Fluorescente en el lugar Hibridación (FISH)

REACTIVOS Y EQUIPOS

1. Tampón de solución salina-citrato de sodio 20x (SSC: NaCl 3 M, citrato de sodio 0.3 M, pH 7, o
Producto No. S6639)
2. RNase A (Producto No. R4642) 100 µg / mL en 2x SSC
3. Pepsina (Producto No. P6887) 40 unidades / mL en HCl 10 mM
4. Paraformaldehído, grado EM (Producto No. P6148) recién despolimerizado, 4% p / v
en agua
5. Etanol
6. Sonda etiquetada. El ADN plasmídico se marca con biotina-11-dUTP utilizando cebado aleatorio de
traducción de muescas o elA3803(p. ej., kit de traducción de Nick ADVANCE ™)

7. Solución de mezcla de hibridación: formamida al 50% (producto núm. F7508), Sulfato de dextrano
al 10% (producto núm. D8906), SDS al 0,1% (producto núm. L4390), 0.5-1.5 ng / µl de sonda
marcada y 300 ng / mL de ADN de esperma de salmón (Producto No. D7656) en 2x SSC

8. Tampón de lavado: formamida al 20% (producto núm. F7508) en 0.1x SSC

9. Tampón de detección: Tween 20 al 0,2% (producto núm. P1379) en 4x SSC
Tampón de bloqueo: albúmina bovina al 5% (producto núm. A3803) en el búfer de detección
11. Anticuerpo o compuesto de detección (p. Ej., Estreptavidina-Cy3, producto núm. S6402) en
búfer de bloqueo
12.DAPI (Producto No. D9542) 2 µg / mL en medio de montaje anti-decoloración.
13.Microscopio de fluorescencia, filtros y filtro de paso de banda triple opcional (x58,
Óptica Omega)
14. Portaobjetos de vidrio (producto No. S8400)
15 Cubiertas de plástico para las etapas de incubación e hibridación (cortadas de bolsas de residuos esterilizables
en autoclave, por ejemplo, Producto No. B4408)
16.Bloque de calor / termociclador modificado
17 Frascos de corcho para los pasos de lavado (Producto núm. S6016, S5641o S5891)

PROCEDIMIENTO

Preparación de diapositivas
Hibridación
Detección

Preparación de diapositivas

1. Comience con preparaciones de cromosomas de cualquier tipo de célula.

2. Incubar con 200 µL de RNasa durante 1 hora a 37 ° C.
3. Lavar los portaobjetos en 2x SSC durante 5 minutos. Repetir.
4. Enjuague los portaobjetos en HCl 10 mM.
5. Incubar con 200 µL de pepsina durante 10 minutos a 37 ° C.
6. Enjuague los portaobjetos en H desionizado.2O.
7. Lavar los portaobjetos en 2x SSC durante 5 minutos. Repetir.
 8. Estabilice los portaobjetos en paraformaldehído durante 10 minutos.
9. Lavar los portaobjetos en 2x SSC durante 5 minutos. Repetir.
10. Deshidratar los portaobjetos en una serie de etanol: 70%, 80%, 95%; 2 minutos cada uno.
11.Secar al aire.

Hibridación

1. Prepare 30 µl de solución de hibridación por portaobjetos. Calentar a 70 ° C. durante 10

minutos y colocar en hielo.
2. Coloque 30 µl de solución de hibridación en cada portaobjetos y cubra con un
cubreobjetos de plástico.
3. Desnaturalice el portaobjetos a 65-70 ° C durante 5 minutos en un bloque de calor.
4. Disminuya gradualmente la temperatura a 37 ° C.
5. Hibridar a 37 ° C durante la noche en una cámara de humedad.

Detección

1. Lave los portaobjetos en 2x SSC para quitar el cubreobjetos.

2. Lavar los portaobjetos en tampón de lavado a 40 ° C durante 5 minutos. Repetir.
3. Lavar los portaobjetos en 0.1x SSC a 40 ° C durante 5-15 minutos.
4. Lavar los portaobjetos en 2x SSC a 40 ° C durante 5-15 minutos.
5. Enfriar los portaobjetos a temperatura ambiente.
6. Equilibre los portaobjetos en el tampón de detección durante 5 minutos.
7. Bloquee en tampón de bloqueo durante 20-30 minutos.
8. Incubar con 50 µl de anticuerpo o compuesto de detección durante 30-60 minutos (por
ejemplo, 5 µg / ml de estreptavidina-Cy3 en tampón de bloqueo).
9. Lavar los portaobjetos en 2x SSC durante 5 minutos. Repite dos veces.
10. Realice una tinción con la solución DAPI durante 10 minutos.
11. Enjuague brevemente y monte en un medio de montaje antidesvanecimiento.
12. Analizar con microscopio de fluorescencia.