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MICROOSCOPIA
INTRODUCCION:
Existen 2 tipos de colorantes que pueden ser utilizados; los colorantes naturales que se
obtienen a partir de plantas o animales y los colorantes artificiales que son obtenidos
gracias a los minerales procesados o hechos por mano del hombre al ser manipulados en el
laboratorio. A su vez, las tinciones pueden ser clasificadas como simples (sucede cuando
toda la muestra llego a tomar 1 solo color al utilizarse un solo colorante), por otro lado,
tenemos la tinción diferencial (Llega a tomar 2 colores o más ya que se utiliza más de un
colorante, usualmente usando colorantes Gram o Ziehl-Neelsen), “también se conoce la
tinción específica (Se hace uso de anticuerpos con fluorescencia para lograr identificar una
estructura celular en particular” (Luis Esaú López-Jácome, y otros, 2014).
Si tenemos en cuenta las técnicas de tinción Gram o Ziehl-Neelsen, primero debemos fijar
la muestra, esto con la finalidad de que la estructura de las células pueda ser visibles de
mejor manera. Entre los procesos para fijación físicos de muestras tenemos “desecación,
calor seco, calor húmedo, ultrasonido y microondas; mientras que para la fijación química
podemos dividirlo en oxidantes y reductores” (Luis Esaú López-Jácome, y otros, 2014).
OBJETIVOS
METODOLOGÍA:
Describir en la metodología paso a paso de forma escrita y con gráficos, cada tipo de las
tinciones utilizadas para cada microorganismo (tinción Gram, tinción de flagelo, tinción de
esporas)
TINCIÓN GRAM
Las bacterias presentan características determinantes y constitutivos en la pared celular, la
cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo. Así la pared celular no
tan sólo le sirve para dar forma, rigidez y tamaño a la célula, sino que soporta altas presiones
osmóticas que pueden llevarla a una muerte segura por lisis osmótica.
El péptidoglicano es la sustancia que le confiere la rigidez a la pared celular y le brinda
todo el soporte que está necesita.
Esta tinción constituye un tipo de tinción diferencial ya que clasifican las bacterias entonces
grandes grupos Gram Positivas y Gram Negativas en virtud a la coloración que este
desarrollo y la coloración dependerá de la diferencia constitutiva en la estructura de la pared
celular de las bacterias. (Gram, 1884)
1. El colorante 2. Luego el Lugol 3. La mezcla de 4. Las bacterias Gram
básico cristal o yodo de Gram alcohol - acetona Positivas (Debido a sus
violeta penetra en entra en las células tiene como función gruesas paredes de
las células y constituye un determinante en la péptidoglicano y pocos
bacterianas tanto de complejo insoluble decoloración ya lípidos no son
microorganismos con la solución que la misma es permeables al decolorar
Gram Positivos acuosa de cristal soluble al complejo puesto que este
como de Gram violeta. que se ha formado deshidrata la pared
Negativos. cristal violeta - celular y cierra los
yodo de Gram. poros, alterando y
afectando el pequeño
espacio entre las
moléculas, el complejo
cristal violeta – yodo
queda atrapado dentro
de la pared celular
teniendo a las bacterias
Gram positivas de
color azul o violeta) no
se decolora. Mientras
que las Gram Negativas
se decolora, finalmente
se adiciona la
Safranina que es un
tinte de contraste cuya
función es poner de
manifiesto las bacterias
que están decoloradas
es decir les da color a
las bacterias Gram
Negativas. Tomando
una tonalidad rojiza.
TINCIÓN DE FLAGELO
Los flagelos, largos y finos apéndices de las células bacterianas que les permiten
desplazarse, son tan flacos que resultan invisibles al microscopio óptico, si no se hace una
técnica particular para su tinción. Los diversos procedimientos de tinción usan
combinaciones de mordientes y metales para engrosar los flagelos, así como colorantes
para teñirlos (Anonimo, 2015).
TINCIÓN DE ESPORAS
Las endosporas son organélos de resistencia de algunas bacterias, se producen en el interior
de las células.
Tienen una capa externa resistente formada de ácido dipicolínico y peptidoglicano.
En tinción simple se ven como cuerpos incoloros o refrágiles dentro de la bacteria (Sánchez
Paz, 2017).
TINCIÓN NELSSEN
La tinción de Ziehl-Neelsen en una técnica de coloración para identificar microorganismos
alcohol-ácido resistentes (AAR). El nombre de este procedimiento de microbiología hace
referencia a sus autores: el bacteriólogo Franz Ziehl y el patólogo Friedrich Neelsen.
Esta técnica es un tipo de coloración diferencial, lo que implica el uso de distintos
colorantes con la finalidad de crear contraste entre las estructuras que se desean observar,
diferenciar y posteriormente identificar. La tinción de Ziehl-Neelsen sirve para identificar
ciertos tipos de microorganismos (Briceño, 2021).
Clasificación
Tipos de
tinciones
Tinción Tinción
Tincion simple
diferencial estructural
Tinción simple:
Este tipo de tinción utiliza solo un solo colorante, por esta razón, la muestra solo adquiere
un color que nos permite reconocer fácilmente la morfología y agrupación de los
microorganismos. La finalidad de que se utilice un solo colorante tiene que ver con el
comportamiento específico del microorganismo frente a cada tipo de colorante.
Tinción Diferencial:
Este tipo de tinciones son las más utilizadas en la microbiología ya que se encuentra
enfocada en las áreas de salud. Se caracteriza por utilizar más de un colorante, con la
finalidad de poder observar claramente las reacciones de los microorganismos de acuerdo
con un colorante en específico, esto sucede por la composición química que tiene cada tipo
de colorante. Esto ayuda a clasificar de mejor manera a los microorganismos dependiendo
de su capacidad de tinción.
• Tinción de Gram
Las bacterias Gram Positivas llegan a tener una coloración azul o violeta, mientras que
las bacterias tienen una coloración rosa clara. Esta clara diferencia se da por la
estructura de estos microorganismos. Por ejemplo, en el caso de las Gram Positivas,
quienes poseen una red mureína de múltiples capas (formando una capa gruesa), hace
que la coloración pueda notarse con facilidad; caso contrario con las bacterias Gram
Negativas, estas tienen una sola capa delgada de mureína, por lo que se nota un color
rosado tenue.
Entre algunos de los microorganismos que podemos observar con la Tinción Gram
tenemos al “Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas
aeruginosa, y al más conocido Escherichia coli” (González Meléndez, Elizalde
Cuevas, Cortés Cruz, & Orduña Sánchez, 2020).
También llamado como tinción de ácido alcohol resistencia, ya que una de sus
características más importantes es la capacidad de separar los bacilos tuberculosos de
los microorganismos relacionados. Este método es rápido, fácil y de muy bajo costo,
por lo que suele ser utilizado en muchos laboratorios clínicos.
Principalmente este tipo de tinción es utilizada para la observación de Micobacterias,
ya que estos microorganismos están cubiertos por un material grueso que es resistente a
la tinción (por presentar varios tipos de ácidos grasos, alcoholes y carbohidratos), la
técnica de Ziehl Neelsen llega a ser muy efectiva.
La razón de que este método resulta ser muy efectivo por la solubilidad de las ceras,
lípidos y otros ácidos grasos presentes en la pared celular, gracias a la utilización de un
mechero. Ya que, al aplicar calor, va a existir mayor concentración de los colorantes.
Sin embargo, los compuestos que antes se encontraban más solubles (en un estado más
liquido) vuelven a solidificarse al enfriarse.
“Algunos de los microorganismos que se tiñen con la Tinción de Ziehl Neelsen son
Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium phlei” (González Meléndez, Elizalde
Cuevas, Cortés Cruz, & Orduña Sánchez, 2020).
• Tinción de Kinyoun
Este tipo de tinción fue hecha en base a la tinción de Ziehl Neelsen, pero con ciertas
variaciones, por ejemplo, la tinción de Kinyoun no utiliza el proceso del mechero
(aplicar calor a la muestra), y tampoco utiliza el mismo colorante. Así mismo, este
método ayuda a observar a las micobacterias o patógenos similares. Un punto a favor
es que la tinción lleva mucho menos tiempo que la de Neelsen, por lo que es más
efectivo de usar.
Tinción Estructural:
• Cápsulas
-Tinta china: No se puede tiñen con tinta cristal violeta o la safranina entonces para
reconocer una tinción negativa lo haremos con tinta china. En esta tinción se emplea el
cromógeno ácido que posee una carga negativa lo que hace que repele a la célula con carga
negativa y dicha célula permanece sin teñir contra un fondo coloreado. El colorante no tiñe
a los microorganismos y la capsula se desplazará a las partículas de carbono coloidal de la
tinta china. Los microorganismos que sean positivos se observaran con un halo claro en su
capsula sobre un fondo negro.
La especie que puede ser observada con tinción china es Klebsiella pneumoniae.
- Rojo Congo: Este tipo de tinción se empleará a los dos reactivos (al rojo Congo y al
mordente de capsula), esta tinción penetra al cuerpo del Bacilo sin teñir por lo que su zona
de halo será transparente con un color rojo alrededor del bacilo. Lo que hace este colorante
que no logra teñir a los microrganismos, por lo que la capsula se desplazara a las partículas
del colorante y así teñir el fondo de rojo.
La especie que puede ser observada con tinción de rojo Congo es Cryptococcus
neoformans.
• Esporas:
-Schaeffer fulton: Las endosporas son muy poco permeables y son formas de resistencias
deshidratas por lo que son difíciles de teñir, pero si calentamos la preparación para así
permeabilizarlas. Los pasos para esta tinción son:
La especie que puede ser observada con la tinción de Schaeffer fulton es Bacillus Cerus.
• Gránulos metacromáticos
-Albert: Los gránulos tienen una afinidad fuerte por colorantes básicos, y lo que hace esta
tinción es teñir a los gránulos metacromáticos de azul y el resto de la célula tendrá un color
de verde claro, a este fenómeno se lo conoce como metacromasia porque se tiñen con el
colorante de Albert.
La especie que puede ser observada con la tinción de Albert es Corynebacterium xerosis.
-Loeffer: Para esta tinción es lo mismo que la anterior, nos ayudan a identificar a los
gránulos metacromáticos. Este colorante tiñe a los gránulos de color azul intenso y resto de
células darán a un color de azul claro. El colorante que se utiliza es el azul de metileno.
La especie que puede ser observada con la tinción Loeffer es Corynebacterium diphtheriae.
Bacillus thuringiensis
(González Meléndez, Elizalde Cuevas, Cortés Cruz, & Orduña Sánchez, 2020)
Tinción
Gram
Tinción gram, según Luego, Se aplica el Aplicamos el alcohol- Y finalmente
(C, 2021) : Lugol o yodo de cetona, el cual sirve aplicamos el colorante
Gram. Con el cual la para la decoloración,. de contraste, que
A la muestra se le coloración de nuestra En este proceso se corresponde a la
aplica el colorante → bacteria se degrada un visualiza que solo Safranina. Finalmente
cristal violeta, y se poco. algunas de las se logra observar a las
puede observar que las bacterias se quedan de bacterias Gram
todas las bacterias se una coloración positivas(morado) y
tiñen de morado morada mientras que Gram
oscuro otras pierden el color. negativas(rosado/rojo)
Tinción
de
esporas
(DIRI
NVES
TIGA,
2007)
Pseudomonas putida
(Larkings, 2016)
Tinción
Gram
(Stewa
rd,
2019)
Tinción gram, según Luego, Se aplica el Aplicamos el alcohol- aplicamos el colorante
(C, 2021) : Lugol o yodo de cetona, el cual sirve de contraste, que
A la muestra se le Gram. Con el cual la para la decoloración,. corresponde a la
aplica el colorante, coloración de nuestra En este proceso se Safranina. Finalmente
cristal violeta, y se bacteria se degrada un visualiza que solo se logra observar a las
puede observar que las poco. algunas de las bacterias Gram
todas las bacterias se bacterias se quedan de positivas(morado) y
tiñen de morado una coloración Gram
oscuro morada mientras que negativas(rosado/rojo)
otras pierden el color
Staphylococcus aureus
(Staphylococcus aureus)
Tinción
Gram
(Stewa
rd,
2019)
Clostridium botulinum
(Aldonza, 2016)
Tinción
Gram
Tinción gram, según Luego, Se aplica el Aplicamos el alcohol- aplicamos el colorante
(C, 2021) : Lugol o yodo de cetona, el cual sirve de contraste, que
A la muestra se le Gram. Con el cual la para la decoloración,. corresponde a la
aplica el colorante, coloración de nuestra En este proceso se Safranina. Finalmente
cristal violeta, y se bacteria se degrada un visualiza que solo se logra observar a las
puede observar que las poco. algunas de las bacterias Gram
todas las bacterias se bacterias se quedan de positivas(morado) y
tiñen de morado una coloración Gram
oscuro morada mientras que negativas(rosado/rojo)
otras pierden el color
Tinción
de
esporas
(DIRI
NVES
TIGA,
2007)
Vibrio cholerae
(Arévalo, 2003)
Tinción
Gram
Tinción Gram, según Luego, Se aplica el Aplicamos el alcohol- aplicamos el colorante
(C, 2021) : Lugol o yodo de cetona, el cual sirve de contraste, que
A la muestra se le Gram. Con el cual la para la decoloración,. corresponde a la
aplica el colorante, coloración de nuestra En este proceso se Safranina. Finalmente
cristal violeta, y se bacteria se degrada un visualiza que solo se logra observar a las
puede observar que las poco. algunas de las bacterias Gram
todas las bacterias se bacterias se quedan de positivas(morado) y
tiñen de morado una coloración Gram
oscuro morada mientras que negativas(rosado/rojo)
otras pierden el color
Tinción
de
flagelos
Candida albicans
(Erasmus MC)
Tinción
Gram
Tinción gram, según Luego, Se aplica el Aplicamos el alcohol- aplicamos el colorante
(C, 2021) : Lugol o yodo de cetona, el cual sirve de contraste, que
A la muestra se le Gram. Con el cual la para la decoloración,. corresponde a la
aplica el colorante, coloración de nuestra En este proceso se Safranina. Finalmente
cristal violeta, y se bacteria se degrada un visualiza que solo se logra observar a las
puede observar que las poco. algunas de las bacterias Gram
todas las bacterias se bacterias se quedan de positivas(morado) y
tiñen de morado una coloración Gram
oscuro morada mientras que negativas(rosado/rojo)
otras pierden el color
DISCUSIÓN:
1) Explicar cómo identifica a cada microorganismo como Gram positivo o Gram
negativo, argumentando con explicación de la estructura de cada
microorganismo.
o Bacillus thuringiensis
Este microorganismo es Gram positivo porque su pared es gruesa y no tiene espacios
perisplasmáticos.
o Pseudomonas putida
Este microorganismo es de Gram negativo aerobio porque son pequeños y tienen espacios
perisplasmáticos.
o Staphylococcus aureus
Son de Gram positivas por sus paredes gruesas y no tener espacios perisplasmáticos ni una
membrana extra.
o Clostridium botulinum
Son de Gram positivos ya que tienen un gran tamaño, su pared es gruesa y no tiene espacios
perisplasmáticos.
o Vibrio cholerae
Es de Gram negativo ya que es un bacilo anaerobio, fermenta glucosa y son sensibles a la
acidez.
o Candida albicans
Son de Gram positivas porque tienen una pared gruesa y tienen gran cantidad de proteínas y lípidos
(Steward, 2019).
o Pseudomonas putida
El tipo de flagelo del Pseudomonas putida es Anfítrico, ya que los flagelos se encuentran en
cada polo de la bacteria.
o Staphylococcus aureus
No forman ningún tipo de flagelo.
o Clostridium botulinum
El tipo de flagelo del Clostridium botulinum es monótricos porque solo tiene un flagelo.
o Vibrio cholerae
El tipo de flagelo del Vibrio chlolerae es monótricos ya que presenta un solo flagelo.
o Candida albicans
El tipo de flagelo del Candida albicans es monótricas ya que solo tiene un único flagelo.
o Bacillus thuringiensis
El tipo de espora del Bacillus thuringiensis es terminal de forma ovalada.
o Pseudomonas putida
No forman esporas.
o Staphylococcus aureus
No forman esporas, pero si pueden tener cápsula.
o Clostridium botulinum
El tipo de esporas del Clotridium botulinum es terminal con formas ovales o esféricas.
o Vibrio cholerae
No forma esporas.
o Candida albicans
El tipo de esporas del Candida albicans es terminal (Steward, 2019).
PREGUNTAS:
1. Describir los requisitos indispensables que debe tomar un laboratorio de
bioseguridad tipo 2.
• Tener siempre puesto la ropa protectora, como un mandil blanco con el fin de
poder observar fácilmente cualquier derrame, así mismos zapatos cerrados,
cabello recogido, mascarilla, gorro, gafas protectoras.
• Tener la mesa de trabajo al descubierto, las puertas se mantienen cerradas y
llevan las debidas señales de riesgo biológico (Ilja, 2003).
CONCLUSIONES:
• Gracias al conocimiento del marco teórico, como de los procedimientos de la
tinción Gram, se logró reconocer y comprender las características específicas de las
bacterias Gram Positivas y las bacterias Gram negativas, al analizar su estructura de
forma macroscópicamente como de forma microscópicamente.
• Lograr identificar las diferentes formas y tipos de tinción para cada microorganismo
diferenciando entre bacterias Gram negativas y Gram positivas, y reconocer los
otros tipos de tinciones que nos ayudan a distinguir la cápsula, esporas, gránulos.
• Se investigó cada una de las tinciones que se pueden utilizar, como se emplean los
diferentes colorantes para reconocer al microorganismo presentado en el informe en
cuestión.
• Con el objetivo de dibujar las diferentes muestras de microrganismos, podemos
lograr comprender de una manera más práctica las estructuras y comportamientos
que presentan los mismos.
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