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Métodos de siembra y tinción de Gram

Gram staining and seeding methods.

Autor 1: Juan Sebastián Montoya Osorio Autor 2: Luis Eduardo López Cañas
Universidad tecnológica de Pereira, Pereira, Colombia
Correo-e: juansebastian.montoya@utp.edu.co
luislopez@utp.edu.co
Resumen— En la naturaleza, la mayoría de los staining is one of the most important methods used in
microorganismos no se encuentran aislados, sino the microbiology laboratory because with the help of
integrados en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el this dye we can divide the bacteria into two large
estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, groups which are gram positive and gram negative. The
es necesario separar unos de otros y trabajar con objective of this practice was to take from mixed
especies aisladas, obteniendo cultivos axénicos o puros. cultures a single colony from 2 different surfaces and
Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene un sólo sow them by the different sowing methods most
tipo de microorganismo y que procede generalmente de commonly used in order to obtain a bacterial culture.
una sola célula; el crecimiento de ésta origina, en medio
sólido, una masa de células fácilmente visible que recibe
el nombre de colonia. Para lograr este aislamiento son
usados diferentes métodos de siembra, Sembrar o Key Word — seeding, microorganisms, staining,
inocular es introducir artificialmente una porción de bacteria.
muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin de
iniciar un cultivo microbiano. El tamaño de las
mayorías de las células bacterianas resulta difícil de ver I. INTRODUCCIÓN
con el microscopio óptico. La principal dificultad que se
encuentra es la falta de contraste entre la célula y el
Para lograr el estudio de microorganismos, se han
medio que lo rodea es por esto que se opta por la
utilización de colorantes que permitan este contraste. desarrollado diferentes métodos que permiten
La tinción de Gram es uno de los métodos de mayor cultivarlos bajo condiciones artificiales, lo que hace
importancia y que se emplea en el laboratorio de posible manejar en muchos casos un solo tipo de
microbiología ya que con la ayuda de este colorante microorganismo cuando se requiera. Una de las
podemos dividir las bacterias en dos grandes grupos técnicas mas utilizadas en el laboratorio consiste en
que son las gram positivas y las gram negativas. El transferir unas muestra de cualquier ambiente a un
objetivo de esta practica fue tomar de cultivos mixtos medio de cultivo optimo para el desarrollo de los
una sola colonia de 2 superficies diferentes y microorganismos para así obtener cultivos
sembrarlas por los diferentes métodos de siembra mas
microbianos. Al realizar este procedimiento es
utilizados con el fin de obtener un cultivo bacteriano.
necesario comprender y tener en cuenta que en el
ambiente de trabajo hay muchos microorganismos
Palabras clave— siembra, microorganismos, tinción,
bacterias. diferentes, es por esto que se deben tomar
precauciones para impedir que se contamine nuestra
Abstract— In nature, most microorganisms are not muestra de estudio. La aplicación de estos
found isolated, but integrated in mixed populations. To procedimientos ha permitido propagar a los
carry out the study of these microorganisms and their microorganismos en cultivos mixtos, así como su
properties, it is necessary to separate them from each aislamiento en cultivos puros, facilitando el estudio,
other and work with isolated species, obtaining axenic caracterización, aplicación y control de los mismos.
or pure cultures. An axenic or pure culture is one that Cultivar microorganismos significa promover
contains only one type of microorganism and generally intencionalmente el desarrollo de este en medios
comes from a single cell; the growth of this cell
donde haya todas las condiciones para su optimo
originates, in solid medium, an easily visible mass of
cells that receives the name of colony. To achieve this crecimiento y desarrollo. La población de
isolation different seeding methods are used. To seed or microorganismos en un medio se le llama cultivo,
inoculate is to artificially introduce a portion of sample cuando este contiene una sola especie se denomina
(inoculum) in a suitable medium, in order to initiate a puro o axénico, cuando tiene mas de una se le
microbial culture. The size of most bacterial cells is denomina mixto.
difficult to see with the optical microscope. The main Un cultivo microbiano que ha estado en crecimiento
difficulty encountered is the lack of contrast between por determinado tiempo en el mismo medio se debe
the cell and the surrounding medium, which is why the transferir a un medio nuevo, ya que si no se hace, el
use of stains that allow this contrast is chosen. Gram
crecimiento y supervivencia de este no podrá
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continuar. Para realizar una siembra de

microorganismos existen diversidad de técnicas, cada
una de estas técnicas se usa dependiendo de lo que se
desee estudiar y el alcance que se quiera.
Principalmente los métodos más utilizados para la
siembra de microorganismos son: siembra en placas,
siembra en tubos de agar inclinado, siembra en
profundidad, siembra por agotamiento y siembra por
dilución.

Debido a la falta de contraste entre las células Imagen 1: Siembra en superficie

bacterianas y su medio, se ha tenido que usar
métodos de tinción con el fin de poder diferenciar B. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO.
especies de bacterias. La tinción es un método
sencillo que ayuda a incrementar el contraste entre la Igual que en la siembra por superficie, se tomaron las
célula y su entorno, lo que ayuda a mejorar la muestras y con un asa de siembra se realizó el zigzag
observación de estas. En la tinción las células de forma horizontal, pero esta vez al llegar maso
absorben las moléculas del colorante, lo que permite menos un poco antes a la mitad del medio, se giró la
cambiar el color de la célula y permite diferenciar caja 90° y se realizó el mismo procedimiento, así
unas de otras. La tinción de Gram es una de estas hasta completar las 4 esquinas de la caja de Petri. En
tinciones. Esta tinción es de gran utilidad y esta la última esquina antes de terminar se realizo una
definida como una tinción diferencial ya que utiliza 2 estría hasta la mitad del medio.
colorantes que clasifican a las bacterias en 2 grandes
grupos, las Gram positivas y las Gram negativas. La
tinción de Gram se basa en las diferencias de la pared
celular de las bacterias, las cual confiere
características especiales a cada microorganismo. Las
Gram negativas están formadas por una capa fina de
peptidoglicano y una membrana externa, mientras
que las Gram positivas poseen una pared celular
constituida por peptidoglicano, pero no contiene capa
externa; así pues estas características explican las
características tintoriales de cada tipo de bacteria.
Esta práctica se enfocó en poner en práctica los
métodos de siembra más usados y en realizar el
método de tinción de Gram para la caracterización de
bacterias presentes en un medio.

II. CONTENIDO

Se usaron 4 métodos de siembra diferentes para la

siembra de 1 colonia por cada superficie(silla y tarro Imagen 2 : Siembra por agotamiento
de alcohol) y para cada una de estas colonias se
realizó tinción de Gram y se observo en el C. SIEMBRA EN TUBO DE AGAR
microscopio. INCLINADO

A. SIEMBRA EN SUPERFICIE. Igual que en los métodos anteriores se tomo la

muestra con el asa de siembra, siempre cerca al
Primero se generó la zona estéril con los mecheros, mechero y se paso al medio de cultivo, en este caso
después de esto, con los medios de cultivo ya era un tubo de agar inclinado previamente preparado,
preparados en cajas de Petri y con los cultivos de se realizo un zigzag en la superficies del agar desde
cada superficie se pasó a tomar un poco de muestra el extremo inferior hasta el superior.
del cultivo de cada superficie(silla y tarro de alcohol)
con un asa de siembra y cerca al mechero se realizo
un zigzag de extremo a extremo por todo el medio de
cultivo y se cerro la caja de Petri.
 alcohol acetona para decolorar, el cual se dejo actuar
por 30s y se realizó también el enjuague. Para
finalizar se agregó el colorante safranina y se dejo
actuar por 1min.Terminada la tinción se paso a
observar en el microscopio.

Imagen 3: Siembra en tubo de agar inclinado

D. SIEMBRA EN CALDO NUTRITIVO

Se tomaron las muestras de manera adecuada con el

asa de siembra y se pasaron al medio de cultivo
previamente preparado, en este caso se realizo en
medio liquido(caldo nutritivo) se introdujo el asa con
la muestra y se agito rápidamente para que esta se
quedara en el medio líquido. Imagen 6: Tinción de Gram

III. RESULTADOS Y ANALISIS

Imagen 5: Siembra en caldo nutritivo En la siembra de los microorganismos por los 4

métodos usados se obtuvo lo siguiente:
E. TINCION DE GRAM

Se tomo una muestra del cultivo de cada superficie y

se puso con el asa de siembra sobre un portaobjetos
haciendo un espiral. Después se pasó a fijar la
muestra mediante calor, para esto se paso el
portaobjetos cerca a la llama hasta que se secara por
completo la muestra. Una vez fijada la muestra se
procedió a aplicar el primer colorante(Cristal violeta)
al aplicarlo se dejó reposar por 1min y después se
retiro el exceso con agua destilada. Se agrego
después el reactivo de Lugol el cual se dejo actuar
por 1min mas y después se enjugado con agua
destilada el exceso de este, así mismo se agregó
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Imagen 8: Siembra en superficie del tarro de alcohol

Se pudo observar un crecimiento bacteriano mas

ordenado que el de la muestra original. También se
observó algún crecimiento de pequeños hongos en
los bordes del vidrio reloj.
Imagen 7: Siembra en superficie de la silla

Se pudo observar buen crecimiento bacteriano,

aunque no se pudo observar muy bien las colonias,
ya que al ser una siembra masiva es muy complejo
determinar cuantas colonias hay presentes en el
cultivo.

Imagen 9: Siembra por agotamiento de la silla

En este método de siembra se pudo observar de
mejor manera el numero de colonias en el medio, se
pudo contar un total de 45 colonias individuales con
una forma rizoide, una elevación plana y un borde
ondulado.

Imagen 11: Siembra en tubo de agar inclinado de la

silla

En esta siembra se pudo observar un buen

crecimiento bacteriano y también se pudo observar
como este crecimiento fue desplazándose hacia la
parte inferior del tubo.

Imagen 10: Siembra por agotamiento del tarro de

alcohol

En este caso se realizo la siembra de mala forma, es

por esto por lo que no se pudo contar las colonias ya
que no se diferenciaban a simple vista, la siembra
quedo como una siembra masiva, lo cual interfirió en
el conteo de las colonias que era el objetivo principal.
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Imagen 12: Siembra en tubo de agar inclinado del
tarro de alcohol
En esta siembra se observo un buen crecimiento
bacteriano e igual que el de la silla el crecimiento se
fue desplazando hacia la parte inferior del tubo.
Imagen 13: Siembra en caldo nutritivo de la silla
En esta siembra se esperaba una turbidez en el caldo
nutritivo, pero no se noto esa turbidez esperada, solo
en la parte inferior del tubo se noto un poco de
turbidez, pero era casi nula.
Imagen 14: Siembra en caldo nutritivo del tarro de
alcohol
En esta siembra si se pudo observar una turbidez
bastante notoria, esto era lo que se pretendía
alcanzar, una turbidez que significara el buen
crecimiento bacteriano que hubo en el medio.
Para la tinción de Gram para cada una de las
muestras tomadas de cada superficie diferente se
obtuvieron los siguientes resultados.
Imagen 15: Tinción muestra de la silla vista en 4x
En este lente no se puede observar muy bien aun que
tipos de bacterias hay, sin embrago se vio que el
color que predomina es el color morado, lo que
significa presencia de Gram positivas
Imagen 16:Tincion muestra de la silla vista en 10x
En este aumento aún no se pudieron ver las bacterias
de buena manera, aun así el color morado seguía
prevaleciendo.

Imagen 18: Tinción muestra de la silla vista en 100x

En esta aumento al fin se pudo ver las diferentes

bacterias presentes en la muestra teñida, se pudieron
observar que había presencia de bacterias Gram
positivas.

Imagen 17: Tinción muestra de la silla vista en 40x

En esta aumento ya se pudieron ver de mejor manera

las bacterias presentes, se pudieron ver algunos
círculos coloreados de morado y algunos cilindros
pequeños del mismo color.

Imagen 19: Tinción muestra del tarro de alcohol vista

en 4x

En este aumento como con la muestra de la silla no

se puedo ver claramente que bacterias había
presentes en el medio, sin embargo el color morado
seguía siendo prevalente.
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Imagen 20: Tinción muestra del tarro de alcohol vista
10x
En este aumento a comparación de la tinción de la
silla se logro ver ya mas claramente algunas formas
de bacterias presentes.
Imagen 21: Tinción muestra del tarro de alcohol vista
en 40x
En esta aumento ya se empezaban a diferenciar los
tipos de bacterias que había presentes, al igual que en
la muestra de la silla, se veían círculos y cilindros
pequeños.
Imagen 22: Tinción muestra del tarro de alcohol vista
en 100x
En este aumento ya se pudo evidenciar claramente
los tipos de bacterias presentes, que al igual que en la
muestra de la silla fueron bacterias gran positivas las
que prevalecían.
IV. ANALISIS DE
RESULTADOS
Analizando los resultados obtenidos con los
diferentes métodos de siembra, pudimos ver cómo
influye la técnica de siembra en cuanto a los que se
quiera estudiar, en nuestro caso el objetivo era el
conteo e identificación de cada una de las colonias
bacterianas presentes en el cultivo, lo cual analizando
cada método de siembra se debería optar claramente
por utilizar el método por agotamiento, ya que este
me permite identificar y contar colonias presentes de
manera sencilla ya que al agotar la muestra en la
siembra , esta me disminuye por así decirlo la carga
microbiano permitiendo un crecimiento mas
ordenado como se puede ver en la imagen 9.Este
método por agotamiento es el mejor para este tipo de
análisis, ya que si vemos los demás métodos, no nos
permiten como tal un conteo y una identificación
adecuada, claramente cada método tiene sus ventajas
y cada uno de estos se aplica dependiendo de lo que
se este estudiando. Logramos percibir que si se
quiere una buena conservación el mejor método es en
el caldo nutritivo, ya que al estar en mayor contacto
la muestra con los nutrientes, este hará que el
crecimiento bacteriano sea mejor y además de esto
que se preserve por mas tiempo debido a la gran
disposición de nutrientes que tienen las bacterias.
Con estos 2 análisis podemos ver que el método a
utilizar depende del estudio que se esté haciendo.
En cuanto a la tinción de Gram que se realizó,
pudimos analizar como al principio no teníamos ni
idea de que tipo de bacterias estaban presentes, solo
pudimos hacer una caracterización macroscópica,
pero gracias a la ayuda de la tinción pudimos
diferenciar los tipos de bacteria que había presentes.
En nuestro caso se presento mayormente, presenta de
bacilos gram positivos(imagen 18 y 22), estos son
muy comunes encontrarlos en los ambientes que nos
rodean y como el estudio lo hicimos con
microorganismos de estos ambientes, pues se
esperaba obtener este tipo de bacterias. Así pudimos
ver la gran importancia de estos métodos de
coloración para la identificación y como gracias a
estos se lograron y se logran actualmente grandes
avances en la ciencia.
V. CONCLUSIONES
-En esta práctica se pudo concluir que el mejor
método para el conteo de colonias es el método por
agotamiento, ya que este me permite hacer una
característica morfológica a macroescala de manera
adecuada y además de esto me ayuda hacer un conteo
adecuado de las colonias presentes. También se
concluye que dependiendo de lo que se quiera
estudiar, se escoge un método de siembra adecuado
para ese estudio.
-Se pudo concluir sobre la importancia de los
métodos de tinción en los estudios microbiológicos
ya que estos permiten hacer una diferenciación de
bacterias que permiten hacer estudios adecuados.
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