SEMINARIO 1

HISTOLOGÍA

-NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LA
MATERIA Y SU ESTUDIO
MORFOLÓGICO
-INSTRUMENTOS OPTICOS DE
ESTUDIO
-MICROSCOPIA
 NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LA MATERIA
Anatómico Tisular Celular

Tisular

Subcelular

Microfotografía electrónica de un soma neuronal, 15.000X

Unidades de medida que se utilizaran en el curso:

1 mm = 1000 µm ( µm : micrómetro)
1 µm = 1000 nm ( nm : nanómetro)
1nm = 10 Å ( Å : Angstrom )

El microscopio óptico se basa en la utilización de la luz

visible
MICROSCOPIOS
-
COMPUESTOS
Microscopía óptica y electrónica
 PARTES DE UN MICROSCOPIO
ÓPTICO

FORMACIÓN DE LA IMAGEN EN UN
MICROSCOPIO ÓPTICO
 Luz blanca
 Ondas electromagnéticas
 Distintas longitudes de onda
 Se desvía en su trayecto al
pasar por medios de distinto
índice de refracción
 Al pasar por compuestos
coloreados son absorbidos
determinados rayos
PARTES DEL MICROSCOPIO ÓPTICO

Estático Pie
Brazo
Platina
Tubo

Parte óptica : Espejo Aparato de

Condensador Iluminación
Diafragma

Objetivo
Ocular
MODELOS DE MICROSCOPIOS ÓPTICOS
 Ganglio linfático,
Mucosa olfatoria humana corteza profunda, H y E
H y E x 540 x 400.
 REFRACCIÓN A TRAVÉS DE UNA LÁMINA DE
VIDRIO DE CARAS PARALELAS
Indice de refracción (IR) de un medio:

Relación entre la velocidad de la luz en un determinado medio

EJ : vidrio) y la velocidad de la luz en el vacío.

VIDRIO
AIRE

AIRE
VIDRIO
REFRACCIÓN A TRAVÉS DE UNA LENTE
BICONVEXA (empleadas en microscopía)
 Marcha de rayos

Lado de la lente donde se

Lado de la lente donde forma la imagen
se ubica el objeto
Centro de la lente
Distancia Focal
Punto focal Eje óptico
objeto Imagen

Punto focal
objeto

Lente biconvexa
 FORMACIÓN DE LA IMAGEN

Lente objetivo
Lente ocular

La imagen es mayor, virtual e invertida

FORMACIÓN DE LA IMAGEN
ABERRACION DE ESFERICIDAD ABERRACIÓN CROMÁTICA
Corrección de aberraciones cromáticas y de esfericidad
 Oculares

• Monoculares
• Binoculares
• Trinoculares (generalmente el tercer ocular
es para adaptar una cámara fotográfica, de
video o una salida de señal que puede ir a
un Analizador de Imágenes.
Hepatocitos observados con el
MO. Técnica de H&E.

Epitelio intestinal observado con el MO.

Técnica de coloración H&E.
 CONCEPTOS RESLACIONADOS CON LA
FORMACIÓN DE LA IMAGEN

-Poder de resolución

- Aumento

- Poder de penetración o profundidad de foco

- Poder de definición

- Distancia frontal
 LIMITE DE RESOLUCIÓN
Límite de resolución (LR)
Es la distancia mínima que debe haber entre dos puntos de un
objeto para que se visualicen como separados

El LR del ojo humano es de 0,1mm

Si estos dos puntos están separados por una

distancia menor de 0,1 mm se verán como
un solo punto
D
Límite de Resolución (LR)

0.61 x λ
0,61 X λ
LR = =
n x senα AN
AN : Apertura numérica
Objetivo
n : índice de refracción del aire = 1
(que está entre el preparado y la lente objetivo)
λ longitud de onda (Luz blanca:550 nm)
α α = semiángulo de apertura.

Preparado

LR = 0,25µm (microscopio óptico )

Poder de Resolución

1/ LR = PR
 ¿Cómo se puede mejorar el Poder Resolutivo del MO?
Se logra un mayor PR si se obtiene un menor LR. Para ello:

0.61 X λ 1) λ : Utilizando filtro azul

LR = n x senα
se aproxima λ
a los 400 nm
Objetivo
Este rayo no contribuye
a formar la imagen
α
2) n
Aire n=1

Objetivo
Utilizando aceite de inmersión
n =1.52
α
α Aceite de inmersión
El rayo entra dentro de la lente
objetivo y contribuye en la
formación de la imagen
 Cálculo del aumento
• El aumento o magnificación se obtiene multiplicando la
magnificación del objetivo por la del ocular.
• Ejemplos:
• Ocular y objetivo seco débil.: 10X multiplico por 10X= 100X.
• Ocular y objetivo seco fuerte: 10X multiplico por 40X= 400X.
• Ocular y objetivo de inmersión: 10X multiplico por 100X=
1000X.

Aumento máximo útil: 500-1000 la AN del objetivo

TIPOS DE MICROSCOPIOS
-
ÓPTICOS
 Tipos de microscopios ópticos según
iluminación: Fundamentos y utilidades
• Campo claro (la mostrada previamente)
• Campo oscuro
• Luz polarizada
• Contraste de fase
• Contraste diferencial de interferencia
(Optica Nomarsky)
• Epifluorescencia
• Confocal
• Por excitación de dos fotones
Tipos de iluminación:
 Microscopio de campo oscuro
• Se ilumina el objeto de
forma oblicua usando
un condensador
especial. Sólo la luz
que impacta
oblicuamente al objeto
entra al objetivo.
• Empleo de objetivos
de baja AN (<1.1)
Borrelia
-El objeto se ve brillante sobre
fondo oscuro.
-Se ven contornos o bordes, no la
estructura interna.
-Se ven objetos que con campo
claro no se ven por falta de
contraste.
Cultivo celular -Pueden distinguirse, aunque no
resolverse, estructuras que no se
distinguen con el MO común.
-Pueden visualizarse células vivas.
Permite estudios dinámicos.
Microscopio de contraste de fase: convierte la
diferencia de fase en diferencia de intensidad
 Microscopio de contraste de fase
Convierte las cambios de fase en variaciones de intensidad.

1/2 long onda de dif: anula 1 long onda de dif: suma

Microscopio de contraste de fase

Diafragma anular y
placa de fase en el
objetivo (anillo
transparente).

Imagen intermedia
formada por
interferencia de todos
los rayos

Ventaja: estudio de
células vivas. Permite
estudios dinámicos.
 Fibroblasto en cultivo

Campo claro Contraste de fase

Interferencia diferencial Campo oscuro

Distintos tipos celulares en cultivos observados
con contraste de fase
 Microscopio de luz polarizada

- Luz polarizada
- Polarizador y analizador:
Prismas de espato de Islandia o Nicol, Discos polaroid (lámina de nitrato
de celulosa)
- Cuerpos isotrópicos o monorrefringentes
- Cuerpos anisótropos o birrefringentes
rayo ordinario
rayo extraordinario (polarizado)
 Microscopio de luz polarizada
Consta de:
 Un polarizador: está debajo del
condensador.
 Un analizador: Encima de las lentes
objetivos.
Prismas de espato de Islandia o Nicol
Discos polaroid (lámina de nitrato de
celulosa)

Cuando estos están cruzados no hay

transmisión de luz polarizada.

• Rotar el objeto para encontrar el

brillo máximo o mínimo.
• fibras colágenas, fibras musculares
estriadas, mielina,
• cristales
Cristales de imidazolato observados con microspio de luz polarizada
Microscopio de interferencia diferencial (DIC)
- Se hacen visibles las diferencias de
velocidad que sufren los rayos
luminosos al atravesar un objeto
transparente (diferencia de fase) :
como diferencias de intensidad o de
coloración.
- Aspecto de relieve.
- Luz blanca polarizada (polarizador).
- División del rayo en dos haces
paralelos (prisma de cuarzo)
- Colector de rayos
- Analizador
- Interferencia entre ambos haces:
diferencias de fase se convierten en
diferencias de intensidad y de color
- Ventajas: las del microscopio de
contraste de fase y se puede
cuantificar el espesor del corte y
cambios en el índice de refracción
Microscopio de interferencia diferencial:
Observación dinámica
 Microscopio de epifluorescencia
Propiedades de la fluorescencia
Las moléculas fluorescentes absorben la
luz de una determinada longitud de
onda y emiten luz de otra longitud de
onda más larga. Si un componente de este
tipo es iluminado a su longitud de onda
absorbente y visualizado a través de un
filtro que sólo permita pasar la luz de
longitud de onda igual a la de la luz
emitida, el componente aparece brillante
sobre un fondo oscuro. La intensidad y
el color de la luz es una propiedad
característica de la molécula fluorescente
utilizada
Microscopio de epifluorescencia

Filtro barrera

Espejo dicroico

Luz fluorescente
Objetivo

Espécimen
MICROSCOPIO DE EPIFLUORESCENCIA
 Inmunofluorescencia con fluorocromos de distintos colores

Neuronas marcadas con distintos anticuerpos Mitosis: marcación de microtúbulos,

cromosomas y filamentos de actina
 Combinación de epifluorescencia y DIC:
Fluorocromos que no dañan las células vivas
(proteína fluorescente verde y marcador de
mitocondrias en un cultivo de células epiteliales)
Microscopio invertido
Microscopio invertido
Estudios en tiempo real
 Estudio en tiempo real observado
con contraste de fase:
axones (conos de crecimiento) creciendo entre
grupos de células epiteliales
Microscopio confocal (invertido)
La particularidad del
equipo reside en que
permite observar una
célula o tejido vivo en
diferentes planos
focales, lo que
posibilita tener una
visión tridimensional
de lo que ocurre en el
elemento bajo estudio
 Microscopio confocal
• Permite que sólo observemos el plano que
está situado en el punto de foco del sistema
óptico eliminando, de forma óptica a través
de un diafragma o "pinhole", la luz
proveniente de los planos que están fuera de
foco. Este principio fué descrito por Minsky
en los años 50, pero es a partir de los 80
cuando se empieza a extender su uso.
Esquema de los diferentes caminos ópticos en
un microscopio confocal invertido
Microscopio de epifluorescencia Microscopio confocal
 Reconstrucción tridimensional

Specimen: Rat cerebral cortex with astrocytes’ (yellow) endfeet wrapping around blood vessels (red). Cell nuclei are cyan. Technique: Confocal microscopy, spectral imaging
with 50 Z-slices. (Madelyn May/Rensselaer Polytechnic Institute/Troy, New York, USA - See more at:

http://www.boston.com/bigpicture/2012/06/extraordinary_microscope_photo.html#sthash.6xrspBC2.dpuf
 Obsevación dinámica

Desplazamiento de una molécula en una dendrita

Desplazamiento de la onda de Calcio en el ovocito fecundado

Microscopio por excitación de
dos fotones
Microscopio por excitación de
dos fotones
Microscopio estereoscópico o de
disección
Microscopio electrónico de transmisión
Microscopio electrónico de transmisión
Microscopio electrónico de transmisión
y microscopio óptico
Célula Eucarionte
 Microfotografíamitocondias
Ultraestructura: electrónica
REG de unelectrónica
Microscopía
nucleolo
núcleo hepatocito CON
Microfotografía electrónica de sinápsis
Envoltura nuclear: a) Microscopio
electrónico de transmisión, b) con
criofractura
Microscopio electrónico de transmisión
y microscopio óptico

Estereocilias
Microscopio electrónico de barrido
Macrófago activado Espermatozoides sobre membrana
pelúcida (coloración agregada
por computación)