedimientos de limpieza y enriquecimiento para reducir el efecto de la matriz y mejorar la sensibilidad del método.
Debido a las desventajas bien conocidas de las técnicas de muestreo convencionales para la determinación de aldehídos,
las técnicas de microextracción como la microextracción en fase sólida (SPME) [22,25] y la microextracción de gota única
(SDME) [19,23] han atraído un interés creciente. Sin embargo, la SPME es propensa a la transferencia de muestras y es
relativamente costosa debido a la vida útil limitada y la fragilidad de la fibra [26], mientras que la SDME requiere
operaciones manuales más elaboradas. La técnica de muestreo de espacio de cabeza (HS) es un método de preparación
de muestras rápido, automatizado y sin disolventes.

El uso de HS con GC puede minimizar el tratamiento de la muestra y evitar las interferencias de componentes no
volátiles en las matrices [27]. Recientemente, Serrano et al [24] han introducido un método analítico sensible de HS – GC
– MS que utiliza orina en blanco diluida para la detección de doce aldehídos en la orina. Basándose en este método, se
realizó un método analítico automático, de bajo costo y sin disolventes para las EAs, y se minimizó el fuerte efecto de la
proteína de la matriz.

Algunos informes se han centrado en la presencia de aldehídos en la orina [11,24,27,28] para la detección de varias
enfermedades debido a la naturaleza no invasiva del método de detección. Solo unos pocos han sido reportados en la
sangre, que pueden relacionarse directamente con las actividades internas del cuerpo humano. En estos estudios, el
hexanal y el heptanal se han detectado con frecuencia [7,12,22,23].

Sobre la base de las consideraciones mencionadas anteriormente, esta investigación se centró en los siguientes
aspectos: (i) desarrollo de un método HS-GC-MS automático y sin disolventes para cuantificar siete aldehídos, incluido el
hexanal y el heptanal, en la sangre de pacientes con cáncer de vejiga; (ii) reducir el efecto de matriz de las muestras de
sangre con una proporción de dilución apropiada y estándar interno (IS); y (iii) simplificando el paso de preparación de la
muestra con un paso de derivación y extracción de HS solamente. Los resultados obtenidos mostraron que los objetivos
de este trabajo se han realizado para los siete EA en sangre humana.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Material

El formaldehído (C1, 36% -38%, solución p / v en agua), propanal (C3, pureza> 98%) y butanal (C4,> 98.5%) se compraron
a Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Shanghai, China). El acetaldehído (C2, 40%, solución p / v en agua) se adquirió
de Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (Tianjin, China). Hexanal (C6,> 95%) y heptanal (C7,> 95%) fueron comprados de la
industria química de Tokio (Tokio, Japón). Metanol (99.9%), pentanal (C5, 97%), o-2,3,4,5,6-
pentafluorobencilhidroxilamina clorhidrato (PFBHA, 98%) y el estándar interno 1,2-dibromopropano (5.0 mg / mL,
Solución en metanol) fueron suministrados por J&K Chemical (Beijing, China). El bicarbonato de sodio (> 99.5%) se
compró en Sitong Chemical Factory (Tianjin, China). El carbonato de sodio (> 99.8%) se compró de Hengxing Chemical
Reagent (Tianjin, China). El liofilizador FD-1C-50 se compró en Bilon (Shanghai, China). Los tubos anticoagulantes EDTAK
se adquirieron de Hepeng Biological (Shanghai, China).

2.2 Estándares y muestras de sangre

Las soluciones madre individuales se prepararon con agua purificada utilizando un Milli-Q sistema (Millipore, Francia)
que contiene los compuestos en concentraciones de 3.75-5.42 mg / mL. El estándar interno se diluyó con metanol hasta
la concentración de la solución de reserva intermedia, y las soluciones obtenidas se almacenaron en viales de vidrio
ámbar a -30. Se obtuvo una solución de PFBHA mediante la dilución del producto químico puro con agua hasta 50 mg /
ml. Las soluciones de trabajo se prepararon diariamente mediante la dilución adecuada de cada solución madre en agua
con la adición de 50 μL de IS.
Las muestras de sangre de 15 pacientes con cáncer de vejiga y 15 sujetos sanos se recolectaron mediante venopunción
en viales de recolección de sangre que contenían EDTAK como anticoagulante del Primer Hospital Afiliado de la
Universidad de Zhengzhou. Posteriormente, las muestras de sangre se almacenaron a -80 en la oscuridad y se midieron
dentro de los 10 días posteriores a la recolección.

2.3 Preparación de la muestra

Se añadió 1,2-dibromoprane (50 μL, 0,5 μg / l) y una solución estándar mixta a la sangre (1 ml) en un vial de espacio de
cabeza (20 ml), y luego la solución se diluyó con agua hasta 5 ml. A continuación, se añadieron sales de tampón (0,5 g) y
PFBHA (2 mg, 50 mg / ml) a la solución. Luego, el vial se selló inmediatamente y se agitó en vórtex durante 10 segundos
y se derivó durante una hora a 50ºC. Después de enfriar a temperatura ambiente, el vial se colocó en un inyector
automático, se introdujo en un horno HS para incubar durante 30 minutos a 80, y luego se sometió a un análisis de GC.

2.4 Análisis HS-GC-MS

El análisis de la muestra se realizó utilizando un gas TRACE ISQ TM cromatógrafo-instrumento de espectrometría de masas
acoplado con un automuestreador Triplus HS y un sistema de procesamiento de datos Xcalibur. Los compuestos se
separaron utilizando una columna capilar HP-5MS (5% de difenil-95% -dimetilpolisiloxano, 25 m × 0.20 mm i.d., 0.33 µm,
Agilent Technologies).

Las condiciones operativas fueron las siguientes: el tiempo de equilibrio del vial se programó en 30 minutos, y la
temperatura del vial se mantuvo a 80; se aplicó ionización por impacto de electrones a 70 eV; el espectrómetro de
masas funcionó en el modo de monitoreo de iones seleccionado (SIM); y la temperatura de la línea de transferencia y la
temperatura de la fuente de iones se mantuvieron a 250. La inyección se llevó a cabo en el modo de división (relación de
división 50: 1) con una temperatura de entrada de 200; gas portador de helio se pasó a una velocidad de 1 ml / min, y se
utilizó un retraso de disolvente de 4 min.

La temperatura de la columna se programó para cambiar de 40 (mantenido durante 2 min) a 110 a una tasa de 20 ℃ /
min, luego se incrementó a una tasa de 10 ℃ / min a 125 ℃, seguido de un aumento de la tasa de 20 ℃ / min a 250 ℃ y
mantener durante 2 min.

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1 Preparación de la matriz de decapado

Se diseñó un experimento para comparar dos métodos de producción de matriz de extracción "sangre en blanco". En el
primer método, después de descongelar completamente la muestra de sangre congelada, se colocó sangre humana sana
en un baño de agua a 60 ° C bajo agitación continua durante 2 horas. Se observaron pequeñas cantidades de derivados
de formaldehído-PFBHA, lo que demuestra que el formaldehído no se eliminó por completo. Continuamos la agitación
durante 2 horas adicionales, obteniendo el resultado mostrado en la Fig. 1A. Formaldoxime todavía estaba presente, y el
color de la sangre era más profundo que el de la sangre fresca. Por lo tanto, este método se abandonó debido al cambio
en la composición de la matriz y la contaminación del aire del laboratorio. En el otro método, la muestra de sangre se
colocó en un horno de secado por congelación al vacío durante 24 horas después de la congelación en un congelador de
temperatura ultra baja a -80 ℃ durante 24 horas. Se obtuvo un resultado satisfactorio. En el cromatograma (Fig. 1B) no
aparecieron picos distintos de los de PFBHA. Por lo tanto, en experimentos posteriores, la matriz de extracción "sangre
en blanco" se preparó utilizando el segundo método.

3.2 Efecto matricial

La determinación de las EAs se vio gravemente afectada por las fuertes interacciones entre los aldehídos diana y los
componentes de la matriz, como la proteína. La dilución de la matriz se puede utilizar para superar este problema [29].
Se puede lograr una menor viscosidad y un mayor coeficiente de difusión con una mayor dilución para mejorar la
eficiencia de extracción del HS. Sin embargo, la dilución de las muestras conducirá a un aumento en los límites de
detección. Por lo tanto, es necesario encontrar un nivel adecuado de dilución para reducir el efecto de la matriz
mientras se asegura la sensibilidad analítica.

La solución estándar mixta que incluye siete aldehídos se agregó a la sangre en blanco y luego se diluyó 2, 4, 5, 6 y 10
veces con agua ultra pura, respectivamente. La Fig. 2 muestra las respuestas analíticas medidas por HS-GC-MS para las
muestras con diferentes relaciones de dilución. Las áreas de los picos de siete aldehídos continúan aumentando y llegan
a la cima cuando la proporción alcanza 1:4 (sangre: agua). Por lo tanto, se seleccionó la relación de dilución 1:4 para el
análisis de las EAs. Con la excepción del formaldehído y el acetaldehído, se observaron áreas de picos similares para los
aldehídos con diluciones 1:1 y 1:9, lo que sugiere que los aldehídos sufren un fuerte efecto de matriz que no se puede
eliminar simplemente diluyendo la muestra. Por lo tanto, la calibración interna en sangre en blanco diluida se utilizó
para la cuantificación de las EAs. No se observaron diferencias significativas entre las recuperaciones (entre 92% y 106%)
obtenidas de sangre humana y sangre en blanco con la dilución 1:4.

3.3 Optimización de la reacción derivada

Los aldehídos se transforman en las oximas correspondientes por adición nucleófila reversible. El pH de la muestra juega
un papel clave en la formación de oximas. La influencia del pH en esta reacción se estudió en el rango de pH de 8,5 a
10,7 porque las oximas se pueden preparar en medios básicos como se describe en la literatura [17,26]. Se usaron
diferentes proporciones de bicarbonato de sodio y sales de carbonato de sodio para ajustar el pH. Las sales se agregaron
a la matriz de extracción "sangre en blanco" enriquecida con la solución estándar de mezcla antes de que se obtuvieran
los aldehídos diana. La Fig. 3A muestra las áreas de los picos obtenidos a diferentes niveles de pH. Se observó un
aumento apreciable en la señal analítica a pH 10.34, y luego la señal de respuesta disminuyó debido a la posible
descomposición de las oximas a los alcoholes y nitrilos correspondientes [30].

El efecto de la cantidad de PFBHA sobre la eficiencia de la derivación se estudió en 1.5, 2, 2.5 y 3 mg. Para todos los
compuestos de oxima excepto para la oxima de butiraldehído, las áreas de pico más alto se obtuvieron con 2 mg de
PFBHA. Teniendo en cuenta el contenido del reactivo de derivación en exceso, se eligieron 2 mg de PFBHA para esta
reacción de derivación (Fig. 3B).

3.4 Efecto salado

En el análisis de HS, la fuerza iónica tiene un gran impacto en la volatilidad de los componentes objetivo. En este caso,
las sales añadidas pueden compensar las fuerzas iónicas, que puede variar considerablemente entre las diferentes
muestras en la sangre [29]. Se agregaron bicarbonato de sodio y carbonato de sodio a la solución para evaluar el efecto
de la fuerza iónica en las muestras de sangre. En comparación con la extracción con un contenido de sal de 0,02 g / ml,
la eficiencia de extracción de todos los aldehídos mejoró con la adición de 0,1 g / ml de sales (Fig. 4). Para butanal,
pentanal y hexanal, las áreas de los picos se mejoraron en un factor de 2-3. Por lo tanto, se requirió el efecto de salado
para mejorar la sensibilidad de este método, y un contenido de sal de 0.1 g / mL fue una opción apropiada para
experimentos adicionales.

3.5 Optimización de la extracción del HS

La presión de vapor y el coeficiente de reparto entre las fases líquida y gaseosa se ven afectados por la temperatura de
equilibrio y el tiempo de equilibrio. Estos parámetros fueron seleccionados para la optimización de extracción de HS.

La Fig. 5A muestra el efecto de la temperatura de equilibrio en las áreas de los picos. La señal aumentó lentamente
antes de 70. Después de eso, se observó un rápido crecimiento a 80 ℃, pero no se utilizaron temperaturas superiores a
80 in para evitar la posible desnaturalización de la proteína y la descomposición de los aldehídos diana. Las señales de
respuesta de las EAs en diferentes tiempos de equilibrio con la misma temperatura de 80 se muestran en la Fig. 5B. Se
observa que la cantidad de aldehídos aumentó con el tiempo hasta 30 min. Basado en estos resultados, 80 ℃ y 30 min
fueron elegidos como las condiciones óptimas de extracción.

3.6 Validación del método

Los aldehídos diana en la sangre se detectaron mediante la medición de las oximas correspondientes. La separación
eficiente de los compuestos de oxima en condiciones óptimas se realizó en 10 min. Se usaron iones específicos para
identificar cada aldehído como se muestra en la Tabla 1. Además del formaldehído, se obtuvieron dos productos, a
saber, Z-oxima y E-oxima, después de que los aldehídos se derivaron con PFBHA. Por lo tanto, la suma de las áreas de los
picos del isómero Z y E se usó para la cuantificación. La relación de las áreas de los picos de los aldehídos objetivo a la de
la IS se utilizó para la calibración.

Las propiedades del método, como la linealidad, los límites de detección, la precisión y la recuperación se evaluaron en
las condiciones químicas e instrumentales óptimas (Tabla 1 y Tabla 2). Las curvas de calibración muestran una excelente
linealidad en el rango de 0.01-4 μg / mL con coeficientes de correlación superiores a 0.9996. LOD y LOQ se calcularon
utilizando el software Xcalibur sobre la base de las relaciones de señal a ruido de tres y diez, respectivamente. Los
valores LOD oscilaron entre 0.0692 y 0.864 μg / l. La precisión expresada por la desviación estándar relativa (RSD) se
estudió a niveles de concentración bajos, medios y altos en el mismo día y tres días diferentes. Un examen de los datos
muestra que se obtuvo una buena repetibilidad (intradía) y reproducibilidad (interdía), con un promedio de RSD.

valores de 1.9-9.7% y 3.4-11.9%, respectivamente. Se usó una prueba de recuperación para evaluar la precisión de este
método mediante la adición de cantidades conocidas de cada aldehído a tres niveles de concentración diferentes por
triplicado, y el resultado (recuperación que varía de 92 a 106%) muestra que no se observó ningún efecto de matriz en la
determinación de EAs en sangre humana para este método.

3.7 Análisis de aldehídos endógenos en sangre humana

El método de HS-GC-MS propuesto se aplicó para determinar siete EA en 30 muestras de diferentes individuos (15
pacientes con cáncer de vejiga y 15 personas sanas). Las figs. 6 y 7 muestran los cromatogramas y diagramas de caja
obtenidos de la sangre de pacientes con cáncer y personas sanas, respectivamente. Los aldehídos C1-C7 se detectaron
en la sangre de los pacientes a niveles de concentración más altos en comparación con el grupo de control, en particular
para el propanal y el hexanal.

Se realizó un análisis estadístico de los datos para evaluar las posibles diferencias entre los pacientes con cáncer de
vejiga y las personas normales, aunque el número de muestras fue limitado (Tabla 3). Se pueden hacer algunos
comentarios a partir de los datos: con la excepción del formaldehído, las concentraciones promedio de las EAs en la
sangre del paciente fueron varias veces más altas que las concentraciones normales; El formaldehído, el acetaldehído, el
propanal, el pentanal, el hexanal y el heptanal mostraron diferencias extremadamente significativas (p <0,001) y el
butanal mostró una diferencia significativa (p <0,01).

4. CONCLUSIONES

En este trabajo, se desarrolló un método simple, automatizado y respetuoso con el medio ambiente basado en HS con
GC-MS para la determinación de siete EAs en sangre de pacientes con cáncer de vejiga. En el método propuesto, los
aldehídos se detectaron con buena precisión y utilizando sangre humana diluida y un estándar interno para evitar la
influencia del efecto de la matriz, y se aplicaron sales de tampón para mejorar la sensibilidad de este método. Según
nuestro conocimiento, este es el primer informe sobre el uso de HS-GC-MS para la determinación simultánea de estas
EAs en la sangre del paciente con cáncer de vejiga. Los resultados muestran diferencias significativas en las
concentraciones de estos aldehídos en comparación con la sangre de los sujetos sanos, y estos aldehídos pueden
considerarse como los biomarcadores del cáncer de vejiga.