MÉTODO

PRODUCTOS QUÍMICOS Y SUSTRATOS SÓLIDOS.

Todos los productos químicos eran de grado Analar y, a menos que se indique lo
contrario, se obtuvieron de BDH y se fabricaron en agua destilada de vidrio. A
excepción de la biotina y la 1,4-naftoquinona (BDH) y la neomicina (Pfizer), todas las
vitaminas y antibióticos se obtuvieron de Sigma. Los sustratos insolubles incluyeron
Avicel (Schleicher & Schiill), Whatman no. 1, papel de filtro, y paja de cebada molida
(cv. Sonja). El papel de filtro Whatman no. 1 se utilizó para placas de superposición de
celulosa y se trató con ácido fosfórico (Wood, 1971) y luego se molió guijarro durante
4 d a 4 "C.

PREPARACIÓN DE MEDIO.

Los medios fueron preparados, almacenados e inoculados utilizando las técnicas

asépticas y anaeróbicas de Hungate (1950), Bryant (1972) y Miller & Wolin (1974). A
excepción de la solución del agente reductor (preparada y dispensada bajo N sin
oxígeno?), los medios líquidos y las soluciones utilizadas para preparar los medios se
dispensaron bajo CO libre de oxígeno. Se utilizaron dos tipos diferentes de medios;
medio A, que contenía fluido ruminal, y medio B, que no lo hacía. Los medios sólidos se
prepararon mediante la adición de agar bacteriológico oxoide nº 1 (concentración
media final, 18 g I F 1 ) a la solución basal.

MEDIO A.

Medio A contiene, por litro: solución basal A, 830 ml; agua (cuando se utilizaron
sustratos insolubles) o solución de glucosa(37-5 g I - I), 100 ml; Na,CO, solución (80 g
I-'), 50 ml; solución vitamínica, 10 ml; y solución de agente reductor, 10 ml. A veces se
reemplazaron 60 ml de agua con 50 ml de solución antibiótica y 10 ml de solución de
lisozima.

Solución basal A contiene: extracto de levadura, 2 g; Peptona de trippticasa, 2 g;

líquido ruminal clarificado (Bryant & Robinson, 1961), 150 ml; solución de sales
minerales [según lo descrito por Leedle y Hespell (1980) excepto que la fuente de
nitrógeno fue de 0,54 g NH,CI I-'], 75 ml; K,HPO, solución (6 g I-'; Leedle & Hespell,
1980), 75 ml; solución de haemin, 10 ml; solución de ácidos grasos, 10 ml; solución de
resazurin ( I g l-l), 1 ml. El pH de la solución basal A se ajustó a 6,8 con 1 M-KOH y el
volumen se hizo hasta 830 ml con agua o una suspensión de celulosa (concentración
media final 10 g I - I) para las placas superpuestas de celulosa. La solución de Haemin
se preparó disolviendo 0,1 g de haemin en 10 ml de etanol y ajustando el volumen a 1
litro con 0,05 M-NaOH. La solución de ácidos grasos se preparó mezclando 6.85 ml de
ácido acético, 3,0 mL de ácido propiónico, 1,84 ml de ácido butírico, 0,55 ml de ácido
2-metilbutírico, 0,47 ml de ácido isobutírico, 0-55 ml de ácido valérico y 0,55 ml de
ácido isovalérico con 700 ml 0.2 M-NaOH. El pH de la mezcla de ácidos grasos se ajustó
a 7,5 con 1 M-NaOH y su volumen se ajustó a 1 litro con agua.
La solución vitamínica se preparó en BUFFER 5 mM-HEPES y contiene (g 1 - l): 1.4-
naphthoquinone, 0.25; D-pantothenate de calcio, 0.2; nicotinamida, 0.2; riboflavina,
0.2; tiamina. HCl, 0.2; piridoxina. HCI 0,2; biotina, 0,025; ácido folico, 0,025;
cianocobalamina, 0,025; y ácido p-aminobenzoico, 0,025. La solución del agente
reductor contenía 2.5 g de Na2S.9H2O y 2.5 g de L-cisteína. HCl en 100 ml de agua
ANAEROBEO. La solución antibiótica contiene (g I-'): sulfato de estreptomicina, 2;
penicilina G, 8 ; cloranfenicol, 6; oxitetraciclina, 5 ; sulfato de neomicina, 6. La
solución de lisozima contenía lisozima (4 g 1-1) más EDTA (sal disódica; 3 g 1-I).

La solución basal A, Na, CO, glucosa, agua y la solución del agente reductor se pre-
redujeron (hervidos y gaseados con CO libre de oxígeno), mientras que el agar basal A
se cocine al vapor durante 40 min y luego se pre-redujo.

MEDIO B.

El medio B por litro contiene: 810 ml de solución basal B, 10 ml de solución KH2P04,

(68 g 1 elevado a - 1) y 10 ml de solución de extracto de levadura (50 g 1elevado a -1);
100ml de agua (cuando se utilizaron sustratos insolubles) o solución de glucosa(37.5 g
1 elevado a - 1); 50 ml de Na2CO3, solución (80 g I-'); 10ml de solución vitamínica; y
10ml de solución de agente reductor. A veces se reemplazaron 60 ml de agua con 50
ml de solución antibiótica y 10 ml de solución de lisozima.

Solución basal B contiene: KCI 0,6 g; NaCl 0,6 g; MgSO4 . 7H2O 0.5 g; CaCl2. 2H2O 0,2
g; NH4Cl 0,54 g; Tripticasa peptona 1 g ; buffer PIPES 1-5 g; solución de coenzima M 10
ml; solución de ácidos grasos 10 ml; solución de oligoelementos 10 ml; solución de
haemin 10 ml; solución de resazurin (1 g l-l) 1 ml.

El pH de la solución se ajustó a 6,8 con 1 M-KOH y el volumen se hizo hasta 810 ml con
agua o con una suspensión de celulosa. La solución de coenzima M se preparó
disolviendo la sal de sodio de 2-mercaptoethane sulphonic acid en agua para dar una
concentración de 4 g I-'. La solución de oligoelementos se preparó en 0,2 M-HCl y
contiene (g 1-I): MnCI20 .4H2O, 0,25; NiCl2. 6 H2O, 0.25; NaMoO4.2H2O, 0.25; H3BO3,
0,25; FeSO4. 7H2O, 0,20; CoCl2 .6H2O, 0-05; SeO2, 0.05; NaVO3. 4H2O, 0.05; ZnCI2,
0,025; CuCl2. 2H2O, 0.025. Todas las demás soluciones fueron las mismas que para la
solución basal A.

Las soluciones de KH2PO4 y extracto de levadura no se redujeron previamente antes

de la adición al medio final.

ESTERILIZACIÓN Y PREPARACIÓN DE MEDIOS LÍQUIDOS Y SÓLIDOS.

Las soluciones antibióticas, lisozimas y vitamínicas se esterilizaron por filtración por

membrana (diámetro de poro de 0,22 pm). Las soluciones de glucosa se autoclavaron a
115 °C durante 10 min y todas las demás soluciones y medios de agar se autoclavaron
a 121° C durante 15 min.
Los medios líquidos se dispensaron en volúmenes de 10 ml en tubos de vidrio de
paredes gruesas o en volúmenes de 100 ml en botellas de suero de 125 ml. Para los
cultivos cultivados en paja de cebada molida, se agregaron 0,1 g de sustrato a cada
tubo y se autoclavó (121 "C durante 15 min) antes de la adición de 10 ml de medio. Los
cultivos de placas de Petri (4,7 cm de diámetro) contenían 2 ml de medio de agar en el
que el agua reemplazó a la solución de glucosa, y esta x

MUESTRAS DE RUMEN Y CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO.

Las muestras de digesta ruminal se recolectaron por succión en termos llenos de C0,
termos llenos de ovejas fistuladas (alimentadas con ryegrass perenne más concentrado
de cebada) y bovinos (novillos de 5 meses alimentados con ryegrass perenne y vacas
lecheras no lactantes alimentadas con ensilaje de ryegrass perenne más concentrado
de cebada) y se filtraron a través de dos capas de muselina antes de la inoculación del
medio líquido.

El enriquecimiento fúngico se logró incubando I ml de rumen digesta con 0,1 g de paja

de cebada molida y 10 ml de medio líquido B que contenía antibióticos y lisozima.
Después de 5 d de incubación, los cultivos se transfirieron a la cámara anaeróbica y se
utilizaron partículas de paja colonizadas para inocular placas de agar B medio de
celulosa que contenía antibióticos y lisozima. Las placas inoculadas se invirtieron en
frascos anaeróbicos, se retiraron de la cámara y se incubaron durante 5 d. Los frascos
se devolvieron a la cámara, se retiraron las placas de Petri y se utilizaron pipetas
Pasteur estériles para transferir pequeños tapones (de aproximadamente 1 mm de
diámetro) desde el margen de las colonias al medio líquido B, que contenía glucosa
pero no antibióticos ni lisozima. Se utilizó un tapón para inocular cada tubo y se
tomaron rutinariamente cinco tapones del margen de cada colonia de hongos. Tales
colonias tenían un diámetro final de aproximadamente 2 cm y eran hasta 10 veces más
grandes que las que se desarrollaron en tubos de rollo (Joblin, 1981). Los cultivos
líquidos se retiraron de la cámara y se incubaron durante 5 d, momento en el que se
descartaron los cultivos contaminados y se retuvieron los cultivos puros. Este
procedimiento de aislamiento depende de la capacidad de los 'rizoides' para crecer
radialmente hacia afuera del inóculo y de las bacterias contaminantes.

AGITACIÓN DE CULTIVOS.

Los cultivos de botellas de suero se incubaron a 39 "C en una coctelera rotativa a I00
r.p.m. Los pesos secos se midieron cosechando los cultivos en Whatman no prelavado,
seco y pesado. 1 papel de filtro, lavando la biomasa con 200 ml de agua destilada y
secando a 55" C a peso constante.

ANÁLISIS DE PRODUCTOS DE FERMENTACIÓN.

Los sobrenadantes de cultivo se acidificaron (0,05 ml 3 M-H ~ SO, p er 2 ml de

sobrenadante de cultivo) y los ácidos grasos volátiles y el etanol se determinaron a
partir de extractos acidificados por GC (Hewlett Packard GC 5700A con detector de
ionización de llama). La columna de vidrio (2 m x 2 mm de diámetro interno) se
empaquetó con malla Chromosorb 101, 60-80 (Separaciones de fase); la temperatura
del horno fue de 150°C para la determinación de etanol e I70"C para la determinación
de ácidos grasos volátiles. Se utilizó nitrógeno como gas portador y la cuantificación se
logró mediante la comparación de las horas pico y las áreas pico con las de los
compuestos de referencia. El formiato y el lactato fueron determinados por los
métodos de Hopner & Knappe (1974) y Nanni & Baldini (1964) respectivamente.

Para la evaluacion de porcentaje digestibilidad de materia seca in vitro se tiene que

hallar la diferenia de materia seca inicial vs materia seca final a un lapso de 8 horas, 24
horas y 72 horas de fermentación de gases.
%DIVMS.

Evaluación de ph

Evaluaion de de digestibilidad in vitro