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Aquiahuatl Ramos Maria de Los Angeles Manual de Practicas de
Aquiahuatl Ramos Maria de Los Angeles Manual de Practicas de
manual de prácticas
laboratorio
MICROBIOLOGÍA
GENERAL
Rector General
Dr. Luis Mier y Tetón Casanueva
Secretario General
Dr. Ricardo Solís Rosales
Rector
Dr. José Lema Labadie
Secretario
Mtro. Luis Javier Melgoza Valdivia
Departamento de Biotecnología
jefe del Departamento
Dr. J. Mariano García Garibay
ISBN 970-31-0141-0
DERECHOS RESERVADOS © 2004, Universidad Autónoma Metropolitana (México). Prohibida la reproducción de esta obra así como la distribución y venta fuera del ámbito de la UAM®. E-libro Bibliomedia Bibliomedia@mail.com
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laboratorio
MICROBIOLOGÍA
GENERAL
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A toda la gente que revisó este manual, que con sus aportaciones enri-
quecieron este trabajo.
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índice
7 PRESENTACIÓN
PRÁCTICA # 2
20 Preparación, fijación y coloración simple de frotis
22 Preparación de frotis
22 Fijación del frotis
23 Tinción simple
24 Observación al microscopio
PRÁCTICA # 3
28 Tinción diferencial de Gram y tinciones selectivas
30 Tinción diferencial de Gram
31 Tinción selectiva de endosporas
31 Tinción negativa para observación de cápsulas
32 Observaciones al microscopio
PRÁCTICA # 4
36 Métodos de cultivo y aislamiento de bacterias
38 Técnica de estría cruzada
38 Siembra en tubos con caldo y agar nutritivo
39 Siembra de cajas de Petri con medios diferenciales y selectivos
40 Condiciones de incubación
PRÁCTICA # 5
46 Métodos de cultivo y descripción morfológica de hongos
48 Siembra de hongos
49 Descripción macroscópica de levaduras y mohos
49 Descripción microscópica de levaduras
49 Descripción microscópica de mohos en montaje con cinta adhesiva
PRÁCTICA # 6
54 Pruebas de diferenciación bioquímica
56 Técnica de Inoculación en cajas de Petri
57 Técnicas de Inoculación en tubos
57 Evaluación de actividades metabólicas
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PRÁCTICA # 7
64 Métodos de cuantificación de microorganismos
66 Técnica turbidimétrica
67 Técnica de cuenta directa en cámara de Neubauer
68 Técnica de dilución y siembra en placa
PRÁCTICA # 8
74 Efecto del pH y la temperatura en el crecimiento microbiano
76 Efecto de la Temperatura
77 Efecto del pH
PRÁCTICA # 9
(O
82 Efecto de la actividad de agua en el crecimiento microbiano
a
84 Efecto de la presión osmótica y actividad de agua (aw) en hongos y bacterias
84 Efecto de la desecación
PRÁCTICA # 10
90 Curva de crecimiento bacteriano
92 Inoculación e incubación del cultivo
92 Tratamiento de las muestras
97 BIBLIOGRAFÍA GENERAL
101 Anexo 1
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES Y COLORANTES
105 Anexo 2
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
115 Anexo 3
ATLAS DE PRUEBAS BIOQUÍMICAS
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Aunque durante mucho tiempo estos organismos causaron graves problemas de en-
i
fermedades en plantas, animales y humanos también es cierto que desde la
antigüedad algunas especies microbianas han sido utilizadas en procesos de
producción de alimentos fermentados como quesos, vino, pan y cerveza, entre
II
o
otros y actualmente se ha reconocido su importancia en diversas áreas de inves- •o
tigación básica, en la industria alimentaria, ambiental y farmacéutica.
En cada práctica se presentan los Objetivos y una breve Introducción para facilitar la
comprensión de los mismos, después se indican los Materiales necesarios y
Procedimientos a realizarse en forma de instrucciones numeradas que se com-
plementan con figuras y esquemas.
También se presentan tres Anexos que contienen las indicaciones para la preparación
de soluciones y colorantes (anexo 1) y de medios de cultivo (anexo 2), necesa-
rios para la realización de cada una de las prácticas; así como uno (anexo 3) de
fotografías ilustrativas de algunos procedimientos y pruebas bioquímicas de
diferenciación microbiana.
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Consideramos que este material puede ser de gran ayuda para los profesores y alumnos de la
UAM en el curso de Microbiología General, está elaborado de acuerdo a la infraestructu-
ra de los laboratorios y a la programación trimestral del curso, con sesiones de 4 horas/
semana.
a
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1. Durante las sesiones, siempre deberá usar una bata de laboratorio bien abotonada, que deberá quitarse
antes de abandonar el laboratorio.
3. Evitar la acumulación sobre la mesa de trabajo de objetos no relacionados con la práctica de laboratorio.
Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especificada por el profesor. a
•o
4. Se prohibe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimento o bebida dentro del laboratorio.
5. Se prohibe fumar, aplicarse cosméticos o tocarse la cara con las manos o algún otro objeto. Se deberá lavar
meticulosamente las manos con jabón y agua antes de salir del laboratorio, incluso cuando salga por breves
periodos.
6. Por seguridad no debeiá pipetear oralmente ningún tipo de cultivos microbianos, esta actividad deberá
realizarse con pipetas accionadas de forma mecánica o automática, tratando de evitar la formación de
aerosoles.
7. No se admitirán visitas personales que distraigan la atención y pongan en riesgo la seguridad en el trabajo
que se realiza.
Procedimientos de laboratorio
1. Antes y después de cada sesión piáctica los alumnos deberán limpiar las mesas de trabajo con el desinfec-
tante que se le proporcionará para este fin.
2. Cuando se utilice el mechero, este deberá colocarse alejado del microscopio y otros equipos así como de
sus cuadernos o prendas de vestir.
3. Al concluir cada sesión el estudiante deberá asegurarse de que los materiales de desecho u objetos contami-
nados sean colocados en recipientes específicos para ello, colocados en lugares apropiados, que les indicará
el profesor.
4. Siempre deberá dejar perfectamente limpios todos los equipos utilizados (microscopios, balanzas analíticas,
autoclave, potenciómetros, etc.) y reportar al maestro cualquier irregularidad en el funcionamiento.
5. En caso de producirse un incendio o una herida personal, el alumno deberá notificarlo de inmediato al
profesor. En el caso de derrame de cultivos o rotura de recipientes con cultivos activos, deberá conservar la
calma y además de informar al profesor, seguir inmediatamente el procedimiento:
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c. Dejar transcurrir al menos 15 minutos, retirar las toallas y tirarlas en el receptáculo destinado a la
eliminación de materiales contaminados.
3. Un pedazo de tela sin pelusa, cerillos, tijeras, cinta de enmarcar, marcador indeleble o etiquetas pequeñas.
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Objetivos introducción
Que el alumno conozca los principios Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cam-
generales de las técnicas de estéril!- bios de condiciones ambientales y en la medida en que se han podido
zación de materiales de vidrio y me- adaptar a estos cambios, se han distribuido en una gran diversidad de
dios de cultivo de uso común en Mi- hábitats incluyendo los de condiciones extremas sobre todo de tipo físi-
crobiología. Observará el efecto de co y químico. o
trol de la contaminación microbiana Se han desarrollado y aplicado diversos procesos de desinfección y este-
en el laboratorio. rilización para limitar su presencia o eliminarlos. La esterilización es
un método de eliminación total de todo tipo de organismo y que
asegura la ausencia absoluta de cualquier forma viviente, mientras
que la desinfección es un proceso que solamente elimina formas
vegetativas de los microorganismos.
Los procesos con calor húmedo se aplican para esterilizar medios de cul-
tivo, soluciones, y cultivos bacterianos que se desechan, el más
recomendable es el autoclave en el que se utiliza vapor de agua a
presión para alcanzar temperaturas de 121 °C. El material se deja a
esta temperatura durante 15 minutos para asegurarse de la destruc-
ción de endosporas, que son las estructuras bacterianas más resis-
tentes al calor.
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Materiales
Procedimiento
2. Escurrir el exceso de agua y enjuagar el material con agua destilada con una piceta, por las paredes interio-
res. Dejar escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No debe secar el material por ningún
otro medio.
3. Una vez seco el material, se procederá a envolver las cajas de Petri y pipetas con papel de estraza. Para los
tubos y matraces se elaborarán tapones de algodón y gasa, procurando que ajusten con holgura, sobre los
que finalmente se les colocará un capuchón de papel.
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5. Preparar 120 mL de Agar Nutritivo (AN), calentar la mezcla en una parrilla con agitación constante hasta
ebullición, durante 1 minuto (cuidar que no se proyecte) y vaciar enseguida 5 mL de medio en tres tubos
con tapón de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar que se solidifique el agar. El resto se
esteriliza en el autoclave.
6. Preparar 120 mL de medio de cultivo Papa dextrosa agar (PDA) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, ajustar
el pH del medio a 5.0-5.6. Colocar un magneto de agitación y calentar hasta ebullición durante 1 minuto;
cuidando de que no se proyecte o derrame. Posteriormente vaciar 7 mL de medio en tres tubos que se
taparán con tapón de algodón y gasa. El resto se esteriliza en el autoclave.
7. Preparar 120 mL de medio de cultivo Mínimo de sales (MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 mL
a
I
Esterilización de materiales y medios de cultivo •oo
1. Las cajas de Petri y pipetas envueltas se colocaran en horno a 150 °C durante 2 horas. Después de sacarlas,
dejarlas enfriar y abrir los paquetes únicamente en área aséptica.
2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la autoclave se enfríen a una temperatura
aproximada de 40-50 °C, que coincide con la posibilidad de sostener el matraz en la palma de la mano sin
sentir un calor excesivo.
3. Cerca del mechero, etiquetar 3 cajas con AN, 3 cajas con PDA y 3 con MM. Los medios de cultivo se vacían en las
cajas de Petri (aproximadamente 25-30 mL) en zona aséptica cerca del mechero o en campana de flujo laminar.
4. Dejar que solidifiquen los medios (por lo menos 30 minutos) y posteriormente envolver las cajas cuidado-
samente con papel estraza o acomodarlas en forma invertida en bolsa de plástico limpias.
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manual de prácticas del LABORATORIO PE «ICIlCIBiOLCIGÍJI S E Ü I A L
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1. Colocar los tubos con agar inclinado y las cajas de Petri en forma invertida en una estufa de incubación
ajustada a 30 °C durante 24-48 horas.
2. Revisar los tubos y cajas de Petri para detectar la presencia de contaminantes, por la aparición de turbidez,
nata superficial y/o depósito de material en el fondo de los tubos con medio líquido; así como la formación
de colonias microbianas en la superficie de medios sólidos.
3. Si no hay contaminación de los medios, se abrirá una de las cajas de Petri de cada medio durante 1 minuto
en el laboratorio o zonas accesorias al mismo y se etiquetará como"al aire".
(0
CQ
0
4. La otra caja de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del mechero y se etiquetará "en
área aséptica".
Resultados
A. Hacer la descripción morfológica de las colonias obtenidas en las cajas con diferentes medios de cultivo
(AN, PDA y MM) y con los distintos tratamientos en relación a la caja control.
B. Reportar el crecimiento en forma cualitativa: (-) no hay crecimiento, (+) poco crecimiento, (++) crecimiento
regular y (+++) crecimiento abundante.
C. Discuta los resultados y determine si la esterilización en el autoclave y horno fue adecuada, así como el
manejo de los materiales.
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Cuadro 1
a
AGAR t
NUTRITIVO A
a
«
MÍNIMO
DE SALES
PAPA DEXTROSA
AGAR
Cuestionario
1) ¿Cuáles son los métodos de esterilización más utilizados en Microbiología? ¿En que tipo de materiales se
aplica cada uno?
2) Explique cuáles son las diferencias entre los procesos de esterilización, desinfección y asepsia. ¿Cómo se
relacionan estos procedimientos con la pasteurización?
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manual de prácticas del
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•
o
o
Preparación, fijación y
coloración simple de frotis
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Objetivos Introducción
Que el alumno aprenda las técnicas Debido al pequeño tamaño de la mayoría de los microorganismos, se
de preparación de frotis, de fijación requiere de un microscopio óptico, ya sea de campo claro o de campo
y coloración más utilizadas en el es- oscuro para hacer la descripción morfológica de éstos. El microscopio de
tudio microscópico de cultivos uso más común es el de campo claro, en el que la observación de células o
•o
bacterianos, obtenidos de medios vivas es limitada debido a que las células son incoloras y permiten el paso o
sólidos y líquidos. Que identifique las de una gran cantidad de luz.
principales formas bacterianas y la
importancia de las tinciones simples
en la caracterización morfológica de
La observación de frotis teñidos es más recomendable. El frotis se prepara
haciendo una extensión de los microorganismos sobre una superfi-
a
I
estos microorganismos. cie transparente, en la cuál se fijan y tiñen los microorganismos. o
•o
De acuerdo al número de soluciones colorantes y a los objetivos de
estudio se pueden realizar diferentes tipos de tinciones como son:
simple, diferencial, negativa y selectiva.
Los frotis de cultivos líquidos se deberán fijar con alcohol para evitar resi-
duos del medio, que al quemarse darán interferencias en las obser-
vaciones y los de colonias de medios sólidos se fijan generalmente
con calor. Después de la fijación, los frotis son teñidos con diferen-
tes colorantes sintéticos derivados de anilina.
Los colorantes más utilizados son sales formadas por iones coloridos car-
gados conocidos como cromóforos. Por ejemplo:
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Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 mechero
1 asa de siembra
5 Portaobjetos
Piceta con agua destilada
Microscopio compuesto de campo claro
Azul de metileno alcalino (Anexo 1.2)
Alcohol etílico al 70% (Anexo 1.7)
(0
Fenol al 2% (Anexo 1.9)
CQ Aceite de inmersión
o
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichla col¡, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtilis, Klebsi'ella sp. y Pseudomonas fluorescens. El estudiante preparará frotis de
cada cepa obtenida de cultivo sólido y otros de cultivo líquido, los cuales fijará y teñirá con azul de metileno.
El profesor explicará los principios de manejo del microscopio y la forma de ajustar la iluminación.
Preparación de frotis
1. Lavar perfectamente los portaobjetos, secarlos con papel y etiquetarlos (Figura 1).
2. Prender el mechero y esterilizar el asa en la flama del mechero hasta que se ponga al rojo vivo.
3. Dejar enfriar el asa para evitar que al tomar la muestra los microorganismos sean destruidos. Después
acercar al mechero el tubo de cultivo, quitarle el tapón y flamear rápidamente la boca del mismo. Introducir
el asa en el tubo de cultivo y tomar cuidadosamente la muestra.
4. Para el caso de cultivos líquidos, colocar la muestra en el centro del portaobjetos, extenderla suavemente en
un área circular de 2 cm. de diámetro aproximadamente y esterilizar nuevamente el asa. Dejar secar el frotis
al aire y repetir los procedimientos 3 y 4 por 2-3 veces más.
5. Si el cultivo es de medio sólido, previamente se colocará en el centro del portaobjetos una gota de agua
destilada en la que se mezcla una pequeña muestra del cultivo que se toma siguiendo las indicaciones del
paso 3. Extenderla suavemente y dejar secar al aire.
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2. Los frotis de cultivos sólidos, completamente secos se fijarán con calor. Para esto se pasaiá el frotis rápida-
mente 2-3 veces en el interior de la parte amarilla de la flama del mechero.
3. Palpar la parte inferior del portaobjetos con el dorso de la mano izquierda para enfriar y comprobar que no
hubo sobrecalentamiento.
Tinción simple
|
i
1. Cubrir el frotis con 2 gotas de azul de metileno durante 30 segundos a 1 minuto.
2. Eliminar el exceso de colorante con lavado suave al agua corriente o con la ayuda de la piceta con agua
a
destilada. o
•o
3. Dejar secaral aire
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Observación al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Ajustar el haz de luz en el centro del campo de observación, siguiendo las indicaciones del profesor.
3. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para la observación con el objetivo de 100X, colocar previamente una pequeña gota
de aceite de inmersión sobre la preparación.
4. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de
aceite y evitar incrustaciones que dañan estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de forma, agrupación y tamaño relativo de cada uno de los microorganismos en
el cuadro de resultados.
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Cuadro 2
Observaciones microscópicas de frotis de cultivos bacterianos
Cultivo: Líquido
0)
(0
Aumento total: t(0
a
Aumento total:
Cuestionario
1. Investigue cuáles son las estruauras celulares o moléculas responsables de la tinción simple realizada. De
ejemplos de otros colorantes que podrían utilizarse.
2. ¿Por qué se recomienda fijar los frotis de cultivos líquidos con alcohol y no con calor? ¿Por qué se deben
poner varias veces muestras del cultivo líquido y sólo una muestra de cultivos sólidos al preparar los frotis?
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manual de prácticas del
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3. ¿Cuáles son las principales precauciones de manejo del microscopio y por qué se debe utilizar el aceite de
inmersión al hacer el estudio microscópico de bacterias?
a
o
6. Bibliografía consultada
Referencias bibliográficas
• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Practicas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
• Practical Handbookof Microbiology. William MO'Leary, Cornell Medical College, New York, New York, USA.
CRC Press, 1989.
• Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
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Objetivos introducción
Que el estudiante clasifique algunas La tinción propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una
especies bacterianas en Gram positi- de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifi-
vas o Gram negativas de acuerdo a la ca los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y
tinción de Gram. Que observe estruc- Gram negativas. El método se fundamenta en el hecho de que el coloran-
turas bacterianas especiales, como las te primario (cristal violeta) tiñe por igual a todas las bacterias, pero la
endosporas y cápsulas con tinciones combinación con el colorante es más permanente en los gram positivos.
selectivas. Que comprenda la impor-
tancia que tienen estas tinciones para Para establecer la diferenciación en estos dos grupos, se aplica un disol-
la caracterización e identificación de vente del colorante primario que no tiene efecto sobre el grupo de
las bacterias. microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de
aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto
completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy di-
fícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorante
llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica
el color de los microorganismos que habían retenido el color prima-
rio, pero tiñe a los microorganismos decolorados.
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Materiales
1 Probeta de 100 mL
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 Parrilla de calentamiento
1 Mechero
5 Portaobjetos
1 Piceta con agua destilada
Cristal violeta (Anexo 1.3)
Safranina (Anexo 1.8)
Lugol (Anexo 1.5)
Solución de alcohol-acetona (Anexo 1.6)
en Verde de malaquita (Anexo 1.4)
Tinta china
Fenol 2% (Anexo 1.9)
Aceite de inmersión
Microscopio compuesto de campo claro
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos cultivos líquidos y sólidos de: Escherichia coll, Streptococcus sp.,
Staphylococcus sp., Badllus subtills y Klebsiella sp.
El estudiante preparará frotis de cultivo sólido y de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicará la tinción
de Gram.
También realizará la tinción seieaiva de endosporas en un frotis fijado al calor de Badllus subtilis y la tinción
negativa en cultivos de K/ebsfef/a sp.
b) Lavar cuidadosamente el frotis con agua de la llave o destilada para eliminar el exceso de colorante
c) Sacudir un poco y sin dejar secar cubrir el frotis con 2 gotas de lugol por 30 segundos.
e) Inclinar el portaobjetos y aplicar gota a gota el decolorante dejando que escurra hasta que no fluya más
tintura.
h) Lavar nuevamente con agua, eliminar cuidadosamente el exceso de agua con una toalla de papel y dejar
secar al aire.
i
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a) Colocar un pequeño trozo de papel filtro sobre el frotis de Bacillus subtilk (Figura 2).
b) Agregar verde de malaquita sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.
d) Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más sí es necesario) y eliminar
el colorante con agua destilada.
t
e) Cubrir con safranina durante 30 segundos.
a
"O
(a) (b)
(e)
b) Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo de
45° sobre la muestra.
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c) Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.
(a)
10
a
o
(d)
Observaciones al microscopio
1. Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.
2. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posterior-
mente pasar al de 40X. Para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de
aceite de inmersión sobre la preparación.
3. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso
de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistemas.
Resultados
A. Reportar las observaciones de forma, agrupación, color y tamaño relativo tal como se indica en el Cuadro 3
de resultados. Hacer los dibujos de la morfología de cada uno de los microorganismos y colorearlos.
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Cuadro 3
Descripción microscópica de cultivos baaerianos
Aumento total:
Aumento total:
Cuestionario
1. Explique en forma completa la teoría que explica la tinción de Gram. Investigue otros dos ejemplos de
tinción diferencial.
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3. ¿Explique que reacción de Gram darán los cultivos de levaduras? ¿Estos resultados tendrán la misma impor-
tancia que para las bacterias? ¿Por qué?
4. Explique el fundamento de la tinción de endosporas. ¿Por qué se debe calentar la preparación? ¿Que dificul-
tades se tendrían si no se adiciona la safranina al final de la tinción?
6. Bibliografía consultada
Referencias bibliográficas
• Johnson T.R. and C L. Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. EEUUA.
• Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 2001.
• Practical Hahdt^ic of Microbiology. William M O'Leary, Cornell Medical College, New York, New York,
USA. CRC Press, 1989.
• Holt, J. G., N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriology. 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
j
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^ í - w'íV
Métodos de cultivo y
aislamiento de bacterias
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Objetivos Introducción
Que el alumno conozca las diferen- Las bacterias deben ser cultivadas en medios de cultivo de laboratorio
tes técnicas de aislamiento en me- para caracterizar su crecimiento, hacer su identificación y determinar sus
dios de cultivo sólido para la obten- actividades metabólicas. Un medio de cultivo es una solución acuosa de
ción de cultivos puros de bacterias, diferentes compuestos que contiene todos los elementos indispensables
Que el estudiante prepare medios de que requieren los microorganismos para crecer, •o
i
cultivo de uso general, diferenciales
y selectivos para el cultivo de dife- Generalmente las bacterias son inoculadas o introducidas en medios líquidos
rentes especies bacterianas. (caldos) o solidificados con agar para su propagación y/o conserva-
ción, así como para estudiar sus características de crecimiento. Es im-
portante recordar que la inoculación de los microorganismos en los
medios de cultivo, siempre debelan realizarse en zona aséptica (cerca
i
del mechero o en campana de flujo laminar), condiciones que limitan 8.
•o
la presencia de microorganismos indeseables o contaminantes.
Materiales
3 cajas de Petri con Agar nutritivo (Anexo 2.2)
2 cajas de Petri con Agar de eosina azul de metileno EMB
(Anexo 2.3)
2 cajas de Petri con Agar para Estafilococos 110 (Anexo
2.5)
2 cajas de Petri con Medio Mínimo de sales (Anexo 2.3)
1 tubo con agua destilada estéril
2 tubos con Caldo Nutritivo (Ver Anexo 2.1)
4 tubos con Agar Nutritivo (Ver Anexo 2.2)
1 Mechero
tú 1 Asa d e inoculación
0
1 Parrilla d e agitación
1 Autoclave
Procedimiento
También les proporcionará una muestra problema por equipo (con dos microorganismos diferentes) en la que
practicarán la técnica de aislamiento por estría cruzada.
a) En la parte posterior y exterior de la caja, dividirla en cuatro cuadrantes. Tomar una muestra con el asa
previamente flameada y fría, inocular la muestra haciendo 4-5 estrías simples muy juntas de lado a lado
sobre el primer cuadrante de la caja, cerrar la caja (Figura 4).
b) Flamear el asa de inoculación y hacer girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la caja y
enfriar el asa de siembra tocando la superficie del medio lejos de la zona de estrías recién hechas.
c) Rozar con el asa una vez la superficie del conjunto original de estrías y hacer un segundo grupo de estrías
en el segundo cuadrante como en el caso anterior.
2. Sembrar con el asa extendida los mismos cultivos puros en otros dos tubos con agar nutritivo solidificado en
forma recta (Figura 5).
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•o
o
Icu
a
0)
(a)
(b)
Figura 5. Siembra de medios con agar por estría simple (a) en tubos inclinados y por picadura
(b) en tubos solidificados en forma recta.
1. Dividir en tres partes, una caja de Petri con EMB Agar, otra con Agar 110 y una de MM. Sembrar en cada parte
un cultivo puro diferente por estría simple.
2. En otra serie de tres cajas con cada uno de los medios antes descritos, sembrar por estría cruzada la muestra
problema.
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Condiciones de incubación
1. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24 horas. De las cajas inoculadas por estría cruzada,
seleccionar la colonia más aislada (generalmente del cuarto cuadrante). Transferir una pequeña muestra de
esta colonia a tubos inclinados con agar nutritivo.
2. Incubar los tubos a 35°C durante 24-48 horas. Observar la aparición de colonias y reportar la forma en que
se distribuyen a lo largo del tubo.
Resultados
A. Recopilar la información de la caracterización colonial de cada cepa en los cuadros 4 y 5.
ce
0
B. De acuerdo a sus observaciones identifique las especies presentes en la muestra problema.
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Cuadro 4
Morfología colonial de cultivos bacterianos
(íj
selectivos y diferenciales:
Microorganismo 1:
Forma:
Color:
Tamaño (mm):
Elevación:
Luz transmitida:
Luz reflejada:
Consistencia:
41
manual de prácticas del
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Cuadro 5
Descripción morfológica de cultivos puros en tubos de cultivo
Tubos inclinados de w \y w w
Agar Nutritivo
Crecimiento: arborescente,
filiforme, rizoide, disperso,
puntiforme
Color:
ultivo en tubo de
Caldo Nutritivo
Crecimiento: superficie
como película, como sedi-
mento, turbidez en todo
el tubo
Color:
r~\
Tubos rectos de
Agar Nutritivo
Crecimiento: en forma de
película superficial, a lo
largo de la picadura,
solo en el fondo
Color:
i-
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Cuestionario
O
1. ¿Que es el agar y de donde se obtiene? ¿Cuáles son los nutrimentos que proporciona a los microorganismos?
|
o
II
2. ¿Cuál es la composición química de los medios EMB, 110 y MM? ¿Cuáles son los componentes o propiedades
responsables de su función como medios selectivos o diferencíales?
3. ¿Porque el agar nutritivo es un medio de uso general para el cultivo de bacterias? Proponga algunas sustan-
cias que se le agregarían para hacerlo selectivo para bacterias Gram negativas?
4. ¿Cuál es la información que se obtiene de las siembras de cultivos barterianos en tubos con agar inclinado
y en tubos con agar solidificado en forma recta?
5. Bibliografía consultada
Referencias bibliográficas
• Wistreich, G.A. y M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition). Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 200.
• Practical Handbook of Microbiólogo CRC Press, 1989. William M O'Leary, Cornell Medical College, New
York, New York, USA.
• Bergey's Manual of Determinative Barteriology. 9th edition, The Williams and Wiikins Co., Baltimore, USA.
• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. (1991).
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Métodos de cultivo y
descripción morfológica de hongos
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Objetivos introducción
Que el alumno aprenda las técnicas Los hongos son organismos eucarióticos y de mayor tamaño que las bac-
de cultivo y manipulación de diferen- terias, se distinguen de otros eucariotes como los animales por ser inmó-
tes tipos de hongos. Que el estudian- viles y de las algas y plantas por carecer de pigmentos fotosintéticos.
te conozca las principales caracterís-
ticas morfológicas (macroscópica y Son de nutrición heterótrofa, es decir dependen de nutrientes orgánicos
microscópicas) de los hongos. que son solubilizados por sistemas enzimáticos específicos y son 5
absorbidos a través de su pared celular y membrana plasmática.
Estos organismos pueden ser unicelulares (levaduras) o multice-
lulares (filamentosos), sin embargo, también existen hongos (0
dimórficos principalmente patógenos que se presentan en las dos £
formas alternativamente, dependiendo de condiciones ambienta- o
a
les como la temperatura. "O
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manual de prácticas del
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Desde la antigüedad, estos microorganismos se han utilizado en procesos de producción de diferentes alimentos
como: vino, cerveza, pan y queso entre otros. También se ha reportado que en la naturaleza hay diversas
especies que funcionan como importantes agentes de control biológico de insectos (bioinsecticidas) y que
pueden mejorar la nutrición y permanencia de la mayoría de las plantas (micorrizas).
Materiales
4 Cajas de Petri con 25 mL de PDA (Anexo 2.6 )
4 Cajas de Petri con 25 mL de medio Czapek-Dox (Anexo
2.8)
3 Tubos de cultivo inclinados con 7 mL de PDA
2 matraces Erlenmeyer de 250 mL
m 1 Probeta de 100 mL
0
1 Vaso de precipitados de 100 mL
1 Mechero Fisher
5 Portaobjetos y cubreobjetos
1 Aguja de disección
1 Asa de siembra
Cinta adhesiva transparente
Microscopio óptico de campo claro
Aceite de inmersión
Autoclave
Incubadora a 30 °C
Azul de lactofenol (Anexo 1.1 )
Procedimiento
El profesor proporcionará a los alumnos tubos de cultivo con Aspergillus niger, PenicHHum chrysogenum, Rhizopus
oliQosporus, Trlchoderma viridey de la levadura Saccharomycescerevislae.
El estudiante inoculará cada una de las cepas en cajas de Petri con dos medios de cultivo: a) Czapek-Dox Agar, a
base de sales minerales y sacarosa y b) Papa Dextrosa Agar, que es un medio complejo.
Hará la descripción macroscópica de cada especie en los dos medios de cultivo y la observación microscópica la
realizará aplicando la técnica de cinta Scotch con azul de lactofenol.
Siembra de hongos
1. Para sembrar los hongos filamentosos, se deberá separar una parte de micelio de los tubos de cultivo con
aguja de disección, previamente calentada en la flama del mechero y enfriada.
2. Colocar el micelio en el centro de una caja de Petri con PDA y de la misma manera inocular la caja con medio
de Czapek-Dox.
3. Las levaduras se inocularán por estría cruzada sobre la superficie de las cajas, en forma similar a la inocula-
ción de bacterias.
4. Colocar las cajas envueltas en papel o en bolsa de plástico en forma invertida dentro de una incubadora a
28-30 °C durante 3-5 días.
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1. Hacer la descripción de la forma, tamaño, aspecto, textura y color de las colonias de Saccharomyces cerevisiae.
2. En los cultivos de mohos describir la forma, tamaño y el tipo de colonia, así como las características del
micelio (algodonoso, aterciopelado, velloso, aéreo o pegado al medio) el color del micelio, el color de
esporas, cambios en el medio de cultivo, etc.
1. Se corta una tira de 4-5 cm de cinta adhesiva transparente tomándola únicamente por los extremos.
2. Cerca del mechero se abre la caja y se presiona ligeramente la cinta transparente sobre la periferia de la
colonia.
3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre una gota de azul de lactofenol, previamente colocada en el
centro de un portaobjetos. La cinta funcionará como cubreobjetos por lo que se deberá aplanar lo mejor
posible, evitando la formación de burbujas y sin alterar demasiado las estructuras.
4. Dejar reposar durante 3-5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio con los objetivos de 10X y
40X.
5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidióforos, conidias, esporangióforos,
esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan septos o no.
Resultados
A. Reportar sus observaciones en el Cuadro 6. Hacer los dibujos de las observaciones morfológicas de cada
uno de los microorganismos y colorearlos.
49
:
m a n u a l d e p r á c t i c a s del : -. ,-*: v i . ' > : ; -*Z M ^ ; ; • * * ? ; ; < ; * : y ^ v . ; » , ? --,v.::'-í"<t f *
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conidias
conidias
conidióforo
10 ^m 10 \im
10 \im
Aspergillus flavus
(O
m
o
porangiosporas
Aspergillus niger esporangióforo
conidióforos
100
25 Jim
conidias O
•
10 Rhizopus oligosporus
Penicillium roqueforti
® Saccharomyces cerevisiae
conidióforos
conidias
conidióforos
conidias
OOOOooo
10 ¿un oooooo
OOOOOO
10
Trichoderma viride
Penicillium chrysogenum
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Cuadro 6
Descripción morfológica de hongos
liliillilltllillliilllliiilliilliii •o
Descripción macroscópica o
en PDA
;olor y tamaño:
Aspecto:
i
Textura:
Descripción microscópica:
Aumento total:
Aumento total:
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Cuestionario
1. ¿Cuáles son las principales estructuras caraaerísticas de levaduras y mohos?
4. Describir brevemente tres problemáticas concretas para el hombre causadas por hongos y tres ejemplos de
utilización benéfica.
5. Bibliografía consultada
Referencias bibliográficas
• Hudson B.T. and L Sherwood. 1997. Explorations in Microbiology. Prentice-Hall, New Jersey. USA.
• Herrera, T., Ulloa, M. 1990. El Reino de los Hongos. Micología Básica y Aplicada. Fondo de Cultura Económi-
ca, UNAM. México.
• Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
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Objetivos introducción
Que el alumno realice algunas prue- El metabolismo, es toda la serie de reacciones que ocurren en los
bas bioquímicas en medios de cultivo seres vivos. Éstas reacciones incluyen procesos de obtención de ener-
con sustratos específicos que permiti- gía como son: la descomposición de moléculas orgánicas en los
rán demostrar actividades metabólicas quimiótrofos (catabolismo) o la captación de luz para el caso de los
de bacterias y levaduras. Que el estu- fotótrofos, así como de síntesis de material celular a partir de nutrientes
diante comprenda la importancia de las escenciales (anabolismo). Todas las reacciones metabólicas, son
pruebas bioquímicas para la caracteri- catalizados por enzimas que en su mayoría funcionan dentro de la
zación e identificación de estos célula por lo que se conocen como endoenzimas, hay también
microorganismos. exoenzimas principalmente hidrolíticas que son liberadas por la célu-
la para catalizar reacciones fuera de ésta.
t
(0
a
En el laboratorio, es posible conocer las características metabólicas de los
•o
microorganismos, inoculándolos en diferentes medios de cultivo, con
sustratos que pueden utilizar como fuente de energía, fuente de car-
bono y de otros nutrientes escenciales para su crecimiento.
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Materiales
1 Gradilla
1 Parrilla de agitación
1 Probeta de 100 mL.
3 Matraces Erlenmeyer de 250 mL
3 Vasos de precipitados de 250 mL.
1 Mechero
1 Asa de siembra
2 cajas con agar almidón (AA) (Anexo 2.13 )
2 tubos con campana de Durham y 5 mL de cada uno de
fl los siguientes medios: glucosa-rojo de fenol lactosa-rojo
0
de fenol, sacarosa-rojo de fenol y manitol-rojo de fenol
(Anexo 2.9 ).
2 tubos con 7 mL de medio SIM (Sulfuro, Indol, Motilidad)
(Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de medio TSI (triple azúcar hierro)
solidificados en forma inclinada (Anexo 2.15)
2 tubos con 7 mL medio de citrato de Simmons solidificados
en forma inclinada (Anexo 2.10 )
2 tubos con 7 mL de caldo urea (Anexo 2.11)
2 tubos con 7 mL de leche tornasolada (Anexo 2.14)
2 tubos con 7 mL de agar gelatina solidificados en forma
recta (Anexo 2.15 )
2 tubos con 7 mL de agar nutritivo blando solidificados en
forma recta (Anexo 2.17 ).
Peróxido de hidrógeno 30 %
ácido tricloroacético al 5% (Anexo 1).
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos puros de Bacillussubtllis, Escherichia col!, Pseudomonas fluorescens, Klebslella
sp. y Saccharomyces cerevislae. A cada uno de los equipos, les corresponderá también un cultivo problema.
Todos los tubos y cajas deberán etiquetarse e inocularse de acuerdo a las siguientes instrucciones.
1. Dividir en tres secciones por la parte de atrás las cajas con agar-almidón.
2. En una de las cajas inocular por estría simple tres cepas diferentes.
3. En la segunda caja inocular en dos secciones la muestra problema y dejar una sección sin inocular.
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2. Los tubos con agar TSI se inocularán por estría simple en la superficie y por picadura hasta el fondo del tubo
(Figura 5).
3. Los tubos con gelatina nutritiva y agar nutritivo blando se inocularán por picadura (con el asa recta)
2. En un portaobjetos hacer una suspensión en una gota de agua de las colonias obtenidas en cajas de agar-
almidón y agregar unas gotas de peróxido de hidrógeno al 30%. Observar la formación de burbujas que
significan una prueba de catalasa (+).
3. Todas las pruebas en tubo deberán interpretarse en comparación con tubos control, que contienen los
mismos medios de cultivo pero sin inocular
4. En los tubos de agar gelatina, observar la licuefacción del medio y agregar unas gotas de solución de TCA
(ácido tricloroacético) al 5%, observar la aparición de zonas claras o nubosidad en el medio.
5. En los tubos con medios de glucosa, lactosa, sacarosa y manitol rojo de fenol, hacer observaciones a las 24
y 48 horas de incubación. Determinar si hay crecimiento, cambios en el color del indicador y producción de
gas en la campana de Durham
Resultados
A. Reportar los resultados en el Cuadro 7. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-), crece un
poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++). Actividad sobre sustratos (+) o negativa (-)
B. Investigar los resultados bibliográficos de cada una de las cepas y compararlos con los obtenidos en la
práctica
C. Investigar las reacciones enzimáticas y de color realizadas para la evaluación de actividades metabólicas
57
Cuadro 7
Resultados de pruebas de diferenciación bioquímica
Agar Almidón
Crecimiento:
Color del medio con el
ugol:
Hidrólisis de almidón:
Prueba de catalasa:
Aparición de burbujas al
agregar peróxido de
hidrógeno:
Reacción de catalasa:
Gelatina Nutritiva:
Crecimiento:
Licuefacción del medio:
Formación de nubosidad
al agregar TCA al 5%:
Hidrólisis de gelatina:
Agar Nutritivo Blando: r\
Crecimiento: superficial,
en la parte media,
en el fondo:
Crecimiento en la picadura
Movilidad:
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Gluc
1011011
Lac Sac Man
Gluc Lac Sac Man Gluc Lac Sac Man
a
Crecimiento:
Color del medio:
Ácido:
Gas:
Leche tornasolada
(Litmus Milk)
ÁddO:
Álcali:
Sin cambio:
Reducción:
Peptonización:
Coagulación:
Gas:
Caldo Urea
Crecimiento:
Color:
Hidrólisis de urea:
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Medio TSI
€
«i
í
í
Crecimiento:
m Cambio de color:
o Producción de H2s:
Producción de gas:
Fermentación del azúcar:
Medio de citrato de r\
Simmons
Crecimiento:
Cambio de color:
Utilización de citrato:
Cuestionario
1. ¿Cuáles son las rutas bioquímicas de obtención de energía de las bacterias respiradoras aerobias, las de
respiración anaerobia, las fermentadoras, y las anaerobias estrictas?.¿Cuál de éstas es más eficiente?
¿Porque?
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2. Describa brevemente las actividades enzimáticas que se identificaron en cada uno de los medios de cultivo
utilizados en la práctica. ¿Cuál es la reacción bioquímica que cataliza cada una? ¿Cuáles son exoenzimas y
cuáles son endoenzimas?
!
0)
t
ti
a
o>
•o
3. ¿Explique por qué los tubos de fermentación de azúcares deben evaluarse a las 24 y 48 horas? ¿Qué resul-
tados se observarían en los tubos en el caso de que un microorganismo metabolizara oxidativamente la
glucosa?
4. ¿Explique por qué se busca la presencia de precipitados de sulfuros en el fondo del tubo de TSI y no en la
superficie?
5. Bibliografía consultada
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Referencias bibliográficas
• McFaddin, J.F., J Mac Faddin. 2000. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 3rd ed.,
Lippicont, Williams & Wilkins.
• Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (4th Edition) Edited by Francés
Pouch Downes and Keith Ito, 2001
• Practical Handbook of Microbiology. William O'Leary. Cornell Medical College, New York, USA. CRC Press,
1989.
• Bergey's Manual of Determinative Bacteriólogo 9th edition, The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
• Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Associated (APHA),
American Water Eorks Association (AWWA). Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater.
Ed. (1991).
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Métodos de cuantificación
de microorganismos
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introducción
objetivos
Existen diferentes métodos para cuantificar el número o peso (biomasa)
Que el alumno conozca algunas de de células microbianas en un cultivo; los métodos pueden ser directos e
las técnicas de cuantificación direc- indirectos. Entre los directos se pueden mencionar a la determinación de
ta e indirecta de microorganismos peso seco y el recuento de células en cámara de Neubauer.
más utilizadas. Que compare las ven-
tajas y desventajas de cada una en La determinación de peso seco es un método de cuantificación muy utili-
función de la información que se ob- zado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y leva-
tiene, del tiempo invertido y de los duras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtración,
recursos necesarios. lavado, secado) se pueden causar pérdidas importantes de biomasa
y errores en la cuantificación.
a
El método de cuenta direaa en cámara tiene la ventaja de ser muy rápido y •o
económico, aun que no se pueden distinguir las células viables y no
viables. Se puede calcular el número de microorganismos en una mues-
tra a partir del volumen de la cámara y de las diluciones de la muestra
que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la
observación y cuantificación se dificultan en células muy pequeñas (1-
5/¿m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeño volumen
de muestra que se utiliza (0.1-0.2 mm3).
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Materiales
Procedimiento
El profesor proporcionará un cultivo de Saccharomyces cerevisiae y Escherichla colL
El alumno medirá la turbidez de los cultivos en un espectrofotómetro (Spectronic 20); cuantificarán el número de
células totales, por cuenta direaa en cámara de Neubauer y determinará el número de unidades formadoras
de colonias (UFO por dilución y siembra en placa.
Técnica turbidimétrica
3. Calibrar el instrumento a 0% de transmitancia con el botón izquierdo. Para leer en la escala, observar la
aguja a nivel de los ojos y tomar el dato donde la aguja coincida sobre su reflejo en el espejo.
4. Colocar una celda con medio de cultivo estéril como testigo (sin inocular) y calibrar el instrumento a 100% de
transmitancia.
5. Para medir la turbidez de una muestra, vaciarla en otra celda, limpiar perfectamente con papel suave y
medir el valor de %T.
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1. Se coloca 1 mL de la muestra en un tubo de ensaye. Cuando se trata de cuantificar muestras muy concentra-
das (D.O > 1.5) será necesario preparar diluciones de la misma con solución salina isotónica. Agregar 0.5 mL
de solución de fenol al 2% y dos gotas de safranina. Mezclar y dejar en reposo durante 5-10 minutos.
o
2. Lavar cuidadosamente la cámara de Neubauer sin frotar la zona brillante del centro y el portaobjetos. Secar
con papel suave. Colocar el portaobjetos sobre la zona central limitada por dos excavaciones laterales,
donde se aprecian una zona cuadriculada a simple vista. I
3. Homogeneizar perfectamente la muestra en un vórtex, tomar inmediatamente una muestra con una pipeta 8.
Pasteur de punta fina y depositar una gota entre la cámara y el cubreobjetos por el borde de la cámara. Dejar 4)
que la muestra se distribuya por capilaridad, evitando el exceso que dificultará la evaluación precisa de la
población microbiana.
4. Dejar reposar durante 5 minutos, colocar la cámara en la platina del microscopio y localizar con el objetivo
seco débil (10X) la zona cuadriculada que se muestra en la Figura 7.
5. Localizar el cuadro central grande (C1) que miden 1.0 mm por lado, que se encuentra dividido en 5X5
cuadros pequeños (C2) limitados por triple línea que miden 0.2mm por lado. Estos cuadros pequeños a su
vez se encuentran divididos en 16 cuadros mas pequeños (C3) de 0.05 mm de lado.
6. Hacer la cuantificación de células con el objetivo seco fuerte (40X), contando el número de células que se
localicen en el cuadro C1, los cuadros de menor tamaño C2 sirven de guía para el cómputo. Se empieza a
contar desde la parte superior de los cuadros C2 y se continúa hasta la base. Si las células tocan los límites de
los cuadros C2; deberán contarse solamente aquellas que toquen la parte superior y el lado derecho del
cuadro. Si las células tocan la parte inferior o el lado derecho no se cuentan. Este método reduce las
posibilidades de contar la misma célula dos veces.
7. Cuente hasta cerca de 200 a 250 células antes de determinar el número de células por mL En el proceso de
contar se pueden presentar tres situaciones diferentes que a continuación se explican:
a. Si hay de 200 a 250 células por cuadro grande (C1), multiplicar directamente X 104 para reportar el
número de células por mL.
b- Con menos de 200 células por cuadro grande (C1), será necesario contar algunos de los cuadros de las
esquinas (miden 1x1 mm de lado y divididos en 4X4). De esta manera se cuantificarán más de 200 células.
Después dividir el número total de células entre el número de cuadros empleados y sacar el valor promedio
por cuadro grande. Después multiplicar este valor por X 104 para reportar el número de células por mL.
c. En el caso de que se observen más de 200 células por cuadro grande (C1), se deberán contar las células de
los cuadros de menor tamaño (C2) hasta contar cerca de 200 células. Dividir este valor entre el número de
cuadros usados para la cuenta para sacar el valor promedio por cuadro C2. Multiplicar este valor promedio
por 25 para obtener el número de células aproximado en un cuadro grande (C1) y después multiplicar X104
para reportar el número de células por mL.
67
manual d eprácticas del ' ' - -.*;.:* " < < rr ><-. Í ' ^ ' V . '«/«;«: \ *C --'. -\ '*:. -•'•«' :' **< \.
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8. El factor de 104 por el cuál se debe multiplicar el número de células por cuadro grande (C1) es porque este
cuadrado contiene un volumen de 0.1 mm 3 (mide 1mm por lado y la cámara tiene una profundidad de 0.1
mm).
9. En el caso de que el # de células sea muy grande, la suspensión deberá diluirse y se hará la corrección como
sigue:
(O
CQ 1 mm
ü —
1 mm 1 m
m 1 mnri
0.2 mrri
::::::::i:E2
Cuadro 2 (40X)
Cuadro 1 (10X)
2. Distribuir cuidadosamente el inoculo en toda la caja con ayuda de una varilla de vidrio doblada en "L"
previamente esterilizada a la flama del mechero y enfriada.
4. Incubar las cajas en forma invertida a 35°C durante 24-48 horas para bacterias y levaduras y de 5-7 días para
hongos filamentosos.
5. Hacer la cuenta de las colonias de las placas, seleccionando la dilución donde el número de colonias sea
entre 30 y 300.
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6. Si la inoculación fue por duplicado o triplicado, se calcula el número promedio de colonias por dilución y
este número se multiplicará por el inverso de la dilución XI0 (por ajuste de volumen inoculado) para obte-
ner la número total de unidades formadoras de colonias (UFC)/mL en la muestra original.
1 mL
1 mL
0)
1 mL 1 mL 1 mL 1 mL
£
(6
a
•o
Cultivo bacteriano
10-3 io- 4 io- 5 io- 6 io- 7
O.lmL XO.lmL
Resultados
A. Reportar los resultados de cuantificación de los cultivos, aplicando las técnicas descritas. Indicar los cálcu-
los hechos para cada metodología.
B. Recopilar sus resultados en el Cuadro 8 incluyendo los de los otros equipos, indicando la muestra analizada
por cada equipo. Discutir en cada caso cuáles fueron las ventajas y desventajas de las metodologías de
cuantificación.
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Cuadro 8
Cuantificación de microorganismos por técnicas directas e indirectas
Escherichia colí
(0
a
o Saccharomyces
cerevisiae
Cuestionario
1. Compare el método de dilución en placa con el método de cuenta direaa en cámara de Neubauer para la
cuantificación de microorganismos. ¿En que casos conviene usar cada uno?
2. Explique cuáles son las ventajas y desventajas del método turbidimétrico de cuantificación de células.
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3. Mencione dos aplicaciones concretas en las que se utilicen cada una de las técnicas de cuantificación
realizadas.
1
(0
£
ti
a
•o
5. Bibliografía consultada
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Referencias bibliográficas
Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
• Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición.
Prentice Hall. España.
cú
ü
• Prescott L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
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I " O»
ai*
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Objetivos introducción
Que el estudiante conozca el efecto Los microorganismos están continuamente afectados por su ambiente, ya
del pH y la temperatura como paráme- que éste ejerce una influencia profunda en su desarrollo al igual que
tros de control del crecimiento micro- sobre las demás formas de vida. Los factores del medio se pueden clasi-
biano. Que el alumno comprenda la ficar en tres grupos:
importancia de estos factores físico-
químicos en la selección de pobla- a).- Físicos.- temperatura, presiones externas, humedad.
ciones microbianas en los diferentes 0)
ambientes en que se encuentran y b).- Químicos.- pH, disponibilidad de nutrimentos, presencia de produc-
(6
los mecanismos de adaptación a ni- tos tóxicos. t
vel celular y metabólicos que han ti
a
desarrollado. c).- Biológicos.- las interacciones microbianas entre las especies 0)
"O
coexistentes.
75
manual de prácticas del
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Otros microorganismos se desarrollan en los habitat naturalmente alcalinos como lagos salados y desiertos don-
de los valores de pH 10 son comunes, estos alcalófilos incluyen especies de Rhizoblum, Bacillusy algunas
bacterias entéricas y cianobacterias. En general los hongos son más tolerantes a la acidez que las bacterias.
Cada microorganismo tiene un rango de temperatura y pH en el cual pueden crecer, de tal manera que al
modificarse estos factores se pueden alterar la velocidad de crecimiento y causar la muerte de lo mismos,
por lo que se pueden utilizar como factores de control del crecimiento microbiano.
Materiales
2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar (Anexo
2.6) ajustado a p H 7.0
fió 2 Cajas d e Petri con m e d i o d e Papa Dextrosa Agar ajusta-
0
do a pH 5.0
2 Cajas de Petri con medio de Papa Dextrosa Agar ajusta-
do a pH 9.0
22 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación (Bioxon) ajus-
tado a pH 7.0 sin amortiguar (Anexo 2.19)
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH
5.0 sin amortiguar
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH
9.0 sin amortiguador
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH
7.0 con amortiguador (Anexos 1.1, 2.19)
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH
5.0 con amortiguador
4 Tubos con 7 mL de caldo microinoculación ajustado a pH
9.0 con amortiguador
1 Asa de inoculación
3 pipetas de 1.0 mL. estériles
1 mechero Fisher
Espectrofotómetro
Microscopio estereoscópico
Soluciones amortiguadoras de pH 4, 7 y 10
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos líquidos de: Escheñchia coli, Pseudomonas fluorescensy Lactobacii/ussp., una
suspensión de esporas de Aspergillus nigery Penicillium roqueforti. Cada uno de los tubos y cajas deberán
etiquetarse con el nombre del microorganismo que se inoculará.
Efecto de la Temperatura
1. En tres cajas de Petri con PDA divididas en dos secciones, inocular 0.1 mL. de la suspensión de esporas de
hongos en cada sección.
2. Incubar una caja de Petri a 15°C, otra a 30°C y la última a 45°C en forma invertida durante 72 horas y hacer
las observaciones macroscópicas.
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3. Incubar nuevamente las cajas y realizar observaciones en microscopio estereoscópico después de una semana.
4. En seis tubos de caldo microinoculación ajustado a pH 7.0, inocular dos con cada una de las cepas bacterianas.
5. Incubar dos tubos en estufa a 15°C, otros dos a 30°C y los dos últimos a 45°C durante 24-48 horas. Medir la D.O.
Efecto del pH
1. Preparar tres series de cuatro tubos de caldo de microinoculación ajustados a 3 diferentes valores de pH
(5.0, 7.0 y 9.0) con solución de HC11.0 M o NaOH 1.0 M.
i
2. Preparar otra serie de cuatro tubos ajustados a los mismos valores de pH del punto anterior pero utilizando a
soluciones amortiguadoras tal como se indica en la Tabla del Anexo 1.10. •o
3. Inocular 0.1 ml_. de cada una de las cepas bacterianas en la serie de seis tubos de caldo microinoculación
ajustados a diferentes pH con amortiguador y sin amortiguador, dejando uno sin inocular como testigo.
5. Inocular tres cajas de Petri con medio PDA ajustado a tres pH diferentes con cada una de las cepas de
hongos.
6. Incubar las cajas de Petri a 30 °C durante 72-96 horas y hacer observaciones macroscópicas.
Resultados
A. Reportar los resultados en los cuadros 8, 9 y 10 de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),
crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
B. Comparar sus resultados con los reportados en la bibliografía de cada una de las cepas.
77
m a n u a l d e p r á c t i c a s d e l . v> - v<;\ -: 1 ; ^ > 1 ^ ' ! ' ' S ^ ' n u ' , : ^ ; : < ? ' •'::;.^':,''iv>.
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Cuadro 9
Efecto de la temperatura de cultivo en el crecimiento microbiano
TEMPERATURA
Morfología microscópica
a la semana
a
o
Penidllium roquefortí
Morfología de la colonia
a las 72 horas
Morfología microscópica
a la semana
CALDO .
MICROINOCULACIÓN
Escherlchla col i
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
Pseudomonas
fluorescens
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
A
Lactobadllus sp. r\
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia (D.O.)
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Cuadro 10
Efecto del pH de cultivo en el crecimiento microbiano
Morfología de la colonia
a las 72 horas I
Morfología microscópica
a la semana
Iff
Penidlllum roquefortl
Morfología de la colonia
a las 72 horas
Morfología microscópica
a la semana
Escherichia col!
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbanda(D.O.;
Pseudomonas r\ r\
fíuorescens
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbancia(D.O.)
Lactobadllus sp.
i
Crecimiento a las
24-48 horas
Absorbanda(D.O.)
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Cuestionario
1. ¿Cuáles son las temperaturas cardinales y como se clasifican los microorganismos de acuerdo a su tempera-
tura óptima de crecimiento?
(0
ffl 2. ¿Como influyó el pH en el crecimiento de hongos y baaerias? ¿Que diferencias se observaron en los medios
de cultivo amortiguados y sin amortiguar?
3. Explique brevemente cuáles son los mecanismos celulares que los microorganismos termófilos extremos y
psicrófilos han desarrollado para adaptarse a condiciones extremas de temperatura y pH.
4. Explique cuál es la relación que existe entre condiciones óptimas de crecimiento en el laboratorio y las
condiciones del habitat de origen de las poblaciones microbianas.
5. Bibliografía consultada
Referencias bibliográficas
•Harrigan, W.F. Laboratory Methods in Food Microbiology. 1998. Academic Press. 3a. Edition.
• Jay, J.M.1994. Microbiología Moderna de los Alimentos. Tercera Edición. Editorial Acribia, Zaragoza, España.
• Holt, J. C , N.R. Krieg. P.H.A. Sneath, J.T. Staley and S.T. Williams. 1994. Bergey's Manual of Determinative
Bacteriólogo 9th edition. The Williams and Wilkins Co., Baltimore, USA.
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Objetivos introducción
Que el estudiante conozca las res- El agua líquida es esencial para todos los procesos bioquímicos. Para los
puestas de crecimiento de diferen- microorganismos, un factor crítico es la disponibilidad de agua líquida
tes cultivos microbianos, frente al más que la cantidad total de agua presente en el ambiente. El total de
estrés osmótico causado por la adi- agua realmente disponible para uso microbiano se expresa como la acti-
ción de azúcares, la adición de NaCI vidad de agua (aw).
y la desecación. Que el alumno com-
prenda el efecto de estos factores Los efectos de las altas concentraciones de solutos sobre los microorga-
sobre la actividad de agua y los me- nismos pueden deberse a los solutos mismos o a los efectos del
canismos de adaptación que han de- soluto sobre la aw. Cada vez que se disuelven sustancias en el agua
sarrollado los microorganismos. pura se disminuye la cantidad de agua disponible o agua libre. La
actividad de agua en términos termodinámicos proporciona una
medida de agua libre y es definida por la ecuación
a- Po nt +n2
Donde P- la presión de vapor de la solución y Po es la presión de vapor
del agua pura, n1 y n2 son el número de moles de soluto y solvente
respectivamente. Así, si la concentración de soluto aumenta la aw
disminuye, para agua pura la aw es igual a 1.0.
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Materiales
1 asa de inoculación
1 Espectrofotómetro
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10% de sacarosa (p/v)
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 30% sacarosa
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 60% de sacarosa
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 1 % NaCI (p/v)
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 5 % NaCI
3 Cajas de Petri con Agar nutritivo y 10 % de NaCI
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10% sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 30% sacarosa
S 6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 60% de
sacarosa
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 1 % NaCI
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 5 % NaCI
6 tubos de ensaye con 7 mL de caldo nutritivo y 10 % NaCI
36 tubos de ensayo vacíos y estériles
5 pipetas de 1mL estériles
Procedimiento
El profesor proporcionará cultivos líquidos de bacterias: Bacillus subtilis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus,
Pseuc/omonas sp. y hongos: Saccharomyces rouxii, Aspergillus niger, Penicillium chrysogenum. En series de tres
cajas de Petri y 6 tubos de cada medio se inocularán por equipo tres de los microorganismos.
2. Inocular con 0.1 mL de cultivo de dos de las cepas de bacterias en dos tubos de ensaye con 7mL de cada uno
de los medios.
3. Incubar las cajas en forma invertida a 30°C y los tubos de caldo a 35°C durante 48 horas y hacer las observa-
ciones. Incubar nuevamente y a la semana realizar observaciones de la morfología de los cultivos en cajas y
en tubos medir la turbidez de los cultivos en caldo nutritivo a las 24-48 horas.
Efecto de la desecación
1. En series de seis tubos de ensayo vacíos y estériles, con una pipeta estéril, colocar una gota de una suspen-
sión de cada uno de los siguientes cultivos bacterianos: Bacillus subtilis, Escherichia co/iy en un tercer tubo
una gota de una suspensión de esporas de Aspergillus niger
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6. Repetir la instrucciones de los puntos 3-5, después de dos y tres semanas en los tubos restantes.
Resultados
A. Reportar los resultados en los Cuadros 11-13. de acuerdo al siguiente convenio: no hay crecimiento (-),
crece un poco (+), mayor crecimiento (++), crecimiento abundante (++).
Cuadro 11
Efecto de la presión osmótica y aaividad de agua en el crecimiento de baaerias
0.990) = 0.970) 0.940)
Sacarosa NaC11% Sacarosa Nací 5% Sacarosa
NaCI 10%
CEPA
10% 30% 60%
Staphylococcus sp. A A r\ A
Crecimiento a las
24 horas
Densidad óptica:
Escherichia coli r\ A
Crecimiento a las
24 horas
Densidad óptica:
Baclllus subtílis A r\
Crecimiento a las
24 horas
Densidad óptica:
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Cuadro 12
Efecto de la presión osmótica y actividad de agua en el crecimientos de hongos
Morfología de la colonia
m
o a las 72 horas:
Morfología de la colonia
después de una semana:
AspergíIIus nlger
Morfología de la colonia
a las 72 horas:
Morfología de la colonia
después de una semana:
Penlcllllum
chrysogenum
Morfología de la colonia
a las 72 horas:
Morfología de la colonia
después de una semana:
86
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Cuadro 13
Efeao de la desecación en la recuperación de cepas microbianas de bacterias y hongos
SEMANA 1
.1 > **
! / • • • : i.;. 1
Escheríchla col! r\ /->
<J KJ 0)
I
Crecimiento: superficial, I
depósito:
Absorbanda (D.O.):
Badilus subtilis r\ r\ r\ /^\
<J
\J
Crecimiento: superficial,
depósito:
Absorbanda (D.O.):
AspergíIIus nlger r\ r\ r\ r\ r\
<J
U
Crecimiento: superficial
depósito:
Absorbanda (D.O.):
Cuestionarlo
1. Definir brevemente los términos: osmófilo, halófilo, xerófito.
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2. ¿Cuáles son las hipótesis que tratan de explicar la osmofilia y la halofilia de poblaciones microbianas?
0)
o
5. ¿Como se explica la mayor tolerancia de los hongos a valores de aw reducidos que en bacterias?
6. Bibliografía consultada
Referencias bibliográficas
• Johnson T.R. and C. L Case. 1992. Laboratory Experiments in Microbiology. 3a- Ed. Cummings Publishing
Company, Inc. USA.
• Wistreich, G.A. and M.D. Lechtman. 1983. Prácticas de laboratorio en Microbiología. Ed. Limusa México.
• Madigan M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 1998. Brock Biología de los Microorganismos. Octava Edición.
Prentice Hall. España.
• Prescott, L.M., Harley, J.P., Klein, D.A. 1999. Microbiología. Cuarta Edición. McGraw Hill Interamericana.
México.
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1O
O ^
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ú
Objetivos introducción
Que el estudiante conozca las fases El crecimiento y la viabilidad de los microorganismos está determinada
de una curva de crecimiento en un por factores nutricionales y ambientales, y en condiciones de laboratorio
cultivo en lote de Escherichla colL óptimas, es posible predecir una curva de crecimiento característica de
Que el alumno aprenda a calcular cada especie microbiana.
parámetros cinéticos (/*, td) caracte- •o
rísticos de las especies bacterianas. Cuando una bacteria es inoculada a un medio de cultivo líquido fresco,
experimentará un periodo de adaptación al medio y condiciones
de cultivo y posteriormente se dividirá en forma exponencial, dan-
do lugar a una curva de tipo sigmoidal que se acostumbra dividir ti
en 4 partes: t
es
a
o
•o
o
u B
Oí
tiempo
91
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catabólica de obtención de energía. Así, los microorganismos fermentadores crecerán mas lentamente que
los respiradores.
Materiales
1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL con 100 mL de medio
líquido (Anexo 2.18)
2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL con 99 mL de solución
salina isotónica estéril
6 Pipetas de 10 mL estériles
16 Pipetas de 1 mL estériles
1 Potenciómetro
1 Mechero Fisher
1 Espectrofotómetro y celdas
1 Gradilla
16 Tubos con 9 mi de solución salina isotónica estéril
1 Varilla doblada en "L"
12 Cajas de Petri con Agar Nutritivo (Anexo 2.2)
Procedimiento
El profesor inoculará Escherichia co/fen un matraz Erlenmeyer con medio líquido complejo 12 horas antes de
iniciar la práctica, que se utilizará como inoculo para los cultivos en matraces Erlenmeyer con diferente concen-
tración de glucosa.
Los estudiantes cuantificarán el crecimiento periódicamente durante 6 horas de incubación. Se aplicarán los méto-
dos turbidimétrico y el de diluciones y siembra en placa (práctica* 7) para cuantificar el crecimiento bacteriano.
2. Homogeneizar cuidadosamente agitando el matraz e inmediatamente tomar una muestra de 5 mL con una
pipeta estéril y vaciarla en una celda del espectrofotómetro. Esta muestra corresponderá al tiempo cero
(t=0). De la misma manera se tomarán muestras a las 0.5, 1, 2, 3 y 4 horas. Para el tiempo de 6 horas de
incubación se tomarán 6 mL
92
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2. En la muestra de 6 horas además de evaluar la turbidez, se deberá poner 1 mL del cultivo en un matraz
Erlenmeyer con 99 mL de solución salina isotónica (ssi) estéril. Del matraz con la muestra diluida, hacer una
serie de diluciones en tubos con 9 mL de ssi estéril, hasta 108. Cuidando de homogeneizar las muestras
cada vez que se haga una nueva dilución.
3. Enseguida inocular 0.1 mL de las últimas tres diluciones en dos cajas de Petri con agar nutritivo y distribuir
la muestra con una varilla de vidrio doblada en "L".
4. Dejar que se absorba el líquido en las cajas y posteriormente incubarlas en forma invertida durante 24-48
horas.
055
(5)
(6)
Figura 9. Tratamiento de muestras para medición del crecimiento microbiano y elaboración de una curva de crecimiento.
93
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Resultados
A. Se registran los resultados de cuantificación del crecimiento de Escherichla co/ien el Cuadro 14.
B. El alumno reportará también en forma gráfica la relación entre dos variables, la variable independiente
siempre será el tiempo que se colocará en el eje X, para cada concentración de glucosa
c. Determinar la tasa de crecimiento promedio (k) de la fórmula k=( log N- log No)/ log 2 (t), donde No=# de
UFC al tiempo "0" y N = # de UFC al final del experimento
ü
d. Calcular la tasa de crecimiento especifica ( JU ) de la fórmula fi = In2 (k) con este valor determinar el tiempo
de generación de Escherichia co/í con la relación td= In2/fi
Cuadro 14
Resultados de mediciones del crecimiento de Escherichia coll en un
cultivo por lote con diferentes concentraciones de glucosa
0.5
94
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Cuestionario
1. ¿Cómo se define el crecimiento en Microbiología y cuáles son los eventos a nivel celular que ocurren en
cada una de las etapas de crecimiento?
!
a
2. ¿Qué condiciones ambientales y nutrimentales causarán una disminución o eliminación de la fase lag en la
curva de crecimiento. ¿Que condiciones la incrementaría?
3. ¿Cómo se define el tiempo de duplicación? ¿Cómo se relaciona con la tasa de crecimiento específica
4. Bibliografía consultada
95
manual de prácticas del
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Referencias bibliográficas
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o
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manual de prácticas del / ^ K / f - u v ^ Y ;-: i-;-;:". ' " ;",:' '*
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Preparación de soluciones
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1. Caldo nutritivo (CN). Es un medio líquido complejo de uso general para el cultivo de bacterias
ingredientes <g/L)
Peptona de caseína 5.0
NaCI 8.0
Extracto de carne 3.0
PH 6.5-7.0
2. Agar nutritivo (AN). Es un medio sólido complejo de uso general para el cultivo de bacterias exigentes
ingredientes (g/t)
Peptona de caseína 5.0
NaCI 8.0
Extracto de carne 3.0
Agar 15.0
PH 6.5-7.0
3.Medio Mínimo de Sales (MM). Es un medio químicamente definido de uso general para el cultivo de bacterias
poco exigentes.
107
manual de prácticas del \ - ".": \¿ ¿ ?í Va\O :*T:
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4. Agar de Eosina azul de metileno (EMB-agar). Es un medio de cultivo comercial utilizado para identifica-
ción y diferenciación de enterobacterias.
Ingredientes <g/L)
Peptona de gelatina 10.0
Lactosa 5.0
Sacarosa 5.0
K2HPO4 2.0
Eosina 0.4
Azul de metileno 0.065
Agar 13.5
(0
ca a. Disolver cuidadosamente la cantidad indicada en el frasco.
b. Calentar a ebullición durante 1 minuto
c. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos
d. Distribuir el medio en volúmenes de 25 mL en cajas de Petri en condiciones asépticas.
5. Agar para Estafilococos No. 110. Es un medio selectivo comercial para el aislamiento e identificación de
estafilococos.
ingredientes (g/L)
Extracto de levadura 2.5
Peptona de caseína 10.0
Gelatina 30.0
Lactosa 2.0
D-Manitol 10.0
NaCI 75.0
K2HPO4 5.0
Agar 15.0
pH final 7.0
6. Papa-Dextrosa Agar (PDA). Es un medio sólido complejo comercial de uso general para el cultivo de hongos.
Ingredientes (g/L)
Glucosa 20.0
Extracto de papa 4.0
Agar 15.0
PH 5.6
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7. Papa Dextrosa Agar rosa de bengala Es un medio sólido complejo de uso general para el aislamiento de
hongos
Ingredientes (g/L)
Glucosa 20.0
Extracto de papa 4.0
Rosa de bengala 0.03
Agar 15.0
pH 5.6
8. Czapek-Dox Agar (CDA) Es un medio de sales, de uso general para el cultivo de hongos poco exigentes.
Ingredientes <g/u
Sacarosa 30.0
NaNO3 2.0
KH2PO4 1.0
MaSO4-7H2O 0.5
KCI 0.5
FeSO4-7H2O 0.01
Agar 15.0
PH 5.6
9. Caldo rojo de fenol Es un medio con diferentes azucares (glucosa, sacarosa, manitol) para pruebas de
fermentación
Ingredientes (g/L)
Azúcar 20.0
KH 2 PO 4 9.1
K 2 HPO 4 9.5
Extracto de levadura 0.1
Rojo de fenol 0.01
pH final 6.8-7
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10. Medio citrato de Simmons Agar. Medio complejo de prueba de utilización de citrato en enterobacterias
Ingredientes (g/U
Citrato de Sodio 2.0
K2HPO4 1.0
NH4H2PO4 1.0
MgSCy7H 2 O 0.2
NaCI 5.0
FeSCy 7H2O 0.01
Agar 15.0
Azul de bromotimol 0.08
(0
PH 7.0
CQ
0
a. Disolver cuidadosamente las sustancias
b. Ajustar el pH
c. Calentar a ebullición durante 1 minuto.
d. Distribuir 7 mL en tubos de ensaye con tapón de rosca.
e. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos
f. Dejar solidificar el medio en forma inclinada.
11. Caldo urea. Se emplea para la identificación de bacterias, particularmente para diferenciar los miembros del
género Proteus de Salmonella yShlgella
Ingredientes <g/U
Urea 20.0
KH2PO4 9.1
K2HPO4 9.5
Extracto de levadura 0.1
Rojo de fenol 0.01
pH final 6.8
12. Medio SIM. Medio semisóiido usado rutinariamente en la diferenciación e identificación de cultivos de
Enterobacterias y que detecta la producción de sulfuras, indol y movilidad de las mismas.
Ingredientes (g/L)
Peptona de caseína 20.0
Peptona de carne 6.1
Sulfato de hierro y amonio 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Agar 3.5
pH final 7.3
110
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ingredientes (g/U
Almidón 10.0
Peptona de caseína 5.0
NaCI 8.0
Extracto de carne 3.0
Agar 15.0
pH 6.5-7.0
ti
a. Disolver cuidadosamente las sustancias t
b. Ajustar el pH (8
a
c. Calentar a ebullición durante 1 minuto. o
d. Esterilizar en autoclave a 121 °C durante 15 minutos T3
14. Medio de leche con tornasol. Medio comercial para diferenciar microorganismos sobre la base de sus
múltiples reacciones metabólicas en un medio lácteo
ingredientes (g/L)
Leche descremada deshidratada 100
Polvo de tornasol 0.75
15. Agar de hierro y triple azúcar TSI. Medio comercial para identificar y diferenciar enterobacterias. Se basa
en la formación de sulfuros y fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa.
ingredientes (g/L)
Mezcla de peptonas 20.0
NaCI 5.0
Lactosa 10.0
Sacarosa 10.0
Dextrosa 1.0
Sulfato de amonio férrico 0.2
Tiosulfato de sodio 0.2
Rojo fenol 0.025
Agar 13.0
pH final 7.3
111
manual de prácticas del
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Ingredientes (g/U
Peptona de gelatina 5.0
Extracto de carne de res 3.0
Gelatina 120.0
pH final 6.8
Ingredientes (0/L)
Peptona de caseína 5.0
NaCI 8.0
Extracto de carne 3.0
Agar 3.5
PH 6.5-7.0
18. Medio de cultivo complejo. Para la curva de crecimiento microbiano probando diferentes concentraciones
de sustrato carbonado. (1-20 g/L)
Ingredientes (g/L)
Glucosa 10.0
Peptona de caseína 2.0
Extracto de levadura 0.5
K2HPO4 0.5
PH 6.5
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19. Caldo microinoculación. Medio comercial para cultivar y preparar inóculos de Lactobacilos y otros
microorganismos utilizados en ensayos microbiológicos.
ingredientes <g/U
Extracto de levadura 20.0
Mezcla de peptonas 5.0
Dextrosa 10.0 •o
KH2PO4 2.0 o
Polisorbato 80 0.1
PH 6.5
113
manual de prácticas del *> > ,
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microbiología general,
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