26 de Febrero 2021
Diplomado en biosensores 2021
Laboratorio de Tecnologı́a Avanzada de Biosensores
Práctica 2. Cuantificación de proteı́nas
Marco Contreras, Oscar Ortı́z, Ricardo Gallegos, Jorge Juárez
Abstract
El ensayo de Lowry es un ensayo de proteı́nas. Durante algún tiempo fue el método de elección
para la determinación precisa de proteı́nas para fracciones celulares, fracciones de cromatografı́a,
preparaciones de enzimas, etc.
Contents
1 Introducción
1.1 Proteı́nas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.2 Método de Lowry . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
2 Objetivo
3 Métodologı́a
3.1 Materiales y reactivos . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
Materiales • Reactivos
3.2 Procedimiento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
4 Análisis de resultados
5 Conclusiones
References
1. Introducción
1.1 Proteı́nas
Las proteı́nas son un grupo de biopolı́meros constitui-
dos de aminoácidos que exhiben una amplia gama de
estructuras y funciones. Las proteı́nas como un grupo
de biomoléculas, desempeñan una gran variedad de fun-
ciones, algunas participan en la contracción muscular
y sirven para dar soporte estructural, otras trasportan y
almacenan moléculas pequeñas [Shen et al., 2013]
1.2 Método de Lowry
La determinación cuantitativa de la concentración de
proteı́nas es una de las pruebas que más frecuentemente
deben hacerse en el laboratorio de bioquı́mica. Un
método efectivo para llevar a cabo la cuantificación de
proteı́na es el método de Lowry. El método de Lowry
(1951) es un método colorimétrico de valoración cuan-
1
titativa de las proteı́nas. A la muestra se añade un reac-
tivo que forma un complejo coloreado con las proteı́nas,
siendo la intensidad de color proporcional a la con-
2 centración de proteı́nas, según la ley de Lambert-Beer
A = εlc [Zhu et al., 2009b]; donde A es la absorbancia,
2
ε la absortividad molar y l la longitud de camino óptico.
Este método consta de dos etapas: 1) Los iones
Cu2+ , en medio alcalino, se unen a las proteı́nas for-
3 mando complejos con los átomos de nitrógeno de los
4 enlaces peptı́dicos (Figura 4). Estos complejos Cu2+ −
proteı́na tienen un color azul claro. Además, provo-
5
can el desdoblamiento de la estructura tridimensional
de la proteı́na, exponiéndose los residuos fenólicos de
tirosina que van a participar en la segunda etapa de la
reacción [Tanyalçın et al., 2001]. El Cu2+ se mantiene
en solución alcalina en forma de su complejo con tar-
trato. 2) La reducción, también en medio básico, del
reactivo de Folin-Ciocalteau, por los grupos fenólicos
de los residuos de tirosina, presentes en la mayorı́a de
las proteı́nas, actuando el cobre como catalizador. El
principal constituyente del reactivo de Folin-Ciocalteau
es el ácido fosfomolibdotúngstico, de color amarillo,
que al ser reducido por los grupos fenólicos da lugar a
un complejo de color azul intenso. Al producirse dicha
reacción hay un cambio en el color de la muestra que
puede ser cuantificado determinando la absorbancia a
660 nm [Zhu et al., 2009a].
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• Cubetas de colorı́metro

• Agitadores de tubos

3.1.2 Reactivos
• Reactivo A: Na2 CO3 al 1%, NaOH 0.1 M

• Reactivo B1: CuSO4 · 5 H2 O al 2%

Figure 1. Reacción de proteı́na y reactivos. • Reactivo B2: tartrato sódico-potásico al 1%

• Reactivo C: Se prepara mezclando los reactivos

El método de Lowry envuelve dos reacciones quı́micas.
anteriores en proporciones 100:1:1 (en volumen),
La primera reacción es la reducción del ion cobre (II) en
respectivamente.
condiciones alcalinas (básicas), formando un complejo
con enlaces peptı́dicos, denominado reacción de Biuret.
• Reactivo Folin-Ciocalteau: reactivo comercial dilu-
La segunda reacción envuelve la reducción del reagente
ido a 1/4
Folin-Ciocalteau por el complejo cobre-enlace peptı́dico,
causando un cambio en la coloración de la solución para
• Solución patrón de albúmina de suero bovino (BSA)
azul. Por espectrofotometrı́a pueden leerse las mues-
(2 mg/mL)
tras tratadas con este método entre 650 a 750 nm. La
cantidad de proteı́na puede ser estimada utilizando una
3.2 Procedimiento
curva estándar con otra proteı́na, es decir, cuya concen-
Para determinar la concentración de proteı́nas de la mues-
tración sea conocida como la albúmina bovina sérica
tra problema se construye una curva patrón o de cali-
[Kusunoki et al., 2012].
brado a partir de una solución patrón (BSA) (2 mg/mL).
La principal ventaja del método de Lowry es su alta
La concentración que tienen las muestras problema se
sensibilidad. El método de Lowry es más sensible que
determina por interpolación de los valores de absorban-
la determinación UV y también más sensible que el
cia en la curva patrón. El tubo 0, que sólo contiene agua
método de Biuret. Algunas desventajas son el tiempo
destilada y los reactivos, sirve de blanco para el ajuste
de la reacción y la incompatibilidad con detergentes y
del colorı́metro a cero de absorbancia.
agentes reductores.
Se numeraron tubos de plástico de 10 ml del 0 al 5 y se
cubrieron con hojas de aluminio para evitar que la luz
2. Objetivo
pase al interior de los tubos. Con ayuda de pipetas se
Determinar una curva de concentración de la proteı́na prepararon soluciones como se muestran en el Cuadro
utilizando el método de espectrometrı́a. 1. Después, usando los reactivos A, B1 y B2; se realizó
el reactivo C para agregarlo a las soluciones pasadas
3. Métodologı́a y mezclar. Finalmente, se pipeteó el reactivo de Folin-
3.1 Materiales y reactivos Ciocalteau en los tubos de plástico, se volvieron a mezclar
3.1.1 Materiales por agitación y permanecieron en reposo durante 20 min-
• Tubos de ensayo utos para que se desarrolle por completo la reacción
coloreada. Una vez obtenidas las muestras coloreadas,
• Tubos Falcon (50 ml) se obtuvieron las absorbancias usando el colorı́metro
en una longitud de onda de 680 nm, ajustando previa-
• Pipetas
mente el valor de absorbancia nulo usando una muestra
• Colorı́metro de agua.
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Colorante (Folin diluido)

Tubo Agua [ml] Proteı́na [ml] Reactivo C [ml]
[ml]
0 1.0 0 2.5 0.5
1 0.9 0.1 2.5 0.5
2 0.8 0.2 2.5 0.5
3 0.7 0.3 2.5 0.5
4 0.6 0.4 2.5 0.5
5 0.5 0.5 2.5 0.5
Cuadro 1. Cantidades usadas para cada solución.

4. Análisis de resultados
REACTIVO A: Para preparar la solución de NaOH 0.1M
se utilizó un matraz aforado de 100ml y tomando en
cuenta que el PM del NaOH es de 39,997g/mol se realizó
el siguiente calculo:

g ∗ PM
M= (1)
V

Figura 2. Muestras preparadas y colocadas a reposar en

g = 0.1M ∗ 0.1Lt ∗ 39, 997g/mol = 0.39997g (2) tubos Falcon.

El Peso de la solución seria 100.39g por lo que la canti-

dad que se añadió de Na2 CO3 para que fuese al 1% es Resultados espectro de absorción de proteı́na
de 1.0039g. Muestra Concentración ((mg/ml)/2) Absorbancia
REACTIVO B1: Para la solución de CuSO4 · 5 H2 O al B 0 0
2% se utilizó un matraz de 5ml. La cantidad que se peso 1 0.1 1.058
del reactivo fue la equivalente al 2% de 5g es decir 0.1g. 2 0.2 1.261
REACTIVO B2: en esta solución igualmente se usó un 3 0.3 1.529
matraz de 5ml, por lo que la cantidad equivalente al 1% 4 0.4 1.598
de tartrato sódico-potásico que se pesó fue 0.05g 5 0.5 1.622
REACTIVO C: Se preparo mezclando 100ml de reac-
tivo A con 1ml respectivamente de los reactivos B2 y B2. Los datos de absorción de las muestras de proteı́na,
fueron graficados para obtener la linealidad de la curva
de calibración y de esta manera tener la ecuación que
Posteriormente se siguió el procedimiento y una vez
nos permita calcular la concentración de soluciones prob-
preparadas muestras 0, 1, 2, 3, 4, 5 con diferente concen-
lema. Dichos resultados se muestran en la siguiente
tración de proteı́na en tubos Falcon como se muestra en
figura:
la Fig. 2, pasaron a un posterior análisis en el espectro-
Como se puede observar en la Fig. 4, se obtiene
fotómetro para cuantificar la absorción de las muestras.
la curva de calibración correspondiente al espectro de
Los resultados obtenidos fueron los siguientes:
absorción para las muestras de proteı́na. Se ignoró el
blanco puesto que no tiene un comportamiento lineal
con respecto a los demás datos obtenidos. La ecuación

Figura 3. Preparación de tubos de cuarzo con la
proteı́na.
Figura 4. Curva de calibración para las muestras de
proteı́na
que nos permite entonces calcular las concentraciones
de las soluciones problema es:
y = 1.465x + 0.9741 (3)
Se puede observar en la gráfica que se obtuvo una
R2 de 0.8924, que es un valor un tanto debajo de lo
esperado. Esto puede deberse a algunos factores que van
desde errores en la preparación de las soluciones, o de la
muestra.
5. Conclusiones
Conclusión Oscar Ortı́z: Para poder llevar a cabo al-
gunos trabajos bioquı́micos en repetidas ocasiones es
necesario llevar a cabo una cuantificación de proteı́nas.
El método que se analizó durante el desarrollo de esta
práctica fue a través del método de Lowry, el cual es un
método colorimétrico de valoración cuantitativa de las
proteı́nas en el que a la muestra se añade un reactivo que
forma un complejo coloreado con las proteı́nas, siendo
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la intensidad de color proporcional a la concentración de
proteı́nas.
A través del uso del espectrofotómetro se obtuvo el es-
pectro de absorción correspondiente a la cuantificación
de proteı́nas al variar la concentración de la proteı́na
base. Los resultados no fueran muy favorables ya que se
obtienen valores para R2 bastantes bajos y esto se puede
deber a un mal aforado de las soluciones preparadas, lo
cual involucra un exceso de agua o un mal equilibrio
en las soluciones finales con las que se prepararon las
muestras con la proteı́na finales o incluso que en la mez-
cla final influyó para mal la concentración de proteı́na
utilizada y esto no permitió que se generaran resultados
exponenciales.
Al final de la práctica se pudo conocer el proceso por
medio del cual se lleva a cabo la cuantificación de proteı́na
y solamente basta con detectar los posibles errores du-
rante el desarrollo de este proceso de cuantificación
para evitar que estos se repitan en futuras prácticas rela-
cionadas a este tipo de análisis.
Conclusión Marco Contreras: Poder determinar
de forma correcta la concentración de un material, es
esencial para la fabricación de biosensores. La cantidad
de receptores en nuestro transductor es de vital impor-
tancia para tener control sobre lo que seremos capaces
de medir.
Haciendo uso de un espectrofotómetro, podemos deter-
minar la concentración de proteı́na (BSA) contenida en
una muestra. Usando el método de Lowry, logramos de-
terminar la curva de calibración para esta proteı́na, obte-
niendo un coeficiente de determinación R2 de 0.8924.
Pensamos que el valor de R2 por debajo de lo esperado,
se debe a algún inconveniente al realizar las primeras
soluciones. Personalmente, considero que el valor dado
de 680 nm pudo influir en los resultados, y debimos
tomar la longitud de onda que mejor se adaptara a las
muestras. Y este procedimiento deberı́a seguirse siem-
pre que se prepare una nueva solución, pues no se puede
asegurar que todo salga perfecto, y tener una curva de
calibración adecuada para la muestra preparada.
Conclusión Ricardo Gallegos: Determinar valores
precisos en practicas de censado habla de un buen pro-
ceso por esto, es importante determinar de forma correcta
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Práctica 2. Cuantificación de proteı́nas — 5/5

una concentración, ya que esto es indispensable para un of total protein determination by the lowry method.
buen biosensor, este sera siempre mejor si el margen de Japanese journal of infectious diseases, 65(6):489–
error al momento de su medición es bajo. 494.
De esta manera en esta practica se llevo a cabo una [Shen et al., 2013]
Shen, Y.-x., Xiao, K., Liang, P., Ma, Y.-
detección de una proteı́na con espectrometrı́a, Usando w., and Huang, X. (2013). Improvement on the mod-
el método Lowry, se obtuvo un coeficiente de determi- ified lowry method against interference of divalent
nación R2 por debajo de un buen análisis, este fue de cations in soluble protein measurement. Applied mi-
0.8924, se piensa que este error pudo ser causado por crobiology and biotechnology, 97(9):4167–4178.
el factor humano, en el momento en realizar alguna de [Tanyalçın et al., 2001]
Tanyalçın, T., Kutay, F., and Aslan,
las reacciones, lo cual implico un error al preparar las
D. (2001). Interference study should be performed for
muestras con la proteı́na, sin embargo, se puede consid-
every protein measurement method used. Accredita-
erar que el valor de 680 nm puede que sea el apto para
tion and quality assurance, 6(9):427–430.
esta proteı́na, pero este al variarlo o que el equipo deter-
[Zhu et al., 2009a]
Zhu, D., Huang, S., Gebregeorgis, E.,
minara el valor mas óptimo para nuestra muestra pudo
generar un mejor resultado, dejando un posible margen McClellan, H., Dai, W., Miller, L., and Saul, A.
de mejora para los siguientes trabajos. (2009a). Development of a direct alhydrogel formula-
Conclusión Jorge Juárez: La cuantificación cor- tion immunoassay (dafia). Journal of immunological
recta de proteı́nas es esencial para la elaboración de methods, 344(1):73–78.
biosensores. Por medio de la cuantificación se puede [Zhu et al., 2009b]
Zhu, D., Saul, A., Huang, S., Martin,
observar cuanta proteı́na (por ejemplo enzimas) fueron L. B., Miller, L. H., and Rausch, K. M. (2009b).
inmovilizadas en un sustrato (determinando la cantidad Use of o-phthalaldehyde assay to determine pro-
proteı́nas antes y después de colocar el sustrato en la tein contents of alhydrogel-based vaccines. Vaccine,
solución) y también de esta forma conocer los tiempos 27(43):6054–6059.
en donde hay una máxima inmovilización. Para deter-
minar el contenido de proteı́na en las muestras es nece-
sario hacer una curva de calibración utilizando albúmina
sérica bovina como patrón bajo las mismas condiciones
de la prueba. El método de Lowry, que fue utilizado, de
acuerdo a la literatura es utilizado para concentraciones
de proteı́nas entre 0.01–1.0 mg/mL, lo cual lo hace el
apropiado para la concentraciones que se manejaron en
la práctica.
El objetivo de la practica fue alcanzado puesto que se
obtuvo exitosamente una curva de calibración por el
método de espectro fotometrı́a. Los resultados sin em-
bargo no fueron tan exactos como se hubiera deseado
puesto que la R2 fue por debajo de 0.9. Esto probable-
mente se debió a errores técnicos, ya sea al preparar los
reactivos o las muestras.

References
[Kusunoki et al., 2012]
Kusunoki, H., Okuma, K., and Ham-
aguchi, I. (2012). Estimation of lactose interference in
vaccines and a proposal of methodological adjustment