PROTOCOLO PARA LA

IDENTIFICACION DE VIRUS
ZIKA POR RT-PCR

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Versión: 2

Elaborado por: Revisado por: Aprobado por:

Piedad Perilla Paris Carlos Fernando Narvaez Carlos Fernando Narvaez

Fecha: Octubre 2017 Fecha: Octubre 2017 Fecha: Octubre 2017

OBJETIVO.
El objetivo principal de este documento es guiar a todas las personas de la
unidad de molecular en determinar la infección por Virus Zika (ZIKV) a partir de
muestras de sangre (suero) proveniente de humanos o sobrenadantes de
cultivo de células infectadas con ZIKV.

ALCANCE
Este procedimiento está dirigido a todo personal que se encuentre relacionado
con el diagnostico de Virus Zika por RT-PCR.

Autoridad y Responsabilidad.
La autoridad del documento y responsabilidad corresponden a la persona que
realiza la técnica de diagnóstico así como a el coordinador de la unidad de
molecular.

DEFINICIONES.
PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa
RT-PCR PCR por transcripción reversa
cDNA: Es la abreviatura del Ácido Desoxirribonucleico codificante. Constituye
la conversión de RNA cadena sencilla (material genético del Virus Zika en este
caso) a DNA cadena sencilla mediante transcripción reversa. El cual será
posteriormente amplificado y convertido a DNA doble cadena mediante PCR
convencional.

Requerimiento de Recursos.

MUESTRA.
RNA de sangre (suero), preferiblemente mediante columnas de afinidad (por
kit) resuspendido en TE (1x), / (100ug) o en agua Mili Q estéril.

CONTROLES DE CALIDAD.
Control positivo: 2 a 5 µl de RNA de sobrenadante de ZIKA.
Control negativo de la mezcla del PCR: es el que contiene la mezcla de
reacción sin. El RNA (para la transcripción reversa) o ADN (PCR de
serotipificación) se reemplaza por agua destilada.
Opcional: Control negativo: es RNA de la muestra negativa para Zika.

EXTRACCION DE RNA VIRAL QIAGEN

EQUIPOS
Cabina de flujo laminar
Centrifuga
Kit de micropipetas
vortex

MATERIALES
Tubos eppendorf estériles de 1.5 ml
Puntas de 10 μl, 200 μl y 1000 μl
Marcador permanente
Guantes
Bata

REACTIVOS
Kit de QIAGEN
Etanol 99%

PREPARACION DE LOS REACTIVOS

PREPARACION DE CARRIER
Adicionar 310 μl de buffer AVE a los 310 ug del Carrier RNA liofilizado
Alicuotar El Carrier en balitas de 0.2 ml con 39,2 μl (para aislar 5 Mx, C- y C+ 7
en total) y guardar a -20 ºC.
Adicionar etanol absoluto en la cantidad indicada al buffer AW1 y AW2

SOLUCION DE TRABAJO
En tubo de 5 ml:
A 3.92 ml de buffer AVL adicionar 39,2 μl del Carrier

PROCEDIMIENTO
Marcar cada columna y tubo eppendorf de 1.5 ml con su número
En eppendorf de 1.5 ml:
560 μl de AVL + Carrier
Adicionar 140 μl de Mx, C- (suero de paciente sano) y C+ (5 μl mix de
sobrenadante de cultivos virales) según corresponda
Vortex 15 segundos
Dejar a temperatura ambiente 10 minutos
Adicionar 560 μl de etanol 99%
Vortex 15 segundos
Adicionar cuidadosamente 630 μl a la columna correspondiente
Centrifugar 6000 g por 1 minuto
Cambiar de tubo
Adicionar los restantes 630 μl a la columna y
Centrifugar a 6000 g por 1 minuto
Cambiar de tubo
A las columnas adicionar
500 μl de buffer AW1
Centrifugar a 6000 g por 1 minuto
Cambiar de tubo
A la columna
500 μl de buffer AW2
Centrifugar a 20000 g por 3 minutos
Colocar la columna en tubo de eppendorf de 1.5 ml previamente marcado
Adicionar 50 μl de agua estéril a la columna
Dejar a temperatura ambiente por 5 minutos
Centrifugar a 6000 g por 1 minuto
Pasar nuevamente el filtrado por la columna y
Centrifugar a 6000 g por 1 minuto.
El RNA es estable 1 año de-20 a -70ºC

RT-PCR ZIKA

EQUIPOS
Cabina de flujo laminar
termociclador
Serófuga
vortex
kit de micropipetas

MATERIALES
Tubos eppendorf estériles de 600 μl y 200 μl
Puntas de 1000 μl, 200 μl, 10 μl con filtro
Gradilla
Escacha
Bloque enfriador
Marcador permanente
Guantes
Bata

REACTIVOS
Buffer 5x RT
dNTPs (d ATP, d CTP, dGTP, dTTP) a una concentración de 10 mM
Random hexamers 50ng/ml
Oligo dT
MgCl2 25 mM
RNAsin (40u/ μl) Promega
Transcriptasa reversa AMV Promega
DTT
Agua Nucleasas Free

PREPARACION DE dNTPs
Los 4 vienen todos a una concentración de 100mM, si mezclamos partes
iguales de cada uno de ellos quedan a una concentración de 25 mM. Ósea, en
eppendorf de 600 ul adicionar:
100 μl de d ATP 100 mM+100 μl de d CTP 100mM +100 μl de GTP 100mM +
10 μl de dTTP 100 mM = 400 μl de dNTPs 25 mM

Para RT necesitamos dNTPs 10 mM así que tomamos 80 μl de dNTPs 25 mM

y le adicionamos 120 ul de agua nucleasas free.
Alicuoatamos de 50 μl por balita.

PREPARACION DE PRIMERS Y SONDAS

Secuencias 5’-3’
RT-PCR
ZK_Env_1156-1179_FAATATCAGACATGGCTTCGGACAG
ZK_Env_1689-1712_R CATGTGCGTCCTTGAACTCTACCA
Hay 10000 pmoles en cada vial. Adicionar 100 µl de agua depec esteril para
que queden a una concentracion de 100 pmol/µl
Para preparar la solucion de trabajo tomo 10 µl de l vial y adiciono 90 µl de
agua depec esteril.
Las sondas estan a 6000 picomoles en 60 µl (100 picomoles/µl)
Para preparar la solucion de trabajo tomo 5µl de l vial y le adiciono 95 µl de
agua depec esteril.

PREPARACION DE MIX

EN EL CUARTO BLANCO
Preparar los mix de acuerdo con la cantidad de controles y muestras que se
vayan a tipificar.

Stock de Concentración Volumen para

Reactivo
trabajo final (1X) 1 rxn-µl
5xQiagen OneStep RT-PCR Buffer
5x a. 1x 5
dNTP´s (A,C,T,G) 10 mM 400μM 1
Primer RT- PCR ZIKV1 10 μM 0.4 μM 1
Primer RT- PCR ZIKV2 10 μM 0.4 μM 1
5X Q-solution 5x 1x 5
Enzima - Qiagen OneStep RT-PCR 25x 1 1
Agua destilada - - 6
Muestra (RNA) - 1pg a 2µg 5

Volumen final (sug 20) 25 µl

Adicionar el RNA de las muestras que se quieren evaluar en los tubos que
contienen la mezcla de rxn en una zona libre de ampliaciones.
Precalentar termociclador a 50°C. Colocar los tubos en el termociclador y
comenzar la reacción.

PROGRAMA DEL TERMOCICLADOR: (ZIKV)

Transcripción reversa 50°C – 30min 1 ciclo

Activación Taq pol hot-start e
inactivación Transcriptasa reversa 94°C - 5 min 1 ciclo
 94°C - 30 seg 45 ciclos
58°C - 30 seg
72°C - 30 seg
Final Extensión 72°C - 5 min 1 ciclo

Revelar la reacción mediante una electroforesis en gel de agarosa al 1.5% en

buffer TAE 1X. 10 uL del producto de la PCR se mezclan con 2 uL de buffer de
carga 6X y se siembran en cada pocillo del gel. Para la óptima separación y
resolución del tamaño, la electroforesis se realiza a 80 Voltios durante 90
minutos.

El buffer TAE se prepara a una concentración stock de 10X mezclando 48.4g

de Tris base [tris(hydroxymethyl)aminomethane], 11.4 mL de ácido acético
glacial (17.4 M) y 3.7 g of EDTA, disodium salt y llevar a 1L de agua miliq o
destilada.

MANEJO DE LAS MUESTRAS

Los productos de PCR deben mantenerse refrigerados en caso de no realizar
la electroforesis inmediatamente. Todos los reactivos utilizados en la PCR
deben permanecer congelados, una vez descongelados deben permanecer en
hielo el menor tiempo posible. La Taq DNA polimerasa solo deben sacarse del
congelador (-20ºC), al momento de adicionarla a la respectiva mezcla de
reacción.

INFORME FINAL.
Se informa si es POSITIVO O NEGATIVO usando el formato de Reporte para
extracción de y/o PCR diagnóstico de ZIKV.

RESTRICCIONES Y LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO.

En el caso de no encontrarse banda de amplificación debe pensarse en la
calidad del RNA plantilla, la actividad enzimática de la Taq polimerasa, el
programa del ciclador.
Por el contrario la aparición de bandas de amplificación no esperadas en el
control negativo y en las muestras tendría origen en una contaminación con
ADN (amplicones). Para eliminar este problema se deben descartar todos las
alícuotas de reactivos posiblemente contaminados como primers o dNTPs.

Se sugiere evaluar también la muestra haciendo dilución (1/5, 1/10) en agua

destilada con el objetivo de diluir inhibidores (si los hay).
SEGURIDAD
Todo reactivo, muestra de ADN debe ser manipulada con guantes.
El material utilizado, los reactivos y el ambiente en el que se montan las
reacciones deben estar totalmente libres de ADN, ya que debido a la alta
sensibilidad de la prueba, ADN de cualquier origen puede ser amplificado por
esta técnica haciendo difícil la interpretación de resultados.
 Ruta de acceso:
Versión: 2

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Piedad Perilla Paris Carlos Fernando Narváez Carlos Fernando Narváez

Fecha: Agosto 2017 Fecha: Agosto 2017 Fecha: Agosto 2017