CULTIVO, MEDIOS DE CULTIVO, E IDENTIFICACIÓN BACTERIAS

Profesor: Dr. Fernando Salazar

fernando.salazar@pucv.cl
Anexo 4221

INGENIERÍA EN ALIMENTOS
MICRO ALI323-2019
CULTIVO DE BACTERIAS EN LABORATORIO

• Medio de cultivo adecuado

• Atmósfera que determine la
cantidad de oxígeno requerida CRECIMIENTO DE
BACTERIAS
• pH específico para cada medio
• Temperatura apropiada

Medio de cultivo:
Todo material donde los mo pueden reproducirse.
Se preparan sobre AGAR, sustancia inerte polisacarida (hidrato de carbono) que se
extrae de algas marinas y no es digerida por bacterias.
Este conjunto convenientemente esterilizado puede ser vertido en placas de Petri o en tubos de
ensayo y presentan la posibilidad de aislar y diferenciar bacterias, "procesos que antes no eran
posibles en medio líquido".
CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Según su origen:
a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o
vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se
conoce exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cuali y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento
bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de
levadura.

Según su consistencia
a) LÍQUIDOS: se denominan caldos y contienen los nutrientes en solución acuosa.
b) SÓLIDOS: se preparan añadiendo un agar a un medio líquido (caldo) a razón de 15
g/litro (1,5% p/v).
c) SEMISÓLIDOS: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo (0,75% p/v). Se utilizan para
determinar la motilidad de las especies en estudio. Actualmente se encuentran
disponibles comercialmente con el agregado de agar.
 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO
Según su uso:
BÁSICOS ENRIQUECIDOS DIFERENCIALES
SELECTIVOS
Crecimiento de + supl. nutritivo Formulaciones especiales
bacterias y + sustancias que permiten identificar
Favorece el crecimiento inhiben el
mantenimiento bacterias según sus
de un mo en particular crecimiento de ciertos
de poblaciones características.
en una población mixta. grupos de bacterias, fisiológicas (nutrición y
No selectivos permitiendo a la vez respiración sobre todo).
el crecimiento de
otros.

Agar nutritivo Agar sangre

Agar Mac Conkey

Agar Citrato
 IDENTIFICACIÓN DE UN MICROORGANISMO X ?

MÉTODOS DE
IDENTIFICACIÓN DE
BACTERIAS

ANÁLISIS CARACTERÍSTICAS DE ANÁLISIS CON PRUEBAS DETECCIÓN

MICROSCÓPICO LAS COLONIAS EN ENSAYOS SEROLÓGICAS MOLECULAR
MEDIOS SELECTIVOS BIOQUÍMICOS
ANÁLISIS MICROSCÓPICO

• Forma de célula

• Disposición de células

• Presencia de inclusiones, esporas, cápsulas

• Tinción

GRAM+

GRAM+ & GRAM -

CARACTERISTICAS DE LAS COLONIAS
BACTERIANAS

Colonia completa Contorno

Entero

Lobulado

Rizado

Suave, brillante Elevado

Rugoso
Arrugado
Alcolchonado
Seco polvoriento
Apuñado
 ENSAYOS BIOQUÍMICOS

 Permiten diferenciar bacterias de géneros diferentes a través de las características

de su metabolismo:

Tipo de azúcar utilizado como fuente de carbono y energía

Productos del metabolismo de los azúcares

Otros metabolitos como ácidos o gases.

Presencia de ciertas enzimas.

Producción de compuestos coloreados.

Ejemplos de algunos ENSAYOS BIOQUÍMICOS
para identificación de bacterias

1. Prueba de la oxidasa

2. Prueba de la catalasa
3. Pruebas IMVIC (Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato )

4. Pruebas con medio de cultivo diferencial TSI (Triple Sugar Iron)

1. PRUEBA DE LA OXIDASA
 La enzima citocromo oxidasa es una enzima que se encuentra en ciertas
bacterias (que contienen la cadena transportadora de electrones), permite la
transferencia de electrones al oxígeno para formar agua.

 La prueba se basa en la oxidación del colorante tetra-metil-parafenil-endiamina

(por la citocromo oxidasa) en indofenol con viraje a una coloración azulada.

Géneros de Enterobacteriaceae: carecen de enzima (anaerobio facultativo)

Género Pseudomona: posee enzima (aerobio)

Resultado positivo
2. PRUEBA DE LA CATALASA

 Permite detectar la presencia de la enzima catalasa, cuya función es descomponer

el peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno.

2 H2O2 ---- 2 H2O + O2

 Peróxido de hidrógeno es tóxico para la bacteria y se forma como resultado de la
reducción incompleta del O2.
Bacterias anaerobias: No poseen esta enzima
Bacterias aerobias y anaerobias facultativas: contienen la enzima
3. PRUEBAS IMVIC

 I: INDOL

 M: ROJO DE METILO

 V: VOGES PROSKAUER

 C: CITRATO

Conjunto de pruebas utilizadas para identificar géneros de bacterias de la

familia ENTEROBACTERIACEAE
INDOL

Algunas bacterias pueden hidrolizar el aminoácido TRPTÓFANO hasta indol, ácido

pirúvico y amoníaco debido a la presencia de enzima TRIPTOFANASA:

Triptofanasa
Triptófano INDOL + ácido pirúvico + NH3

Metabolizado Biosíntesis de
adicionalmente nuevos
Producción energía aminoácidos
INDOL

Indol puede ser detectado por la reacción con el reactivo de KOVAC’S (para-
dimethylaminobenzaldehyde en alcohol) el cual produce un color rojo.
ROJO DE METILO

 Algunas bacterias pueden utilizar la glucosa por fermentación y transformarla a

varios productos ácidos (fórmico, acético, láctico, succínico) y etanol.

Glucosa Varios ácidos orgánicos

 Producción de ácidos implica un descenso en el pH del medio < 5.

ROJO DE METILO

Disminución del pH puede detectarse por la adición de ROJO DE METILO (colorante

indicador) el cual es rojo cuando el pH es < 4.4.
VOGES PROSKAUER

 Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa a butanodiol y etanol (compuestos

menos ácidos).
 Acetoína (precursor del butanodiol) es detectada en esta prueba.

Glucosa

Acido pirúvico

Acetoína Alfa naftol + KOH DIACETILO + Guanidina

2,3 butanodiol Complejo ROSA

VOGES PROSKAUER

Negativo (-) Positivo(+)

CITRATO

 Esta prueba indica la capacidad de la bacteria de metabolizar o utilizar el citrato

como única fuente de carbono.
 El medio de cultivo (CITRATO DE SIMONS) contiene: citrato, fosfato de amonio, y
azul de bromotimol (colorante indicador de pH).
 Bacteria utiliza citrato y fosfato, liberando amonio (alcaliniza el medio).
CITRATO

Azul de bromotimol permite indicar si el medio se alcaliniza al cambiar del verde al

AZUL.
4. PRUEBAS CON MEDIO DE CULTIVO DIFERENCIAL TSI (TRIPLE
SUGAR IRON)

 Medio diferencial complejo (de color rojo) compuesto por 3 azúcares: 10% lactosa,
10% sucrosa y 1% glucosa, hierro (citrato férrico), tiosulfato de sodio y rojo de
fenol como indicador de pH.

 Permite determinar el tipo de azúcar utilizado, producción de ácidos y gases o SH2

 La siembra se realiza tanto en la superficie del agar (aerobiosis) como en la

profundidad de éste (anaerobiosis).
MEDIO TSI

Utilización de Utilización de GLUCOSA y Utilización de GLUCOSA

GLUCOSA y no de LACTOSA, sin producción y LACTOSA con
LACTOSA de gas (g) producción de gas (g)

CLAVE:
Medio K (alcalino) de color rojo.
Medio A (ácido) de color amarillo
MEDIO TSI
No utiliza ni glucosa
ni lactosa, sólo
peptonas,
alcalinizando el
medio y con
producción de SH2
(color negro)

CLAVE:
Medio K (alcalino) de color rojo.
Medio A (ácido) de color amarillo
ALGORITMOS DE IDENTIFICACIÓN SEGÚN
GRUPO BACTERIANO
ENTEROBACTERIA

Bacilo, GRAM -,
Fermenta LACTOSA? anaerobio facultativo,
fermenta GLUCOSA,
NO SI oxidasa negativo

Puede usar CITRATO Puede usar CITRATO

como fuente de C? como fuente de C?

NO SI NO SI

SHIGELLA SALMONELLA ESCHERICHIA

Produce
Dominio Bacteria
acetoína
Filo Proteobacteria
Clase Gammaproteobacteria NO
Orden Enterobacteriales SI
Familia Enterobacteriaceae
CITROBACTER
Género Shigella - Shiga
Especie S. Sonnei
ENTEROBACTER
 SISTEMA MINIATURIZADO KIT API 20E PARA
IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS

Pruebas bioquímicas del kit API20E, inoculadas con la cepa de

Escherichia coli DH5α

http://perso.wanadoo.es/microdominguez/API.htm
ENSAYOS SEROLÓGICOS

Antígeno: cualquier sustancia

extraña que, introducida en el
interior de un organismo, provoca
una respuesta inmunitaria,
estimulando la producción de
anticuerpos.
Ej. Polisacáridos y proteínas de
cápsulas, pared celular y flagelos
de bacterias.

Anticuerpo: Son proteínas

producidas por el cuerpo en
respuesta a la presencia de un
antígeno.
Ej. Inmunoglobulinas (Ig)
ENSAYOS SEROLÓGICOS

Bacterias que poseen el mismo ANTÍGENO comprenden un SEROTIPO

Detección de
ANTISUERO
diferentes SEROTIPOS
Solución con BACTERIA
dentro de una misma
anticuerpos
especie bacteriana

Ej. Salmonella puede tener hasta mas de 100 serotipos diferentes

USO DE AGENTES ANTIMICROBIANOS

 Algunos agentes antimicrobianos como químicos y antibióticos pueden ser útiles

para diferenciar entre diferentes variedades de la misma especie de alguna
bacteria, o entre especies de bacterias diferentes.

 Por ejemplo, la optoquina (un derivado de la quinina) y las sales biliares son muy
tóxicas para el Streptococcus pneumoniae, pero el Streptococcus viridans es
bastante resistente a ambos antimicrobianos.
 ENSAYOS BASADOS EN BIOLOGÍA MOLECULAR

 Detección de determinadas
secuencias de ADN, propias de un
determinado agente microbiano

 Método ampliamente utilizado en

laboratorios de diagnóstico es el PCR
(polymerase chain reaction)

 Se aplica para identificación de

microorganismos que no pueden ser
cultivados por los métodos
convencionales.

Figura . Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la técnica PCR. A: visualización directa. Las muestras colocadas sobre
un gel y sometidas a la acción de un campo eléctrico (electroforesis) migran de una manera característica que se puede visualizar por tinción
(coloreado) del ADN. (Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamaño conocido.) B: Southern blot. El ADN es
desnaturalizado (separación de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridación
(unión) con una sonda radiactiva. Ésta quedará fijada donde se encuentre el tramo de ADN de interés y su presencia se revelará a través de una
autorradiografía (placa fotográfica sensible a la emisión radiactiva de la sonda). C: dot blot. Método análogo al anterior, pero practicado sobre una
siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente desnaturalizados.