UNIVERSIDAD NACIONAL DE

SAN ANTONIO ABAD DEL CUSCO

licenciada
FACULTAD DE CIENCIAS
DEPARTAMENTO ACADEMICO DE QUIMICA

ANALISIS POR INSTRUMENTACION

Carrera: FARMACIA

2.1.1. espectroscopia: uv - VISIBLE

SEMESTRE ACADEMICO 2020 – II VIRTUAL

DOCENTE. QUIM. NAZARIA JULIETA VALENCIA FARFAN

 LEYES DE LA ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN
LEY DE LAMBERT-BEER
Las dos leyes fundamentales que rigen el comportamiento de la
fracción de la radiación incidente absorbida al pasar a través de una
muestra dada son:
Ley de Lambert: predice el efecto que produce el espesor del
medio-muestra sobre la fracción de radiación que se absorbe.
Ley de Beer: establece el efecto de la concentración del medio-
muestra sobre la fracción de radiación que se absorbe.

Ley de Lambert-Beer: la absorbancia es directamente proporcional

a la longitud b de la trayectoria a través de la solución y a la
concentración c del analito o especie absorbente.
 A  a·b·c
A   ·b·c
a: cte de proporcionalidad llamada absortividad. (L/cm·g, si c=g/L)
b: longitud del camino que recorre la radiación a través del medio
absorbente.
c: concentración expresada en g/L (mg/L, ...).
Si la concentración c viene expresada en mol/L, la cte de
proporcionalidad se denomina absortividad molar y se representa por 
(L/cm·mol).
La absortividad molar, , es característica de cada especie a una λ
determinada

-Disoluciones que contienen varias especies absorbentes:

Para cada λ: Atotal =∑Ai = A1 + A2 + .... + An
Como A =  · b · c
A = 1 · b · c1 + 2 · b · c2 + …. +n · b · cn
Siendo 1, 2, …, n los componentes absorbentes.
 Ley de Lambert- Beer

Potencia del haz

antes de
atravesar la
muestra
Absortividad
Absorbancia molar Concentración molar
P0 de las especies
=bc
total medida
a la longitud
AT,l = log absorbentes
P
de onda l
camino
óptico

Potencia del haz

P después de
P0
= Transmitancia (T) atravesar la A=bc
muestra
A = -logT
Ley de Lambert- Beer
 Comprobación de la ley de beer. curva de calibrado
La Ley de Beer debe comprobarse siempre antes de utilizarla para
un análisis cuantitativo exacto.
• Preparar una serie de disoluciones estándar del analito en el
intervalo en el que se supone que se encuentra la muestra.
• Registrar el espectro de absorción utilizando una de ellas.
• Medir la absorbancia de cada una de las disoluciones a la λ del
máximo de absorción del analito con una longitud de cubeta dada,
generalmente 1 cm.
• Representar las absorbancias en función de las concentraciones.
• Si la ley de Beer se cumple en todo el intervalo de c estudiado:
A = εbc se obtiene una línea recta en todo el intervalo, que pasa
por el origen.
• La recta obtenida se llama Curva de calibrado.
• Pueden aparecer desviaciones positivas o negativas a partir de
una determinada concentración debido a Limitaciones de la ley de
Beer y/ó a posibles errores experimentales cometidos
 Desviaciones de la Ley de Beer
La proporcionalidad directa entre absorbancia y concentración
cuando b es constante, sólo se cumple en un intervalo de
concentraciones del analito.
Fuera de dicho intervalo se observan en las curvas de calibrado
desviaciones positivas o negativas de la linealidad debido a las
limitaciones de la Ley de Beer:
A
respuesta debida
a la autoabsorción
A= εbc
o a la luz escasa que
respuesta del blanco,
Intervalo atraviesa la cubeta
lineal
interferencias o escasa
sensibilidad concentración

Para la aplicación cuantitativa, las medidas de A de la muestra

deben estar incluidas en el intervalo lineal
 Limitaciones de la Ley de Beer

• Limitaciones propias o reales

– Variación de la absortividad con el índice de refracción n, que
varía con la c.
– Para c < 0,01 M n= cte: se cumple Ley de Beer.

• Incumplimiento de las premisas de la ley de Beer.

– Interacciones entre el soluto y la radiación producidas por
mecanismos distintos al de absorción.
– Interacciones entre las especies absorbentes del soluto .
– Radiación no monocromática.
 Errores al aplicar la Ley de Beer
• Errores químicos.
– Efectos debidos a sistemas en equilibrio:
• equilibrios de dimerización
• equilibrios ácido-base
• equilibrios de complejos
– Efectos debidos al disolvente.
– Efectos por impurezas absorbentes de los reactivos.
– Efectos por presencia de interferencias absorbentes en la muestra.

• Errores instrumentales.
– Errores de lectura:
• El mínimo error relativo se obtiene para una A de 0,434
• Las A deben estar comprendidas entre 0,2 y 0,8 para obtener el
mínimo error
– Radiación parásita.
• Errores personales:
– Utilización y cuidado de las cubetas de absorción.
– Control de Temperatura.
 INSTRUMENTACIÓN

Componentes básicos de los espectrofotómetros

Fuente de Cubeta Dispositivo

Selector
energía Detector de lectura
de λ muestra
radiante

Muestra

Fuente de Monocromador Detector

radiación
Luz Luz
compuesta monocromática I

I0 b
 Fuente de energía radiante

Características

Continua. Estable. Intensa

Lámpara de
intensidad lumínica

Lámpara de Para λ en
Tungsteno o Wolframio
Deuterio el Visible

300 500 700 900 1100

Para λ en el
longitud de onda (nm)
Ultravioleta
 Cubetas

Características

Absorción mínima a la longitud de onda de trabajo

 Colocar con caras transparentes perpendiculares a la dirección del
haz incidente

Sílice Vidrio o plástico

Ultravioleta Visible
 APLICACIONES ANALÍTICAS
La espectrofotometría de absorción molecular se puede aplicar
tanto al análisis cualitativo como cuantitativo.
Análisis cualitativo: los espectros de la muestra se comparan con
los estándares, con el fin de identificar las bandas de absorción
coincidentes. Este tipo de análisis es más frecuente en UV e IR para
identificar compuestos orgánicos y rara vez se utiliza en Vis.
Análisis cuantitativo: basado en el intervalo de concentraciones.
•Se establece la curva de calibrado usando estándares y la A de la
muestra de concentración desconocida se remite a la curva (a veces
basta con un solo estándar).
•En espectrofotometría Vis, el analito se suele incorporar a una
especie compleja que presente bandas de absorción intensas.
•Siempre que sea posible se debe medir la absorbancia a λmax
Características de los métodos espectrofotométricos
 Amplia aplicabilidad: Análisis orgánico e inorgánico
 Elevada sensibilidad: los límites detección de 10-4 a 10-5 M.
 Selectividad de moderada a alta.
 Buena exactitud: errores de concentración 1-5% o incluso <.
 Facilidad y comodidad en las medidas espectrofotométricas.
 Se prestan a una fácil automatización.

Campo de aplicación
 Especies absorbentes: compuestos orgánicos que contengan
grupos cromóforos y especies inorgánicas como son los metales de
transición.
 Especies no absorbentes: los analitos reaccionan con un
reactivo para producir un compuesto absorbente.
 Aplicaciones al análisis de alimentos
• La espectroscopia en la región UV-Vis es una de las técnicas de
laboratorio más comúnmente encontradas en el análisis de los
alimentos.
• Ejemplos:
• Cuantificación de macrocomponentes el contenido total de
hidratos de carbono, por medio del método del fenol-ácido
sulfúrico.
• Las estimaciones de enranciamiento el estado de la oxidación
de los lípidos, por medio del ensayo del ácido tiobarbitúrico.
• Determinación de pigmentos basada en su absorción de
radiación en la zona del visible
Especies que no
• Análisis del contenido de proteínas solubles. absorben en el Visible:
• Determinación de nitritos en jamón. mediante su reacción
• Determinación de hierro en vinos. previa con reactivos
adecuados para dar un
• Determinación de fosfato en bebidas. compuesto coloreado
PROBLEMAS

1) Una disolución 100 µM de un determinado cromóforo tuvo

una transmitancia a 525 nm de 0.5 cuando se midió en una
celda 1.5 cm de longitud. Calcular:
a) la absorbancia de la disolución;
b) La absorptividad molar del cromóforo

a) A = -log T = - log 0.5 = 0.301

b) A =  b c

 = A/(c x b) = 0.301 /(10-4 M x 1.5 cm) = 2 x 103 M-1 cm-1


3) ¿Cuál es la absorbancia de una disolución que presenta una
transmitancia del 30% a una longitud de onda de 640 nm?

%T= 30

T= (30/100)= 0,3

A= - LogT,

A= - Log 0,3 = 0,5228

4) Si la disolución del ejercicio anterior consiste de una especie W cuya
concentración es 2,30∙10-4 M, y suponiendo que la celda tiene un grosor de
2 cm: ¿cuál debe ser su concentración para obtener una transmitancia del
8%?

-LogT= εbc

ε = - LogT/bc

ε = (-Log 0,3)/ (2 cm x 2,3∙10-4 M) = 1136,52 M-1∙cm-1

Si %T=8:

c = - LogT/εb
c = (-Log 0,08)/ (1136,52 M-1∙cm-1 x 2cm) = 4,82∙10-4 M

Entonces, basta con que la especie W duplique su concentración (4,82/2,3)

para disminuir su porcentaje de transmitancia de 30% a 8%.