Introducción al curso "Técnicas Microscópicas de

Caracterización"

Bienvenidos al curso de Técnicas Microscópicas de Caracterización, un espacio donde

mostramos algunas de las técnicas que nos permiten observar a nivel atómico y molecular.

Somos un equipo mixto que trabaja entre el Departamento de Electrónica y los Centros
Científicos y Tecnológicos de la Universidad de Barcelona así como en proyectos de
incidencia social como el Nanodivulga.

Os mostraremos el abanico de posibilidades que hoy en día permiten los equipos de

microscopía a los que tienen acceso científicos de distintas areas como la física, química,
biología e ingeniería.

Al finalizarel curso seréis capaces de entender e identificar aquellas técnicas con las que
estudiar propiedades y características de los diferentes materiales y conocer los
procedimientos y los resultados que de ellos podemos obtener.

El curso está diseñado para desarrollarse a lo largo de 5 semanas, con una dedicación
aproximada de 3 horas semanales. Cada lección contiene un video introductorio con
materiales descargables y un espacio para las discusiones, seguido del contenido textual en
varios apartados. Cada módulo termina con un cuestionario que hay que aprobar con un 80%
de aciertos. Tienes tres intentos cada 8 horas para repasar el material y repetir los
cuestionarios que son imprescindibles para avanzar y obtener el certificado de aprendizaje.

En el módulo introductorio, hemos recogido las referencias que aparecen en el temario junto
con una introducción general del mundo de la microscopía. A medida que avanzamos
conoceréis las técnicas de Microscopía Electrónica de Barrido, Microscopía Electrónica de
Transmisión, Microscopía Electrónica de Transmisión de Barrido, Microscopía de Fuerzas
Atómicas y la Microscopía Óptica Avanzada.

El curso está pensado para trabajarse en el orden propuesto. Recomendamos visionar el

video introductorio tanto al principio como al final del módulo, antes de realizar los tests. Esta
segunda visualización permite identificar las dudas que hayan surgido al trabajar con el
contenido y es un buen momento para participar en las discusiones, creando hilos y
formulando preguntas, así como contestando a otros alumnos.

En el caso de que surjan preguntas generales del curso, problemas técnicos o tengáis
sugerencias de mejora o ampliación del contenido podéis crear los hilos en el módulo
introductorio.
Esperamos que encontreis interesante la aproximación al mundo nanométrico a través de las
técnicas y equipos que describimos en el curso. Os deseamos mucha suerte. Hasta pronto.

"Las gafas de lo invisible"

El mundo en el que vivimos evoluciona cada vez a más velocidad: internet, las redes sociales,
los avances tecnológicos, nuevas formas de obtener energía y los nuevos modelos
económicos se han convertido en algo cotidiano que nos empuja a seguir adaptándonos y
progresando como individuos y como especie. Sin embargo, los grandes cambios todavía
están por llegar; la nanociencia y la nanotecnología, el mundo de lo infinitamente pequeño,
revolucionará nuestra concepción del mundo tal y como lo conocemos.

El dominio de la materia a nivel atómico y molecular nos permitirá increíbles avances en los
contextos de la electrónica posibilitando mucha más potencia de cálculo, desarrollar nuevos
fármacos y nanomáquinas que lleven los límites de la vida humana a horizontes más allá de la
imaginación, progresar en la producción de energía sostenible y asequible para todos.

Sin embargo, para estudiar el reino atómico es necesario utilizar técnicas experimentales
avanzadas que lleven nuestra percepción de la materia a un nivel sin precedentes, más allá de
lo que nuestros ojos están acostumbrados a ver y nuestra conciencia a percibir.

Las técnicas microscópicas de caracterización son la puerta de entrada hacia este nuevo
universo en el que las técnicas de visualización ópticas tradicionales no pueden penetrar. Para
ello, es necesario el uso de microscopios electrónicos de barrido y de transmisión, de
microscopios de fuerzas atómicas, microscopios ópticos avanzados y todas sus técnicas que
nos permiten adentrarnos en la exploración de los confines de la materia, haciendo visible lo
invisible.

La microscopía es la puerta de entrada esencial para hacer visible, accesible y menos

abstracto el mundo nano. La ciencia abre una nueva etapa en la que la física, química,
biología e ingeniería desdibujan sus límites para formar un nuevo conocimiento global que
unifique todo aquello que nos es conocido y nos proyecte hacia un futuro lleno de
posibilidades todavía por descubrir. De lo invisible a lo visible a través de las técnicas
microscópicas. Bienvenidos al mundo nanométrico.

Objetivos
Bienvenidos al mundo nanométrico.
Objetivos de aprendizaje del curso:

 Conocer los elementos básicos de los diferentes microscopios

 Entender las técnicas y sus aplicaciones
 Asimilar el funcionamiento y la operativa de los microscopios
 Aprender las necesidades previas para la preparación de muestras
 Identificar los objetivos dentro de los resultados obtenidos

Elementos básicos del SEM

El microscopio electrónico de barrido (SEM)¹

Electrones y resolución

¹ A pesar de que el acrónimo correspondiente sería MEB, nosotros en adelante usaremos el

inglés SEM (Scanning Electron Microscope) por resultar el más ampliamente utilizado.

En un sistema óptico la resolución o el poder de resolución PR expresa la capacidad de

discriminar dos puntos muy cercanos entre sí. El PR, por lo tanto, es inversamente
proporcional al límite de resolución (d), que es la menor distancia que debe existir entre dos
puntos para que puedan ser distinguidos separadamente.

Así, la resolución en un sistema óptico perfecto se puede describir matemáticamente a través

de la ecuación de Abbe:

donde:

d = límite de resolución

λ= longitud de onda de la radiación que forma la imagen

n = índice de refracción medio²

α= ángulo de abertura en radianes

² n sen α a menudo es expresado como NA (apertura numérica) La abertura numérica es

función de α (la mitad del ángulo del cono de luz que emerge del objeto, y que es captado por
la lente objetivo). La AN, así, se define matemáticamente como la resultante de la
multiplicación del seno de α por el índice de refracción del medio a través del cual pasa la luz
(n)

Este sería, como hemos dicho, el límite de la resolución de un sistema óptico en el caso de
que todas las aberraciones y distorsiones se eliminaran del sistema. Pero, inevitablemente, las
aberraciones y distorsiones están siempre presentes, y determinan también el límite práctico
de la resolución.

La resolución de un microscopio óptico se encuentra, por tanto, definitivamente limitada por la

longitud de onda de la luz, del haz de fotones utilizado para iluminar y observar la muestra.
Mientras que el microscopio electrónico, utilizando electrones altamente acelerados, puede
operar con un haz cuya longitud de onda resultante sea varios órdenes de magnitud menor.
Con respecto a otras partículas, la ventaja que tienen los electrones es que pueden ser
fácilmente acelerados mediante una diferencia de potencial. Y, así mismo, para poder emular
un sistema óptico análogo al de un microscopio convencional, resulta también posible focalizar
el haz de electrones y modificar su trayectoria a través de campos electromagnéticos.

Broglie, mediante la combinación de algunos de los principios de la física clásica con la teoría
cuántica, propuso que las partículas en movimiento tienen propiedades ondulatorias y que su
longitud de onda se puede calcular, en función de su masa y su nivel de energía. La forma
general de la ecuación de Broglie es la siguiente:

donde:

λ= longitud de onda.

h = constante de Planck (6.6x10E-34 J·s)

m = masa de la partícula (9.1 x 10E-31 Kg)

v = velocidad de la partícula

Cuando un electrón pasa a través de una diferencia de potencial (voltaje de aceleración de

campo) V, su energía cinética es igual a la energía del campo, es decir eV (energía en
electrón-voltios) = V (tensión de aceleración). Como se recordará, e = mc². Al replantear esto
para velocidades por debajo de la velocidad de la luz y partículas con masa real, la energía de
un electrón puede enunciarse de la siguiente manera:

donde:

eV = energía en electrón-voltios (e = -1.6 x 10E-19 C)

m = masa de la partícula

v = velocidad de la partícula

Mediante el uso de algunas suposiciones acerca de la velocidad de la partícula y su masa, es

posible expresar ya sea la longitud de onda (λ) o la velocidad (v) en términos del voltaje de
aceleración (V). Mediante la sustitución de los valores de h y m de más arriba, la ecuación
para λ se reduce a lo siguiente³:

³ Hay que advertir que a medida que la velocidad del electrón se acerca a la velocidad de la
luz, se hace necesario usar las ecuaciones de Einstein de la relatividad para una mayor
precisión, dado que la masa y cantidad de movimiento de electrones aumenta con la velocidad

Este valor de λ puede ser sustituido en la ecuación de Abbe. Dado que el ángulo α es
generalmente muy pequeño, el valor del ángulo expresado en radianes se aproxima al de sen
α , por lo que se sustituye. Si consideramos n (índice de refracción) igual a la unidad, y
multiplicamos 0.612 por 1.23 obtenemos el valor 0.753 y por lo tanto, la ecuación se reduce a
la siguiente expresión

donde:

d = resolución en nm

α= ángulo de apertura en radianes

V = voltaje de aceleración (V)

4 http://www.nobelprize.org/educational/physics/microscopes/powerline/index.html Accesible
27/01/2016

En última instancia y en términos prácticos, la resolución espacial del SEM dependerá, como
veremos más adelante, del tamaño del haz de electrones utilizado que a su vez dependerá
tanto de la longitud de onda de los electrones como del sistema utilizado para producir el haz.
Y, así mismo, la resolución también estará condicionada por el tamaño del volumen de
interacción, el volumen de material de la muestra que interactúa con el haz de electrones.

La interacción de los electrones con la muestra

EL microscopio electrónico de barrido o SEM, como más comúnmente se le conoce por su

acrónimo en inglés (Scanning Electron Microscope), es un instrumento compuesto por un
sistema óptico-electrónico que explora la muestra por medio de un haz móvil de electrones
que, como resultado de la interacción electrón-materia, provoca la generación de diversas
radiaciones.

Dada la facilidad de dispersión de los electrones, para mantener el control del haz resulta
necesario mantener la columna en altos niveles de vacío. Así, en el SEM, el haz de
electrones, procedente del cañón -5- atraviesa la columna, a través del sistema óptico de
lentes electromagnéticas, llegando a la muestra, donde un generador de barrido produce el
movimiento del haz, de manera que barre o “escanea” la muestra punto a punto.
(Fig. 2) Esquema básico del funcionamiento de un SEM

5 Ver esquema básico en fig 2 y tipos en fig 12

El sistema óptico, compuesto esencialmente por una lente condensadora y una lente objetivo,
focaliza el haz saliente del cañón de electrones, modificando su diámetro y focalizándolo sobre
el espécimen. Y unas bobinas deflectoras, controladas por el generador de barrido, son las
responsables de que el haz focalizado rastree la muestra.

(Fig. 3) Correspondencia del barrido del haz punto a punto y la imagen del monitor

El haz rastrea de izquierda a derecha y de arriba abajo, existiendo una correspondencia uno a
uno entre el patrón de barrido de la muestra y el patrón de barrido utilizado para producir la
imagen en el monitor. De ese modo, la resolución de imagen seleccionada afectará,
obviamente, al número de píxeles por fila así como el número de filas que constituyen el área
escaneada.

De la interacción del haz con la muestra en cada punto se genera una señal que es recogida y
procesada para generar la imagen. El procesador toma la intensidad de la señal procedente
de un píxel en la muestra y la convierte en un valor de escala de grises del correspondiente
pixel en el monitor. La imagen final del monitor será, así, un patrón de barrido bidimensional
de valores de escala de grises.

Para cambiar la magnificación, todo lo que necesitaremos hacer es cambiar el tamaño del
área de barrido sobre la muestra. El tamaño del patrón de rastreo del monitor es constante, de
manera que la magnificación aumentará si reducimos el tamaño del área escaneada en la
muestra.

La colisión del haz de electrones altamente acelerado con los átomos de la muestra da como
resultado la producción de varios tipos de radiación (Ver fig. 4) que puede ser detectada y
analizada por detectores específicos. Estas señales revelan una valiosa información acerca de
la muestra como la morfología y topografía de la superficie, la composición elemental, la
conductividad eléctrica, la estructura cristalográfica, etc.

Estos son los principales fenómenos se producen al interactuar el haz de electrones con el
espécimen:

1. Emisión de electrones secundarios

2. Emisión de electrones retrodispersados

3. Electrones absorbidos

4. Emisión de rayos X

5. Emisión de fotones

6. Electrones Auger
(Fig. 4) Esquema básico de las diferentes señales generadas a raíz de la interacción del haz
primario con la superficie de la muestra. En este caso no se muestran las que corresponderían
a la interacción del haz de electrones con una muestra delgada como sería el caso del TEM.

Todos estos fenómenos se encuentran de un modo u otro relacionados entre sí y dependen,

hasta cierto punto, de la topografía, el número atómico y el estado químico de la muestra.

De la interacción del haz principal de electrones con la muestra nos centraremos en dos tipos
de dispersión de electrones: dispersión o “scattering” de electrones elástica e inelástica.
Los eventos inelásticos ocurren cuando el haz interacciona con el campo coulómbico del
núcleo del átomo de la muestra.

La fuerza coulómbica se define como:

Siendo r la distancia entre las cargas Q1 y Q2 y ε0 la constante dieléctrica. Cuanto más cerca
pasa el electrón del núcleo, es decir, a menor r, mayor es F y por consiguiente el ángulo de
dispersión.

En este tipo de dispersión el electrón incidente pierde parte de su energía, pero sin sufrir una
desviación significativa de su trayectoria. El resultado es una transferencia de energía al
átomo de la muestra y una potencial expulsión de un electrón de este átomo llamado electrón
secundario (Secondary Electron SE). Estos electrones, por definición, tienen una energía
menor a 50 eV. Y, si la vacante ocasionada se llena desde un orbital superior, entonces se
produce un rayo X característico de esa transición de energía.

De otro lado, la dispersión elástica da como resultado un cambio en la dirección del haz de
electrones, pero sin una alteración significativa de la energía del haz de electrones (<1 eV). De
modo que, si el haz de electrones desviado elásticamente se dispersa de nuevo fuera de la
muestra, los electrones se denominan retrodispersados (backscattered electron BSE). Un
BSE puede tener un rango de energía de 50 eV a casi la energía del propio haz incidente.
Pero, sin embargo, la mayoría de los electrones retrodispersados retienen al menos 50% de la
energía del haz incidente.
(Fig. 5) Diversos modos de emisión de electrones a partir de la incidencia de un haz de
electrones: Los electrones secundarios son dispersados inelásticamente y los
retrodispersados elásticamente. Los electrones Auger y los rayos X son causados por la
eyección de electrones de capas internas compensada por electrones de capas orbitales
superiores, ocupando así el nivel de energía vacante, o bien se da un exceso de energía en
forma de un rayo X característico o la expulsión de un electrón a un orbital exterior.

De hecho, los electrones secundarios (SE) pueden ser generados por 3 mecanismos
diferentes:

1. Por interacciones de electrones procedentes del haz incidente con átomos de la muestra.

2. Por interacciones de alta energía de electrones retrodispersados (BSE) con átomos de la

muestra.

3. O bien, pueden ser producidos por electrones retrodispersados (BSE) de alta energía que
impactan contra las piezas polares del microscopio o/y otros objetos sólidos cerca del
espécimen.

El SEM utilizará para la formación de imágenes los electrones secundarios, dado que se
producen cerca de la superficie del espécimen y muestran su estructura topográfica. La
intensidad de esta radiación superficial (electrones de baja energía) varía conforme la sonda
barre la superficie del espécimen, y así se va presentando en la imagen formada en el monitor
representando su topografía.

De otro lado, la variación de emisión de electrones retrodispersados (electrones de alta

energía) dependerá de la composición de la muestra, pudiendo distinguir así la variación de
señal causada por la diferencia en el número atómico promedio, la orientación cristalográfica,
etc. Y nos proporcionan, de ese modo, información adicional sobre la distribución de la
composición de la superficie de la muestra.

Como ya se ha mencionado, en el SEM el haz de electrones, no está estático, sino que, con la
ayuda de bobinas deflectoras, barre punto a punto pequeñas áreas rectangulares de la
superficie de la muestra. De este modo también la señal de rayos X puede capturarse y
procesarse de diferentes formas:

 - Fijado el haz de electrones en un solo punto de la muestra, se puede realizar un

microanalisis elemental cualitativo y cuantitativo de los elementos constituyentes
del espécimen en ese volumen concreto de interacción.

 - Analizar cualitativa o cuantitativamente una línea y reproducir dicho análisis

gráficamente.
 - Sintonizar el espectrómetro para uno o diversos elementos predeterminados y
correlacionar la información con la de la imagen de la superficie de la muestra
escaneada, obteniendo así un mapa de localización elemental.

Resulta también importante entender desde donde llegan las diferentes señales que pueden
ser detectadas (Figura 6). Los electrones Auger y los secundarios con bastante baja energía
se absorben fácilmente en cualquier material y, por lo tanto, solamente los generados cerca de
la superficie pueden dejar la muestra para llegar al detector. Los electrones retrodispersados
tienen la misma energía que el haz incidente y, por lo tanto, penetran en la muestra más
fácilmente. Los rayos X podrán proceder de zonas más profundas.

(Fig. 6) Esquema del volumen de interacción sobre una muestra compacta y el origen de las
diferentes señales detectables.

6 Werner, W, Interaction of electron beams with matter, Surfacen & Plasma Technology
Research Group of the Institut für Allgemeine Physik. 2011
http://www.ualberta.ca/~ccwj/teaching/microscopy/

Cuando el haz de electrones golpea la materia, comienza a ensancharse a causa de fuertes

efectos de dispersión elástica. Simultáneamente, las interacciones inelásticas causan una
pérdida de energía de los electrones. Si la muestra es muy gruesa, la energía será transferida
completamente a la muestra. El resultado global es un volumen de interacción en forma de
pera como vemos en la figura más arriba. La profundidad de penetración t dependerá de la
energía del haz de electrones incidente (t ~ V) y de la composición sobre del material sobre el
que interactua (t ~ 1 masa / atómica).
Microanálisis de Rayos X

Los rayos X pueden tener una energía casi igual a la del electrón haz primario y por lo tanto
pueden proceder de zonas bastante profundas de la muestra (ver fig. 4). La generación de
fotones de rayos X se obtiene al ser expulsado un electrón de alguno de los orbitales internos
del átomo y que esta vacante sea ocupada por alguno de los electrones de un orbital más
externo. Así, de la colisión inelástica entre el haz primario y un electrón de un orbital interior da
como resultado la emisión de ese electrón del átomo. Y la energía liberada por este evento de
reemplazo de electrones produce un fotón con una energía igual a la diferencia de en la
energía entre los dos orbitales.

(Fig. 7) Esquema de posibles saltos orbitales de los electrones y la correspondiente emisión

de fotones.

Como ya mencionamos más arriba, la energía de estos fotones de rayos X resulta

característica de la transición electrónica ocurrida siendo así característica de cada átomo.
Así, obtendremos señales específicas correspondientes tanto a la procedencia orbital del
electrón expulsado (K, L o M) como a la que ocupa la vacante. Así, por ejemplo, a la energía
del rayo X procedente de un electrón eyectado de la capa K será del tipo K, pero si la vacante
la ocupa un electrón del orbital L entonces le llamaremos Kα. Además, se llega a considerar
no solamente el orbital procedente y el que cubre la vacante sino que, también se tienen en
cuenta los suborbitales.

Para la identificación positiva de un elemento será necesaria la comprobación de toda la

familia de picos para un elemento dado dentro del espectro analizado. Aunque, algunos
eventos (Mα, por ejemplo) solamente son posibles en átomos con un alto peso atómico.
(Fig. 8)

En un espectro de Rayos X aparecen picos a diferentes energías. Cada elemento se

caracteriza por un conjunto de picos a energías características, por lo que se puede
determinar la composición de la muestra. La altura de los picos depende de la cantidad
presente en la muestra y de la probabilidad de que se produzaca el pico característico para
cada elemento.

(Fig. 9) Detalle del espectro anterior: En verde marcadas las posiciones de los picos
correspondientes a la señal de las líneas L y M del Pb
(Fig. 10) Mapa donde se muestra la composición asignando un color a cada elemento
identificado en la estructura.

Además de la posibilidad de adquirir espectros de puntos determinados de la muestra, existe

también la posibilidad de realizar mapas elementales que correlacionan la imagen adquirida
de secundarios o retrodispersados con la presencia o no de los elementos que seleccionemos
el área escaneada. De este modo se obtendrán mapas individuales de distribución elemental
que pueden ser superpuestos a la imagen de SE o BSE.

(Fig. 11) Mapa donde se muestra la composición asignando un color a cada elemento
identificado en la estructura.

Las dimensiones del volumen de interacción varían proporcionalmente al voltaje de

aceleración: A medida que la energía del haz aumenta la tasa de pérdida de energía en la
muestra disminuye y, por tanto, los electrones del haz penetran más profundamente en la
muestra. También la probabilidad de dispersión elástica es inversamente proporcional a la
energía del haz. Con menos dispersión elástica, la trayectoria del haz cerca de la superficie de
la muestra será más recta y los electrones penetraran más profundamente en la muestra. Así,
el efecto acumulativo de la dispersión elástica causa que algunos electrones se propaguen de
nuevo hacia la superficie ampliando así e volumen de interacción.

El efecto contrario ocurre cuando el número atómico promedio de la muestra aumenta: La tasa
de pérdida de energía del haz de electrones se incrementa a mayor número atómico y, por lo
tanto, los electrones no penetran tan profundamente en la muestra.

Cañón de electrones
El cañón proporciona un haz estable de electrones altamente acelerados que se focaliza sobre
la muestra mediante un sistema de lentes electromagnéticas. El control de este haz sería
imposible a presión atmosférica, debido a que las moléculas de gas en el aire dispersarían los
electrones. Por ello, tanto el cañón como el resto de la columna del SEM ha de mantenerse en
vacío, y la muestra debe ser capaz de resistir el cambio de presión de manera que se altere su
morfología lo menos posible.

Para la generación del haz de electrones se pueden utilizar dos sistemas: el termoiónico o el
de emisión de campo (FEG Field Emisión Gun): Los de tipo termoiónico producen el haz por
calentamiento de un filamento; en este caso se utilizan o bien filamentos de Tungsteno (W) o
bien cristales de hexaboruro de Lantano (LaB6). En los cañones FEG se utiliza un campo
eléctrico para facilitar la emisión de electrones. Se requiere unas condiciones de vacío mucho
mejores que en los termoiónicos (alrededor de 10-10 Torr). Pero la complicación técnica es
compensada por unos valores de luminosidad de varios órdenes de magnitud mayor.

El diámetro de la sonda o haz puede variarse alterando la corriente de la lente condensadora,

permitiendo una mayor resolución, una cierta disminución de la aberración de las lentes y una
menor corriente de sonda.

(Fig. 12) Filamento de un cañón de emisión de campo. (Izquierda)

(Fig. 13) Filamentos para cañones de tipo termoiónico de W y de LaB6. (Derecha)

Preparación de las muestras

Debido, como hemos dicho antes, a que el SEM utiliza electrones y trabaja en condiciones de
alto vacío para poder formar una imagen, se puede requerir una mínima preparación especial.
Por ejemplo, las muestras hidratadas han de seguir algún tipo de proceso previo de
deshidratación. Las muestras biológicas deben fijarse químicamente de manera previa. Y
aunque los metales conductores no requieren preparación antes de ser observados, toda
muestra no conductora necesita recubrirse con una capa delgada de material conductor. Esto
último se hace mediante el uso de dispositivos que evaporan carbono en condiciones de vacío
o bien depositan algún metal pesado, (Au habitualmente) mediante un aparato llamado
“sputter-coater” (podría traducirse como pulverizador catódico)
El dispositivo de recubrimiento por pulverización catódica o sputtering utiliza un campo
eléctrico y gas argón para su funcionamiento: La muestra se coloca en una pequeña cámara
al vacío. El argón y un campo eléctrico causan una atmósfera ionizada, propiciando que los
iones de argón positivos impacten sobre una lámina de oro polarizada con carga negativa.

(Fig 14) Imagen de un Sputter coater comercial y esquema de funcionamiento básico.

Los iones de argón, arrancan los átomos de oro de la superficie de la lámina, que se
redepositan homogéneamente sobre la superficie de la muestra. Se produce así un
recubrimiento de oro muy fino y de grosor bastante controlable.

Si lo que se pretende es adquirir imágenes de calidad, se utiliza el recubrimiento con Au. Si lo

que se requiere es analizar la preparación mediante rayos X, entonces resulta mejor opción el
carbono ya que la señal de éste elemento no interferirá tan drásticamente con el resto de
lementos, a no ser que precisamente sea carbono lo que se pretenda analizar.

Existen algunos SEM que pueden trabajar en condiciones de bajo vacío, con una presión
superior en la cámara del espécimen a la habitual en los SEMs convencionales. Las presiones
de trabajo en estos microscopios suelen ser mayores de 10 Pa, mientras que la presión de un
SEM convencional suele estar alrededor de 10-4 Pa. Estos microscopios suelen dedicarse a la
observación de muestras biológicas, materiales que presenten una especial sensibilidad al
vacío o muestras únicas que no sea posible recubrir (muestras arqueológicas, por ejemplo).

En bajo vacío, se disminuye el efecto de carga en la muestra descrito más arriba y, de este
modo, se pueden observar también muestras no conductoras, sin necesidad de recubrirlas.

Ventajas y desventaja generales del SEM

Ventajas generales del SEM

• Proporciona una gran profundidad de campo.

• Gran versatilidad amplia gama de aplicaciones.

• Aporta información versátil mediante los diversos detectores.

• Operación rápida y fácil manejo.

• Posibilidad de observar objetos más grandes que en un TEM, incluso en condiciones de bajo
vacío en algunos casos para evitar alteraciones de la muestra.

• No resulta preceptivo cortar o adelgazar la muestra para la observación y, en una gran

mayoría de casos, no requiere prácticamente preparación.

Desventajas generales del SEM

• Aunque existen versiones de sobremesa con un precio algo más asequible, un microscopio
SEM conlleva un alto coste económico.

• Solamente se pueden examinar estructuras superficiales y con menor resolución que un

microscopio de transmisión, a pesar de que los actuales microscopios dotados con cañones
FEG han mejorado este último aspecto notablemente.

• Supone una mínima formación específica, tanto para su uso como para la preparación de
muestras.

• La preparación de muestras puede provocar artefactos sobre todo en muestras biológicas..

• Las condiciones de vacío y espacio limitado de la cámara del espécimen condicionan el

tamaño máximo de la muestra y la preparación, sobre todo en el caso de los materiales
orgánicos.

¿Por qué ver con electrones?

Introducción

Cuanto más acercamos un objeto al ojo, mayor es el ángulo aparente. Pero existe una
distancia mínima, el punto próximo (25 cm), por delante de la cual no se ve nítidamente el
objeto. En este punto la imagen llega a su máximo tamaño en la retina y todavía la percibimos
con nitidez. Para un ojo normal, un objeto situado a la distancia x = 0,25 m –punto próximo- lo
ve el ojo bajo un ángulo aparente máximo. El cristalino es una lente convergente (figura 1), así
que los rayos que pasen por el centro de la lente no se desviarán y los que pasen por la focal
llegarán paralelos al eje óptico.
Así queda claro que si queremos observar objetos los bastante pequeños, el ojo no será
suficiente. En este sentido, se pueden utilizar microscopios óticos o lupas (figura 2).

Si el objeto se sitúa en el foco de la lente, el ojo situado en cualquier posición detrás de la lupa
ve la imagen sin acomodación. La imagen que produce la lupa se forma en el infinito pero la
imagen del sistema lupa + ojo se forma en la retina. El aumento lateral de la lupa vendrá dado
por la distancia del punto próximo (como se ha dicho, unos 25cm) a la focal de la lupa.

¿Podemos hacer esta focal infinitamente pequeña para tener un aumento infinitamente
grande? ¿Qué limita la resolución de los microscopios ópticos? Justamente el hecho de que
trabajamos con fotones.

Recordemos el principio de Huygens:

“Todos los puntos a lo largo de un frente de ondas actúan como emisores puntuales. Por lo
tanto, cuando una onda se encuentra con una barrera con una pequeña apertura, todos los
emisores se ven bloqueados excepto uno, y la luz que pasa por la apertura se comporta como
un emisor puntual, de forma que la luz sigue en todas las direcciones, en vez de seguir recta a
través de la apertura.”

El principio de Huygens nos indica que si el objeto observado es menor que la longitud de
onda de la luz utilizada, la luz difractará alrededor del objeto. Teniendo en cuenta la longitud
de onda de la luz visible, las lupas resuelven hasta unos 600 nm.

Cuantitativamente, podemos considerar la ecuación de Abbe,

donde δ es la resolución, λ la longitud de onda de la radiación utilizada, n el índice de
refracción del medio y ß un ángulo relacionado con lo paraxial que sea el sistema (depende de
las aperturas utilizadas).

Por lo tanto, si queremos observar objetos con un tamaño característico menor que estos 600
nm, y dados los recientes desarrollos en nanotecnología y ciencia de materiales, es evidente
que sí, tendremos que buscar una radiación con una longitud de onda menor.

En este sentido, la física cuántica nos indica que todas las partículas se comportan también
como ondas (y las ondas como partículas), es la llamada dualidad onda-partícula. Los
electrones, en particular, tendrán asociada una longitud de onda según la relación de Broglie:

donde h es la constante de Plank (6.63.10-34J/s) y p es el momento lineal del electrón.

Por lo tanto, la longitud de onda de los electrones dependerá de la diferencia de potencial con
la que los aceleremos. En particular, si aceleramos el electrón con una diferencia de potencial
de 200 kV, ¡su longitud de onda será tan pequeña como 2.5 pm!

¿Por qué ver con electrones?

Hemos visto que los electrones parecen buenos candidatos para hacer imagen, pero podemos
considerar otros tipos de radiaciones, como por ejemplo los neutrones o los rayos X.

Típicamente, en los experimentos de difracción de neutrones, los neutrones tienen una

longitud de onda λ= 1.5 - 5 Å. Por su parte, los rayos X tienen una longitud de onda del orden
de λ= 1 Å. Por lo tanto, ¿por qué no “ver” con neutrones o rayos X? ¿Qué hace que los
electrones sean tan particularmente interesantes en óptica, hasta el punto de hablar de óptica
electrónica?

El hecho es que los electrones son partículas cargadas, y por lo tanto siguen la ley de Lorentz:
Por lo tanto, es posible deflectarlos con campos electromagnéticos, es decir, construir lentes
para electrones, y en última instancia, microscopios.

El primer microscopio electrónico de transmisión lo construyeron Ruska y Knoll en la década

de 1930, hecho por el cual recibieron el premio Nobel de física en 1986.

En la figura 3, se muestra a Ruska y Knoll con su microscopio; en la figura 4, el FEI Titan Pico,
el TEM con mejor resolución actualmente.
Lo que limita la resolución del TEM son las aberraciones. Las lentes electromagnéticas están
muy lejos de ser perfectas; si nuestros ojos presentaran las mismas aberraciones que un
TEM, se nos consideraría legalmente ciegos.

Les aberraciones más importantes son el astigmatismo, la aberración esférica y la aberración

cromática. El astigmatismo se corrige compensándolo con otras lentes que se encuentran en
la columna.

La aberración esférica proviene del hecho que todos los puntos del frente de ondas esférico
no ven la misma focal de la lente, sino que el valor de la focal depende de la distancia al eje
óptico. Esto hace que la imagen de un punto no sea un punto sino un disco. Se trabaja en el
plano donde el diámetro de este disco es mínimo, es el llamado disco de mínima confusión.

Finalmente, la aberración cromática proviene del hecho que los campos electromagnéticos
actúan de distinta manera sobre electrones que tienen distinta energía, y, en consecuencia,
distinta velocidad. Es decir, que electrones de energías (o “colores”) diferentes verán focales
diferentes.

Algo de física del estado sólido

Un cristal ideal es una repetición infinita de una unidad estructural (grupo de átomos). La red
de Bravais es el conjunto de puntos de un cristal desde los cuales se ve el mismo entorno
atómico. Se genera todo el cristal al repetir periódicamente un cierto conjunto de átomos, que
llamaremos base atómica, asociándola a cada nudo de la red de Bravais.

La red de Bravais se puede definir a partir de tres vectores de translación fundamentales, a1,
a2 i a3, de manera que las posiciones, R, de los nudos de la red se obtienen a partir de
combinaciones lineales de estos vectores.

T es el vector de translación.

Sólo hay 14 clases de redes de Bravais en tres dimensiones. Se obtienen combinando las
diferentes operaciones de simetría de translación y simetría puntual.
Para poder entender muchos fenómenos físicos que tienen relación con la estructura periódica
de los sólidos, introducimos la noción de red recíproca. La red recíproca no tiene existencia
real en el cristal. Es una construcción matemática que simplifica la descripción de los
fenómenos que tienen lugar en el sólido. A cada red cristalina le corresponde una red
recíproca.

Experimentalmente, podemos visualizar esta red recíproca como el diagrama de difracción

de electrones. Por esto, midiendo distancias y ángulos entre los puntos que aparecen en
estos diagramas, podemos deducir los parámetros de red del cristal real y sus elementos de
simetría y con estos datos identificar la estructura cristalina de los materiales.

Entendemos el electrón incidente como un frente de ondas. Según el modelo de Bragg, los
planos del cristal se comportan como espejobqs semitransparentes de manera que en cada
plano se reflejan partes del mismo frente de ondas. Como no recorren el mismo camino óptico
antes de superponerse de nuevo en el exterior del cristal, se producirá interferencia positiva si
la diferencia de caminos ópticos es un múltiplo entero de la longitud de onda (nλ).

Así pues, la red cristalina se comporta como una red de difracción para el haz de electrones
incidente, lo que nos permite obtener una difracción de electrones, que nos dará información
valiosa sobre la muestra de estado sólido que estemos caracterizando.
En un microscopio de transmisión de electrones, los electrones impactan contra la muestra y
la imagen correspondiente se obtiene a través de la recolección de los electrones resultantes
de este impacto. Algunos habrán traspasado la muestra sin ningún tipo de interacción, otros
habrán traspasado pero habrán sido dispersados de forma elástica (sin pérdidas de energía) o
inelástica (con pérdidas de energía), y otros pueden ser absorbidos. Además, también pueden
producirse fotones como consecuencia de transiciones de energía de los electrones de los
átomos que forman la muestra. Según qué tipo de señal detectemos después del impacto del
haz obtendremos diferente información.

En el TEM, tenemos una lente objetivo que nos permite formar la imagen, y la muestra se
sitúa en el plano objeto de la lente; la imagen de la muestra se forma en el plano imagen;
además, en el plano focal imagen de la lente se encuentra el patrón de difracción. En este
sentido, un conjunto de lentes en la columna (intermedia y proyectora) permiten hacer una
imagen del plano imagen de la lente objetivo (modo imagen) o del plano focal imagen de la
lente objetivo (modo difracción).

La apertura de selección de área, situada en el plano imagen, nos permite seleccionar una
región de la muestra de la que obtener un patrón de difracción.

De forma análoga, la apertura de objetivo se encuentra en el plano de difracción. En este

plano, nos permite seleccionar uno o más spots de difracción para obtener una imagen. En el
caso de que seleccionemos la parte del difractograma que incluye el haz directo (los
electrones que no han sido difractados) obtendremos una imagen llamada de campo claro
(Bright Field), y si no lo incluimos obtendremos una imagen llamada campo oscuro (Dark
Field).

En las imágenes de campo claro, veremos claras las zonas en las que no haya muestra (más
intensidad del spot transmitido) mientras que en campo oscuro veremos oscuras las zonas en
las que no haya muestra.

El campo oscuro nos permite obtener imágenes de defectos cristalinos y entender en qué
dirección cristalográfica se dan, o estimar el grado de policristalinidad de una muestra dada.
En campo claro obtenemos imágenes de la morfología general de la muestra, por ejemplo. Un
caso particular del campo claro son las imágenes de alta resolución, en las que vemos la
periodicidad de los planos cristalinos.

El modo STEM es una técnica avanzada de microscopio de transmisión que utiliza

bobinas electromagnéticas adicionales situadas
en la columna de un TEM para controlar la posición del haz.
Eso permite utilizar un haz de electrones muy delgado y desplazarlo
secuencialmente sobre la superficie de la muestra.
En este modo de operación, las imágenes que se van construyendo pixel a pixel
a medida que el haz barre la muestra.
Pero no con electrones secundarios como en el SEM,
sino con los electrones que la han atravesado.
Reproduce el video desde ::40 y sigue la transcripción0:40
En un TEM entendemos los electrones como ondas que al atravesar la muestra
difractan e interfieren entre sí.
Para dar lugar a los diagramas de difracción y a las imágenes de alta
resolución.
Pero la dualidad onda partícula también nos permite abordar los fenómenos de
interacción entre electrón y la muestra desde una perspectiva diferente.
Considerando el electrón como una partícula de carga eléctrica negativa.
Reproduce el video desde :1:7 y sigue la transcripción1:07
Las cargas positivas de los núcleos pueden cambiar la trayectoria de los electrones
incidentes haciendo que en vez de seguir aproximadamente en línea recta,
se desvíen a un ángulo alto.
La probabilidad de que esto ocurra depende de la carga del núcleo,
y por lo tanto, del número atómico.
El número de electrones que sufrirán esta interacción
es aproximadamente lineal con el número atómico al cuadrado.
Reproduce el video desde :1:31 y sigue la transcripción1:31
En modo STEM podemos utilizar detectores de electrones de forma anular
colocados debajo de la lente objetivo para formar las imágenes
con los electrones dispersados a diferentes ángulos.
Reproduce el video desde :1:44 y sigue la transcripción1:44
El detector de campo claro centrado en el eje óptico recoge los electrones que no se
han desviado y nos da una imagen similar a la del campo claro en modo TEM.
Con el detector angular de mayor diámetro
recogeremos los electrones dispersados a alto ángulo.
El contraste Z en la imagen dependerá del número atómico de los elementos presentes
en la muestra.
Donde tengamos elementos más pesados recogeremos más electrones
y el pixel correspondiente tendrá mayor intensidad.
Reproduce el video desde :2:14 y sigue la transcripción2:14
Esta dispersión, causada por los núcleos de los átomos de la muestra,
es prácticamente elástica sin pérdida de energía.
Por otro lado, los electrones del haz primario pueden interaccionar
con la nube electrónica de los átomos de la muestra y cederles cierta energía.
Reproduce el video desde :2:31 y sigue la transcripción2:31
Al atravesar la muestra tendremos electrones con diferentes energías
en función de la energía perdida en la muestra.
Este haz puede ser dispersado por un campo magnético de forma análoga
a como un haz de luz blanca puede ser separado en colores por un cristal.
De esta manera,
podemos detectar el número de electrones que han perdido una determinada energía.
Reproduce el video desde :2:53 y sigue la transcripción2:53
La espectroescopía de pérdida de energía de los electrones
nos dará información sobre la naturaleza de los átomos presentes en la muestra
y como están enlazados.
Reproduce el video desde :3:3 y sigue la transcripción3:03
Según el control del haz sobre la muestra,
podemos obtener un espéctro IS en un único punto.
Adquirir un aspecto en cada pixel a lo largo de una línea.
O bien si barremos una determinada región de interés,
construir la llamada imagen de espectros.
En la que cada píxel contiene el espectro de pérdida de energía de los electrones en
ese punto de la muestra.
Reproduce el video desde :3:24 y sigue la transcripción3:24
Analizando adecuadamente la información contenida en los espectros
podemos cuantificar la composición química del material.
Los estados de oxidación de los elementos y otras propiedades de la muestra.
Reproduce el video desde :3:36 y sigue la transcripción3:36
La observación en modo HADF nos permite hacer una
reconstrucción tomográfica de la muestra obteniendo su forma tridimensional.
Para ello, iremos girando la muestra y tomando imágenes a diversos ángulos.
A partir de estas imágenes se puede reconstruir la forma del objeto.
[MUSIC]

Dispersión y difracción de electrones

Dado que el electrón es una partícula con una masa muy pequeña y cargada negativamente,
es muy susceptible a ser desviada al pasar cerca de otros electrones o de núcleos cargados
positivamente. Como ya se ha visto, esta dispersión de los electrones al pasar a través de
una muestra es la que permite obtener imágenes de TEM.

Figura 1. Diferentes tipos de haces resultantes de la interacción de los electrones del haz
incidente con una muestra fina.

La dispersión de los electrones puede producirse de dos formas:

 Elástica: los electrones no pierden energía en la interacción. Esta interacción se

suele producir para ángulos de entre 1º y 10º y para bajas energías. El conjunto
de electrones resultantes suelen ser coherentes (respecto a su carácter
ondulatorio, la coherencia indica la alineación de las longitudes de onda de un
conjunto de ondas). La dispersión elástica pierde coherencia a medida que el
ángulo sobrepasa los 10º. Los electrones dispersados elásticamente suponen la
mayor fuente de contraste en el TEM, y también crean la mayor parte de la
intensidad de los patrones de difracción (DPs).
 Inelástica: los electrones pierden energía en la interacción. Se suele producir
para ángulos pequeños, menores a 1º, y para electrones de alta energía. El
paquete de electrones resultante suele ser incoherente. Este tipo de interacción
es interesante en cuanto a la información que nos aporta sobre la composición
química de la muestra, que no se puede obtener de forma immediata a partir de
los electrones dispersados elásticamente.

Para referirnos a la probabilidad de que un electrón padezca una dispersión elástica o

inelástica utilizamos el concepto de cross section o sección eficaz. Esto es un área imaginaria
cuya fracción respecto al área total es igual a la probabilidad de que el fenómeno ocurra. Así,
si la probabilidad de que un electrón interaccione inelásticamente con la muestra es de 0,1, la
fracción de sección eficaz respecto al área será la misma, aunque ésta no representa ningun
área real. Por lo tanto, cada posible interacción tiene una "cross section" o sección eficaz (σ),
que depende de la energía de la partícula (en nuestro caso, la energía del haz de electrones)
y, cuanto mayor sea ésta, mayor será la probabilidad de que ocurra esta interacción.
Para un espécimen observado bajo el TEM, el número de eventos en los que el electrón sufre
desviaciones por unidad de área a lo largo de su trayectoria a través de la muestra es:

 donde σ (atomos) es la sección eficaz para la interacción del electrón con un

átomo, Nₒ es el número de Avogadro, A es la masa atómica de la muestra, ρ la
densidad del material y (t) el grosor. No obstante, debido a la cantidad de
variables que afectan tanto la sección eficaz para un átomo como la total, se
suele mostrar una estimación: para las energías del TEM (100-400 KeV), la σ
elástica es casi siempre el componente dominante de la dispersión (del orden de
10E-22 m2).

En vez de utilizar el área para describir la interacción también podemos utilizar una medida de
longitud, ya que la distancia que recorre el electrón entre interacciones será importante para
muestras delgadas (que son las utilizadas para microscopía electrónica). Este otro parámetro,
llamado trayectoria libre media (λ, mean free path) es la distancia media que el electrón
recorre entre dos sucesos de dispersión. Esta distancia será importante en el sentido de que,
conociendo este concepto, podremos saber cuán delgado debe ser el espécimen para que la
dispersión múltiple no sea significativa. De esta forma, se hace más sencillo interpretar los
datos espectroscópicos e imágenes en términos de desviaciones únicas.

La relación entre σ (sección eficaz total) y λ (trayectoria libre media) es:

λ =1/σ

Para TEM, los valores típicos de λ para dispersión son del orden de decenas de nm; esto
implica que para obtener interacciones de una única dispersión, necesitaríamos muestras de
grosor del orden de decenas de nanómetros.

A pesar de toda la información anterior, los valores que podemos conocer de σ y λ siguen
siendo imprecisos, especialmente para energías de 100-400 KeV utilizadas en TEM. Por lo
tanto, lo que se hace es una simulación Monte Carlo para predecir la trayectoria del electrón a
través de una capa fina: este método consiste básicamente en la utilización de números
aleatorios en los programas computacionales, de manera que el resultado siempre estará
regido por la estadística.
Figura 2. Simulación de Monte Carlo para la dispersión de electrones (haz de 1000 electrones
de energía 100 KeV) a través de una capa fina de Cu (A) y Au (B). Se puede observar un
aumento en el ángulo de dispersión para la muestra de mayor número atómico (oro).

Como ya hemos comentado, por la dualidad onda-partícula, los electrones en movimiento a

altas velocidades también tienen propiedades ondulatorias. Por lo tanto, no sólo son
susceptibles a interaccionar con la muestra como partículas, sino también como ondas. De
esta forma, cuando los electrones atraviesan la muestra, también se produce el fenómeno de
difracción, que ocurre cuando una onda interacciona con un objeto que se encuentra en el
límite de su trayectoria.

Este fenómeno permite obtener patrones de difracción (DP, Diffraction Patterns), que también
aportan información sobre la muestra. De forma simplificada, podemos decir que los patrones
de difracción se obtienen por interferencias constructivas entre ondas (electrones) que se
encuentran en el plano de difracción: la amplitud de las ondas se suma cuando su fase difiere
en un múltiplo de 2, lo que requiere que la diferencia de caminos ópticos entre estas ondas
sea un múltiplo de la longitud de onda, según la ley de Bragg (vista en apartados anteriores).
Esta ley se formuló para rayos X, pero dado que no depende del mecanismo de difracción,
sino de la geometría,es también aplicable a los electrones.

La difracción de rayos X se ha usado históricamente en la mayoría de estudios para obtener

información sobre materiales. Hay ciertas analogías entre la difracción de rayos X y de
electrones, pero en realidad los mecanismos implicados son distintos (más complejos en la
difracción de electrones).

La difracción de rayos X se produce porque estos son desviados por los electrones presentes
en el material, ya que la carga negativa de los electrones interacciona con el campo
electromagnético de los rayos X. Los electrones responden al campo aplicado del flujo de
rayos X oscilando con el período de este haz, y las partículas cargadas aceleradas resultantes
emiten su propio campo electromagnético, de idéntica longitud de onda y fase que el de los
rayos X incidentes. El campo resultante, que se propaga radialmente desde cada fuente de
dispersión, se denomina la onda difractada.
Por su parte, los electrones se difractan tanto por los electrones como por los núcleos
presentes en la muestra a estudiar, al interactuar las cargas negativas con los campos
electromagnéticos locales del espécimen. De esta forma, los electrones del haz son
dispersados de una forma directa por la muestra (no se trata de un intercambio de campo a
campo como en el caso de los rayos X). Así, los electrones son más fuertemente dispersados
que los rayos X.

Figura 3. El haz incidente de electrones en la muestra se convierte en un conjunto de de

haces desviados por diferentes fenómenos.

Los patrones de difracción (DP) de electrones se corresponden estrechamente con la

difracción de Fraunhofer observada en la luz visible (esta difracción se produce cuando un
frente de onda plano interacciona con un objecto; dado que una onda emitida por una fuente
puntual se vuelve plana a largas distancias, se conoce como difracción de campo lejano).
Aunque, en realidad, lo que observamos en el patrón se corresponde con el efecto de la
difracción de Fresnel para la luz visible (conocida como difracción de campo cercano).

El TEM tiene las características necesarias para poder obtener imágenes de la distribución de
los electrones dispersados: patrones de difracción. Imaginemos que colocamos una placa
fotográfica justo debajo de la muestra fina y que los electrones desviados de la figura 4 inciden
directamente en la película imprimiendo el punto de su trayectoria. En estas circunstancias,
contra mayor es el ángulo de desviación, más lejos del centro impactará el electrón: por tanto,
las distancias en el film corresponden a los ángulos de dispersión de los electrones.
Figura 4. Ejemplos de patrones de difracción de electrones en un TEM convencional de 100
KeV. (A) Carbón amorfo (B) cristal simple de aluminio.

Qué factores afectan a la dispersión de los electrones en el TEM?

La σ total de dispersión disminuye contra mayor es la energía: por lo tanto, la dispersión de un

haz de electrones a 300 KeV será menor que a 100 KeV. La densidad de la muestra también
afecta a la dispersión: las regiones de alta densidad producen más eventos de dispersión que
las de baja densidad y, contra mayor sea el número atómico Z de la muestra, más dominará la
dispersión elástica.

Además, en general habrá menos dispersión a ángulos mayores (cuando seleccionamos

electrones que se han desviado un cierto ángulo θde su trayectoria, estamos cambiando su
sección eficaz efectiva, que disminuye contra mayor es el ángulo). Por esto, la dispersión que
más nos interesará en el TEM convencional es la que se produce hacia delante (atravesando
la muestra), ya que la mayoría de los electrones desviados se encuentran dentro de del haz
directo (obtendremos más información).

AEM (Microscopía Electrónica Analítica)

La AEM (Analytical Electron Microscopy) conforma las técnicas de recopilación de datos

espectroscópicos en el microscopio electrónico de transmisión. Estas señales se basan en
diversos fenómenos generados durante las interacciones inelásticas de los electrones con la
muestra (explicadas anteriormente).

Estas señales se pueden utilizar para identificar y cuantificar la concentración de elementos

presentes en un área de la muestra, mapear su distribución en la muestra con una alta
resolución espacial e incluso determinar su estado químico. Aunque hay diversas señales
generadas por la interacción del haz incidente de electrones, las principales técnicas de la
AEM se basan en la detección de rayos X y la medida de las pérdidas de energía de los
electrones. En el primer caso, hablamos de EDXS o espectroscopia de dispersión de energía
de rayos X (Energy Dispersive X-ray Spectroscopy) y, en el segundo, de EELS o
espectroscopía por pérdida de energía de los electrones (Electron Energy Loss Spectroscopy);
estas técnicas se realizan en un TEM con los detectores correspondientes. Hay otras técnicas
incluidas en la AEM, como la catodoluminiscencia o la especroscopia de Auger, pero no se
suelen implementar en los TEMs comerciales.

Las condiciones inherentes a la microscopía STEM, como veremos, dan lugar a la realización
de diversas técnicas de microscopía analítica, como la técnica de EELS, que también
describiremos en este texto.

STEM (Scanning Transmission Electron Microscope)

La microscopía STEM (Microscopía electrónica de transmisión de barrido) combina los

principios de TEM y SEM.

Como en SEM, la técnica de STEM desliza un haz de electrones fino y focalizado a lo largo de
la muestra. La interacción entre este haz y los átomos de la muestra generan un flujo de
señales que se correlacionan con la posición del haz para construir una imagen virtual donde
la intensidad de señal en cualquier localización de la muestra es representada por la
intensidad en la escala de gris de la correspondiente localización en la imagen. La principal
ventaja respecto al SEM convencional es la mejora en la resolución espacial.

Como en TEM, la técnica de STEM requiere muestras muy finas y detecta principalmente los
electrones transmitidos a través del espécimen. Su principal ventaja respecto al TEM
convencional es que permite el uso de otras señales que no puede ser espacialmente
correlacionados en TEM, como los electrones secundarios, electrones dispersados, rayos X
característicos y pérdidas de energía de los electrones.

Detectores en el STEM

Como se ha explicado en apartados anteriores, la obtención de contraste en el TEM se puede

realizar de dos modos en función de los electrones seleccionados en el sistema de creación
de la imagen: mediante campo claro (BF, Bright Field), donde se recogen los electrones del
haz directo, o campo oscuro (DF, Dark Field), donde se seleccionan los electrones
dispersados. En el STEM, también se seleccionan estos dos tipos de electrones, pero
mediante detectores en lugar de aperturas.
Para seleccionar los electrones del haz directo, se utiliza un detector situado en el eje del haz
(on-axis), mientras que para recoger los electrones dispersados, se utiliza un detector anular
alrededor (off-axis).

En STEM, algunas de las técnicas que se pueden realizar en función de las señales
detectadas son:

- Electrones dispersados: En STEM, los electrones del haz que han sido dispersados en un
ángulo relativamente grande son detectados utilizando un detector HAADF (High Angle
Annular Dark Field, campo oscuro anular de grandes ángulos). Hablaremos de esto más
adelante.

- Microanálisis de rayos X: los rayos X emitidos por la muestra a causa del bombardeo de
electrones, son característicos de la composición elemental de esta. Para contar y clasificar
los rayos X en función de su energía, se utiliza un espectrómetro dispersivo de energía de
rayos X (EDX, Energy Dispersive X-ray spectrometer).

Figura 6. Comparación del modo de obtención de imágenes en DF o BF para TEM

convencional y STEM.

- La espectrometría dispersiva de longitud de onda de rayos X (WDX, Wavelength Dispersive

X-ray spectrometry) mide y cuenta los rayos X según su longitud de onda, como el nombre
indica (la longitud de onda se puede correlacionar con la energía). Un espectrómetro de
longitud de onda utiliza un cristal o una rejilla de espaciado conocido para difractar los rayos X
característicos.

- EELS: analiza los electrones transmitidos para determinar la cantidad de energía que han
perdido en la interacción con la muestra. Se explicará con detalle más adelante.

Como veremos, en STEM se pueden detectar y medir prácticamente todas las señales
generadas por una muestra fina bajo un haz de electrones. Por tanto, se podrían reproducir
todas las técnicas convencionales utilizadas en TEM y otras menos convencionales, como el
contraste Z y otras técnicas especializadas. No obstante, el modo de operación de STEM está
enfocado a la obtención de información donde el TEM convencional tiene limitaciones, y de la
misma forma, el modo STEM no será tan óptimo en técnicas en las que el TEM constituye el
modo más especializado y adaptado, como veremos.

Imágenes en STEM: HAADF y en tres dimensiones

Un STEM permite una mayor flexibilidad en la selección de los electrones a detectar que el
TEM, ya que es posible modificar el ángulo del detector, de manera que se obtiene el
equivalente a una apertura de objetivo variable y se tiene un mayor control de los electrones
que contribuirán a formar la imagen. Siempre podremos, por tanto, ajustar el contraste en una
imagen de STEM modificando los controles de procesamiento de señal en el ordenador
(ganancia del detector, brillo, etc.).

Aun así, las imágenes de STEM en campo claro suelen tener una baja resolución, ya que para
un espécimen de pequeño grosor, el haz directo domina la resolución (por ello se necesita un
mayor haz de electrones para obtener imágenes de intensidad aceptable). En general, en una
imagen de STEM obtendremos un mayor contraste pero también más ruido que en la misma
imagen para TEM.

En cambio, las imágenes de STEM en campo oscuro (en el que la mayoría de electrones
dispersados son recogidos por el detector, a diferencia del campo oscuro en el TEM),
contienen menor ruido que en TEM. Dado que no se utilizan lenes para la creación de la
imagen, éstas no sufren las aberraciones típicas del TEM(mencionadas en apartados
anteriores). A pesar de esto, la resolución en el STEM siempre será menor, excepto para
muestras de mayor grosor, ya que la aberración cromática en este caso no afecta a la
formación de las imágenes en STEM.

En definitiva, el uso de STEM está indicado en aquellos casos en los que la visualización de
contraste sea más importante que la resolución: por ejemplo, en muestras de polímeros no
teñidos, que no mostrarían contraste en un TEM convencional. El modo STEM también es
muy útil en caso de que la muestra a estudiar sea sensible a la irradiación de los electrones:
de esta forma se puede controlar el área irradiada de la muestra, convirtiéndolo en una forma
de microscopía de baja dosis. También es adecuado utilizar STEM en caso de que la muestra
sea tan gruesa que la aberración cromática limite la resolución en TEM, que tenga un
contraste bajo de forma inherente o que se óptima para HRTEM (High Resolution TEM) por
contraste de número atómico Z. Actualmente, el modo STEM en un TEM se ha convertido en
una técnica rutinaria de alta resolución.
Figura 6. Comparación de imágenes de TEM de campo oscuro (A) y claro (C) y de STEM de
campo oscuro con detector anular ADF (B) y campo claro (D) para el mismo polímero de doble
fase. En ambos casos, la imagen en STEM muestra un mayor contraste a pesar de la menor
resolución respecto al TEM convencional.

Contraste de grosor de masa (mass-thickness contrast) y contraste Z (Z-contrast)

El grosor de materia es la principal fuente de contraste en materiales amorfos. Este contraste

está causado principalmente por la dispersión de Rutherford (desviación de los electrones a
causa de la proximidad de su trayectoria a los núcleos de la muestra cargados positivamente;
se trata de una interacción elástica). El contraste de un punto de la muestra vendrá dado por:

, donde I y ΔI son la intensidad y el incremento de ésta, respectivamente, Δt es la diferencia de

grosor y Q es la sección eficaz total elástica, de la que ya hemos hablado anteriormente. Por
tanto, si el contraste mínimo que podemos observar es de un 5%, la diferencia de grosor
observable será:
, donde (A) es la masa atómica de la muestra, átomo, Nₒ es el número de Avogadro, σ la
sección eficaz para un átomo y ρ la densidad del material.

El efecto del grosor en el contraste se deduce también del camino libre medio libre medio λ. λ
eses inversamente proporcional a σ, como ya hemos visto, por lo que los especímenes de
mayor grosor son los que más dispersión producirán, hecho que es bastante intuitivo después
de los conceptos que hemos tratado.

De forma global, si no tenemos en cuenta los electrones dispersados inelásticamente (lo cual
no es razonable: a pesar de que la mayor parte de electrones que generan contraste son los
dispersados elásticamente, no se pueden obviar la contribución de los inelásticos, pero lo
haremos para simplificar la materia), podemos obtener la expresión para la reducción del
número de electrones dispersados a medida que aumenta el grosor de la muestra:

, donde N=No/A y el resto de variables corresponden a las mismas que hemos descrito ya.

Se puede aplicar un razonamiento similar al anterior para . Utilizando el factor de dispersión

atómico y otros parámetros en los que no haremos hincapié en este capítulo, podemos llegar
a una expresión que nos indica que la sección eficaz eficaz σ(β), donde β queda definido por
el ángulo de colección de la apertura de objetivo, depende de Z y de la energía en kV de los
electrones: los especímenes con un mayor muestran más dispersión, mientras que para las
energías de los electrones, son las Eo bajas las que aumentan la dispersión.

El contraste Z se refiere a la técnica de obtención de imágenes por contraste de masa de alta

resolución (atómico). Se trata del límite del contraste por grosor de masa donde la dispersión
detectable proviene de átomos aislados o columnas de átomos.

En los años 1970 ya se demostró la potencial capacidad del STEM para observar átomos
aislados pesados en sustratos de bajo . Estas imágenes se formaban con el detector ADF
recolectando únicamente los electrones dispersados elásticamente a pequeños ángulos. Pero
a menudo había problemas debido a la recolección de electrones dispersados inelásticamente
que se sumaban al señal de de ADF. Esto se solucionó separando estos electrones de la
señal de ADF con el sistema de EELS (un inconveniente era que el contraste de difracción,
proveniente por ejemplo de un sustrato cristalino, se preservaba en la señal de ángulos
pequeños, hecho que dificulta la interpretación de la imagen).

Por tanto, de forma general podemos decir que en primera aproximación el contraste de una
imagen en STEM dependerá de las variables locales de la muestra Z y t, y de las variables
ajustables en el microscopio β y Eo
Figura 7. Contraste Z proveniente de átomos de platino individuales o en grupos de una
imagen en ADF. Los átomos de Pt se encentran en una capa de Al2O3. Esta capa genera las
amplias regiones claras por la difracción detectada en el ADF, dificultando la visualización de
la dispersión por los átomos de Pt.

Imágenes HAADF

Por lo explicado en el apartado anterior, el primer intento de obtener contraste Z no fue

adecuado para el estudio de materiales cristalinos. Como el detector ADF convencional
siempre iba a recolectar algunos electrones provenientes de la difracción de Bragg, fue
necesario diseñar otro detector con una apertura central mayor: se puede disminuir la longitud
de la cámara con las lentes que se encuentran después de la muestra, para asegurar que los
electrones de Bragg no llegan al detector. De esta forma, sólo los electrones dispersados en
ángulos muy grandes contribuirán a la

imagen.
Figura 8. Esquema del funcionamiento del detector HAADF en comparación con el ADF y el
BF convencionales.

Los efectos de Bragg se pueden evitar si el detector HAADF (High Angle Annular Dark Field,
campo oscuro anular de grandes ángulos) únicamente detecta electrones dispersados a
ángulos mayores a 50mrad (3°). Por ejemplo, el detector Fischione HAADF mide 28mm, y su
diámetro interior, 4mm. Por esto, las imágenes de contraste de Z también se llaman
comúnmente imágenes de HAADF.

Figura 9. Imagen de alta resolución de TEM por contraste de fases (A) de Ge en Si con una
capa superficial de SiO2 amorfo. El Si y el Ge son indistinguibles por contraste de fases. La
misma muestra por contraste Z en STEM (B) permite observar las regiones del cristal con Ge
(de mayor Z) y las regiones de SiO2 (de menor Z), que aparecen muy oscuras. Las
estructuras cristalinas de Ge y Si son visibles en ambos casos, aunque en el segundo caso se
observa más ruido. En (C) se observa un modelo cristalino superpuesto a una imagen de Z
previamente procesada y refinada para reducir el ruido. En este caso se puede observar
fácilmente el nivel atómico.

Una enorme ventaja de las imágenes por HAADF es que se pueden recolectar en el mismo
momento y región de la muestra que los datos generados por EELS. Como veremos más
adelante, esta es la única combinación de dos técnicas que permite obtener los dos tipos de
información a la vez.

Contraste de difracción en STEM

Para obtener patrones de difracción en el STEM, análogamente al TEM, se deben detectar los
haces difractados, asegurando que el detector ADF sólo recoja el haz fuertemente difractado
(mediante la apertura de objetivo seleccionamos sólo un haz difractado). Esto se puede
conseguir, alternativamente, desplazando el patrón para que la reflexión hkl caiga justo en el
detector BF. De todas formas, el contraste de difracción observado en una imagen de STEM
será en general de peor calidad que la observada en el de TEM: las condiciones normales de
utilización del STEM no equivalen a las de TEM, en el que éstas aseguran un gran contraste
de difracción. Estas condiciones son:

 El haz incidente debe ser coherente (el ángulo de convergencia debe ser muy
pequeño).
 La muestra debe ser inclinada en la orientación adecuada para obtener los dos
haces diferenciados
 Sólo el haz directo o el haz fuertemente difractado deben pasar por la apertura de
objetivo.

Figura 10. Comparación de los ángulos de convergencia (2α) y divergencia (2β) del haz en
TEM y STEM.
Dado que para los propósitos de STEM utilizamos un haz de electrones convergente en lugar
de paralelo, podemos ver que no se podrá obtener la equivalencia con el TEM (el ángulo de
convergencia siempre será mayor en STEM). No obstante, existe un principio llamado el
Principio de reciprocidad, que en esencia afirma que siempre que los caminos de las ondas de
los electrones contengan ángulos equivalentes (de convergencia y recolección) en algún punto
del sistema óptico electrónico, la imagen de contraste será idéntica. De esta forma, dado que
el ángulo de la apertura de objetivo en el TEM y el ángulo de convergencia en STEM son
iguales, se puede tratar de satisfacer la igualdad recíproca disminuyendo la apertura de
objetivo en STEM. No obstante, esto da como resultado un incremento del ruido a medida que
obtenemos imágenes de mayor contraste. Por este motivo, por lo general el contraste de
difracción sólo se utiliza en STEM con propósito analítico, pero las imágenes de difracción se
siguen obteniendo con TEM, donde las condiciones son más adecuadas.

Nuevas técnicas de imagen

La mayor parte de las técnicas descritas hasta ahora se podrían incluir en lo que llamaríamos
las imágenes TEM “clásicas”. Esto incluiría las técnicas BF y DF, que fueron las primeras
técnicas y que pronto dieron lugar a modos de operación que utilizaban diferentes haces:
contraste de difracción, contraste de fases, contraste de masa, etc. Estos mecanismos con los
que caracterizamos nuestras muestras se basan en la selección de diferentes haces de
electrones usando una variedad de detectores para obtener distintos contrastes en las
imágenes. No obstante, actualmente hay variaciones de esta forma de trabajo que permiten
obtener mucha más información de una imagen de TEM. En este texto presentaremos algunas
de ellas, que constituyen una importante aplicación dentro de la Microscopía Electrónica
Analítica.

Imágenes en tres dimensiones

Cualquier imagen de TEM o STEM consiste, en realidad, en una proyección bidimensional de

una muestra tridimensional, lo cual constituye una limitación fundamental. Por ejemplo, si
estudiamos un defecto en un material cristalino a través de imágenes de contraste de
difracción, a veces es posible diferenciar si éste se encuentra en la parte superior o inferior de
la capa, si se cuenta con experiencia en la observación; no obstante, en general se pierde la
dimensión de profundidad.

Para recuperar la información de la profundidad habitualmente se usa la estereomicroscopía,

aunque esta únicamente permite obtener información de características que muestren
contraste de fase o de difracción (dado que esta técnica requiere la inclinación de la muestra a
diferentes ángulos, no se puede utilizar el contraste de fases, ya que éste se vería modificado
por en cambio de ángulo y se perdería el efecto estéreo). Esta técnica es muy útil, por
ejemplo, cuando se quiere discernir si los precipitados en un espécimen se han formado en la
superficie o en la base de éste.
La imagen en estéreo aporta información gracias al sistema de calibración de nuestro cerebro:
la interpretación simultánea de imágenes recibidas en cada uno de los ojos (los cuales
observan la imagen desde ángulos ligeramente distintos, con una separación aproximada de )
permite calibrar la profundidad de los elementos de la imagen gracias al cambio de paralaxis.
Este es un mecanismo cerebral intrínseco que utilizamos de forma continuada y que nos
permite observar el espacio tridimensional en el que nos movemos. Es fácil comprobar que,
con un solo ojo, esto no es posible: si cerramos un ojo e intentamos unir nuestros dedos
índices a unos 20 cm de la cara, es muy probable que no acertemos a la primera, ya que la
falta de información proveniente del otro ojo impide obtener la profundidad de la imagen.

Figura 11. Pareja de imágenes de estéreo de precipitados en espinela en un espécimen de

NiO-Cr2O3. Estas imágenes combinadas, con la separación adecuada, deberían mostrar la
profundidad de los precipitados. Se puede observar también el pequeño cambio de paralaxis
entre las dos imágenes.

Por lo tanto, si obtenemos dos imágenes de TEM de la misma área pero inclinadas con
ángulos ligeramente distintos y se muestran de forma simultánea con un visualizador de
estéreo, es posible observar una imagen única donde se aprecie la profundidad de las
características observables gracias a este mecanismo cerebral. De hecho, algunas personas
son capaces de diferenciar incluso el efecto estéreo sin ayuda del visualizador.

Para observar el efecto estéreo, las imágenes deberían estar separadas unos 60 mm, pero a
la práctica es suficiente mover las imágenes hasta que la separación relativa entre éstas sea
tal que los ojos y el cerebro sean capaces de captar y cuantificar el efecto. Además, es
necesario que las dos imágenes tengas exactamente el mismo campo de visión, contraste y
magnificación para poder observar este efecto, ya que de otra forma el cerebro interpretará el
efecto de profundidad de forma incorrecta. Para ello, el procedimiento a seguir en la obtención
de un par de imágenes de estéreo sería:
 1. Seleccionar una región de interés y obtener una imagen (normalmente se utiliza
campo claro)
2. Inclinar el espécimen alrededor de 5° y asegurarse de que el campo de visión no
se ha modificado en este paso, y corregirlo en caso de que haya cambiado
3. Asegurar que la imagen sigue enfocada (utilizando el control de altura de la
muestra (z, specimen-height control).
4. Obtener la segunda imagen.

Una vez obtenidas ambas imágenes, se pueden simplemente observar con un visualizador de
estéreo. Si las imágenes están correctamente espaciadas debería observarse el efecto de
profundidad. Además, el visualizador permite calcular la profundidad relativa de una
característica de interés en un par de imágenes, en base a la relación:

, donde Δp es el cambio de paralaxis del detalle en cuestión entre las imágenes, φ la

inclinación relativa entre éstas y (M) la magnificación (si la definición del ángulo de inclinación
es ±φ, el sin φ/2 será simplemente sinφ).

Para una determinación de la profundidad real sería necesario marcar la superficie del
espécimen con alguna característica reconocible, como partículas de oro, para tener una
referencia. Esto no es importante, en general, en TEM, donde la profundidad relativa es
suficiente para el fin de la imagen. Si se necesitan medidas cuantitativas en estéreo, es
posible realizar más cálculos complejos, o utilizar la ET, que es una técnica emergente en
TEM.

En biología, la necesidad de imágenes tridimensionales reales ha sido aparente durante las

últimas décadas: las estructuras biológicas como virus o macromoléculas necesitan ser
determinadas en las tres dimensiones, especialmente en las regiones donde la topología es
importante para las propiedades físicas y químicas del complejo. En física de materiales, se
comenzó a usar el APFIM (Atom Probe Field Ion Microscope), que permitía en contaje de
átomos individuales en una estructura tridimensional. No obstante, esta sensibilidad era una
limitación, ya que esta técnica es incapaz de analizar una muestra de unos centenares de
nanómetros de grosor. Además, es necesario que la muestra sea conductora.

Tomografía electrónica (ET)

Ante la creciente necesidad de examinar nuevos materiales y dispositivos de forma integral a

escala nanométrica, se desarrolló la tomografía electrónica (ET, Electron tomography), que es
una técnica utilizada para la determinación de la estructura tridimensional de las muestras.
Literalmente, la palabra tomografía significa la visualización de cortes o rebanadas. Aunque
actualmente este término es más flexible, y se puede usar cuando se engloban geometrías
arbitrarias, siempre que el espécimen sea inclinado activamente en diferentes ángulos. Para
realizar esta técnica se pueden obtener los datos en un microscopio de TEM. El procedimiento
experimental de obtención de datos consiste básicamente en dirigir el haz de electrones a
través de la muestra, inclinando el ángulo de rotación respecto a un eje de ésta de forma
diferencial en cada paso. Para esto es necesario un portamuestras específico que permite el
cambio de orientación (es evidente que cambiar el ángulo de incidencia del haz de electrones
sería inviable). El principio implicado en la obtención de reconstrucciones tomográficas es
básicamente el mismo que el de las imágenes de estéreo, pero es esencial obtener al menos
un centenar de imágenes y disponer de un ordenador que permita analizar los datos y
visualizar los resultados obtenidos.

Una vez hemos recogido los datos para cada ángulo, es necesario realizar un procesamiento
posterior para integrar toda la información y así obtener una imagen tridimensional de la
muestra. Para este paso, obviamente, necesitamos herramientas computacionales que
permitirán reconstruir la información proveniente del microscopio y observar la estructura
interior de la muestra.

Esta técnica tiene especial interés para el estudio de nanomateriales y semiconductores: con
el rápido avance de la nanotecnología, existe la necesidad de obtener información estructural
de alta resolución para los nuevos dispositivos y materiales desarrollados. Inicialmente esta
técnica se vio limitada por la necesidad de utilizar ordenadores rápidos y grandes memorias,
así como portamuestras que permitan una inclinación relativa de prácticamente . Actualmente,
la resolución de las tomografías electrónicas es del orden de 5 a 20 nm.

Como en la mayoría de técnicas microscópicas, existen diferentes modos de trabajo en la

realización de tomografías electrónicas. La mayoría son combinaciones de técnicas que ya
hemos visto.

La tomografía de campo claro (Bright-field TEM tomography) tiene el inconveniente de

requerir que la intensidad de la imagen proyectada varíe monótonamente con el grosor del
material. Esta condición es difícil de asegurar en estos casos, ya que la intensidad de la
imagen está dominada por el contraste de fases, siendo por lo tanto difícil distinguir las
inclusiones de alta densidad con los espacios vacíos. Además, el contraste del BF-TEM se
basa esencialmente en un filtro de paso de frecuencias espaciales altas (la información para
las bajas se suprime), por lo que las zonas afiladas o de cambios bruscos aparecen
exageradas. La ventaja de la tomografía de campo claro es que permite obtener medidas
fiables para materiales parcialmente cristalinos con dominios pequeños de cristal único. No
obstante, no es una buena opción en ciencia de materiales, ya que no constituye una
reconstrucción real debido a que el contraste de las imágenes no satisface las condiciones de
proyección requeridas para la tomografía.
La tomografía HAADF-STEM (HAADF-STEM tomography) es más versátil y permite obtener
imágenes tridimensionales de alta resolución para materiales altamente cristalinos como los
dispositivos semiconductores. Los electrones recolectados por el detector HAADF
corresponden principalmente a electrones que han interaccionado cerca del núcleo atómico y
que son incoherentes, por lo que no muestras cambios de contraste según el grosor y
orientación de la muestra asociados a la dispersión elástica. Por tanto, al contrario que los
casos anteriores, se elimina el contraste de fase y difracción (las intensidades de la imagen
varían con el grosor de la muestra proyectado en materiales de bajo Z), y de esta forma se
suprimen los artefactos de realce de los bordes.

Como en todas las técnicas utilizadas para obtener imágenes tridimensionales, es importante
prestar atención al cambio de foco según la profundidad: la profundidad de foco se puede
maximizar usando una apertura de condensador pequeña que minimice el ángulo de
convergencia, pero en última instancia el límite de difracción dominará resultando en un efecto
difuminado residual. Esto limitaría la resolución de la tomografía obtenida, y lo que se suele
hacer es reenfocar las imágenes en cada secuencia de cambio del ángulo de inclinación para
asegurar que el enfoque sea óptimo en la mayoría de imágenes.

Figura 12. Imagen de STEM HAADF típica de un catalizador heterogéneo de nanopartículas

de Pd6Ru6 de 1 nm de diámetro aproximadamente dentro de un soporte mesoporoso de sílice
(MCM-41), en que los mesoporos son hexagonales. Es muy importante conocer la distribución
tridimensional de las nanopartículas metálicas y su localización respecto a los poros internos,
ya que esto es crucial para entender los factores que gobiernan la actividad y selectividad de
los nanocatalizadores.
Figura 13. Montaje donde cada imagen corresponde a una proyección de la reconstrucción
tridimensional del mismo catalizador MCM-41-Pd6Ru6 de la figura 13 vistas desde los ángulos
que se muestran en cada caso. Las nanopartículas han sido posteriormente coloreadas en
rojo para una mejor visualización.

Por lo tanto, la tomografía HAADF-STEM permite obtener una reconstrucción fiel de la

muestra, siempre que las características de esta se puedan resolver.

La tomografía EFTEM (Energý-filtered TEM) permite a su vez realizar de forma rápida

mapeados cuantitativos de determinados elementos con una resolución espacial de nm.
Según el interés del estudio, se seleccionan diferentes rangos de electrones: en biología, se
seleccionan rutinariamente el pico de electrones con pérdida nula de energía (zero-loss peak),
donde los electrones que han sufrido una interacción inelástica mayor a 5 eV son suprimidos,
permitiendo un mayor contraste; también en química analítica raramente se utilizan los
electrones que han sufrido interacciones cerca del núcleo atómico, debido a la alta dosis de
electrones necesaria para obtener la información; en física de materiales, en cambio, los
especímenes suelen ser unos órdenes de magnitud más estables bajo el haz de electrones
que en los campos anteriores, por lo que se puede reconstruir un mapa tridimensional de la
distribución elemental de una muestra. Hablaremos de esta técnica más adelante.
EELS (Electron Energy-Loss Spectrometry)

Si en un microscopio que permite hacer STEM añadimos un espectrómetro de electrones, es

posible realizar la técnica de medida de EELS (Espectrometría por pérdida de energía de los
electrones).

La técnica de EELS se basa en el análisis de la distribución de energía de los electrones del

haz que han atravesado la muestra de interés. La interacción de estos electrones con el
espécimen nos aporta información sobre la composición y estructura química y la
configuración electrónica de los átomos que conforman el material. Por tanto, podemos llegar
a conocer el estado de valencia y el tipo de enlaces de los átomos presentes en el material, la
densidad de electrones libres o la estructura atómica circundante, entre otros. Gracias al
hecho de que el haz convergente en STEM nos proporciona información de forma local,
podemos obtener medidas cuantitativas de las propiedades mencionadas, en correlación con
la localización espacial en la muestra.

La técnica EELS está substituyendo a la XEDS gracias a su capacidad de obtener mayor

información de la muestra (permite obtener más información que la simple identificación de los
elementos). A pesar de que la XEDS nos proporciona una resolución de unos cuantos átomos
y una alta sensibilidad, tiene la limitación de que es incapaz de detectar elementos por debajo
del Litio en la tabla periódica. La EELS, además de ofrecer una mayor resolución espacial y
sensibilidad analítica (ambas del nivel de un solo átomo), permite la detección de elementos
ligeros.

La dificultad de esta técnica reside en su aplicación experimental: requiere muestras

especialmente finas para obtener la información adecuada, y la interpretación de los
resultados precisa unos conocimientos físicos más profundos que la XEDS.

Cuando un electrón de alta energía atraviesa una muestra fina, puede pasar inalterado o bien
puede perder su energía (dispersión inelástica de los electrones). La técnica de EELS
separa estos electrones dispersados inelásticamente en un espectro que podemos interpretar
y cuantificar, que nos permite formar imágenes o DPs de electrones de una determinada
energía, e incluso combinar los espectros y las imágenes.

El espectro de pérdidas de energía puede observarse en la figura 15. Se puede ver una
separación del espectro en dos zonas: la de bajas pérdidas de energía y la de altas pérdidas
(el punto que determina el límite entre estas zonas es más bien arbitrario, y en este caso se ha
determinado del orden de ~50 eV. Cabe destacar las siguientes características:

El pico correspondiente a pérdidas nulas de energía es muy intenso

El rango de intensidades es enorme (el gráfico en realidad utiliza una escala logarítmica para
la intensidad para poder mostrar todo el espectro).

La región de bajas pérdidas de energía que contiene el pico en plasmón es relativamente

intensa.

La señal global de intensidad disminuye rápidamente con el aumento de las pérdidas de

energía, alcanzando niveles que pueden ser omitidos por encima de los 2 KeV
aproximadamente (que define el límite energético de la técnica).

Aunque no se pueda deducir fácilmente de la figura, en realidad, la región de bajas pérdidas

de energía se corresponde con la información de los electrones del átomo enlazados más
débilmente, mientras que la zona de altas pérdidas aporta información de los electrones que
están más fuertemente ligados y de la distribución de los enlaces atómicos.

Figura 14. Ejemplo de espectro de EELS. El pico de pérdida nula de energía es un orden de
magnitud más intenso que la porción de pérdida baja de energía, que a su vez es varios
órdenes de magnitud más intensa que los picos identificados con el rango de altas pérdidas de
energía.

Instrumentación

Para examinar el espectro de energía de los electrones, utilizamos un espectrómetro con un

prisma magnético. Este prisma magnético es la base del filtro de energía que permite
conocer los valores para los electrones que atraviesan la muestra. Este detector de alta
sensibilidad llega a una resolución menor a 1eV de energía (incluso cuando el haz de
electrones tiene una energía mayor a 300KeV). Actualmente, sólo hay un tipo de
espectrómetro disponible a nivel comercial, llamado EELS de recolección paralela o PEELS
(manufacturado por Gatan, Inc.). A veces también se le denomina sector magnético, y
consiste en un sistema de prismas magnéticos colocados en un TEM o STEM después de los
detectores situados detrás de la muestra.
Hay dos tipos de filtros que dan lugar a dos instrumentos totalmente distintos a pesar de su
función similar: el GIF (post-column Gatan Image Filter), que se basa en el sistema de
prismas magnéticos PEELS, y el filtro in column, que es una variante magnética del prisma
magnético de Castaing-Henry, ejemplificado por el filtro Omega (Ω), siendo los pioneros Zeiss,
pero también usado en JEOL. Este último filtro, como indica su nombre, está integrado dentro
del TEM entre la muestra y el detector; por lo tanto, no es un elemento añadido opcionalmente
como en el primer caso.

En cualquiera de los filtros utilizados, el electrón pasa a través de uno o más prismas
magnéticos, en un proceso análogo a la dispersión de la luz blanca por un prisma de vidrio.
Los prismas magnéticos son preferibles a espectrómetros electrostáticos por diversas
razones: son compactos y fácilmente integrables en el TEM, ofrecen suficiente resolución
energética para distinguir el espectro de los elementos de la tabla periódica (lo cual hace
posible el análisis) y los electrones en un rango de energía de 100-400 KeV (típico en AEMs)
pueden ser dispersados suficientemente para detectar el espectro electrónicamente sin limitar
así la resolución de energía.

La estructura básica de un PEELS-TEM se puede observar en la figura 16. Se puede observar

que los electrones son seleccionados por una apertura de entrada variable (de 1, 2, 3 o 5 mm
en el sistema Gatan). Estos viajan a través del espectrómetro hasta un “tubo de deriva” y son
desviados por el campo magnético en ≥90°. Los electrones que han perdido energía son
desviados un ángulo mayor que los que no han sufrido pérdidas. De esta forma, el espectro se
forma en el plano de dispersión (figura 17), y consiste en una distribución de la intensidad de
los electrones (I) en función de la pérdida de energía (‘E). A pesar de que las pérdidas de
energía son un incremento y por tanto deberían expresarse en términos de ΔE, en la literatura
de EELS se usa la convención de expresar tanto la energía como los cambios de energía con
la letra E (en este caso, usamos 'E). El prisma magnético también actúa como una lente: se
puede observar también en la figura 17 que los electrones con idénticas pérdidas energéticas
que viajan en direcciones dentro y fuera del eje son reconducidos al foco en el plano de la
imagen del espectrómetro.
Figura 16. Diagrama esquemático que muestra la situación de un PEELS (debajo de la
pantalla de visualización de un TEM) y sus componentes.

Figura 15. Trayectorias seguidas por los electrones a través de un espectrómetro de prisma
magnético. Se pueden observar la diferente dispersión y foco en el plano de la imagen
(dispersion plane) de los electrones que pierden y no pierden energía. En la parte inferior
podemos ver el efecto de lente magnética que ejerce el prisma en el plano normal al
espectrómetro. En el cuadro superior derecho, la analogía con la dispersión de la luz blanca
con un prisma de vidrio.

Técnica experimental: obtención de un espectro EELS

Para obtener un espectro por EELS, necesitamos un dispositivo que registre las medidas del
plano de dispersión del espectrómetro. Históricamente, se utilizaba una película fotográfica o
un semiconductor, pero en la actualidad se utiliza una cámara CCD tanto en GIFs como en
filtros Ω. Una cámara CCD, charge-coupled device, es un dispositivo que permite el
movimiento de cargas hacia un terminal donde estas son convertidas a valores digitales; las
cargas generadas (electrones libres) en cada región de la CCD corresponderán a la señal
recibida, y contribuirán al valor de la intensidad del píxel correspondiente. El uso de la CCD se
ha extendido gracias a que muestra una mayor sensibilidad, mayor rango dinámico (ratio entre
los valores máximo y mínimo de una magnitud; en este caso el mínimo correspondería al ruido
de fondo) y mejor resolución energética en comparación con los métodos anteriores. Después
del tiempo de integración necesario para obtener un espectro de calidad, éste se puede
convertir a la señal requerida para el sistema visualizador de un ordenador.

Durante el uso del espectrómetro se puede trabajar en dos modos. Si utilizamos del TEM de
forma que la imagen se presente por pantalla, el plano focal de la lente proyectora contiene un
DP, que el espectrómetro después de la columna utiliza como objeto. Desde el punto de vista
de un espectroscopista, esta forma de trabajo sería el modo de difracción, pero desde el punto
de vista de un microscopista, es más natural llamarla modo imagen, ya que nosotros vemos
una imagen por pantalla. En cambio, si ajustamos el microscopio de forma que el DP se
proyecte en la pantalla (incluido el modo STEM), entonces el plano objeto del espectrómetro
contiene una imagen, y la terminología es inversa. Esta terminología puede resultar confusa
en función del punto de vista de la persona que la utiliza. En general, se utiliza el modo
difracción o STEM.

El ángulo de recolección del espectrómetro β (que en realidad es un semiángulo) es una

variable muy importante en EELS, por lo que hay que conocerla durante la obtención del
espectro. Si no se controla el valor de este ángulo, no se pueden comparar directamente dos
espectros, y esto introduce con frecuencia un error de cuantificación en las medidas.

Hay un ángulo para el cual un proceso específico de pérdida de energía del electrón es más
probable: típicamente, debemos fijar el ángulo β como 2 o 3 veces aquél ángulo. En caso de
duda, lo mejor es hacer β grande. No obstante, en general, ángulos de recolección grandes
permitirán obtener altas intensidades pero también baja resolución. Un ángulo de recolección
menor aportará una relación señal/ruido mayor en el espectro.
Figura 16. El valor de β (A) en TEM (modo imagen) o STEM/TEM (modo difracción). En (A), β
depende principalment de las dimensiones de la apertura de objetivo, mientras que en (B),
vendrá determinado por la apertura de entrada del espectrómetro (proyectada en el plano del
DP).

Espectro de pérdida de energía

El término “pérdida de energía” de los electrones (EEL) implica que estamos interesados
únicamente en las interacciones inelásticas. No obstante, el espectro también contendrá
electrones que no han perdido energía distinguible, por lo tanto, deberemos considerar
también la dispersión elástica.

Según el valor de la cantidad de energía perdida por el electrón, podemos hablar de diferentes
regiones del espectro:

 El pico de pérdida nula (zero-loss peak): contiene principalmente electrones

dispersados elásticamente, pero también incluye electrones que han perdido
cantidades de energía muy pequeñas. Se hace muy útil formar imágenes y DPs
con los electrones de este pico, ya que ofrece ventajas respecto a imágenes no
filtradas de muestras de un grosor considerable, que dan lugar a un mayor
número de electrones desviados que no contribuyen al contraste, como ya hemos
explicado (estas imágenes estarán libres de aberración cromática y efectos de
dispersión difusa). Este pico será la señal de mayor intensidad del espectro.
Figura 17. Comparación de imágenes en TEM de una muestra biológica gruesa sin filtro (A) y
con filtro (B), donde la señal de los electrones con pequeñas pérdidas de energía ha sido
eliminada. Se puede observar un mayor contraste en (B).

La región de bajas pérdidas (low-loss region): contiene electrones que han perdido una
energía de hasta 50 eV (este es un límite arbitrario). Estos electrones han interaccionado con
los electrones débilmente ligados de las capas superiores de los átomos. Por ende, esta parte
del espectro refleja la respuesta dieléctrica del espécimen a electrones de alta energía.
También se pueden formar imágenes con estos electrones que muestran información sobre la
estructura electrónica y otras características de la muestra. Una de estas características y
probablemente la de mayor importancia es la de conocer la valencia con la que se encuentran
los átomos de la muestra. También se puede calcular la constante dieléctrica local del
espécimen, la densidad de electrones libres y el grosor, entre otros. La identificación de
elementos y compuestos específicos se obtiene por comparación con espectros estándar de
referencia que se pueden encontrar en las bases de datos.
Figura 18. Espectro de bajas pérdidas de energía de un espécimen de aluminio puro de grosor
muy pequeño. El espectro muestra la intensidad de señal recibida según la energía de los
electrones detectados. Se puede observar claramente el pico de pérdida nula (I_0) y un
pequeño pico de plasmón (I_p) a los 15 eV.

Región de altas pérdidas: contiene electrones que han perdido una cantidad de energía
mayor a 50 eV. Estos provienen principalmente de la ionización o de interacciones inelásticas
con electrones fuertemente ligados más cercanos al núcleo atómica. En este caso también se
puede obtener información sobre la composición elemental de la muestra. Esta información se
suele utilizar para complementar los espectros obtenidos por XEDS, en los que falta
información sobre elementos ligeros, como ya se ha comentado. Uno de los potenciales usos
de los espectros de altas pérdidas es la obtención de mapas de los elementos presentes en la
muestra, ya que la información obtenida permite una identificación elemental directa. Los
márgenes correspondientes a ionizaciones permiten, además, obtener análisis e imágenes
cuantitativos de todos los elementos de la tabla periódica. La principal limitación de esta última
aplicación es que los especímenes deben ser mucho menores que la trayectoria libre media
(típicamente menores a 50 nm), ya que de otro modo el procesamiento necesario de los
resultados puede introducir artefactos.

Figura 19. Mapeado cualitativo de elementos de Si3N4 policristalino. En la primera imagen se

puede observar la muestra bajo TEM convencional. Las subsecuentes imágenes muestran los
puntos donde se ha encontrado presencia de diferentes elementos por la técnica de EELS:
nitrógeno (verde), oxígeno (rojo) y silicio (azul).

Tomografía EELS (EELS tomography)

Es posible utilizar una serie de imágenes 2D filtradas por alguna región del espectro EELS de
diferente inclinación para reconstruir una imagen 3D, como ya hemos visto en la sección de
TE. Estas imágenes se denominan de tipo EFTEM (Energy-Filtered TEM). Con la
reconstrucción tridimensional podemos apreciar características de superficie, ángulos y caras
de crecimiento y otras propiedades que no se pueden obtener tan fácilmente a partir de las
imágenes bidimensionales habituales. La tomografía EFTEM es un área aun en desarrollo,
pero en la figura 21 se puede observar un ejemplo: la distribución del fósforo en una
reconstrucción de una célula de mosca de la fruta (Drosophila melanogaster).
Figura 20. (A) Visión superior 2D y (B) reconstrucción tomográfica en 3D filtrada por energía
que muestra la distribución de fósforo de una sección de larva de Drosophila. La región
principal es parte de un núcleo celular y la zona superior derecha es una región del citoplasma
que contiene ribosomas. Ambos contienen ácidos nucleicos (DNA y RNA, respectivamente),
que son ricos en fósforo.

Corolario

Las técnicas y modos de operación expuestos en este texto ponen de manifiesto que la
microscopía electrónica de transmisión no constituye únicamente la solución a la falta de
resolución proporcionada en su momento por los microscopios ópticos. En efecto, hemos visto
que las posibilidades que ofrece un TEM van más allá de la extraordinaria resolución de las
imágenes que permite obtener: la comprensión de la interacción entre los electrones del haz y
la muestra a estudiar nos ha permitido desarrollar técnicas y acoplar detectores
complementarios que permiten obtener una gran cantidad de información valiosa sobre la
naturaleza del material de estudio.

El amplio espectro de datos de diferente categoría que permite obtener es la base de los
estudios que se están llevando a cabo en la actualidad. Es por esto que la microscopía
electrónica de transmisión se ha convertido uno de los recursos principales y fundamentales
de investigación en el campo de la nanociencia y la nanotecnología.
Referencias de los 5 módulos

Módulo 1: Microscopía

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Módulo 2: Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM)

 Williams, David B., Carter, C. Barry, Transmission Electron Microscopy: A

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Módulo 5: Microscopía Óptica Avanzada (MOA)

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