TEMA 12. TÉCNICAS CONVENCIONALES DE IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.

PRUEBAS
MORFOLÓGICAS Y BIOQUÍMICAS. MINIATURIZACIÓN Y AUTOMATIZACIÓN DE ENSAYOS.

Concepto microbiológico de especie: grupo de cepas (aislado de un microorganismo, siendo todos los individuos que forman esa
cepa clónicos, iguales entre sí) que tiene un alto grado de similitud en sus propiedades y que difieren en forma significativa de
otros grupos.

A la hora de identificar vamos a coger una cepa en estudio, una cepa problema, analizaremos determinadas propiedades y vamos
a compararlas con las ya descritas para otros grupos. Esto es identificar.

TAXONOMÍA POLIFÁSICA. Consiste en la integración de distintos tipos de caracteres:

• FENOTÍPICOS:
▪ Clásicos (morfología, nutrición, etc.)
▪ Marcadores quimiotaxonómicos.
▪ Perfil de proteínas totales y enzimas.
• GENOTÍPICOS:
▪ Clásicos: %G+C, hibridación DNA
▪ Nuevos: fingerprinting (por ejemplo, los perfiles moleculares por restricción o amplificación de ADN).
• FILOGENÉTICOS: basados principalmente en los genes de ARNr, gyrB, rpoD... Estudiamos como van evolucionando
distintos genes conservados. Los podemos utilizar como relojes evolutivos. Pequeños cambios en estos genes
conservados (secuencias antiguas y conservadas) dan lugar a características evolutivas que podemos ir siguiendo.

Vamos a hacer nuestro diagnostico microbiologico, identificar el microorganismo. Lo primero que tendremos que hacer para ello
es coger la muestra del paciente. En esa muestra puede o no estar presente el propio microorganismo, es decir, no hace falta que
en la muestra del paciente este presente el microorganismo infeccioso para poner en evidencia su posible presencia.

Dependiendo del tipo de muestra se puede utilizar lo que se denomina la ruta serológica o bien la llamada ruta microbiológica.
Vamos a ver las diferencias entre las dos rutas.

En la RUTA MICROBIOLOGICA si que tiene que estar presente

el microorganismo infeccioso en la muestra que cogemos del
paciente. Se toman muestras de sangre, heces, tejidos, mucosas,
etc.

Trata de poner en evidencia la presencia de un determinado

microorganismo. La ruta microbiológica puede seguir dos vías
para realizar un diagnostico microbiológico:

• Microbiología convencional.
• Microbiología molecular.

La principal diferencia entre la microbiología convencional y la microbiología molecular es que:

LA MICROBIOLOGÍA CONVENCIONAL NECESITA DEL CULTIVO DEL MICROORGANISMO, DE SU AISLAMIENTO, MIENTRAS

QUE LA RUTA MOLECULAR NO NECESITA AISLAMIENTO DEL MICROORGANISMO, YA QUE LO PONEMOS DIRECTAMENTE
EVIDENCIA EN ESA MUESTRA CLÍNICA QUE HAYAMOS COGIDO.

En general, a la ruta microbiológica, ya sea convencional o molecular, también se la denomina DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
DIRECTO.

Mientras que en la RUTA SEROLÓGICA no hace falta que este presente porque en esta ruta lo que analizo es la presencia de
anticuerpos frente a ese microorganismo, no voy a analizar la presencia del microorganismo con sus posibles antigenos. Analizo
los anticuerpos que el paciente está creando frente al microoganismo infeccioso.

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La ruta serológica toma muestras de sangre y trata de poner en evidencia la presencia de un anticuerpo frente a determinado
microorganimos. A este tipo de diagnóstico se le denomina DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO INDIRECTO. No está el
microorganismo en sí, hay ciertas moléculas (anticuerpos) que se quedan como respuesta a la presencia del microorganismo
infeccioso.

RUTA SEROLÓGICA.

Siempre trabajamos con muestras de sangre, y lo que vamos a hacer es intentar

buscar en esa muestra de sangre la presencia de anticuerpos. Tenemos una serie
de herramientas de diagnóstico para poner en evidencia la presencia de esos
anticuerpos: aglutinación, RIA, ELISA, etc. Veremos esas técnicas en su
momento.

Tenemos como podemos observar en una muestra de sangre la presencia de determinados componentes del virus de la hepatitis
B o también la presencia de anticuerpos. Como se va desarrollando a lo largo de la infección esa presencia. Hablamos de
componentes del virus, y después como respuesta, la presencia de anticuerpos. Esto lo necesitamos para después comprender
como podemos hacer el diagnostico.

Cuando el virus entra hay una etapa en la cual todavía no hay signos clínicos, en este caso al tratarse de la Hepatitis B lo que está
haciendo es infectar células del hígado, se empieza a multiplicar y causar daños que posteriormente ya nos darán los signos clínicos
que presenta el paciente.

En un primer momento, pero ya en sangre, lo que podemos empezar a observar es la

presencia de esos componentes. Ya que se están lisando células que son arrastradas
por el torrente sanguíneo, apareciendo así componentes, no solo de las células
hepáticas como la bilirrubina que nos empiezan a indicar que hay infección, sino
también componentes del virus, que son los que nos interesan.

El virus de la Hepatitis B es un virus con envuelta, ADN, parcialmente de doble cadena

que tiene una cápside proteica con unas 180 moléculas de una proteína característica
que se denomina el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B. También tiene
otro antígeno que el antígeno E y el antígeno C que es el core, pero este no lo
observamos.

También podemos observar cómo aparece ADN del virus en el torrente sanguino, que posteriormente decae y empezamos a
observar una respuesta inmunológica. Esta respuesta inmunológica con la aparición del anticuerpo anti-icore.

Formando parte de la subida tenemos una inmunoglobulina M anti-core, sube y decae. Pero los anticuerpos presentes frente a
esta proteína se mantienen ya que también estamos produciendo otra clase de inmunoglobulina, en este caso una IgG.

Primero tienen que aparecer esos antígenos y a partir de la presencia de ellos, nuestro sistema inmune responde primero con una
IgM y después con una IgG que mantiene posteriormente. Más tarde aparecen otras inmunoglobulinas frente a otras proteínas
antigénicas como eran la de superficie y el antígeno E que es una proteína de anclaje dentro del cápside del ácido nucleico.

Si pensamos en una persona que nunca ha estado expuesta a

ese microorganismo. No ha estado expuesto por lo tanto a una
proteína o un antígeno, por lo tanto, en su suero sanguíneo no
hay anticuerpos frente a ese microorganismo.

Lo que observamos es que empieza a aparecer en las etapas

tempranas (en un punteado azul) las IgM, que como hemos
visto antes eran las primera que aparecían. A continuación, en
rojo vemos señaladas las IgG. Vemos como los máximos de las
IgG son posteriores a los máximos de las IgM y que la respuesta
de la IgG es mayor que la de las IgM (se producen en mayor
cantidad).
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Las IgM se producen antes y en menor cantidad que las IgG, y el tiempo en el cual tenemos mayor concentración de Ig es mayor
en el caso de las IgG que en el de las IgM.

Hemos dicho que el paciente no tenía esas Ig frente al microrganismo en el suero, y ahora resulta que aparecen como
consecuencia de la infección, ¿qué es lo que ha ocurrido? → lo que ha ocurrido es una SEROCONVERSIÓN, aparecen Ig frente
a ese microorganismo por primera vez.

Va pasando el tiempo, el paciente ha superado la enfermedad, se mantienen durante bastante tiempo las IgG (esto depende del
tipo de microorganismo). Lo que sucede si hay una REINFECCIÓN por el microorganismo, rápidamente empiezan a multiplicarse
los clones que había de Linfocitos B (respuesta humoral) produciendo una muy rápida respuesta humoral en cuanto a la presencia
de Ig.

Rápidamente se produce una cantidad elevadísima de IgG y también un ligero aumento de IgM. Pero la relación que hay como
respuesta es muy diferente a la que teníamos al principio (aparecía solo la M y después la G).

Al principio de la infección (marcado con un rectángulo verde) la relación entre IgM e IgG que tenemos es muy distinta a la que
tenemos en una reinfección (segundo rectángulo verde). En este caso la respuesta se denomina RESPUESTA ANAMNÉSICA.
Todos estos datos nos tienen que ayudar a la hora de hacer un diagnóstico.

EJEMPLO. De pequeño ya he pasado por una Hepatitis B. Mis niveles de IgG puede que se mantengan, aunque sean muy bajos. Si
analizo la posible presencia de IgG frente al virus de la Hepatitis B en una muestra de sangre voy a dar positivo y esto NO SIGNIFICA
QUE ESTÉ PASANDO LA HEPATITIS.

Si tomamos la muestra en el caso de la reinfección, donde si que estoy cursando esa enfermedad, tengo unos niveles de IgG muy
superiores a los que presentaba antes de pasar esa segunda infección. ESTO SI ES SIGNIFICATIVO, ese aumento del nivel de IgG
ya me está indicando la posible infección por un microorganismo.

La presencia de niveles significativos de IgM también es significativo, ya que la presencia de IgM no se produce nada más que al
principio de las infecciones, ya sea la primaria o la secundaria.

Estas cosas son las que tenemos que tener en cuenta a la hora de hacer ese diagnóstico indirecto, ese diagnóstico serológico.

Tras ese aumento significativo de IgG que indica que puedo estar sufriendo un proceso infeccioso, es donde tenemos que recurrir
a nuestras herramientas inmunológicas para constatar esos aumentos. De lo que se habla normalmente es de un aumento en el
TÍTULO DE ANTICUERPOS, que es la cantidad, es una medida indirecta de la cantidad de anticuerpos.

El título de un anticuerpo es por definición la inversa de la última dilución de un suero que da lugar a una rección positiva a una
técnica inmunológica (respuesta positiva a la aglutinación). Se trata de una medida indirecta ya que solo vamos a ver diluciones:
la dilución me va a indicar que está cambiando la concentración.

En la técnica de la aglutinación aglutinamos antígenos, que puede estar o no unido a un transportador. Si hay anticuerpo se
produce aglutinación que es lo que tenemos marcado en un círculo rojo completamente pintado (+). Mientras que si la
aglutinación da negativa aparece un segundo circulo más pequeño en el interior (-)

Las fracciones que aparecen arriba son las diluciones que hago de la muestra. No sabemos exatamente la cantidad de antígeno
que hay.

En la de 1/2 : pongo 1mL de un suero y 1mL de un buffer.

La prueba meda positiva. Diluimos a continuacion 1/4 y
me sigue dando positiva. Entre estas dos hay mayor
cantidad del posible anticuerpo en la 1/2 (menos diluida).

Vemos que en la dilucion 1:128 ya me da negativa. Lo que

quiere decir es que, según la definicion del titulo del
anticuerpo que es la inversa de la última dilución, el titulo
de ese suero frente a un determiando antigeno es 64.

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En el caso numero 2 (la muestra es del mismo paciente unos meses después) resulta que el título en este caso es 8. Lo que ha
sucedido aquí es que hay menos cantidad de anticuerpo. Solo me da + si hago una dilución baja, lo que significa que había desde
el principio en el suero poco anticuerpo.

Ha pasado el tiempo, hemos cogido suero otra vez y calculado el título saliendo (línea número 3) 512 de título, significando esto
que ahora hay mucho anticuerpo (la curva esta subiendo). Esto quiere decir que esta sufriendo o ha sufrido hace muy poco un
proceso infeccioso por el cual nuestro cuerpo ha respondido produciendo más Ig. Ese paciente esta sufriendo una infección por
ese microorganismo, ya que para hacer estas pruebas ya estamos utilizando antígenos específicos para detectar estos
anticuerpos.

Una de las normas que se siguen para establecer si ese paciente está sufriendo una nueva infección es que el aumento sobre los
niveles que tenía anteriormente de Ac tiene ser del CUÁDRUPLE.

En las líneas 5 y 6 (olvidándonos ahora de los dos primeros casos en la 6 que parecen negativos, ya veremos más adelante porque
puede suceder esto cuando tenemos mucho anticuerpo, que se debe a la técnica que usamos de aglutinación y lo veremos más
adelante) vemos que el titulo en la 5 es 32 mientras que el titulo 6 es 128 y si multiplicamos 32 x 4 sale 128. Esto es significativo
para el diagnóstico.

Son medidas indirectas, pero un aumento del cuádruple ya nos está indicando que hay un aumento muy alto de Ac y por lo tanto
estamos cursando una infección.

CONSIDERACIONES. Estas son algunas de las muchas consideraciones importante que tenemos que tener en cuenta a la hora
de hacer un diagnóstico indirecto vía serológica observando la presencia de determinados Ac.

• Seroconversión. Presencia de determinados anticuerpos en una persona que antes no los tenía, lo que nos indica que
esa persona antes o después ha estado en presencia de ese antígeno.
• IgG/IgM. La relaciones entre las Ig. Las IgM son mayoritarias al inicio de la infección, mientras que las IgG se producen
posteriormente. Puedes calcular la presencia de IgG e IgM por separado (hay técnicas para ello, pero la aglutinación no).
Estudiando estas relaciones podemos saber si estamos al principio de una infección o no, por ejemplo, si tenemos solo
IgG estamos en una etapa posterior y si detectamos la IgM indica que estamos al principio de la infección.
Si la relación IgG/IgM es baja quiere decir que hay mucha IgM (estamos al inicio).
• Aumento del cuádruple. En la IgG es significativo, estamos cursando una infección.
• Fase aguda → convaleciente. Si en dos tomas sucesivas vemos que disminuye el titulo de IgG nos encontramos en una
etapa muy tardía de la enfermedad, habiéndola superado alomejor ya. Han pasado unos meses y el título de Ig.
• Infecciones neonatales: STORCH. Es un acrónimo de distintas enfermedades sífilis, toxoplasmosis, rubeola,
citomegalovirus y herpes. Son un conjunto de enfermedades cuya posible presencia se analiza en neonatales que pueden
haber estado expuestos a esas enfermedades porque sus madres son grupos de riesgo. Se analizan rutinariamente, y una
forma de hacerlo es mediante análisis serológicos.
Las IgM son muy grandes, de manera que no pasan la barrera placentaria, en cambio las IgG sí. Por lo tanto, si
encontramos presencia de IgG en un recién nacido pueden ser de la madre. No ha estado expuesto, sino que la ha estado
expuesta ha sido la madre.
Pero si nos encontramos una IgM, esta no puede proceder de la madre, y significa que está cursando el principio de la
enfermedad.
• LCR. La presencia de anticuerpos en el líquido cefalorraquídeo significa que estas cursando la enfermedad.
• Rabia y botulismo. Enfermedades que son muy extrañas en nuestra sociedad. En cuanto hay detección de anticuerpos
significa que estamos en proceso infectivo reciente.
• M. pneumoniae, V. Influenza B. En la primera un aumento del cuádruple nos indica que estamos en una etapa temprana
de la infección, mientras que el virus de la gripe tiene técnicas serológicas para ponerlo de manifiesto que son específicas:
se utiliza una inmuno-inhibición de hemoaglutinación (ya lo veremos, ciertos virus tienen la capacidad de ser
aglutinantes). La presencia de anticuerpos evita esa aglutinación ya que están neutralizando el virus, pero tienen que ser
anticuerpos específicos frente a ese virus.

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RUTA MICROBIOLÓGICA.

Tenemos que coger muestras del paciente que contengan el microorganismo infeccioso. Dentro de lo que es el diagnostico
directo podíamos coger dos rutas diferentes la convencional o la molecular.

Nos centramos en la microbiología convencional, que se

diferenciaba de la molecular en la necesidad del cultivo.
Tenemos que proceder a realizar un cultivo, y lo haremos
en unos medios de cultivo primarios, necesitamos cultivar
y aislar el microorganismo (importante), obtener un
cultivo puro (punto 3).

Podemos utilizar técnicas moleculares, técnicas

inmunológicas o lo tradicional, que son métodos
bioquímicos. Por la ruta molecular, por ejemplo, podemos
utilizar una PCR para poner en evidencia un fragmento de
ADN.

Por eso en el punto 4 pone identificación. Ensayos

dependientes de crecimiento que son todas las pruebas
bioquímicas que hacemos en el laboratorio, pero también
puedo utilizar identificación inmunológica o identificación
molecular ya que tengo el microorganismo aislado.

Para utilizar una de estas dos técnicas (inmunológica o molecular) no hace falta que el microorganismo esté puro. Sin embargo,
si vamos a utilizar un método de identificación biológico si que tiene que estar puro (de esto pone preguntas en el test). Si vamos
a utilizar un método tradicional de identificación bioquímica que es dependiente de crecimiento, si hay varios microorganismos
tenemos un problema.

O, por ejemplo, (técnicas moleculares) si vamos a utilizar cebadores universales para hacer una amplificación por PCR, me amplifica
el ribosoma de cualquier bacteria que esté presente. Para estos cebadores necesitarías tener el cultivo puro, pero con unos
cebadores específicos no los necesitarías.

Lo importante de la microbiología convencional es, utilices al final una técnica u otra, siempre a partir de un cultivo puro

Cuando tenemos un cultivo puro lo que también podemos hacer son ensayos de susceptibilidad a antibióticos. Si no tuviéramos
cultivo puro podemos tener un problema.

Con la microbiología convencional lo que estamos haciendo es identificar al microorganismo y también poniendo en evidencia la
susceptibilidad de ese microorganismo a determinados antibióticos, o presencia de resistencias frente a determinados
antibióticos (muy importante).

Por la vía molecular es muy complicado saber la sensibilidad de resistencias, ya que la vía molecular no necesita de cultivo puro,
como hemos mencionado anteriormente.

La IDEA es que la microbiología convencional necesita de cultivos puros, y a esos cultivos puros vamos a poderles aplicar distintas
técnicas, pero no tiene que ser de manera excluyente, además de las técnicas tradicionales bioquímicas que necesitan de cultivo
también podemos utilizar técnicas inmunológicas y técnicas moleculares que no lo necesitan.

Y lo que también es importante es que a partir de un cultivo puro yo puedo establecer también las resistencias y sensibilidad a
antibióticos, que a la hora de hacer el diagnóstico es muy importante.

En determinadas circunstancias tenemos que pasar por cultivos de enriquecimiento para ciertos microorganismos.

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¿QUÉ MEDIO DE CULTIVO UTILIZAMOS?

No cualquier microorganismo crece en cualquier medio y en cualquier condición de cultivo, sino que supone un gran problema a
tratar.

Estamos trabajando con muestras clínicas y aquí cerramos un poco el campo, es decir, la diversidad de microorganismos con la
que vamos a trabajar, no son tantos si lo comparamos con muestras ambientales.

La diversidad de microorganismos procedentes de pacientes en un hospital no es mucha, por lo tanto, si no son muchos los
microorganismos los medios de cultivo a utilizar no son tantos.

MEDIOS DE CULTIVO. Los principales medios de cultivo son Agar sangre, Agar entérico, Agar Chocolate (C), Modificación de
Thayer-Martin y un Agar para anaerobios. Los vamos a ir viendo todos. Con estos medios cubrimos prácticamente la mayoría de
aislados clínicos.

En la tabla de la imagen podemos ver como en un cuadro rojo engloba agar sangre y agar entérico, y lo que tenemos en la tabla
son distintos tipos de muestras.

Resulta que con AGAR SANGRE y AGAR ENTÉRICO, son dos medios de cultivos con los que cubrimos la mayoría de
microorganismos que podemos encontrar en estas muestras. Hay excepciones.

AGAR SANGRE. Es un medio muy general que permite el crecimiento de microorganismos infecciosos del hombre y animales de
sangre caliente. Es un medio rico en nutrientes con tres fuentes de peptona y sangre de cordero al 5%. Reacciones hemolíticas.
+CNA (colistina y nalidíxico), selectivo para gram positivos (especialmente estafilococos y estreptococos).

Es un medio muy rico en fuentes de N y fuentes de C. Lo que le añadimos además son eritrocitos. El 99% de las veces los eritrocitos
son ovinos, es decir, que lo que añadimos a ese medio de cultivo es sangre ovina con eritrocitos íntegros.

Hay que asegurar la procedencia de esos eritrocitos, ya que puede haber variaciones sustanciales, los enterococos no lisan
prácticamente nada los eritrocitos de ovinos, sin embargo, da una buena reacción de beta-hemolisis al usar eritrocitos de caballo.
En Sataphilococcus es al revés, da hemolisis en ovinos.

El caso es el que el agar sangre permite el crecimiento de muchos tipos de microorganismos y, además, ya te está dando
información que es de interés para la identificación, como son las reacciones de hemólisis (alfa si es parcial, beta si es total y
gamma si no hay hemólisis).

+CNA es si lo completamos con antibióticos, nosotros podemos hacer este medio selectivo para el aislamiento de microorganismos
gram +. Lo que añadimos para conseguir esto es colistina y nalidíxico. La colistina es un polipéptido, un anillo ciclado, producido
por un microorganismo naturalmente. Es un antibiótico que se une a los fosfolípidos de membrana de los gram-, produce poros
causando la muerte celular.

Se le añade el ácido nalidíxico que es una quinolona, de manera que actúa a nivel de la topoisomerasa II que es una ADN girasa.
Actúa a nivel de la subunidad alfa. Añadimos estos dos antibióticos para que no crezcan gram- y lo hacemos selectivo a gram+, lo
que viene muy bien para que no haya mucho crecimiento de microorganismos y podamos distinguir bien la presencia de
estafilococos y estreptococos, que entre los gram+ son los más importantes.

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AGAR ENTÉRICO. Vamos a usar este para el aislamiento de las enterobacterias, las más importantes a nivel de los gram-. Se
utiliza EMB o MacConkey. Inhiben el crecimiento de gram positivos. Permite distinguir gram negativos entéricos fermentadores y
no fermentadores de lactosa

El medio EMB es un medio selectivo y diferencial para bacterias gram-. Es selectivo porque la eosina y el azul de metileno inhiben
el crecimiento de bacterias gram+. Para que sea diferencial, en cuanto a las gram- que van a poder crecer ahí, lleva sacarosa y
lactosa como fuente de carbono.

Dentro de las enterobacterias, las que consumen lactosa son las coliformes solamente. Pueden bajar muy rápidamente el pH.

El medio que se usa más es el MacConkey. Para hacerlo más selectivo para aislamiento de bacterias gram- lo que lleva como
inhibidor son sales biliares, pero como algún gram+ se escapa a estas, lo que se hace es ponerle cristal violeta y como fuente de
carbono se le pone lactosa.

AGAR CHOCOLATE (AC). Es un agar sangre, pero con los eritrocitos lisados (liberan hemoglobina, hemina (factor X), NAD (factor
V), etc…).

El nombre viene por el color que presenta. Es un agar sangre, pero hemolizado. Es decir, se han roto los glóbulos rojos
sometiéndolos a 56°C durante un tiempo. No contienen ningún eritrocito entero, solo el contenido de los mismos. (de esto pone
pregunta trampa en el examen).

¿Por qué lisamos los eritrocitos? Hemos visto antes que hay reacciones de hemolisis, hay microorganismos que son alfa, beta o
gamma hemolíticos. Los gamma hemolíticos son incapaces de producir toxinas hemolíticas, no son capaces de romper los
eritrocitos y aprovecharlos los nutrientes que hay dentro.

Pero alguno de los componentes de los eritrocitos si que son necesarios para el crecimiento de determinados microorganismos.
Entre estos componentes tenemos lo que se denomina el factor X o factor 10, que es la hemina; y el factor 5 que es el NAD. Estos
dos componentes permiten el crecimiento de microorganismos que son incapaces de romper los eritrocitos, y que por lo tanto en
el agar sangre chocolate al haberlos rotos por calor, están disponibles.

Permiten el crecimiento de Neisseria (N. gonorrhoeae) (sensible a la Bacitracina) y Haemophilus (Bacitracina resistente, necesita
X+V). Estos dos microorganismos si los ponemos en agar sangre no van a crecer.

Si queremos distinguir en este medio entre Neisseria y Haemophilus utilizamos un antibiótico que es la BACITRACINA. Resulta que
Neisseria es sensible mientras que Haemophilus es resistente, por lo tanto, si ponemos bacitracina en el medio de cultivo solo va
a crecer Haemophilus. Si queremos que sea al revés es más complicado y necesitamos otros medio.

En la biosíntesis de la pared bacteriana encontramos un transportador, el bactoprenol, que es un lípido de 55 C fosforilado que
se tiene que desfosforilar para coger la subunidad precursora de la pared celular y translocarla al exterior de la membrana porque
la pared está por fuera. Si no se desfosforila no puede recargar. La BACITRACINA SE UNE A ESE BACTOPRENOL: es un antibiótico
polipeptídico producido por una cepa de Bacillus subtilis.

AGAR THAYER-MARTIN MODIFICADO (MTM). Es un Agar Sangre enriquecido con componentes basales y sangre hemolizada.
Contiene una gran cantidad de antibióticos:

• Colistina (inhibe gram negativos)

• Vancomicina (inhibe gram positivos)
• Nistatina (inhibe levaduras)
• Trimetropim (inhibe Proteus).

La VANCOMICINA es un glicopéptido que se une a la D-alanil-D-alanina, dos alaninas situadas al final de la subunidad precursora
o pentapéptido (el N-acetilmurámico y la N-acetilglucosamina) que se introduce como una “capucha”. De manera que actúa a
nivel de la biosíntesis del peptidoglucano. Al poner esa “capucha” no entra al centro activo de las PBPs, que son las enzimas
encargadas de la glicosilación y la transpeptidación para construir la pared.

La NISTATINA es un antifúngico. En la modificación de Martin-Lewis se sustituye la nistatina por anfotericina e incrementa la

concentración de vancomicina. Selectivo para Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.
7
Tanto la nistatina como al anfotericina son antifúngicos macrólidos polémicos con dobles enlaces conjugados en el anillo (7). La
nistatina se usa en forma tópica, no pasa la piel, mientras que la anfotericina es más potente y se utiliza para intoxicaciones
sistémicas. La anfotericina tienen un problema y es que es nefrotóxica, pero funciona bastante bien.

El TRIMETROPIM es un antibacteriano que actúa a nivel de la biosíntesis del ácido tetrahidrofólico. Las sulfonamidas también a
actúan a nivel de esto, pero lo hacen al principio de la biosíntesis a nivel del PABA y una enzima, la cual confunde ese PABA con
las sulfonamidas. El Trimetropim lo que hace es bloquear la reducción del dihidrofólico al tetrahidrofólico.

MEDIOS PARA ANAEROBIOS. Lo primero a considerar es que tienen que ser medios muy ricos en nutrientes, más que en los
de microorganismos aerobios. Se debe simplemente al rendimiento energético: el metabolismo anaerobio requiere más
nutrientes.

Se utilizan medios selectivos, no selectivos y de enriquecimiento. Los medios de cultivo para anaerobios tienen una alta
proporción de peptonas e hidratos de carbono ya que su metabolismo es más exigente que el de bacterias facultativas y requieren
además factores de crecimiento como la hemina y vitamina K.

Los medios empleados con mayor frecuencia son:

▪ Agar Sangre Anaerobios (ASA): Agar sangre complementado con vitamina K y hemina. Es un medio no selectivo, crecen
anaerobios (Clostridium, Bacteroides, Fusobacterium…) y anaerobios facultativos (estafilococos, Escherichia coli,
Corynebacterium, Listeria...).
De los últimos cuatro el único gram- que tenemos es Escherichia coli. El grupo bacteroides es el que esta mas presente
en las heces.
En este tipo de medio nos van a crecer cualquier tipo de anaerobios y también de anaerobios facultativos, ya sean
gram+ o gram- (esta es una de las preguntas truco que pone en el examen, que distingamos este medio del siguiente).

▪ Feniletil Alcohol Agar (FEA): Inhibe el crecimiento de bacilos gram negativos anaerobios facultativos (si en el test nos
pregunta que medio utilizaríamos para aislamiento de anaerobios facultativos gram+ y NO gram- tenemos que elegir este
medio).
A diferencia que ene l anterior, aquí no nos van a crecer anaerobios facultativos gram-, por ejemplo, Escherichia coli,
que es capaz de crecer en presencia de oxígeno.
Crecen la mayor parte de anaerobios gram positivos y gram negativos, el alcohol sirve como aceptor final de electrones.
En la fermentación de un microorganismo que sea anaerobio facultativo fermentador, de alguna forma tenemos que
“detoxificar” ese poder reductor que esta generando en los primeros pasos. En una fermentación arrancas electrones y
consigues de alguna forma ATP. Al final de la fermentación, uno de los subproductos de la fermentación tiene que
cargarse de electrones, y eso lo hace el alcohol.

▪ Agar Bacteroides Bilis Esculina (BBE) + amikamicina: Selectivo para Bacteroides sobre todo grupo fragilis, pueden crecer
también Fusobacterium. Determinadas sustancias que nos son de interés para construir medios selectivos.
La AMIKAMiCINA es un derivado semisintético de la kanamicina y es un antibiótico aminoglucósido que actúa a nivel de
biosíntesis de proteínas.
Hay microorganismos a los que la presencia de bilis les sienta fatal y se lisan o no crecen. Lo utilizaremos para seleccionar
determinados microorganismos. En este caso, los bacteroides que viven en el intestino grueso son resistentes.
La esculina es un glucósido, glucosa + esculetina. Hay microorganismos que son capaces de romper esta molécula
liberando la esculetina de la glucosa, y esta pone en el medio una sal férrica y se pone de color negro.
Este microorganismo que sobrevive en presencia de bilis y en presencia de amikamicina produce unas colonias negras.
De manera que aparte de ser selectivo, el medio también es diferencial.

CALDO DE TIOGLICOLATO. Medio líquido enriquecido, contiene caseína, vitaminas y extractos de levadura y carne (hay
modificaciones con rosazurina, dextrosa, vitamina K1 y hemina). El medio contiene 0,075% de agar para impedir corrientes de
convección (transferencia de O2 desde la superficie) y tioglicolato como agente reductor

El TIOGLICOLATO es un compuesto que es reductor, luego va a quitar oxígeno del medio de cultivo y, además, lo que hacemos es
añadir un poco de agar (0,75%).

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Cuando llevamos este medio al autoclave para esterilizarlo, no solo quitamos todo microorganismo vivo que haya por ahí, sino
que además estamos calentándolo y por lo tanto disminuyendo la solubilidad de los gases. Estamos quitando del medio los gases,
de manera que hemos conseguido un medio libre de oxígeno.

Como tiene agar se ha “espesado” bastante y no va a permitir que haya una difusión del aire de superficie a través del medio de
cultivo, y si la hay es muy lenta. Por lo tanto, vamos a conseguir un medio de cultivo en el cual hay un gradiente de oxígeno, de
los gases que están difundiendo desde la superficie donde tengamos el medio. Si inoculamos por punteadura conseguimos que
puedan crecer microorganismos en superficie aerobios, microaerófilos, anaerobios. Es un medio muy interesante.

Contiene cantidad de nutrientes para permitir un buen desarrollo de estos microorganismos.

Con esto nos quitamos del medio los medios para anaerobios.

HEMOCULTIVO. Son muy importantes. Cuando sospechamos de una bacteriemia, de una infección en sangre. Una septicemia
es una respuesta inmunológica exacerbada a una infección que se esta generalizando. No tiene por qué ser una septicemia creada
solo por bacteriemia, sino que también se puede producir por una infección en un órgano.

Esta respuesta inmunológica exacerbada de nuestro organismo trae como consecuencia todo lo contrario a lo que en principio es
lo lógico. Provoca un fallo multiorgánico y la muerte. Es muy peligroso que haya una infección en sangre.

Existe un gran problema con los hemocultivos ya que necesitamos tener resultado rápidos. Vamos a ver que es lo que podemos
utilizar como sustrato para el crecimiento de estos microorganismos y después, como podemos ponerlos en evidencia (que están
creciendo ahí rápidamente), y, por lo tanto, actuar de una forma conveniente.

Caldo nutritivo más un anticoagulante: 0,025-0,05% polianetol sulfonato de sodio, SPS. Los caldos nutritivos más usados: Caldo
de Tripticasa Soja, Caldo de Infusión de Cerebro Corazón (BHI), Peptona Complementada o Caldo de Tioglicolato. Hay algunos
específicos: Caldo Columbia o Caldo Brucella.

Normalmente en cuanto detectamos que es positivo el crecimiento, para tratar de identificar posteriormente el microorganismo
si es que es necesario, tomamos una alícuota y vemos si hay gram+ o gram-. Una infección es el resultado de que esta medrando
un microorganismo, normalmente, no son poliinfecciones simultaneas por varios microorganismos sino por uno solo.

Si observamos crecimiento no va a ver microorganismos diferentes, sino que va a predominar uno. De manera que cogemos una
alícuota observando si es gram positivo o negativo. Si es gram (+) nos vamos a un agar chocolate y si es gram (-) nos vamos a ir
un McConkey. Tratamiento empírico rápido ya que lo más importante es el tiempo, que se detecte la presencia del
microorganismo lo antes posible.

Los hemocultivos positivos y en los que se observa gram negativos, generalmente se transfieren a Agar McConkey. Los que
contienen gram positivos a Agar Chocolate.

Sistemas automatizados de hemocultivo. Viales en los cuales dentro ya van los nutrientes, los
anticoagulantes y determinadas sustancias que nos permitan el reconocimiento de ese crecimiento.
Se utilizan sustancias que son capaces de detectar reducción, oxidación presencia de CO2 en altas
concentraciones.

En el fondo de la botella vemos como puede varar la coloracion (amarillo al final). El aparato
(incubadores) lo que hace es controlar todo el rato si existe ese cambio de color, que indica crecimiento.

9
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS.

Como estamos en el diagnostico microbiológico, a partir de métodos clásicos utilizando estudios morfológicos bioquímicos
primordialmente, siempre tenemos que partir de cultivo puro.

Los pasos a seguir para un perfecta identificación bacteriana son:

▪ Obtener un cultivo puro.

▪ Examen macroscópico de las colonias. Observar si una colonia es grande o pequeña, si tiene o no los bordes lisos. Nos
proporciona datos.
▪ Examen microscópico de células vivas y de frotis teñido por coloración de Gram. Se determina la forma y el tipo de
respuesta gram del microorganismo en estudio. También es importante determinar la agrupación y la presencia de
esporas y otras características morfológicas de interés.
▪ Realización de pruebas primarias (catalasa, oxidasa, OF, crecimiento en aerobiosis y anaerobiosis, movilidad…).
▪ Realización de pruebas secundarias y terciarias a efectos de llegar a especie. Estas dependerán del género o familia
determinado (p. ej.: producción de pigmentos, producción de indol a partir de triptofano, producción de coagulasa, de
fenilalanina deaminasa…).

IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR DE BACTERIAS.

1. IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR DE LAS BACTERIAS AISLADAS EN CULTIVO.

Cocos Gram +

▪ Staphylococcus aureus. Es un microorganismo gram+ implicado en distintas enfermedades como la forunculosis,

abcesos, endocarditis. Cualquier herida que se produce es susceptible de infectarse con Staphylococcus. También
produce toxoinfecciones alimentarias.
Se le da muy bien crecer en medios con poca actividad de agua, con muchas sales disueltas. Se utiliza manitol salado
para aislarlo, siendo capaz de crecer con un 7,5% de ClNa pero también de azucares.
En cuanto tengas una intoxicación alimentaria que parezca provocada por la ingestión de almíbares o pasteles (poca
actividad de agua por la gran cantidad de azucares).

Staphilos viene del griego que significa racimo. Son microorganismos cocos gram+ que se agrupan en
forma de racimos. Son beta hemolíticos, por lo que producen un halo de hemolisis, una serie de
toxinas que son hemolíticas y lisan los eritrocitos provocando que su contenido se difunda y quede
un halo transparente alrededor de las colonias que están creciendo.

Por otro lado, es capaz de producir catalasa y coagulasa.

✓ En la respiración cuando el oxígeno está aceptando electrones se forman distintas
moléculas reactivas, relacionadas con el, como el radical superóxido o el peróxido de
hidrogeno.
El microorganismos se protege de esto produciendo la catalasa que rompe el
peróxido de hidrogeno dando lugar a oxígeno y agua.
✓ En cuanto a la coagulasa. Este microorganismo es capaz de simulas la enzima
trombina, que es capaz de pasar el fibrinogeno a fibrina. El Staphylococcus aureus se
une a la pro-trombina activándola y formando una molécula que es capaz de hacer
pasar el fibrinógeno a fibrina. Lo hace para cuando esté invadiendo a un ser humano
el fibrinógeno presente precipite en forma de fibrina sobre la célula para que nuestro
sistema inmunológico no lo detecte.
En resumen, son catalasa +. Les añadimos la prueba de la coagulasa para diferenciarlos del resto de Staphylococcus.

▪ Streptococcus pyogenes. Son importantes. En un hospital de Viena especializado en obstetricia, la incidencia de lo que
se denominaba en aquellos tiempos fiebres pauperales era de un 1 o 2%.

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 Esta fiebre traía consigo la muerte del neonato y también por sepsis de la madre. Un médico que trabajaba allí se dio
cuenta que, de alguna forma, en los cadáveres que los médicos diseccionaban había algo que se transmitía después a las
mujeres, por una higiene inadecuada de los médicos. Los responsables de estas sepsis eran estos microorganismos.
Es el mayor responsable de todas las infecciones en garganta. Es un microorganismo beta hemolítico muy potente. De
la garganta puede pasar a otros órganos produciendo endocarditis.
Morfológicamente son cocos gram+ de cadenas largas que le permiten distinguirse de otros Streptococcus que pueden
ser también beta hemolíticos como es Streptococcus pneumoniae.
Las colonias son pequeñas, pero son muy beta hemolíticos. Son catalasa – y PYR +.

El PYR es una característica bioquímica que tiene este microorganismo, que produce una enzima que es una amidasa.
PYR es un acrónimo del nombre de la enzima que es pirrolidonil aridil amidasa. Para poner esta enzima en evidencia
tenemos que ponerle un sustrato adecuado, el piroglutanil-beta-naptilamida.
La enzima lo que hace es romper esta molécula liberando una nactilamina que añade
otro componente que reacciona produciendo una reacción coloreada. En la imagen el
redondel blanco es – y el rosa es +.
Esta prueba PYR es fundamental para distinguir el tipo de Streptococcus del que se
trata.

▪ Streptococcus pneumoniae. Es un microorganismo que produce NEUMONIAS. Tambien produce otro tipo de infecciones
en el tracto superior respiratorio como epiglotitis por ejemplo. Otros problemas que no tienen que ver con el tracto
respiratorio es que puede producir también MENINGITIS.
Es un microorganismo muy importante sobre todo en los neonatos y en gente joven.
Son cocos gram+ de cadenas mucho más cortas que los anteriroes. En algunos casos los encontramos solo en forma de
diplococos (dos cocos).
Grandes colonias alfa hemolíticas o gamma hemolíticas. En las alfa vemos un halo verodoso alrededor pero sin
aclaramiento. Son catalasa – como todos los Streptococcus.

La diferencia es la prueba del PYR y otras como solubilidad en bilis. Normalmente los Streptococcus son bastatantes
resistentes a las sales biliares. Esta capacidad de que se solubilice es propia de Streptococcus pneumoniae dentro del
resto de los Streptococcus utilizandose para diferenciarlo, entre otras pruebas.

▪ Enterococcus. Son unos microorganismo que son habitantes normales de nuestro tracto digestivo (en la parte más
distal). Los encontramos en gran numero en el colón pero también libres en la naturaleza (sabor del salchichón, quesos).
Se suministran como probióticos también. En microbiología ambiental también los encontramos como indicadores de
contaminación fecal en aguas. Pero algunos de ellos también son patógenos oportunistas como Enterococcus feacalis o
Enterococcus faecium (muy importantes los dos). Cuando tenemos abcesos o traumatismos intestinales pueden iniciar
una invasión de órganos.
Hay un problema y es que SON MUY RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS además de ser CAPACES DE CAPTAR ADN EXÓGENO
E INCORPORARLO A SU GENOMA. En ese ADN externo que encuentran puede ser que haya resistencias, las cuales
también incorporan. Son resistentes a vancomicina.
En clínica tienen una gran repercusión en infecciones urinarias, pero no son muy graves, lo único que hay que dar con el
antibiótico adecuado para quitarlo. Sobre todo, tienen también incidencia en cuanto utilicemos catéteres. También en
personas mayores inmunodeprimidas que pasen mucho tiempo encamadas, se les forman ulceras y por ahí pueden
causar infección.

Para distinguirlos de los anteriores grupos la característica fundamental es que resisten a altas concentraciones salinas
además de altas concentraciones de sales biliares. Normalmente son muy resistentes a condiciones ambientales
agresivas.

Son cadenas cortas, grandes colonias alfa hemolíticas o gamma hemolíticas y catalasa -. En este paso es PYR + al igual
que Streptococcus pyogenes, pero este ultimo presentaba cadenas largas. Además, son resistentes a las sales biliares,
no hay lisis.

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 Bacilos Gram +

▪ Listeria monocytogenes. Es un microorganismo implicado en una enfermedad llamada listeriosis que se transmite por
alimentos. Es una enfermedad muy grave con una tasa de mortalidad del 30-40%.
Se caracteriza por ser una bacteria móvil. Pequeñas colonias débilmente beta hemolíticas y con una motilidad
característica “tambaleante”.

BAAR

▪ Mycobacterium tuberculosis. Las Mycobacterias son bacterias caracterizadas por un CRECIMIENTO MUY LENTO.
Presentan ácidos micólicos formando parte de la zona externa de la pared celular lo que les confiere ciertas
características como, por ejemplo, evadir nuestro sistema inmune y desde un punto de vista químico permiten que se
distingan mediante una reacción en una tinción que es la ácido alcohol resistente.
La presencia de esos ácidos micólicos pone en evidencia una reacción positiva que esa tinción. Es una tinción muy
específica.
En la imagen vemos unas colonias muy características que son como
terrosas (opacas) y abultadas, pero necesitan mucho tiempo para crecer lo
que es un problema a la hora de hacer diagnóstico.
Simplemente con la tinción (aparecen los bacilos rojos) ya podemos saber
que estamos con un micobacteria. Son acido alcohol resistentes,
característica más importante.
Identificación con sondas moléculas específica: el identificar las micobacterias entre sí. Dentro de las micobacterias hay
como dos grandes grupos, las incoloras y las que presentan pigmentación. Para identificarlo se tiende a utilizar sistemas
moleculares rápidos.
✓ Se puede hacer por un lado un estudio de los ácidos micólicos que presenta en superficie por HPLC pero eso
implica que haya algo de crecimiento.
✓ Utilizar sondas de ADN, PCR, que requiere muy poca presencia del microorganismo. La identificación es
inmediata.

Bacilos Gram -

▪ Enterobacterias. Las vamos a agrupar porque nos vamos a encontrar varias: E. coli, Klebsiella, Salmonella, Yersinia. Las
enterobacterias se caracterizan por ser bacilos gram – oxidasa negativo. La oxidasa nos indicaba presencia o ausencia de
un citocromo C en la cadena respiratoria: para esta prueba se utiliza un reactivo que si esta el citocromo C presente es
capaz ese reactivo de reducir la reacción cromogénica; si no se reduce ese reactivo, no hay cambio de color y la prueba
de oxidasa es negativa.
Son capaces de utilizar glucosa fermentándola y produciendo ácido a 37°C. Dentro de estas enterobacterias hay un
subgrupo que son las COLIFORMES, que además de glucosa son capas de utilizar lactosa. El grupo de las coliformes lo
constituye E. coli, Klebsiella, Citrobacter, Enterobacter.
Son bacilos gram negativos con tinción bipolar (más intensa en los extremos), esto depende
también del medio de cultivo que utilicemos. Son típicamente células aisladas.
Colonias grandes que crecen en Agar MacConkey (donde pueden fermentar la lactosa o no).
Recordar que el Agar MacConkey nos permitía el crecimiento de bacterias no solo gram -, sino
que al estar presente la lactosa si eran capaces de fermentarla se produce un cambio de color
que pone en evidencia la presencia de coliformes.

▪ Pseudomonas aeruginosa. Es muy importante en clínica porque es un microorganismo muy resistente. No es que tenga
mucha incidencia, pero cuando está medrando en una herida de un paciente es muy complicado porque presenta muchas
resistencias (sobre todo en unidades de quemados).
No es un microorganismo presente en numerosas patologías, pero hay que tener cuidado también cuando usemos
catéteres. Produce biopelículas. Sus infecciones se complican.
Lo utilizamos para ver el estado ambiental de las aguas de los ríos, ya que es un microorganismo que es normal que este
ahí.

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 Tiene una característica muy importante y es que produce grandes colonias y
pigmentadas. Algunos de estos pigmentos son verdes (colonias fluorescentes
verdes de gran expansión). Son beta-hemolíticos. Olor afrutado característico de
la placa. Crecen en agar MacConkey (no fermentadoras). Son oxidasa positiva lo
que las diferencia de las enterobacterias, si tienen citocromo C.

▪ Especies de Campylobacter: C. jejuni, C. coli, C. fetus. Sobre todo, en infecciones alimentarias del hemisferio norte (países
desarrollados). Tienen una incidencia muy alta, en EE.UU el 40% o más de las infecciones que se transmiten por alimentos
que llegan a clínica en hospital se deben principalmente a estos microrganismo. Se transmite sobre todo por carne,
preparados cárnicos frescos como carne picada. Las dos primeras especies (jejuni y coli) son las más implicadas en
alimentación. El C. fetus tiene que ver con infecciones en animales de granja que abortan.

Son bacilos gram – curvos dispuestos en parejas (parejas en forma de S) como letras chinas.
Crecen en medios de cultivos muy específicos (muy complejos y característicos). No es fácil
que el microorganismo crezca, no crecen en medios convencionales como agar chocolate,
sangre o MacConkey. Son oxidasa positivo, microaerófilo.

CAMPYLOBACTER AGAR (BUTZLER), el extracto de carne y la peptona proporcionan los nutrientes, mientras que el
cloruro sódico mantiene el equilibrio osmótico.
✓ La novobiocina (cumarina que actúa a nivel de ADNgirasa sobre la subunidad alfa) y la colistina inhiben las
bacterias entéricas gram negativas
✓ La cefazolina (cefalosporina de 1ª generación) betalactámico que actúa al mismo nivel que la penicilina pero
que se diferencia de esta en su estructura química
✓ La bacitracina inhiben las bacterias gram positivas.
✓ La cicloheximida (antifúngico) inhibe numerosos hongos que actúa a nivel de biosíntesis de proteínas, pero en
ribosomas eucariotas. No se utiliza normalmente en tratamiento en humanos porque es muy tóxico, es
teratogénico entre otras muchas cosas. Actúa muy bien deteniendo instantáneamente la biosíntesis de
proteínas, pero no es fungicida, es fungistático.
✓ Se añade la sangre de caballo proporciona nutrientes y suministra catalasa y superóxido dismutasa
(microaerófilas).
Necesitamos atmosferas especiales para la incubación, las cuales tienen que tener menos de un 5% de oxigeno y hasta
un 10% de CO2.

▪ Especies de Haemophilus. H. influenzae. Es un microorganismo muy muy sensible, siendo complicado hacerle crecer. Sin
embargo, es un microorganismo implicado en numerosas infecciones respiratorias. Creían en un primer momento que
era el agente causal de la gripe.
A parte de producir infecciones pulmonares también está implicado en epiglotitis (muy desagradable). Esporádicamente
puede causas episodios de meningitis. Es un microorganismo bastante común en distintos tipos de infecciones que se
producen en periodos invernales y de otoño. Pero es muy difícil de aislar y de trabajar con él.
Necesita una atmosfera de CO2, pero a diferencia de Campylobacter donde teníamos que meter atmósferas de hasta un
10%, en este caso un 5% le viene bien para crecer. Necesita el factor X (hemina) y el factor V (NAD).
Se trata de un bacilo gram negativo pequeño dispuesto en células sueltas. Crece en agar chocolate, pero no crece en agar
sangre o MacConkey.

Bacilos anaerobios

▪ Clostridium perfringens. C. difficile, C. septicum, C. botulinum, C. tetani. Es un género que tiene muchas especies que
son patógenas para el hombre. Clostridium perfringens es el agente causal de la gangrena. C. difficile tiene mucho interés
en clínica, no es una infección tan grave como las otras, pero tiene su incidencia sobre todo en enfermos hospitalizados,
en residencias de ancianos. Hay cepas de C. difficile que son muy virulentas llegando a producir diarreas bastante
productivas que debilitan al paciente complicando su situación si además presenta otras patologías. Son bacilos grandes
rectangulares con esperas no observables. Crecimiento rápido de colonias en expansión con una “doble zona” de
hemolisis (gran zona de hemolisis alfa con una zona interna de hemolisis beta). Anaerobios estrictos gram positivos.
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 ▪ Grupo Bacteroides fragilis. Es el microorganismo que se encuentra en mayor número en nuestra microbiota. Es un buen
microorganismo salvo cuando es un patógeno oportunista.
Bacilos gramnegativos de tinción débil, pleomorfos (longitudes variables); crecimiento rápido estimulado por la presencia
de bilis en el medio de cultivo. Anaerobio estricto.
Puede estar presente en una apendicitis. Traumatismos en los que haya una herida por golpe que puede hacer que el
contenido de las heces se salga.

Prevotella es otro microorganismo que se encentra en el intestino en gran número. Dependiendo de la dieta que
tengamos abunda uno u otro. Bacteroides es más abundante cuando la dieta es rica en proteínas, mientras que si la dieta
es más rica en carbohidratos abunda más Prevotella. La composición de los gases (fermentación) puede ser rica en
hidrogeno o en otros gases como el sulfhídrico o el metano, de manera que los olores van a ser completamente
diferentes.
Bacteroides aparte producen sustancias muy nutritivas para nosotros como acetato, butirato, propionato que se
absorben en la mucosa del intestino grueso y energéticamente son muy buenas. El intestino grueso es un fermentador
especializado en utilizar fibra que nosotros somos incapaces de digerir.

CLASIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS PARA SU IDENTIFICACIÓN.

Vamos a ver como con tablas dicotómicas podemos llegar a identificar microorganismos de una forma relativamente sencilla.
Antes de empezar con la clasificación de los COCOS GRAM+, donde nos encontrábamos estafilococos, estreptococos y
enterococos. Vamos a hablar de una clasificación que hay de los estreptococos donde en su momento se incluyó a los enterococos.

Se sigue utilizando hoy día la clasificación de LANCEFIELD (a mediados del siglo pasado una señora hizo esta clasificación
inmunológica de los estreptococos). A mediados del siglo pasado los enterococos estaban incluidos en los estreptococos (ahora
esto no es así).

Esta clasificación hace referencia a unos grupos inmunológicos dentro de los estreptococos lo que permite una identificación muy
rápida. Nosotros haremos una identificación basada en ensayos bioquímicos.

▪ GRUPO LANCEFIELD A. El más representativo es S. pyogenes.

▪ GRUPO LANCEFIELD B. El más representativo es S. agalactiae.
▪ GRUPO LANCEFIELD C Y G. En cuanto a patologías que producen ya son más minoritarios. El más representativo S.
dysgalactiae y equismilis.
▪ GRUPO LANCEFIELD D. Aquí es donde metían a los Enterococos faecalis y faecium. Dentro de este mismo grupo D
compartiendo el antígeno que se detecta (ósea que hay antígenos comunes a enterococos y estreptococos, aunque sean
diferentes especies) nos encontramos con S. bovis.
▪ GRUPO VIRIDANS. Es un grupo que es un cajón de sastre, no tienen antígenos reconocidos que sean comunes para todos
ellos. Este grupo a su vez se subdivide en 7 grupos (no tenemos que aprendérnoslos todos). De estos nos tenemos que
quedar con S. pneumoniae que es el representativo dentro del subgrupo Mitis.

En la siguiente columna de la tabla vemos

que aparece el grupo hemolítico (sin son
alfa, beta o gamma hemolíticos)
mayoritariamente en las cepas que se aíslan.

Hago aislados de una cepa de S. pyogenes

mayoritariamente me aparece beta
hemolisis. Pero esto no significa que no me
aparezca una cepa que sea alfa (raro que sea
gamma). El grupo Viridans son alfa
mayoritariamente (flecha).

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En cuanto a las enfermedades en las que están implicados (última columna):

• S. pyogenes produce faringitis, impétigo (infección en la cara de niños, forma como pústula), celulitis (infección de las
capas internas de la piel causadas por la entrada de este microorganismo a esas zonas, sobre todo se da en las piernas)
pudiendo llegar a ser muy grave dando lugar a amputaciones y sepsis, fiebre escarlatina (enrojecimientos generalizados
en la piel acompañados de dolores de garganta y fiebre muy alta). También puede producir endocarditis, aunque no está
en la tabla.

• S. agalactiae implicado en sepsis neonatal (la historia del hospital de Austria), meningitis, infeccione vías urinarias,
endocarditis.

• S. dysgalactiae y equismilis producen celulitis, bacteriemia y endocarditis.

• E. faecalis y E. faecium los vamos a encontrar sobre todo en infecciones urinarias, sin descartar bacteriemias y
endocarditis.

• S. pneumoniae esta implicado en accesos cerebrales y viscerales, sinusitis, neumonías.

Hay que quedarse, al menos, con lo que pueden producir pyogenes, agalactiae y pneumoniae. Los enterococos también son
importantes.

COCOS GRAM+

Nosotros tenemos un aislado y ya sabemos su reacción hemolítica y me interesa saber cuál es su morfología. Partimos de un coco
gram+. Si nosotros tenemos un coco gram + sabemos que con repercusión en clínica tenemos los estafilocócicos, lo estreptococos
y los enterococos, ahora bien, ¿cómo los distingo?:

Lo primero que vamos a hacer es un ensayo para ver como reacciona a la catalasa (a ver si tiene catalasa o no). La catalasa enes
capaz de desdoblar el peróxido de hidrogeno produciendo agua y oxígeno. Consiste en pone una gota de agua oxigenada sobre la
colonia del microorganismo que queremos identificar para ver si se producen burbujas o no (foto esquina superior derecha).

Vamos a ver como se agrupan esos cocos, si se agrupan de forma alineada (en cadena) o se agrupan formando racimos. Los
catalasa – (estreptococos y neumococos) están formando cadenas (alineados en cadenas que pueden ser de distinta longitud
según la especie). Mientras que los catalasa + normalmente aparecen en forma de racimos (estafilococos).

S. aureus tenía una capacidad que era la de coagular el plasma de conejo (pasar el fibrinógeno a fibrina formando un coagulo).
Vamos a comprobar si el Staphylococcus es capaz de coagular: si es capaz de coagular se trata de S. aureus, mientras que si no es
capaz de coagular el plasma pasamos a un grupo denominado CONS (Staphylococcus no coagulasa).

15
La prueba de la coagulasa hecha con el plasma de conejo no es una prueba que se haga habitual, sin embargo, en el esquema
vemos que necesitamos distinguir rápidamente entre coagulasa + y – para establecer si se trata de S. aureus u otros estafilococos.

Lo que se les hace es pasarlos por un medio de cultivo que es el MSA (manitol salado agar). Este medio de cultivo contiene una
elevada proporción de cloruro sódico (7%), a las cuales S. aureus puede crecer bien con baja actividad de agua, por eso decíamos
que puede producir toxoinfecciones alimentarias.

Utiliza manitol para producir ácidos orgánicos. Hay un indicador de pH que es el rojo fenol, el medio de cultivo es de color rojo y
si crece el microorganismo aparecen las colonias de color amarillento y alrededor amarillo. Directamente creciendo en ese medio
decimos que es coagulasa +. Si crece en manitol salado los bacteriólogos normalmente dictan que son coagulasa + y la identifican
como S. aureus.

Si resulta que son catalasa – constituye un grupo de estafilococos (20 o 30 especies), pero con repercusión en clínica son S.
saprophyticus y S. epidermidis. Para distinguirlos les hacemos una prueba de susceptibilidad a antibióticos utilizando
NOVOBIOCNA, una cumarina que actúa a nivel de biosíntesis los ácidos nucleicos (DNA girasa) pero sobre una subunidad
diferente a la de las quinolonas, sobre la subunidad A o alfa.

Nos vamos a meter con los ESTREPTOCOCOS. Tienen morfología de cocos y las células se presentan en cadenas y son catalasa -.
Vemos en el esquema un recuadro en el que pone HEMOLISIS BAP (placa de agar sangre), es decir, los clasificamos en base a sus
características hemolíticas.

Dependiendo de la reacción hemolítica que tengan (alfa, beta o gamma) vamos a tener distintas especies, pero en algunos casos
se repiten, es decir, vamos a encontrar que hay especies que pueden aparecer como alfa, beta o gamma, como una sola o como
dos de ellas (tenemos de todo).

▪ ALFA. Es una hemolisis parcial. Aquí dentro tenemos los Enterococos, los Estreptococos del grupo D que no son
Enterococos como S. bovis. Y también tenemos Estreptococos pneumoniae. La cuestión es como distinguimos entre unos
y otros.
Prueba de la esculetina. El castaño de indias produce un glucósido bastante toxico pero que algunos
microorganismos tienen la enzima que es capaz de romperlo liberando esculetina y glucosa. La esculetina
después es capaz de reaccionar con sales férricas (citrato férrico) produciendo ese precipitado negro que se ve
en los tubos de la imagen (de los tres tubos el de la derecha aparece positiva la prueba).

Resistencia a la presencia de cloruro sódico (NaCl). Ensayos al 5-5,5%. Podemos distinguir ya los enterococos
de los estreptococos del grupo D. Los últimos son incapaces de crecer a estas concentraciones de NaCl y S.
pneumoniae tampoco. Los enterococos son los únicos que aguantan estas concentraciones.

PYR. Pirrolidonil-aril-amidasa. La presencia de esa amidasa. Dentro de todos estos cocos gram+, solo son PYR+
los Enterococos y S. pyogenes que veremos por otro lado. Esta prueba del PYR nos permite distinguir entre los
Enterococos y los Estreptococos del grupo D.

Para rematar todo esto, para distinguir entre los Estreptococos del grupo D y S. pneumoniae hay un ensayo muy
sencillo que consiste en utilizar la OPTOQUINA, antibiótico dentro del grupo de las quininas que actúa a nivel de
ATPasa. Resulta que, entre todo, enterococos y estreptococos, el único que es sensible a la Optoquina es S.
pneumoniae.
Hay otra prueba que es la de solubilidad en bilis que se hace normalmente para recomprobar S. pneumoniae
que es muy sensible a la presencia de sales biliares (se lisan y no pueden usar la esculina). Por eso se pone en los
tubos donde hacemos la prueba de la esculina, porque resulta que podemos distinguir muy bien todo lo que son
el grupo que incluye estreptococos y enterococos de los neumococos.

Preguntas en el test sobre esto: un microorganismo que positivo en X o negativo en X ¿cuál es?; o como distinguir entre un grupo
de microorganismos, con que pruebas distinguirlos.

16
RESUMEN:

▪ Los Enterococos son esculina+, NaCl+, resistentes a la Optoquina y PYR+.

▪ El resto de Estreptococos del grupo D la diferencia que tienen con los enterococos es que no son resistentes a NaCl, son
esculina+ y Optoquina resistentes y, además, PYR-. Con el PYR los podemos distinguir rápidamente (enterococos o
pyogenes, pero pyogenes es beta hemolítico).
▪ Con S. pneumoniae hay una prueba que siempre se hace y es la sensibilidad a la Optoquina, que es lo que le diferencia
del resto de todos los Enterococos y Estreptococos.
En el examen si nos pone que prueba usar para diferenciar S. pneumoniae de una ristra de microorganismos (cualquier
estreptococo y enterococo) es con la prueba de sensibilidad a Optoquina.
La prueba que más se utiliza con este microorganismo es la de la solubilidad en bilis: es uno de los pocos estreptococos
que se lisa en presencia de sales biliares. Es esculina-, por eso la prueba de esculina se hace junto con la de la resistencia
a ser lisado por sales biliares. PYR-, Optoquina sensible y esculina-, soluble en bilis.

En la imagen vemos un recuadro punteado encima del de S. pneumoniae que hace referencia al grupo viridans: para diferenciarlo
bien (todas esas especies que contiene) de la de S. pneumoniae es insoluble en bilis y Optoquina resistente. Pregunta trampa de
esto en el examen.

▪ BETA. Aquellos estreptococos que presentan beta hemolisis. El medio que utilizamos es un agar sangre normal, un buen
halo de aclaramiento alrededor de la colonia (alfa hemolisis). Lo primero que haríamos si tenemos una placa con un poco
de Gram+ y que es beta (antes hemos hecho la prueba de la catalasa para ver si es + o – y ver si es un estreptococo o un
enterococo) es hacer una prueba de resistencia a Bacitracina.
Nos puede dar que ese microorganismo sea sensible o resistente a Bacitracina:
✓ Si es SENSIBLE resulta que es uno de los pocos estreptococos que lo es, encontrándonos con S. pyogenes
(microorganismo importante). Pero esto aún no es suficiente para confirmar.
Para confirmar hacemos la prueba del Hipurato (que veremos más adelante), la prueba del PYR: es el único
microorganismo junto con los enterococos que es PYR+. Y después la prueba de la esculina, que sabemos que
es Esculina-. Con estas tres pruebas si que podemos confirmar que es S. pyogenes.
Recordar que es el “rey” dentro del grupo A de la clasificación de Lancefield

✓ Si es RESISTENTE el que más nos interesa es S. agalactiae que es el representante del grupo B de la clasificación
de Lancefield. Para diferenciarlo del resto de beta hemolíticos resistentes a bacitracina hay una nueva prueba
CAMP.
Lo interesante de esta prueba es que resulta que algunos microorganismos son capaces
de amplificar la actividad beta hemolítica de S. aureus. En una placa de agar sangre en
vertical sembramos un cordón S. aureus, viendo que es ligeramente beta hemolítico.
A continuación, de forma perpendicular sembramos cordones de los microorganismos
que queremos testar si son CAMP + o -:
❖ Los negativos (-) son los que NO producen amplificación de esta beta hemolisis.
❖ Los positivos (+) como S. agalactiae SI producen la amplificación.
Esta prueba del CAMP la necesitamos para confirmar, dentro del los beta resistentes a bacitracina, que entramos
en el grupo B de los estreptococos donde está S. agalactiae. Confirmamos esto con la prueba del Hipurato, PYR-
y Esculina -. S. pyogenes (grupo A) es Hipurato -, mientras que S. agalactiae es Hipurato +.

PRUEBA DEL HIPURATO. El Hipurato es acido benzoico y glicina. Hay

microorganismos que tienen una enzima llamada hipuricasa que es capaz de
romper el enlace liberándose acido benzoico y glicina. Los que dan la
reacción azul son los Hipurato positivos.

PRUEBA DE SOLUBILIDAD EN BILIS. Bastante confirmatorio para identificar S.

pneumoniae ya que es uno de los pocos que es muy sensible. En una solución
de alguna sal biliar resuspendemos viendo que a los pocos minutos se aclara
esa suspensión porque se han lisado las células, en este caso sería POSITIVO.

17
 Seguimos dentro de los beta hemolíticos resistentes a bacitracina. Si la prueba del CAMP sale NEGATIVA nos
encontramos a todo el grupo de los Enterococos y los Estreptococos verdaderos del grupo D.
La pregunta es que hacen estos últimos aquí → generalmente los del grupo D son alfa hemolíticos o no
hemolíticos, pero pueden aparecer cepas de estos microorganismos que son beta. Hay que seguir haciendo
pruebas teniendo mucho ojo para confirmar que es.
Ya hemos visto como distinguirlos: hacemos las pruebas de la Esculina, NaCl, Optoquina y PYR para poderlos
distinguir bien, teniendo en cuenta que son CAMP- y bacitracina resistentes.
❖ Los Enterococos son Esculina+, NaCl+, PYR+.
❖ Los Estreptococos del grupo D son Esculina+, NaCl-, PYR-.

▪ GAMMA. La gamma hemolisis era la que no presentaba nada de hemolisis. Aquí solamente encontramos Enterococos y
Estreptococos del grupo D. Se realizan las pruebas ya conocidas de Esculina, NaCl y PYR.

A continuación, vemos una TABLA RESUMEN de las características de los estreptococos y enterococos que hemos visto, con todas
las pruebas.

BACILOS GRAM+

Como entramos a identificar bacilos gram+ de interés en clínica. Lo primero que

podemos hacer es la prueba del ácido-alcohol resistente.

Si esta prueba es POSITIVA (son ácido alcohol resistentes) el grupo principal son las
Mycobacterias: crecen muy lentamente y sus colonias son muy características de
aspecto terroso debido a la presencia de ácidos micólicos en las paredes celulares.

Si la prueba es NEGATIVA tenemos bastantes bacterias que son de interés clínico.

Resumiendo, dentro de los bacilos gram+ vamos a ver el grupo de Clostridium, Bacillus, Listeria monocytogenes y Corynebacterium
diphtheriae. Son muy significativas.

BACILLUS. Hemos entrado por una ácido alcohol resistente negativa y ahora lo que vamos a hacer es una tinción de esporas,
simplemente para ver si son esporulados o no esporulados.

Sin son esporulados simplemente es ver si hay crecimiento en presencia de aire para distinguir entre:

▪ Bacilos gram +, acido alcohol resistente -, esporulados, AEROBIOS. BACILLUS.

▪ Bacilos gram+, acido alcohol resistente-, esporulados, ANAEROBIOS. CLOSTRIDIUM.

Dentro del género BACILLUS hay un montón de especies, pero que tengan interés y de las que haya que acordarse: Bacillus
anthrracis. Produce el ántrax, enfermedad que se daba en el ganado. Fue una de las grandes aportaciones de Pasteur. Causa
enfermedad en animales y en hombre.

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Hay que aprender a distinguirlo bien de otra especie parecida que es Bacillus cereus que tiene mucha fama en infecciones
toxicoalimentarias. Produce problemas medico “leves” comparados con otros microorganismos, pero en cambio, el número de
casos que produce de esas infecciones es muy grande.

COMO DISTINGUIR BACILLUS ANTHRACIS DE BACILLUS CEREUS. Bacillus anthracis es sensible a la penicilina mientras que Bacillus
cereus es resistente a la penicilina. Por otro lado, Bacillus anthracis es inmóvil mientras que Bacillus cereus es móvil. Bacillus
anthracis es gamma hemolítico (es decir, no es hemolítico), mientras que Bacillus cereus es beta hemolítico.

LEC. Es la prueba de la lecitina. Lo que se busca es la presencia de una enzima que es la lecitinasa que es propia de ciertos
microorganismos, es un determinante de patogenicidad. La lecitinasa es capaz de romper distintos fosfolípidos. Cuando los
rompen se liberan diglicéridos insolubles que precipitan en el medio de cultivo y alrededor de las colonias se forman unos halos
blanquecinos opacos.

El medio que se utiliza es de yema de huevo agar. Nos sirve para ver si hay producción de lecitinasas, de lipasas y de proteasas.
Pero a nosotros nos interesa solo el halo de precipitación blanco. Si produce lipasas es un halo opalescente sobre la superficie y si
produce proteasas es un halo transparente alrededor.

En la imagen vemos Bacillus cereus que es POSITIVO y otro bacilo que es NEGATIVO para lecitinasa en este medio de yema de
huevo agar.

Ahora nos vamos con los que ESPORULAN, PERO SON ANAEROBIOS. El ejemplo aquí es Clostridium donde destacamos a
Clostridium perfringens y Clostridium difficile.

CLOSTRIDIUM PERFRINGENS. Lo primero que nos llama la atención de el en una placa de agar sangre es el doble halo: uno
beta interior y uno alfa exterior. Esto halos se corresponden a que presenta dos tipos de exotoxinas este microorganismo: una
que es la TOXINA TETA que produce el halo beta interno y la otra que es la TOXINA ALFA que produce el halo alfa externo.

Resulta que las distintas especies de Clostridium presentan todas actividad lecitinasa. Pero esa toxina alfa, la que produce la alfa
hemolisis externa es una lecitinasa. PERO ESA TOXINA ALFA SOLO ES PROPIA DE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS.

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Para distinguir que la que se produce es esta lecitinasa alfa (que solo la produce C. perfringens)
hay una prueba que se llama TEST DE NAGLER. Es una prueba muy sencilla: en una placa
dividida por la mitad, una parte lleva el medio normal de la yema de huevo (derecha) y la otra
parte es la que lleva además del medio de yema de huevo un ANTICUERPO FRENTE A LA
TOXINA ALFA (izquierda).

Lo que ocurre al hacer el cordón horizontal que se ve en la imagen es que en la zona donde
están los anticuerpos (izquierda) no hay precipitado, mientras que en la zona sin anticuerpos
(derecha) si hay precipitado. Específicamente esa cepa esta produciendo la toxina alfa, la
lecitinasa alfa, de manera que podemos decir que esta cepa es Clostridium perfringens.

Clostridium difficile es NAGLER -. Saldría una línea sin precipitado.

Otra característica propia y muy distintiva de C. perfringens es la beta hemolisis doble. Es CAMP INVERSO +.

Lo que vamos a hacer ahora en el CAMP INVERSO es poner C. perfringens en un cordón horizontal, viendo que produce la doble
hemólisis: la beta interna y la alfa externa. Ahora lo que hacemos es poner cordones verticales de S. aureus (producía beta
hemolisis pero que se potenciaba por la presencia de S. agalactiae en el CAMP normal).

Resulta que aquí es al revés, en la zona de coincidencia de los dos cordones desaparece la beta y la alfa hemolisis de C.
perfringens. En el caso de que fuera C. difficile lo mismo: si es positivo desaparecería esa beta hemolisis doble, mientras que si
fuese negativo se mantendría. Aquí es lo inverso: cuando desaparecen las hemolisis es positivo

Volviendo al esquema general de los bacilos gram +, si son PRODUCTORES DE ESPORAS NEGATIVOS, lo que nos vamos a fijar es
en sí hay MOVILIDAD:

▪ Si hay movilidad nos encontramos con Listeria monocytogenes. Responsable de la listeriosis, una enfermedad de
transmisión por alimentos muy grave. Se dan muy pocos casos, pero la mortandad que subyace es como si fuera la suma
del conjunto de todas las infecciones de transmisión por alimentos que se puedan dar.
Al ponerlas al microscopio son muy características porque todas están “tambaleándose”.
Es Esculina+ (si tienen la enzima rompen el glucósido reaccionando después con el citrato y el tubo que la contiene
adquiere una tonalidad negra). Gelatina+ (ahora la veremos) y la prueba del CAMP sale
positiva también.

La PRUEBA DE LA GELATINA hace referencia a la presencia de una gelatinasa (proteasa). Se

coloca gelatina de carne y el tubo se queda semisólido. Para ver si es gelatina+ picamos sobre
la superficie un inoculo del microorganismo que estamos probando y al cabo de unas horas
pasamos el tubo de vertical a horizontal y vemos que está semilíquido.

▪ Si no hay movilidad y son capaces de crecer en el aire nos encontramos con el género Corynebacterium. Tienen mucha
importancia industrial y también mucha importancia médica, sobre todo Corynebacterium diphtheriae que produce la
difteria. Para distinguirlo de otros microorganismos: es inmóvil, Esculina-, Gelatina- (incapaz de producir proteasas que
a la gelatina de carne) y es beta hemolítico.
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 COCOS GRAM -

Bacterias gram- de interés que sen cocos tenemos las Neisseria gonorrhoeae y
Neisseria meningitidis. En cuanto a las características que tienen, son capaces de
crecer en presencia de aire.

En cuanto a que sean capaces de crecer en Thayer-Martin (ya visto), un medio que
era una mezcla de agar chocolate, agar sangre y una reacción de antibiótico,
encontramos un grupo de Neisseria que no son capaces de crecer, pero a nosotros las
que nos interesan son Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis que si que
crecen.

Tenemos otra prueba que es la ONPG (orto-para-nitrofenol galactopiranosido), que

consiste en utilizar un sustrato artificial para ver si tiene actividad betagalactosidasa.
La betagalactosidasa la utilizan microorganismos para poder consumir lactosa. Si
tienen la actividad se desarrolla un color azul oscuro (positivo). Si sale positivo lo que
hay presente es una Neisseria lactámica.

Si sale negativa la ONPG nos centramos en las especies de Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.

¿Cómo distinguirlas?: hay que estudiar la producción de ácido a partir de dos azucares que son la glucosa y la maltosa:

▪ Si resulta que es capaz de utilizar glucosa, pero no maltosa estamos frente a Neisseria gonorrhoeae.
▪ En cambio, si es capaz de utilizar los dos azúcares estamos frente a Neisseria meningitidis.

BACILOS GRAM –

Tienen mucha importancia desde el punto de vista clínico. Hay

microorganismos muy conocidos como puede ser E. coli, pero nos
podemos encontrar Vibrios o Salmonelas.

La primera parte seria hacer una tinción de gram y observar si ese

microorganismo es Gram+ o Gram-, bacilo o coco.

Vamos a hacer una primera prueba para ver si son capaces de

crecer en presencia de aire o en su ausencia, es decir, ver si son
anaerobios estrictos, aerobios o anaerobios facultativos.

En cuanto a ANAEROBIOS ESTRICTOS hay un grupo muy pequeño

que esta constituido por las especies Bacteroides. Su identificación
es complicada y se tiende a utilizar métodos moleculares, ya sea
por caracterización de ácidos nucleicos o por caracterización de
alguna molécula que sea distintiva.

Esta distinción ya química se hace por cromatografía de gases o

mediante cromatografía liquida o HPLC.

Nos interesan aquellos que son AEROBIOS ESTRICTOS o

ANAEROBIOS FACULTATIVOS. La siguiente prueba que vamos a
hacer es crecerlos en un MacConkey (para distinguir si eran
capaces de utilizar lactosa o no).

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Los microorganismos que NO son capaces de crecer en MacConkey, pero si son capaces de crecer en presencia de eritrocitos
(placa de agar sangre o de agar chocolate) son los Haemophilus (MacConkey+).

También tenemos aquellos que no requieren sangre en el medio de cultivo, pero tampoco van a crecer en MacConkey y necesitan
medios especiales que son Brucella, Beordetella, Campylobacter (MacConkey-).

Los que si crecen en MacConkey deben pasar por la PRUEBA DE LA OXIDASA, que consiste en ver la presencia del citocromo C.
Encontramos unos que son oxidasa + y otros que son oxidasa -, los más interesantes son los oxidasa -, donde están todas las
enterobacterias.

Respecto a los oxidasa + (presencia de citocromo C), tenemos algunos géneros que nos interesan como Pseudomonas y Vibrio,
por ejemplo. Para distinguirlos fácilmente hacemos un TEST DE ÓXIDO-FERMENTACIÓN (OF). Esta prueba consiste en ver si es
capaz de usar un azúcar determinado en ausencia y en presencia oxígeno. Vamos a observar a su vez que se generen ácidos a
partir de esa utilización del azúcar, para ello ponemos un marcador de pH en el medio de cultivo.

En la imagen vemos una serie de tubos de distinto color. En el primero

tubo lo que vemos es parafina, que es un liquido transparante que
impide que el microorganismo esté en contacto con el aire (no tiene
oxigeno). Si el microorganismo crece ahí es que es capaz de fermentar
el azúcar (anaerobiosis) cambia el pH y el vira a color amarillo (positivo).

El segundo tubo que no tiene la parafina es capaz de hacer esa fermentación en presencia de oxígeno (son capaces de respirar y
fermentar). Se observan unas burbujas en medio del tubo hacia el interior: lo que hacemos es sembrar en picadura, introducimos
el asa de siembra en el interior donde se van a encontrar con un ambiente anaerobio (no llega el oxígeno) y por eso dentro están
fermentando produciendo acido.

Si el tubo de la derecha del todo nos diera un poco de amarillo en la superficie, no significa que sea capaz de fermentar, ya que
ahí tiene oxígeno, solo sería respirador de ese azúcar: es capaz de crecer a partir de ese azúcar y respira utilizando como aceptor
de electrones le oxígeno.

Aquí solo tenemos los que son capaces de respirar o lo que son capaz de fermentar, pero no son anaerobios estrictos. Un
anaerobio estricto no podría crecer aquí nada. En el caso de la izquierda del todo, si solo fuera positivo el tubo de la izquierda y
negativo (color verde) el de la derecha de la pareja, esta claro que es anaerobio estricto.

En la pareja de tubos del medio, vemos como el de la izquierda es verde y el de la derecha es amarillo: esto quiero decir que está
oxidando, solo puede respirar. El segundo tubo representa la oxidación, ya que el microorganismo está en contacto con el aire.

Los tubos de la derecha del todo, al ser ambos verdes, nos indica que no puede crecer el microorganismo: no es anaerobio, pero
tampoco es oxidador/fermentador. Lo que esta sucediendo es que no es capaz de utilizar el azúcar que le hemos puesto (glucosa).

Los oxidativos eran aquellos que no podían crecer si no hay oxígeno, y si tiene parafina no puede.

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Como distinguimos Pseudomonas del resto: sus colonias están pigmentadas y son fluorescentes. Es un microorganismo que causa
muchos problemas en clínica al ser muy resistente.

▪ Pseudomonas oxidación glucosa +.

▪ Vibrio fermentación glucosa +.

En cuanto a los que son oxidasa -, hacemos el test de la óxido-fermentación (OF) obteniendo:

▪ Oxidativo/Negativo a la prueba de óxido-fermentación con glucosa. Aparece un microorganismo nuevo, Acinetobacter,

un microorganismo que nos encontramos en la naturaleza. Se ha adaptado muy bien a los ambientes antropogénicos y
sobre todo a los ambientes hospitalarios, produciendo infecciones nosocomiales muy graves que van en aumento.
Al igual que los enterococos, son capaces de adquirir ADN exógeno. Es un microorganismo que resiste muy bien
condiciones extremas fisicoquímicas.
Tiene muchas resistencias, tanto intrínsecas como adquiridas, por lo que es muy grave.
▪ Fermentadores donde encontramos las Enterobacterias. Bacilos gram – capaces de crecer en MacConkey, oxidasa-,
fermentadores. Hay muchas especies de interés, pero destacan E. coli y Salmonella.

COMO DISTINGUIR LAS ENTEROBACTERIAS. Para distinguir las enterobacterias hay que comprobar, una vez que vemos que
es fermentativa, que sean capaces de usar la lactosa o no con un medio MacConkey.

Si resulta que si son capaces de utilizar lactosa hay que hacer la PRUEBA DE LA UREA para ver si contienen la enzima ureasa: la
urea se produce por el metabolismo de sustancias aminadas (aminoácidos y ácidos nucleicos). La ureasa lo que hace es romper
esa urea y liberar amoniaco que basifica el medio, cambia el pH apreciándose un cambio de color (rojo de fenol) a morado-rojo.

▪ Klebsiella es ureasa +. Produce infecciones urinarias.

Si hacemos la prueba y nos sale ureasa – (más a la izquierda en el esquema), hacemos la PRUEBA DEL INDOL: el indol es un
subproducto del metabolismo del triptófano. Si el microorganismo tiene una enzima que es la triptofanasa y lo ponemos en un
medio de cultivo enriquecido con triptófano, utiliza ese triptófano liberándose indol y después, con un reactivo llamado reactivo
de Kobac o el reactivo de Ehrlich, lo ponemos en evidencia.

▪ E. coli: es indol+.
▪ Enterobacter y Citrobacter es indol-.

Dentro de los que no son capaces de usar la lactosa se realiza también la prueba de la urea. A su vez, dentro de los ureasa +,
vamos a ver los que tiene la enzima β-galactosidasa utilizando el reactivo artificial ONPG:

▪ Yersinia: ONPG+. Esto es contradictorio ya que se encuentra dentro del grupo de los que no son capaces de usar la
lactosa, pero presentan la enzima β-galactosidasa. Si que puede usar lactosa, el problema que tiene es que no tiene
sistema de transporte para que la lactosa entre ene la célula.
▪ Proteus: ONPG-. Infecciones urinarias, muy importante.

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Dentro de los que son ureasa -, distinguimos con la prueba
de la producción de H2S (sulfhídrico) y movilidad. El H2S se
puede producir en el propio metabolismo de aminoácidos
azufrados: una vez que el microorganismo agota fuente de
carbono de uso fácil (carbohidrato) tiran de esqueletos
carbonados de aminoácidos. Produce amonio y por eso
bajan los pH también. De aquellos aminoácidos azufrados
desprenden el azufre en forma de sulfhidrilo.

Aquí nos encontramos que:

▪ Salmonella +.
▪ Shigella -.

CUADRO RESUMEN DE TODO.

OTROS CONCEPTOS DE INTERÉS.

El avance en las técnicas de diagnóstico microbiológicas ha ido en el sentido de ahorrar tiempo para aliviar el sufrimiento y el
quesillo de los hospitales.

El primer paso en esta evaluación ha sido ver que para grandes grupos de microorganismos existen
pruebas comunes y alguna que otra diferencial, de manera que se pueden hacer todas las pruebas a la
vez.

Otra evolución ha sido miniaturizar los ensayos, aparecieron distintos sistemas en los cuales había distintos sustratos para ver
reacciones químicas y se observaba si cambiaban de color: de una misma suspensión de microorganismo se cogían alícuotas y se
cargaban los dispositivos.

Las tiras API (para identificación de enterobacterias), que nos permiten ver los cambios
de colores de distintas reacciones para la identificación de microorganismos (poner en
evidencia características bioquímicas del microorganismo)

El siguiente paso fue encontrar marcadores que pusieran en evidencia si hay un crecimiento
de microorganismos, en función de si utiliza o no el sustrato que se le coloca. Lo que es mucho
más rápido que modificarlo químicamente para cambiar el color. Suelen ser derivados de
Tetrazolium, un producto químico que al reducirse produce color o fluorescencia
(modificación). Es muy sensible a reducción.

El SISTEMA BIOLOG utiliza placas con 96 pocillos, lo que nos permite reducir mucho el tiempo de identificación. De acuerdo a la
combinación de los pocillos negativos y positivos son capaces de identificar. También se usan estas placas para ver la diversidad
de microorganismos en el suelo (a mayor diversidad mayor numero de azucares se están utilizando).

En clínica se utilizan los SISTEMAS VITEK: placas que contienen distintos productos químicos o antibióticos a distintas
concentraciones. Presentan un tubito por el que se van rellenando todas las cámaras con la misma suspensión. El producto
químico que permite la identificación esta impregnado en la cámara, no se transmite de un lado a otro. Después se mete en el
incubador y es éste el que mide si hay cambios de alguna en las cámaras.

El microSCan, sistema basado en lo anterior, tiene dos sistemas para identificación:

▪ Rapid: 2,5 horas a partir de un cultivo puro, necesitamos el microorganismo aislado.

▪ Convencional: 6-18 horas.

En hacer el antibiograma se tarda 20 horas y en menos de 24 horas se tiene el microorganismo identificado y se conoce a qué
antibióticos es susceptible (si no pasamos por cultivo puro esto es complicado).

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