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Anais da Academia Brasileira de Ciências (2018) 90 (3): 2955-2965

(Anales de la Academia Brasileña de Ciencias)
Versión impresa ISSN 0001-3765 / Versión en línea ISSN 1678-2690
http://dx.doi.org/10.1590/0001-3765201820170952
www.scielo.br/aabc | www.fb.com/aabcjournal

Producción de enzimas lipolíticas por bacterias aisladas

de los sistemas de tratamiento biológico de efluentes

GRACIANE FURINI1, JUSSARA S. BERGER1, JOSÉ AM CAMPOS1,

SUELI T. VAN DER SAND1 y JOSÉ C. GERMANI2

1Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade

Federal do Rio Grande do Sul, Rua Sarmento Leite, 500, 90050-170 Porto Alegre, RS, Brasil
2Departamento de Produção de Matéria Prima, Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do
Rio Grande do Sul, Avenida Ipiranga, 2752, 90610-000 Porto Alegre, RS, Brasil

Manuscrito recibido el 24 de noviembre de 2017; aceptado para publicación el 26 de marzo de 2018

ABSTRACTO
Este trabajo tuvo como objetivo evaluar la producción de complejos lipolíticos, producidos por microorganismos aislados de un
sistema de tratamiento biológico de efluentes de un hotel. Para seleccionar el mejor microorganismo lipolítico para su uso en
procesos biotecnológicos, probamos 45 aislamientos bacterianos recuperados del efluente crudo del tanque de desechos del
restaurante del hotel. La producción de lipasa se analizó en medio de cultivo suplementado con aceite de oliva y rodamina B,
incubado a 25 ° C y 30 ° C durante 24 h - 48 h. Los resultados mostraron 22 aislamientos productores de lipasa. Todos los
aislamientos se inocularon en medio sin extracto de levadura para seleccionar aquellos con mayor rendimiento enzimático. De
estos, nueve aislados mostraron una alta actividad de lipasa. La cepa con el halo más grande se ensayó en cultivo sumergido
utilizando un agitador orbital y un biorreactor, con tres sustratos diferentes (aceite de oliva, aceite de semilla de uva y aceite de
canola). Aislar G40 identificado comoAcinetobacter baylyi fue seleccionado para ejecutar los ensayos de producción porque
mostró el mejor resultado en el medio sólido. En el biorreactor se obtuvo la máxima producción de lipasa luego de 12 h de
cultivo con los tres sustratos evaluados: 0,358 U / mL.min-1 en aceite de oliva, 0,352 U / mL.min-1 con aceite de semilla de uva y
0,348 U / mL.min-1 con aceite de canola.

Palabras clave: enzimas lipolíticas, bacterias, cultivo sumergido, aguas residuales.

INTRODUCCIÓN enzimas de origen microbiano. Los hongos

filamentosos, las levaduras y las bacterias continúan
La creciente necesidad de enzimas industriales, especialmente
siendo una de las fuentes más grandes y útiles de
en el área medioambiental, está impulsada por la creciente
muchas enzimas (Adrio y Demain 2014, Santos 2012,
necesidad de soluciones sostenibles. Las estimaciones

muestran que el mercado mundial de enzimas crece entre un Freedonia 2014). Lipasas (triacilglicerol acil hidrolasas EC

6% y un 7% anual y que en 2017 puede llegar a los 7.000
millones de dólares. Actualmente, el sector más grande de la
industria biotecnológica es la producción y uso de
Correspondencia a: Sueli Teresinha Van Der Sand Correo
electrónico: svands@ufrgs.br
3.1.1.3) son enzimas que catalizan la hidrólisis del
triacilglicerol en glicerol y ácidos grasos (Liu y Kokare
2017). Su producción por fermentación sumergida
está directamente relacionada con factores
nutricionales y fisicoquímicos, como el carbono y

An Acad Bras Cienc (2018) 90 (3)

2956 GRACIANE FURINI y col.

fuentes de nitrógeno, temperatura, pH, además de la AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

presencia de inductores enzimáticos como los aceites

Las muestras recuperadas se diluyeron en agua de
vegetales (Almeida et al. 2016, Orlandelli et al. 2012). Los
peptona hasta una dilución 10-4. Diluciones 10-2, 10-3, 10-4
estudios con diferentes microorganismos y sustratos
se inocularon en placas de Petri que contenían agar TSA y
para la producción de lipasas en medios líquidos,
se incubaron a 25 ° C y 30 ° C durante 48 h. Después del
pueden contribuir a encontrar las condiciones óptimas
crecimiento, las colonias se volvieron a aislar en placas de
para obtener altos rendimientos de enzimas, y así
TSA.
reducir los costos de producción a escala industrial
(Ochsenreither 2016, Feitosa et al. 2010). Hay muchas SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS
bacterias productoras de lipasa que se utilizan PRODUCTORES DE LIPASAS

comercialmente, principalmente del género

La actividad lipolítica se ensayó utilizando el medio de cultivo
Achromobacter, Alcaligenes, Burkholderia,
propuesto por Kouker y Jaeger (1987), con modificaciones
Cromobacteria, y Pseudomonas. Con el avance de la
(peptona al 0,5%, extracto de levadura al 0,1%, NaCl al 0,4%,
investigación en esta área, se identificaron otras
agar al 1,5% y solución de rodamina B al 0,1%). Después de la
bacterias lipolíticas comoAcinetobacter yBrevibacterium
esterilización, se añadió aceite de oliva estéril al 2,5% como
(Bhosale y col. 2016, Ugras y Uzmez 2016, Sharma 2017).
fuente de carbono. Todos los aislamientos se inocularon por el
La biodiversidad microbiana en Brasil y la
método de la mancha y las placas se incubaron a 25 ° C y 30 ° C
posibilidad de utilizar residuos agrícolas e industriales
durante un máximo de 72 h. El crecimiento de los aislamientos
como sustratos, justifican la búsqueda de nuevos
se comprobó diariamente y la hidrólisis de lípidos se confirmó
microorganismos productores de enzimas con
por la fluorescencia naranja de las colonias cuando se
características deseables que puedan ser aplicadas
expusieron a luz ultravioleta a 350 nm. Los aislados con
industrialmente (Vitorino y Bessa 2017, Costa 2014).
crecimiento más rápido se reinocularon en el medio de cultivo
El presente trabajo tiene como objetivo aislar e
privado de extracto de levadura, para inducir la absorción de
identificar bacterias productoras de lipasa y cuantificar
aceite de oliva y así seleccionar las mejores cepas productoras
la actividad lipolítica del aislado bacteriano recuperado
de enzimas. La incubación tuvo lugar en las mismas condiciones
de un sistema de tratamiento biológico de un hotel en el
descritas anteriormente. El mismo ensayo se realizó con aceite
municipio de Bento Gonçalves, estado de Rio Grande do
de canola y aceite de semilla de uva como fuente de carbono.
Sul. El efluente objeto de este estudio presenta una gran
concentración de lípidos, lo que lo hace adecuado para
el aislamiento de bacterias productoras de enzimas IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
lipolíticas para su uso en procesos biotecnológicos
Todos los aislamientos fueron sometidos a las pruebas
industriales.
bioquímicas de oxidación / fermentación, utilización de
MATERIALES Y MÉTODOS citrato, fermentación de lactosa y glucosa, oxidasa,
catalasa, producción
2
de HS, indol y motilidad,
COLECCION DE MUESTRA
producción de nitrato, rojo de metilo (VM) y Voges-

Las muestras del efluente en la caja colectora de grasas del
restaurante del hotel se recolectaron en botellas de vidrio
estériles, en dos puntos: efluente crudo entrante y efluente
tratado en la caja de salida. Las muestras se almacenaron
en hielo y se llevaron al laboratorio para los ensayos.
Proskauer (VP), gelatina, urea, bilis esculina y celobiosa,
crecimiento en agar MacConkey y agar cetrimida.
CULTURA SUMERGIDA EN EL AGITADOR ORBITAL
El aislado que presentó la mayor fluorescencia en los
ensayos de medios sólidos, con los tres diferentes

An Acad Bras Cienc (2018) 90 (3)

 ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE BACTERIAS
sustratos, se probó en cultivos sumergidos. El inóculo se
preparó sembrando el aislado seleccionado en un matraz
Erlenmeyer de 150 ml que contenía 50 ml de medio de
cultivo como se describió anteriormente. El matraz se
mantuvo en un agitador orbital a 120 rpm, a 30 ° C durante
12 h. De este cultivo, se utilizó una alícuota de 2.5 mL para
sembrar un matraz con 50 mL de medio y se incubó en un
agitador orbital a 120 rpm, a 30 ° C durante 24 h. Cada dos
horas se extrajo una alícuota de 2,5 ml para determinar la
densidad óptica (DO) a 540 nm y la actividad de la lipasa.
Para la actividad enzimática, se centrifugó una alícuota de
1,5 ml a 12000 rpm durante 15 min. El sobrenadante
recogido se congeló para ensayos de actividad enzimática
adicionales. Se realizó el mismo procedimiento y
condiciones para los aceites de canola y semilla de uva.
Para evaluar el efecto de un emulsionante sobre la
producción de enzima, se añadió al medio 0,01% de Tween
80 estéril y se realizaron los ensayos en las mismas
condiciones que se describieron anteriormente. Todos los
ensayos se realizaron por duplicado.
CULTURA SUMERGIDA EN EL BIOREACTOR
El biorreactor utilizado fue un BIOSTAT B de volumen
nominal de 2 L (Braun) con un volumen de trabajo de 1,5 L
del mismo medio de cultivo utilizado en el agitador orbital.
Los tres aceites se probaron por separado como única
fuente de carbono. El biorreactor se inoculó con 750 mL de
un cultivo de 12 h desarrollado en el mismo medio utilizado
en el biorreactor. El tiempo de funcionamiento fue de 24 ha
30 ºC, la aireación se mantuvo a 1,5 vvm con aire estéril y la
agitación a 300 rpm. Se tomaron muestras de cultivo de 10
mL en el tiempo cero y cada dos horas durante 24 h, y se
determinó la densidad óptica, pH y actividad lipolítica. Los
mismos ensayos se realizaron con aceite de oliva, aceite de
canola y aceite de semilla de uva. Todos los ensayos se
realizaron por duplicado.
ACTIVIDAD LIPOLÍTICA POR ESPECTROMETRÍA
La actividad lítica se determinó mediante
espectrofotometría con palmitato de p-nitrofenilo
2957
(pNPP) como sustrato siguiendo el método descrito
por Winkler y Stuckmann (1979). Una unidad de
lipasa (U) es la cantidad de enzima que libera 1 µM
de p-nitrofenol (p-NP) en 1 min / ml de sobrenadante
en las condiciones del ensayo. Todas las pruebas
realizadas por duplicado.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
La extracción de ADN se realizó mediante el método de ebullición. Las
células cultivadas en TSB durante 18 h se transfirieron a microtubos y se
colocaron en un baño de agua a 100ºC durante 10 minutos después de
centrifugar durante 5 minutos a 13000 rpm y se utilizó el sobrenadante.
La calidad del ADN extraído se evaluó en un espectrofotómetro
Nanodrop. Para la amplificación de la región 16S del ADN ribosómico, se
utilizaron los cebadores 8F 5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3 '(Turner et al.
1999) y 1544R 5' AGAAAGGAGGTGATCCAGCC 3 '(Dorsch y Stackebrandt
1992). La amplificación se realizó en un volumen final de 25 μL agregando
2.5 μL de buffer (10X), 1.5 μL de MgCl (50 mM), 200 ng de Albúmina de
Suero Bovino (BSA), 10 pmol de cada cebador, 1U de Taq polimerasa , 0,2
mM de desoxinucleótido trifosfato y 50 ng de ADN y agua MilliQ para
completar el volumen final. La amplificación se realizó con una
desnaturalización inicial a 94 ° C durante 5 minutos seguida de 35 ciclos a
2
94 ° C durante 45 segundos, 58 ° C durante 45 segundos y 72 ° C durante
1 minuto y la extensión final de 72 ° C durante 5 minutos. . El producto de
amplificación se purificó usando el kit de purificación de productos de
PCR (Ludwig Biotec). La secuenciación se realizó en Ludwig Biotec
utilizando el equipo ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems). La secuencia obtenida se comparó utilizando las secuencias
almacenadas en GenBank utilizando el software BLAST (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi). La secuenciación se realizó en Ludwig
Biotec utilizando el equipo ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems). La secuencia obtenida se comparó utilizando las secuencias
almacenadas en GenBank utilizando el software BLAST (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi). La secuenciación se realizó en Ludwig
Biotec utilizando el equipo ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied
Biosystems). La secuencia obtenida se comparó utilizando las secuencias
almacenadas en GenBank utilizando el software BLAST (http://
blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi).
An Acad Bras Cienc (2018) 90 (3)
2958 GRACIANE FURINI y col.

SDS-PAGE (Tabla I). La cepa con la fluorescencia más alta en los

tres sustratos en ambas temperaturas se nombró
La masa molecular de la lipasa producida por el
como aislado G40 y se eligió para ensayos de cultivo
aislado se analizó mediante electroforesis en gel de
sumergido adicionales.
poliacrilamida al 12% (SDS-PAGE). Se añadieron
alícuotas del sobrenadante que contenía la enzima al IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
tampón de muestra en una proporción de 1: 1 y se
Los nueve aislamientos fueron bacterias gramnegativas,
colocaron en un baño de agua a 100ºC durante 5
siendo cuatro bacilos y cinco bacilos cocos. Tres de ellos
minutos. Se aplicó al gel una alícuota de 35 μL de
fueron identificados comoEnterobacter, tres del género
esta muestra. La migración electroforética se realizó
Burkholderia, dos del género Acinetobacter, y uno como
en tampón Tris-glicina 50 mM, 100 V, durante 2 h.
Pseudomonas utilizando ensayos bioquímicos. El aislado
Posteriormente, el gel se tiñó con nitrato de plata,
según Alfenas (1998). G40 identificado comoAcinetobacter sp., mediante
ensayos bioquímicos, se sometió a identificación
RESULTADOS molecular utilizando rDNA 16S. El resultado mostró un
99% de similitud conAcinetobacter baylyi.
SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS LIPOLÍTICOS
CULTURA SUMERGIDA Y ACTIVIDAD
Del total de 45 bacterias aisladas, 22 fueron positivas para ENZIMÁTICA
lipasa y de estos nueve aislados mostraron actividad lipolítica

en el medio de cultivo privado de extracto de levadura. Estos El aislado G40 se probó en cultivo sumergido, en

nueve aislados se analizaron posteriormente utilizando tres condiciones de agitador orbital, utilizando las tres fuentes

fuentes de carbono diferentes: aceite de oliva, aceite de canola de carbono, con y sin Tween 80. Los resultados mostraron

y aceite de semilla de uva. Los ensayos se realizaron a 25 ° C y que el aislado G40 creció más rápido en presencia de
30 ° C. Los aislamientos cultivados a 30 ° C en los tres aceites Tween 80 demostrando que la concentración utilizada fue
mostraron una mayor fluorescencia bajo luz ultravioleta en suficiente para emulsionar los diferentes aceites. y no era
comparación con el crecimiento a 25 ° C tóxico. Se observó un crecimiento exponencial

TABLA I
Resultados de la intensidad de fluorescencia obtenidos por los aislados en medio sólido utilizando aceite de oliva, aceite de pepitas de uva y aceite de canola como

sustratos. Crecimiento a 25 ° C y 30 ° C durante 72 h.

Aislar Aceite de oliva Aceite de semilla de uva Aceite de canola

25 ° C 30 ° C 25 ° C 30 ° C 25 ° C 30 ° C

G33 + +++ + +++ + ++

G34 ++ +++ + ++ + +++

G35 + +++ ++ +++ + ++

G39 + ++ + ++ + +
G40 ++ +++ ++ +++ ++ ++
G41 + ++ + ++ + ++
G49 + ++ - + + ++
G56 + + - + - +
G57 + + + + + +
Intensidad de fluorescencia: (+) baja intensidad, (++) media intensidad, (+++) alta intensidad.

An Acad Bras Cienc (2018) 90 (3)

 ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE BACTERIAS
en las primeras 2 h en presencia de Tween 80 seguido
de la fase estacionaria durante las 24 h (Fig. 1).
G40 cultivado en medio de cultivo en el agitador
orbital mostró mayor actividad enzimática con Tween
80 como emulsionante (Fig. 2). La máxima actividad
enzimática con los tres aceites en las condiciones
ensayadas se observó a las 16 h de cultivo. El ensayo
que utilizó aceite de oliva como fuente de carbono y
Tween 80 mostró la mayor actividad enzimática de
0.141 U / mL.min-1, seguido del aceite de semilla de
uva con 0.113 U / mL.min-1 y 0.079 U / mL.min-1
de aceite de canola. La actividad enzimática en los
medios de cultivo de los tres aceites, privados de Tween
80, mostró valores similares entre ellos, aunque con una
producción de lipasa mucho menor (Fig. 2).
La Tabla II muestra la actividad enzimática y el
crecimiento celular del aislado G40 en el biorreactor. Es
posible observar un crecimiento exponencial de las
células en las dos primeras horas, mejorando la
actividad enzimática en la fase estacionaria. La mejor
actividad enzimática para el aislado G40 se observó a las
12 h para los tres sustratos. El aceite de oliva alcanzó
una alta producción ya a las 6 hy fue mejorando
Figura 1 - Curvas de crecimiento del aislamiento G40 en cultivo sumergido con aceite de oliva, aceite de semilla de uva y
aceite de canola como fuente de carbono, con y sin adición de Tween 80. El experimento se realizó en agitador orbital, a
30 ºC durante 24 h.
2959
hasta las 12 h. El aceite de oliva mostró la mejor actividad
enzimática con 0.358 U / mL.min-1, seguido del aceite de
semilla de uva con 0.352 U / mL.min-1 y aceite de canola con
0.348 U / mL.min-1 (Fig. 3 y Tabla II). Los resultados
obtenidos en el biorreactor fueron muy superiores a los
observados en el agitador (Figs. 2 y 3) con una mejora del
253,90% para el aceite de oliva, 311,5% para el aceite de
pepita de uva y 440,5% para el aceite de canola.
DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR
La figura 4 muestra el resultado obtenido en el gel SDS-
Page del extracto crudo de enzima. El peso molecular de
la enzima observado fue de aproximadamente 35 kDa.
DISCUSIÓN
Las nueve cepas aisladas, de los géneros Enterobacter,
Burkholderia, Acinetobacter, y Pseudomonas,del tanque
trampa de grasa, representan una pequeña fracción de
la enorme diversidad de bacterias lipolíticas que se
pueden recuperar del medio ambiente para aplicaciones
biotecnológicas.
An Acad Bras Cienc (2018) 90 (3)
2960 GRACIANE FURINI y col.

TABLA II
Comparación entre el crecimiento celular del aislado G40 y su actividad enzimática.
El experimento se realizó en el biorreactor, a 30 ºC durante 24 h.

Tiempo1 Aceite de pepitas de uva Aceite de oliva Aceite de canola

Crecimiento2 EA3 Crecimiento2 EA3 Crecimiento2 EA3

0 0,496 0,126 0,298 0,119 0,647 0,11
2 1.288 0,143 1.534 0,135 1,489 0,22
4 1.335 0,172 1,46 0,146 1.526 0.304

6 1,35 0,252 1.552 0.348 1.521 0,287

8 1.358 0,253 1.564 0.351 1,52 0,33

10 1.383 0.308 1.574 0.354 1.531 0.342

12 1,38 0.352 1.576 0.358 1.534 0.348

14 1.382 0.334 1.574 0.309 1.531 0,236

dieciséis 1.376 0.325 1.576 0,234 1.529 0,194

18 1.384 0,222 1.575 0,22 1,49 0,179

20 1.382 0,173 1.576 0,173 1.459 0,244

22 1,39 0,213 1.561 0,209 1.457 0,236

24 1.377 0,227 1,473 0,271 1.436 0,254

Dakota del Sur4 0,243 0,074 0.349 0,09 0,239 0,069

1Hora; 2Absorbancia (540 nm); 3EA- actividad enzimática (U / mL.min-1 ); 4Desviación estándar (SD).

Figura 2 - Actividades enzimáticas producidas por el aislado G40 utilizando aceite de oliva, aceite de semilla de uva y aceite de
canola como principal fuente de carbono, con y sin adición de Tween 80. Experimento realizado en el agitador orbital a 30 ºC, 120
rpm durante 24 h.

An Acad Bras Cienc (2018) 90 (3)

 ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE BACTERIAS 2961

Figura 3 - Actividad enzimática producida por el aislado G40 utilizando aceite de oliva, aceite de semilla de uva y aceite de canola
como principal fuente de carbono, con Tween 80. Experimento realizado en el biorreactor a 30 ° C, agitación fijada a 300 rpm, tasa
de aireación de 1,5 vvm, para 24 h.

Musa y Tayo (2012) trabajando con muestras de
suelo contaminadas con varios aceites, alimentos en
mal estado y otros residuos identificaron y
caracterizaron 13 géneros con actividad lipolítica. Los
géneros bacterianos obtenidos fueron:Acinetobacter
sp.,Yersinia sp., Arthrobacter sp., Brevibacterium sp.,
Estafilococo sp., Aeromonas sp., Acidomonassp.,
Lactobacillus sp., Bacilo sp., Estreptococosp.,
Bifidobacteria sp., Acetobacterias sp., yCitrobacter
sp.
Ankit y col. (2011) investigando microorganismos
lipolíticos para uso industrial, especies aisladas de bacterias
lipolíticas del géneroPseudomonassp. yBacilo sp. de
muestras de agua altamente contaminadas de varios ríos
en la región de Bhopal de la India. Odeyemi y col. (2013) al
examinar microorganismos capaces de utilizar aceite de
palma como sustrato, encontraron 32 bacterias lipolíticas
agrupadas en los génerosEnterococcus sp., Escherichia sp.,
Klebsiella sp.,Pseudomonas sp., Serratia sp. yStaphylococcu
s sp., aislado de un tanque trampa de aguas residuales de
un restaurante.
Las nueve cepas lipolíticas seleccionadas en este trabajo
fueron bacterias Gram-negativas, que se encuentra en
de acuerdo con la investigación de varios autores,
que afirman que la mayoría de las bacterias
lipolíticas que se encuentran en la naturaleza son
Gram-negativas (Ramnath et al.2017, Alhamdani y
Alkabbi 2017, Dharmsthiti y Kuhasuntissak 1998).
Aunque algunas bacterias lipolíticas son Gram
positivas, como es el caso de los génerosBacilo sp.,
Estafilococo sp. yClostridium sp., su actividad
lipolítica es menos expresiva que la de las bacterias
Gram-negativas (Rousenau y Jaeger 2000).
Las lipasas extracelulares bacterianas están
influenciadas por factores nutricionales y fisiológicos
como la temperatura, el pH y las fuentes de carbono. En
este trabajo, la temperatura óptima para la producción
de lipasas fue de 30 ° C. Sin embargo, algunos autores
encontraron que las lipasas bacterianas pueden exhibir
una actividad de producción óptima a bajas y altas
temperaturas, como lo demuestra el trabajo de Ugras y
Uzmez (2016), donde la máxima actividad enzimática se
detectó a 40 ° C. Por otro lado, Pratuandejkul y
Dharmsthiti (2000) trabajando conAcinetobacter
calcoaceticus aislado de la leche cruda obtuvo la
máxima actividad lipolítica después de 48 h de cultivo a

An Acad Bras Cienc (2018) 90 (3)

2962
Figura 4 - Gel desnaturalizante de poliacrilamida (12% SDS-
PAGE).a: marcador de peso molecular, B: extracto crudo de la
enzima. El gel se tiñó con nitrato de plata.
15 ° C. El valor de actividad observado fue tres veces
mayor que el encontrado después de 24 h de cultivo a
30 ° C. Estos hallazgos enfatizan la importancia de
realizar más estudios de la producción enzimática a
diferentes temperaturas, buscando mayores
rendimientos y productividad.
La actividad de la lipasa en este estudio se
evaluó en el intervalo de tiempo entre 0 a 24 h de
cultivo. Los resultados muestran que en el agitador
orbital la producción máxima se alcanzó a las 16 h a
30 ° C, aunque en el biorreactor se produjo a las 12 h
de cultivo a la misma temperatura. Este resultado es
similar al encontrado por Anbu et al. (2011)
trabajando conAcinetobacter juniide aislado de suelo
contaminado con aceite en Corea del Sur, donde se
observó la mejor actividad enzimática después de 12
h de incubación a 30 ° C. Gururaj y col. (2016),
trabajando con una cepa deAcinetobacter sp., obtuvo
la máxima actividad enzimática después de 16 h de
incubación a la temperatura de 30 ° C.
An Acad Bras Cienc (2018) 90 (3)
GRACIANE FURINI y col.
Los valores de máxima actividad lipolítica
encontrados en el presente estudio son notables ya que
el aislado G40 produjo lipasa en 12 h de crecimiento en
el biorreactor a 30 ºC. Por lo tanto, mostró una
característica importante para fines industriales ya que
las cepas preferidas son las que entregan mayor
actividad enzimática en el menor tiempo posible
(Niyonzima et al. 2014, Orlandelli 2012).
Uno de los factores más importantes para el aumento de la actividad
lipolítica es la fuente de carbono, ya que las lipasas son de tipo inductivo, y sus
sustratos preferidos son los ácidos grasos monoinsaturados de cadena larga
(más de diez carbonos), como el ácido oleico (C18: 1). encontrado en mayor
cantidad en aceite de oliva (78%). La cantidad de ácido oleico en los otros
aceites probados en este trabajo es 56% en aceite de canola y 9% en aceite de
semilla de uva. Varios estudios confirman una alta producción de lipasa en
medios de cultivo en presencia de aceite de oliva en una concentración de 0,1%
a 3% (Feitosa et al.2010, Sooch y Kauldhar 2013, Iqbal y Rehman 2015) que
corroboran los resultados obtenidos en el presente trabajo. Quian y Chun-Yun
(2009) en sus estudios informaron un aumento del 4% en la actividad de la
lipasa con aceite de oliva en el medio de cultivo. Nwachukwu y col. (2017)
compararon varios aceites naturales, aceite de oliva aceite de palma, aceite de
cacahuete, aceite de soja y aceite crudo. Los resultados con aceite de oliva
mostraron la mayor actividad lipolítica en comparación con otros aceites, y la
concentración de aceite de oliva al 0,8% dio como resultado un aumento en la
producción de lipasa en un 30%. El trabajo de Vishnupriya et al. (2010) y
Essakiraj et al. (2010) también demostraron la capacidad del aceite de oliva
como la mejor fuente de carbono para la producción de lipasa bacteriana en
comparación con otros aceites. Dandavate y col. (2009) evaluaron el efecto de
los aceites de ricino, oliva, maíz y maní sobre la producción de lipasa por
bacterias del género (2010) también demostraron la capacidad del aceite de
oliva como la mejor fuente de carbono para la producción de lipasa bacteriana
en comparación con otros aceites. Dandavate y col. (2009) evaluaron el efecto
de los aceites de ricino, oliva, maíz y maní sobre la producción de lipasa por
bacterias del género (2010) también demostraron la capacidad del aceite de
oliva como la mejor fuente de carbono para la producción de lipasa bacteriana
en comparación con otros aceites. Dandavate y col. (2009) evaluaron el efecto
de los aceites de ricino, oliva, maíz y maní sobre la producción de lipasa por
bacterias del géneroBurkholderia. La mejor producción se observó en el cultivo
de aceite de oliva. Rodríguez y col. (2006) observaron que el uso de aceite de
maíz, aceite de almendras, aceite de cacahuete, aceite de semilla de uva, aceite
de girasol y aceite de oliva para complementar el bagazo de caña de azúcar,
indujo la producción de alta
 ENZIMAS LIPOLÍTICAS DE BACTERIAS
tasas de lipasa por Rhizopus homothallicus. Kobori y Jorge
(2005) compararon varios aceites vegetales como el de
oliva, soja, canola, girasol y semilla de algodón como
sustratos para la lipasa. Descubrieron que entre estos
aceites, el aceite de oliva promovía la máxima producción
de la enzima. Sharma y col. (2001), se refieren al aceite de
oliva como un componente económico y eficiente para el
análisis de lipasa y un buen sustituto de los sustratos
sintéticos, que son más caros.
No hubo diferencia significativa en los resultados para
la actividad enzimática del aislado G40 cuando se cultivó en
cultivo sumergido en el biorreactor utilizando aceite de
oliva, canola o aceite de semilla de uva. Este resultado es
satisfactorio, ya que sugiere que cualquiera de estos
sustratos se puede utilizar como fuentes nutricionales
alternativas de bajo costo para la producción de lipasa.
El uso del emulsionante Tween 80 en el agitador
orbital y en el ensayo de cultivo sumergido en biorreactor
mostró un mejor crecimiento que en el ensayo sin el uso del
emulsionante Tween 80. El Tween 80 en pequeñas
cantidades actúa como tensioactivo dispersando
homogéneamente los aceites a través del medio de cultivo,
haciendo que los lípidos estén fácilmente disponibles para
el microorganismo. También puede aumentar la
permeabilidad celular aumentando así la secreción de
varias moléculas a través de la membrana celular (Silva et
al. 2005). Según Ramani et al. (2010), la adición de
tensioactivos en el medio de cultivo puede incrementar
tanto la actividad como la estabilidad de la enzima. En
cantidades mayores, este emulsionante se convierte en una
de las fuentes de carbono lipídico disponibles para el
microorganismo.
La masa molecular de la lipasa de bacterias del
género Acinetobacter es bastante variable de 23 a 62
kDa. Nuestro trabajo muestra una masa de 35 kDa para
la enzima. Los estudios han encontrado valores de masa
molecular de 32 kDa paraAcinetobacter calcoaceticus (
Kok y col. 1995), 38 kDa paraAcinetobacter
radioresistenscepa CMC-2 (Ng et al. 1999), 37,2 kDa para
Acinetobacter sp. SY-01 (Han et al. 2003), 45 kDa en
Acinetobacter radioresistens CMC-1 (Hong y Chang
1998) y 53 kDa en Acinetobacter
2963
Johnsonii (Wang y col. 2011). Uttatree y col. (2010)
trabajando conAcinetobacter baylyi encontraron una
lipasa con masa molecular de 30 kDa, menor que la
observada en este trabajo. Según Agobu et al. (2017),
la variación en el peso molecular podría ser el
resultado de mutaciones de cambio de marco que
resultan en la inserción o deleción del gen.
La peptona utilizada como fuente de nitrógeno en este
trabajo también es un inductor de la producción de lipasa.
Según Sharma et al. (2001), la peptona y el extracto de levadura
son las mejores fuentes de nitrógeno para las lipasas
microbianas en comparación con otras fuentes como el
extracto de carne, la triptona o el salvado de trigo.
Las presiones ambientales son factores
importantes para la expresión de enzimas como las
lipasas por microorganismos. Se ha demostrado que los
entornos altamente contaminados, como los efluentes
con altas cargas de grasas y aceites, son adecuados
para la detección y el aislamiento de especies
bacterianas que producen estas enzimas.
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