Laboratorio Microbiología 2021

Departamento de Biotecnología

Facultad de Ciencias Naturales, Matemática y del Medio

Ambiente
 GUÍA N°2: Microscopía y técnicas básicas de
tinción

Introducción

El tamaño de las bacterias oscila entre las 0.5 y 3 µm, pudiendo llegar en algunos tipos a 10
µm. Solo son visibles entonces, al microscopio óptico o microscopio electrónico A modo
comparativo, una célula eucariota mide más de 5 µm (un eritrocito tiene un diámetro de 7µm),
mientras que un reovirus mide menos de 0.1µm.

La forma de las bacterias al microscopio está determinada por la rigidez de su pared celular.
Básicamente, se diferencian según su forma en cocos (esférica u ovalada), bacilos (cilíndrica
o de bastones; rectos o curvos) y espirilos (espiral); dentro de estas últimas se encuentran:
Treponema, Borrelia y Leptospira. Las espirilos varían en el número de vueltas, desde pocas
(Borrelia) a muchas (Treponema). Las bacterias pueden mantenerse unidas unas con otras
después de la división celular, pero conservando siempre la independencia celular. Si el plano
de división es único, podemos encontrar diplococos o cocos en cadena (microorganismos del
género Streptococcus). Si los planos de división son muchos, los cocos pueden agruparse en
tétradas o en racimos (Staphylococcus).

Los bacilos pueden ser muy cortos (cocobacilos) o muy largos. Sus extremos pueden ser
redondeados o rectos; pueden estar aislados, en cadenas, en filamentos o formando letras
chinas (Corynebacterium). Los bacilos curvos pueden tener forma de coma (Vibrio cholerae).

La observación microscópica se puede realizar en fresco o en preparaciones fijadas. Con el

primer procedimiento se pueden observar los microorganismos generalmente vivos y su
motilidad, y es especialmente indicado en algunas muestras clínicas. Para observar con más
detalle la morfología de una bacteria es necesario fijar la muestra a un portaobjetos y luego
aplicar la tinción apropiada y observar con el objetivo de inmersión (100X), sumergiendo esta
lente en una gota de aceite (aceite de inmersión) en el preparado a observar.

Los colorantes, que se emplean en bacteriología, son compuestos orgánicos que tienen
afinidad por determinadas estructuras celulares. Muchos de los utilizados en microbiología
son colorantes catiónicos, y se combinan fuertemente con estructuras celulares cargadas
negativamente como ácidos nucleicos y pared celular bacteriana. El azul de metileno, cristal
violeta y safranina son colorantes catiónicos que se combinan con estructuras de la superficie
celular, y que tienen una aplicación general.

Las tinciones se agrupan en dos grandes categorías: tinciones positivas, en las que la bacteria
se tiñe y las tinciones negativas en las que se tiñe el fondo y no la bacteria. Entre las tinciones
positivas se encuentran las tinciones simples (un solo colorante, aplicación general),
diferenciales (no tiñen de la misma manera a todos los tipos de células) y especiales o
específicas (para la observación de estructuras celulares como flagelo, o esporas) y la tinción
de cápsula es un ejemplo de tinción negativa.

La tinción diferencial más importante en microbiología es la tinción de Gram, que permite la

clasificación de la mayoría de las bacterias en Gram positivas y Gram negativas. La diferencia
entre las bacterias Gram positivas y Gram negativas se debe a la naturaleza física de sus
paredes celulares. El peptidoglicano no se tiñe por sí mismo, más bien parece actuar como
barrera de permeabilidad para evitar la pérdida de cristal violeta.

Durante el proceso de coloración las bacterias se tiñen primero con cristal violeta y luego se
tratan con yoduro para favorecer la retención del colorante. En la decoloración con etanol-
acetona, se cree que el alcohol contrae los poros de la capa gruesa de peptidoglicano y se
retiene el complejo colorante yoduro; así las bacterias adquieren color violeta. Por el contrario,
la capa de peptidoglicano de las bacterias Gram negativas es muy fina, con menos enlaces y
con poros de mayor tamaño. Además, es posible que el tratamiento con alcohol extraiga
suficientes lípidos de la membrana externa como para aumentar su porosidad. Por estos
motivos el alcohol elimina más fácilmente el complejo cristal violeta yoduro en las bacterias
Gram negativas.

Existen géneros como Bacillus y Clostridium que producen estructuras altamente resistentes
a temperatura, radiaciones y agentes químicos, denominadas endosporas. Estas estructuras
son capaces de sobrevivir por largos períodos en ambientes desfavorables y en condiciones
apropiadas dan lugar a una nueva célula vegetativa. Las esporas no se tiñen fácilmente y es
necesario aplicar calor para que penetre el colorante. Se emplea una tinción diferencial
(método de Schaeffer-Fulton) que permite distinguir la endospora de la célula vegetativa.
Actividades

1. Preparación de un frotis

Objetivo:
● Adquirir destreza en la preparación de frotis bacterianos.

Materiales
● Cultivos bacterianos en placas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
● Portaobjetos
● Asa de siembra.

Procedimiento
La preparación del frotis consiste en extender homogéneamente la muestra (por ejemplo un
cultivo bacteriano) o una suspensión de la misma sobre una lámina. El frotis debe ser delgado,
translúcido y homogéneo para que, durante el proceso de tinción, reciba en toda su superficie
el mismo tratamiento con las diferentes sustancias químicas y se debe usar para la
preparación la técnica aséptica. La preparación se debe secar al aire antes de fijarla a la llama
y al fijarla se debe tener cuidado de no calentar demasiado porque se alteran las
características tintoriales del material contenido en la muestra, igualmente se debe permitir
que la lámina se enfríe antes de hacer la tinción. Alternativamente los frotis se pueden fijar
utilizado metanol. Para ello, se coloca la lámina sobre una superficie nivelada. Con cuidado
se cubre el frotis completamente con metanol absoluto y se deja secar al aire hasta que el
metanol se haya evaporado.
Con la fijación del frotis se pretende obtener la muerte de los microorganismos, la adhesión
a la lámina y la conservación de su morfología. Después de preparar y fijar el frotis, se puede
realizar cualquier tipo de coloración (simple o diferencial).

2. Tinción de Gram:

Objetivo:
● Conocer el fundamento de la tinción de Gram.
● Adquirir destreza en el procedimiento de la tinción de Gram.

Materiales:
● Frotis de las bacterias indicadas anteriormente.
● Soluciones: cristal violeta, lugol, alcohol-acetona y safranina
● Microscopio óptico.
● Aceite de inmersión

Procedimiento:
● Tome uno de los frotis realizados anteriormente.
● Realice una tinción de Gram:
○ Tiña con cristal violeta agregando suficiente colorante y deje que actúe durante
1 min.
○ Lave suavemente con agua.
 ○ Inunde suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y deje actuar durante 30
segundos.
○ Lave suavemente con agua.
○ Decolore con alcohol- acetona e intercale con lavados con agua, repita hasta
que no se desprenda colorante.
○ Agregue la safranina para la tinción de contraste y deje actuar por 1 minuto
○ Lave suavemente con agua.
○ Seque la preparación.
○ Examine al microscopio con el objetivo 100X de inmersión de aceite y complete
la siguiente tabla:
Bacteria Forma Agrupación Gram
Staphylococcus
aureus
Escherichia coli

*Algunos errores durante la tinción de Gram:

● Nunca usar cultivos viejos, ya que cambia el patrón de coloración.
● Tiempo de decoloración:
○ Corto: Gram (+) puede cambiar a Gram (-)
○ Largo: Gram (-) puede cambiar a Gram (+)