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3
Hematológico básico
Técnicas
Carol Briggs • Barbara J. Bain
BOSQUEJO DEL CAPÍTULO
Hemoglobinometría, 19
Medida de la concentración de hemoglobina.
utilizando un espectrómetro (espectrofotómetro)
o colorímetro fotoeléctrico, 19
Cianuro de hemiglobina (cianmetahemoglobina)
método, 20
Diluente, 20
Estándar de referencia de hemiglobincianuro, 20
Método, 21
Cálculo de la concentración de hemoglobina. 21
Espectrometría directa, 22
Hemoglobinómetros portátiles de lectura directa, 22
Comparadores de color, 22
Hemoglobinómetros portátiles, 22
Pruebas de detección no invasivas. 23
Rango de concentración de hemoglobina en
salud, 23
Volumen de células empaquetadas o microhematocrito, 23
Consejo Internacional de Normalización en
Método de referencia de hematología, 24
Método de referencia sustituto, 24
Rango de volumen de células empaquetadas en salud, 24
Recuento manual de células e índices de glóbulos rojos, 24
Rango de MCHC en salud, 25
Recuento de leucocitos diferencial manual, 25
Método, 25
Recuentos de basófilos y eosinófilos, 26
Rango de recuento de eosinófilos en salud, 26
Rango de recuento de basófilos en salud, 26
Informar el recuento diferencial de leucocitos, 26
Recuento diferencial de glóbulos blancos de referencia, 27
Rango de glóbulos blancos diferenciales en salud, 27
18
Recuento de plaquetas, 27
Rango de recuento de plaquetas en salud, 27
Recuento de reticulocitos, 27
Tinciones de reticulocitos y recuento, 27
Métodos de fluorescencia para realizar una
recuento de reticulocitos, 30
Método de referencia manual, 30
Rango de recuento de reticulocitos en salud, 30
Técnicas automatizadas de conteo sanguíneo,
30Concentración de hemoglobina, 31Recuento
de glóbulos rojos, 31Sistemas de conteo, 31
Recuento de impedancia, 31
Dispersión de la luz, 32
Fiabilidad de los contadores electrónicos, 32
Establecer umbrales de discriminación, 33
Volumen de celda empaquetada y celda media
volumen, 33
Índices de glóbulos rojos, 35
Volumen celular medio, 35
Hemoglobina celular media y célula media
concentración de hemoglobina, 35
Variaciones en los volúmenes de glóbulos rojos: glóbulos rojos
ancho de distribución, 35
Porcentaje de glóbulos rojos hipocrómicos y variación.
en hemoglobinización de glóbulos rojos: ancho de
distribución de hemoglobina, 36
Recuento de glóbulos blancos, 36
Conteo diferencial automatizado, 37
El recuento automático de granulocitos inmaduros, 38
El glóbulo rojo nucleado automatizado
contar, 38

Análisis automatizado de imágenes digitales de sangre
células, 39
Nuevos parámetros de glóbulos blancos, 39
Gráficos de instrumentos automatizados, 40
Recuento de plaquetas, 40
Recuento de plaquetas en salud, 40
Volumen medio de plaquetas, 40
Plaquetas reticuladas y plaquetas inmaduras
fracción, 42
Es posible utilizar técnicas manuales, semiautomatizadas o
automatizadas para determinar los diversos componentes del
hemograma completo (FBC). Las técnicas manuales son generalmente
de bajo costo en cuanto a equipo y reactivos, pero requieren mucha
mano de obra; Las técnicas automatizadas implican altos costos de
capital pero permiten la rápida realización de un gran número de
hemogramas por un número menor de trabajadores de laboratorio.
Las técnicas automatizadas son más precisas, pero su precisión
depende de la calibración correcta y del uso de reactivos que suelen
ser específicos para el analizador en particular. Muchos laboratorios
utilizan ahora técnicas automatizadas casi exclusivamente, pero
ciertas técnicas manuales son necesarias como métodos de referencia
para la estandarización. También pueden ser necesarios métodos
manuales para tratar muestras que tienen características inusuales
que dan resultados discrepantes con analizadores automáticos.
Todas las pruebas que se describen en este capítulo se pueden realizar
en sangre venosa o capilar de flujo libre que haya sido anticoagulada con
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (consulte la página 4). La mezcla
completa de la muestra de sangre antes de la toma de muestras es esencial
para obtener resultados precisos de la prueba. Idealmente, las pruebas
deben realizarse dentro de las 6 horas posteriores a la obtención de la
muestra de sangre porque algunos resultados de las pruebas se alteran por
períodos de almacenamiento más prolongados. Sin embargo, los
resultados que son suficientemente fiables para fines clínicos se pueden
obtener normalmente en sangre almacenada hasta 24 horas a 4 ° C.
HEMOGLOBINOMETRIA
La concentración de hemoglobina (Hb) de una solución puede
estimarse midiendo su color, determinando su poder de
combinación con oxígeno o monóxido de carbono o analizando
su contenido de hierro. Los métodos que se describirán son todas
técnicas de igualación de color o intensidad de luz, que también
miden, en grado variable, cualquier metahemoglobina (Hi) o
sulfaemoglobina (SHb) que pueda estar presente. La capacidad
de combinación de oxígeno de la sangre es
1,34 ml de O por
2
g de hemoglobina. Idealmente, para evaluar
las consecuencias clínicas de la anemia, se debe realizar una
estimación funcional de la Hb mediante la medición de
3 Técnicas hematológicas básicas 19
Recuento de reticulocitos, 42
Fracción de reticulocitos inmaduros, 42Recuento de
reticulocitos en salud, 43Medición de hemoglobina de
reticulocitos, 43
Instrumentos en el punto de atención, 43
Calibración de glóbulos automatizados
contadores 43
Marcado de recuentos sanguíneos automatizados,
44Microscopía, 45
capacidad de oxígeno, pero esto es poco práctico en el laboratorio de
hematología de rutina. Da resultados que son al menos un 2% más
bajos que los dados por los otros métodos, probablemente porque
siempre está presente una pequeña proporción de pigmento inerte. El
contenido de hierro de la hemoglobina se puede estimar con
precisión,1 pero, nuevamente, el método no es práctico para
propósitos de rutina. Las estimaciones basadas en el contenido de
hierro generalmente se consideran auténticas, pero se incluye el
hierro unido al pigmento inactivo. El contenido de hierro se convierte
en hemoglobina asumiendo la siguiente relación: 0,347 g de hierro =
100 g de hemoglobina.2
MEDIDA DE
HEMOGLOBINA
CONCENTRACIÓN
USANDO UN ESPECTROMETRO
(ESPECTROFOTÓMETRO) O
COLORÍMETRO FOTOELÉCTRICO
Solo el método de hemiglobincyanide (HiCN;
cyanmethaemoglobin) es ahora de uso común. Tiene la
ventaja sobre el método de la oxihemoglobina
2
(HbO) de que
existe una preparación de referencia estable y confiable
disponible. Con la excepción de varios instrumentos en el
lugar2de atención, el método HbO ahora se usa raramente. El
método se da en la edición anterior de este libro.
Aunque el reactivo HiCN contiene cianuro, solo hay 50 mg
de cianuro de potasio por litro y se deberían ingerir entre 600
y 1000 ml para producir efectos graves. Sin embargo, el uso
de cianuro de potasio se ha considerado un peligro potencial;
Los reactivos alternativos menos peligrosos que se han
introducido son la azida de sodio.3 y lauril sulfato de sodio,4,5
que convierten la hemoglobina en hemiglobinazida y
hemiglobinsulfato, respectivamente. Se utilizan en algunos
sistemas automatizados, pero no se dispone de estándares
estables y también son sustancias tóxicas que deben
manipularse con cuidado.
 20 Hematología práctica
Otros métodos que se han utilizado incluyen el método
acidhematin de Sahli, que es menos preciso porque el color se
desarrolla lentamente, es inestable y comienza a desvanecerse
casi inmediatamente después de alcanzar su punto máximo. El
método de hematina alcalina proporciona una estimación real de
la concentración total de hemoglobina incluso si hay
carboxihemoglobina (HbCO), Hi o SHb; Las proteínas y lípidos
plasmáticos tienen poco efecto sobre el desarrollo del color,
aunque causan turbidez. El método original era más engorroso y
menos preciso que los métodos
2
HiCN o HbO, pero se ha
desarrollado un método modificado en el que la sangre se diluye
en una solución alcalina con detergente no iónico y se lee en un
espectrómetro a una absorbancia de 575 nm frente a una
solución estándar de clorohemina.6,7 Una evaluación arrojó
resultados alentadores,8 aunque otro estudio mostró un sesgo del
2,6% en comparación con el método de referencia, con no
linealidad en la relación entre la concentración de hemoglobina y
la absorbancia a concentraciones altas y bajas de hemoglobina.9
HEMIGLOBINCIANURO
(CIANMETAEMOGLOBINA)
MÉTODO
El método de hemiglobincianuro (cianmetahemoglobina) es el
método recomendado internacionalmente.2 para determinar la
concentración de hemoglobina en sangre. En algunos países, los
reactivos de cianuro ya no están disponibles. La base del método
es la dilución de sangre en una solución que contiene cianuro de
potasio y ferricianuro de potasio. La hemoglobina, Hi y HbCO,
pero no SHb, se convierten en HiCN. La absorbancia de la
solución se mide luego en un espectrómetro a una longitud de
onda de 540 nm o en un colorímetro fotoeléctrico con un filtro
amarillo-verde, como Ilford 625, Wratten 74 (puede estar
disponible enwww.ebay. co.uk) o Horiba XF3415, 530QM30 (
www.horiba.com).
Diluente
El reactivo original (Drabkin) tenía un pH de 8,6. La siguiente
solución modificada enumerada enTabla 3-1, Reactivo tipo
Drabkin, según lo recomendado por el Comité Internacional
(ahora Consejo) de Estandarización en Hematología (ICSH),2
tiene un pH de 7,0 a 7,4. Es menos probable que cause
turbidez por la precipitación de proteínas plasmáticas y
requiere un tiempo de conversión más corto (3-5 min) que la
solución Drabkin original, pero tiene la desventaja de que el
detergente produce algo de espuma.
El pH debe controlarse con un medidor de pH al menos una vez al
mes. El diluyente debe ser transparente y amarillo pálido. Cuando se
mide frente al agua como un blanco en un espectrómetro a una
longitud de onda de 540 nm, la absorbancia debe ser cero. Si se
almacena a temperatura ambiente en una botella de vidrio de
borosilicato marrón, la solución se conserva durante varios meses. Si
la temperatura ambiente es superior a 30 ° C, la solución debe
conservarse en el frigorífico pero llevarla a temperatura ambiente.
TABLA 3-1
REACTIVO TIPO DRABKIN
Reactivo Monto
Ferricianuro de potasio (0,607 mmol / l) 200 mg
Cianuro de potasio (0,768 mmol / l) 50 mg
Dihidrogenofosfato de potasio (1,029 mmol / l) 140 mg
Detergente no iónico* 1 ml
Agua destilada o desionizada Hasta 1 litro
* Los detergentes no iónicos adecuados incluyen el sustituto Nonidet P40
(Sigma-Aldrich; www.sigmaaldrich.com, Roche Diagnostics;http://
lifescience.roche.com y otros proveedores) o Triton X-100 (Sigma –
Aldrich).
antes de usar. No se debe permitir que se congele. El reactivo
debe desecharse si se vuelve turbio, si se encuentra que el pH
está fuera del rango de 7,0 a 7,4 o si tiene una absorbancia
distinta de cero a 540 nm frente a un blanco de agua.
Estándar de referencia de
hemiglobincianuro
Con la llegada de la solución HiCN, que es estable durante
muchos años, otros estándares han quedado obsoletos.10
El ICSH2 ha definido especificaciones sobre la base de una masa
molecular relativa (peso molecular) de hemoglobina humana de
64458 (es decir, 16114 como monómero) y una absorbancia de
área milimolar (coeficiente de extinción) de 11,0 (es decir, la
absorbancia a 540 nm de una solución que contiene
55,8 mg de hemoglobina de hierro por litro).
Algunos patrones se preparan a partir de sangre de buey,
que tiene el mismo coeficiente de extinción pero un peso
molecular de 64532 (16133 como monómero). Estas
especificaciones se han adoptado ampliamente; Se ha
establecido un estándar internacional de la Organización
Mundial de la Salud (OMS) y el ICSH (www.eurotrol.com). En
2008 se lanzó un nuevo lote de hemoglobincianuro o
estándar de hemoglobina.11 Esto reemplaza al lote anterior y
se produjo utilizando la misma metodología previamente
especificada por ICSH.2 El estándar actual tiene un valor de
concentración asignado de 574,2(±5,1) mg / lo 35,63 (±0,32)
µmol / l; la concentración exacta se indica en la etiqueta. La
expectativa de estabilidad de esta norma es de 15 años.11
pero se seguirá supervisando dos veces al año durante la vida
útil del lote. El estándar de hemoglobina proporciona un
material de referencia a partir del cual tanto los contadores
de células de laboratorio como los instrumentos en el punto
de atención calibran sus métodos de hemoglobina.2
La solución de HiCN se dispensa en ampollas selladas de
10 ml y se considera una dilución de sangre total. La Hb
original que representa se obtiene multiplicando la cifra
indicada en la etiqueta por la dilución que se aplicará a la
muestra de sangre. Por tanto, si la solución estándar contiene
800 mg (0,8 g) de hemoglobina por litro, tendrá la misma
densidad óptica que una muestra de sangre que contenga

160 g / l de hemoglobina si se diluye de 1 a 200 o como uno que
contiene 200 g / l de hemoglobina si se diluye de 1 a 250. En el
Système International d'Unités (SI), la Hb puede expresarse como
concentración de masa en g / l ( o g / dl) o en términos de
concentración de sustancia como μmol / l = g / l × 0.062. Para
fines clínicos, existen ventajas prácticas al expresar la Hb en
concentración de masa por litro o por decilitro (dl) y esta es
nuestra recomendación.
La preparación de referencia de HiCN está destinada principalmente a
la comparación directa con sangre que se convierte en HiCN.
Método
Haga una dilución de sangre de 1 en 201 agregando 20 μl
de sangre a 4 ml de diluyente. Tape el tubo que contiene
la solución e inviértalo varias veces. Deje reposar la
muestra de prueba a temperatura ambiente durante al
menos 5 min (para asegurar la conversión completa de
hemoglobina en cianuro de hemiglobina) y luego viértala
en una cubeta y lea la absorbancia en un espectrómetro a
540 nm o en un colorímetro fotoeléctrico con un filtro
adecuado (ver arriba) contra un blanco de reactivo. La
absorbancia de la muestra de ensayo debe medirse en las
6 h siguientes a su dilución inicial. La absorbancia de un
estándar HiCN disponible comercialmente (llevado a
temperatura ambiente si se almacenó previamente en un
refrigerador) también debe compararse con la de un
blanco de reactivo en el mismo espectrómetro o
colorímetro fotoeléctrico que se usó para la muestra del
paciente.
Cálculo de la concentración de
hemoglobina.
*
A540de la muestra de
Media pensión(g / l)= ´Conc. de estándar
prueba A540de estándar
†
Factor de dilución (201)
´
1000
Preparación de gráfico estándar y tabla estándar
Cuando se van a analizar muchas muestras de sangre, es conveniente
leer los resultados de un gráfico o tabla estándar que relacione las
lecturas de absorbancia con la Hb en g / l para el instrumento
específico. Este gráfico debe prepararse cada vez que se utiliza un
nuevo fotómetro o cuando se reemplaza una bombilla u otro
componente. Puede prepararse de la siguiente manera.
Prepare cinco diluciones del estándar de referencia HiCN
(o preparación equivalente) (llevado a temperatura ambiente)
con el reactivo de cianuro-ferricianuro de acuerdo con
* Absorbancia de una solución que contiene 5,8 mg de hemoglobina de hierro por
litro a 540 nm.
†O 251 si la dilución inicial es 250 (es decir, 20 µl de sangre por 5 ml de reactivo).
3 Técnicas hematológicas básicas 21
TABLA 3-2
DILUCIONES DE HEMIGLOBINCIANURO
(HiCN) SOLUCIÓN DE REFERENCIA PARA LA
PREPARACIÓN DE GRÁFICO ESTÁNDAR
Hemoglobina* HiCN Reactivo
Tubo (%) Volumen (ml) Volumen (ml)
1 100 (fuerza completa) 4.0 (ordenado) Ninguno
2 75 3,0 1.0
3 50 2.0 2.0
4 25 1.0 3,0
5 0 Ninguno 4.0 (ordenado)
* Como porcentaje de hemoglobina en solución de referencia.
Tabla 3-2. Debido a que el gráfico se utilizará para determinar
las mediciones de hemoglobina, es esencial que las diluciones
se realicen con precisión.
La concentración de hemoglobina de la preparación de
referencia en cada tubo debe representarse frente a la medición
de absorbancia. Por ejemplo, si la etiqueta de la preparación de
referencia indica que contiene 800 mg / l (es decir, 0,8 g / l) y el
método de medición de hemoglobina utiliza una dilución de 1:
201, las concentraciones de hemoglobina respectivas de los tubos
1-5 serían 160 , 120, 80, 40 y 0 g / l.
Utilizando papel cuadriculado lineal, trace los valores de
absorbancia (antes llamado densidad óptica) en el eje vertical y
los valores de hemoglobina en el eje horizontal. En algunos
instrumentos, las medidas se leen como porcentaje de
transmitancia; en este caso, utilice papel semilogarítmico con la
transmitancia registrada en la escala vertical o logarítmica. Los
puntos deben ajustarse a una línea recta que pase por el origen.
Siempre que el estándar se haya diluido correctamente, esto
proporciona una verificación de que la calibración del fotómetro
es lineal. A partir del gráfico, es posible construir una tabla de
lecturas y los correspondientes valores de concentración de
hemoglobina. Esto es más conveniente que leer valores de un
gráfico cuando se realizan grandes cantidades de mediciones. Es
importante que el rendimiento del instrumento no varíe y que su
calibración permanezca constante en relación con las mediciones
de hemoglobina. Para garantizar esto, la preparación de
referencia debe medirse a intervalos frecuentes, preferiblemente
con cada lote de muestras de sangre.
Las principales ventajas del método HiCN para la determinación de la
hemoglobina son que permite la comparación directa con el estándar de
referencia y que no es necesario realizar las lecturas inmediatamente
después de la dilución, por lo que es posible el procesamiento por lotes de
muestras. También tiene la ventaja de que todas las formas de
hemoglobina, excepto la SHb, se convierten fácilmente en HiCN.
La tasa de conversión de sangre que contiene HbCO es
marcadamente lenta. Esta dificultad se puede superar
prolongando el tiempo de reacción a 30 minutos antes de
leer los resultados.12 La diferencia entre las lecturas de 5 y 30
minutos se puede utilizar como un método semicuantitativo
para estimar el porcentaje de HbCO en la sangre.
 22 Hematología práctica
Como se mencionó anteriormente, lauril sulfato5 o azida de sodio3
se puede utilizar como sustitutos no peligrosos del cianuro de potasio.
Sin embargo, no hay estándares estables disponibles para estos
métodos, por lo que una muestra de sangre a la que primero se le
asignó un valor de hemoglobina asignado por el método HiCN debe
usarse como estándar secundario.
Las proteínas plasmáticas anormales o un recuento alto
de leucocitos pueden producir turbidez cuando la sangre se
diluye en el reactivo tipo Drabkin. La turbidez se puede evitar
centrifugando la muestra diluida o aumentando la
concentración de dihidrogenofosfato de potasio a 33 mmol / l
(4,0 g / l).13
ESPECTROMETRIA DIRECTA
La concentración de hemoglobina de una muestra de sangre
diluida se puede determinar mediante espectrometría sin
necesidad de un patrón, siempre que el espectrómetro se haya
calibrado correctamente. La sangre se diluye 1: 201 (o 1: 251) con
reactivo de cianuro-ferricianuro (ver pág. 20) y la absorbancia se
mide a 540 nm. La concentración de hemoglobina se calcula de la
siguiente manera:
A540HiCN´16 114´ Factor de dilución
l) =
Media pensión(g /
11,0 ´ D ´1000
A540 HC
en ´ Factor de dilución
o Hb ( metromol / )l =
110 ´ D ´1000
dónde A540= absorbancia de la solución a 540 nm; 16114 = peso
molecular monomérico de hemoglobina; dilución = 201 cuando se
diluyen 20 ml de sangre en 4 ml de reactivo; 11,0 = coeficiente de
extinción milimolar;D= espesor de capa en cm; y 1000 =
conversión de mg en g.
Al asignar un valor a una solución de hemoglobina que puede
usarse como preparación de referencia, primero es necesario
calibrar el espectrómetro. Esto requiere comprobar la longitud de
onda con un filtro de óxido de holmio, la absorbancia con un
conjunto de filtros de densidad neutra calibrados y la luz parásita
con un filtro de densidad neutra a 220 nm (National Physical
Laboratory, Teddington, Reino Unido,www.npl.co.uk). Deben
utilizarse cubetas de vidrio de cuarzo o ópticas combinadas con
una diferencia de transmisión de <1% a 200 nm. Posteriormente,
se puede verificar la calibración del espectrofotómetro
verificando que dé una lectura precisa del estándar HiCN. Leves
desviaciones de lo esperadoA540 El valor de HiCN para el estándar
puede usarse para corregir los resultados de las muestras de
prueba en busca de un sesgo en la medición.2
HEMOGLOBINÓMETROS
PORTÁTILES DE LECTURA DIRECTA
Comparadores de color
Estos son dispositivos clínicos simples que comparan el color de
la sangre con una gama de colores que representan las
concentraciones de hemoglobina. Están destinados a la anemia
cribado en ausencia de instalaciones de laboratorio y se
describen en Capítulo 26.
Hemoglobinómetros portátiles
Los hemoglobinómetros portátiles tienen un filtro incorporado y
una escala calibrada para lectura directa de Hb en g / lo g / dl.
Generalmente se basan en el método 2
HbO. Actualmente se
dispone de varios instrumentos que utilizan un diodo emisor de
luz de longitud de onda adecuada; están estandarizados para dar
los mismos resultados que con el método HiCN.
El sistema HemoCue (www.radiometer.co.uk/en-gb/
products / hemocue) es un método bien establecido para
la hemoglobinometría. Consiste en un espectrómetro
portátil precalibrado que funciona con baterías; no es
necesaria ninguna dilución porque la sangre pasa por
acción capilar directamente a una cubeta que contiene
nitrito de sodio y azida de sodio, que convierten la
hemoglobina en azidemetahemoglobina. La absorbancia
se mide a longitudes de onda de 565 y 880 nm. Las
mediciones no se ven afectadas por niveles altos de
bilirrubina, lípidos o glóbulos blancos y el sistema
HemoCue es suficientemente confiable para su uso como
instrumento de laboratorio; es fácil de operar para el
personal no técnico y, por lo tanto, también es adecuado
para su uso en lugares de atención. Las cubetas deben
almacenarse en un recipiente con un agente secante y
mantenerse dentro del rango de temperatura de 15 a 30 °
C.14 Los fabricantes de HemoCue también han lanzado un
sistema portátil que mide tanto la Hb como el recuento de
glóbulos blancos (WBC), el HemoCue WBC.15
Chempaq (Chempaq A / s, Farum, Dinamarca; http: //
chempaq-dk.business1.com/) produce dos analizadores de
hematología multiplataforma portátiles diferentes que
utilizan el recuento de células de impedancia y la medición de
Hb mediante un método espectrofotométrico en 20 μl de
sangre. El Chempaq XBC utiliza un cartucho desechable para
medir tres perfiles de prueba diferentes, Hb sola o WBC, con
diferencial de tres partes, más Hb o Hb con recuento de
glóbulos rojos (RBC), hematocrito (Hct), volumen celular
medio (MCV), hemoglobina celular media (MCH) y
concentración de hemoglobina celular media (MCHC). El
Chempaq XDM701 utiliza los mismos principios, pero también
informa un recuento de plaquetas.
El sistema de hemoglobinometría DiaSpect (www.diaspect.eu)
mide la Hb en sangre total inalterada en una cubeta de plástico
especial que también sirve como dispositivo de muestreo.dieciséis El
instrumento es un espectrofotómetro portátil alimentado por
baterías recargables de iones de litio integradas de 3.6 V o por un
adaptador de 100-240 V. Debido a que las cubetas no contienen
reactivos, no se ven afectadas por la temperatura o la humedad y
no se requieren condiciones especiales de almacenamiento.
Tienen una vida útil de al menos 2 años. Las fracciones de
hemoglobina se miden a partir de longitudes de onda de
absorbancia entre 400 y 800 nm. Un método patentado elimina el
impacto de la dispersión de

las células sanguíneas, mientras que la posible turbidez de
fondo de las sustancias interferentes se mide y compensa a
una longitud de onda alta. Los resultados se muestran en <5
s. Una precisión dentro±Se ha mostrado 3 g / l para medidas
entre 10 y 200 g / l.
Pruebas de detección no invasivas
Se han desarrollado métodos para usar espectroscopía de
infrarrojo cercano en sitios del cuerpo, principalmente un dedo,
para identificar el patrón espectral de hemoglobina en un vaso
sanguíneo subyacente y obtener una medición de Hb. Varios
estudios han demostrado una correlación aproximada con la
hemoglobinometría sanguínea.17,18
GAMA DE HEMOGLOBINA
CONCENTRACIÓN EN SALUD
Ver Capítulo 2, tablas 2-1, 2-2 y 2-3, para rangos de
Hb en salud. Cabe señalar que existen diferencias
de género, variaciones diurnas y factores
ambientales y fisiológicos que también deben
tenerse en cuenta.
VOLUMEN CELULAR EMBALADO
O MICROHAEMATÓCRITO
El volumen de células empaquetadas (PCV) se puede utilizar como una
prueba de detección simple para la anemia, como un método de
referencia para calibrar los sistemas de recuento sanguíneo
automatizados y como una guía aproximada para la precisión de las
mediciones de Hb. El PCV×1000 es aproximadamente tres veces la Hb
expresada en g / l (p. Ej., 0,36 × 1000 es aproximadamente 120 × 3).
Junto con las estimaciones de Hb y RBC, la PCV se puede utilizar en el
cálculo de índices de glóbulos rojos. Sin embargo, su uso en
laboratorios de escasos recursos puede verse limitado por la
necesidad de una centrífuga especializada y un suministro confiable
de tubos capilares.
El método del microhematocrito para la determinación del PCV19 se
lleva a cabo sobre sangre contenida en tubos capilares de 75 mm de
longitud y con un diámetro interno de aproximadamente 1 mm. Los
tubos pueden ser simples para usar con muestras de sangre
anticoagulada o recubiertos por dentro con 1 unidad internacional (iu)
de heparina para la recolección directa de sangre capilar. La
centrífuga utilizada para los tubos capilares proporciona una fuerza
centrífuga de aproximadamente(C.) 12 000 gramo y la centrifugación
de 5 min da como resultado una PCV constante. Cuando el PCV es>
0,5, puede ser necesario centrifugar durante 5 minutos más.
Permita que la sangre de una muestra bien mezclada, o de un flujo
libre de sangre por punción cutánea, ingrese al tubo por capilaridad,
dejando al menos 15 mm sin llenar. Luego selle el tubo con un sello de
plástico (por ejemplo, Cristaseal, Hawksley, Lancing, Sussex;
www.hawksley.co.uk). No se recomienda sellar el tubo mediante
calentamiento porque los sellos tienden a ser cónicos y existe la
posibilidad de lisis. Después de la centrifugación para
3 Técnicas hematológicas básicas 23
5 minutos, mida la proporción de células en toda la columna (es decir,
el PCV) utilizando un dispositivo de lectura.
Precisión del microhematocrito
El método del microhematocrito tiene un nivel adecuado de
exactitud y precisión para su utilidad clínica.20 Sin embargo, se
debe prestar atención a una serie de factores que pueden
producir un resultado inexacto.
Anticoagulante
Se recomienda K -EDTA, porque K -EDTA provoca el encogimiento de los glóbulos
2 3
rojos, reduciendo el PCV en aproximadamente un 2%. Una concentración de
anticoagulante superior a 2,2 mg / ml también puede provocar una PCV
falsamente baja como resultado de la contracción de las células.
Muestra de sangre
Debido a que la PCV aumenta gradualmente con el almacenamiento, la
prueba debe realizarse dentro de las 6 h posteriores a la recolección de la
muestra de sangre, pero es aceptable un retraso de hasta 24 h si la sangre
se mantiene a 4 ° C.
Si no se mezcla la muestra de sangre adecuadamente, se
producirá un resultado inexacto. El grado de oxigenación de la sangre
también afecta el resultado porque el PCV de la sangre venosa es
aproximadamente un 2% más alto que el de la sangre completamente
aireada (que ha perdido CO y absorbido
2
O).21 Para asegurar
2
una
adecuada oxigenación y mezcla de la muestra, el espacio de aire libre
sobre la muestra debe ser> 20% del volumen del recipiente.
Tubos capilares
La variación del diámetro interior de los tubos puede causar errores
graves si no se encuentran dentro de los estrechos límites de las
especificaciones definidas que deben cumplir los fabricantes: longitud
75 ±0,5 mm; diámetro interno 1.07–1.25 mm; espesor de pared
0,18-0,23 mm; y una conicidad del orificio que no exceda el 2% del
diámetro interno en toda la longitud del tubo.20
Centrífugo
Las centrífugas deben comprobarse a intervalos (al menos una vez al año)
con un tacómetro para comprobar la velocidad y un cronómetro para
comprobar la precisión del temporizador. La eficacia del empaquetamiento
también debe probarse centrifugando muestras de sangre normal y
policitemia durante tiempos variables de 5 a 10 minutos para determinar el
tiempo mínimo para el empaquetamiento completo de los glóbulos rojos.
Leer
La prueba debe leerse lo antes posible después de la centrifugación
porque los glóbulos rojos comienzan a hincharse y la interfase se
vuelve cada vez más indistinta. Para evitar errores en la lectura con el
dispositivo de lectura especial, se debe utilizar una lupa. Los glóbulos
blancos y las plaquetas (la capa leucocitaria) deben excluirse en la
medida de lo posible de la lectura del PCV. Si no se dispone de un
dispositivo de lectura especial, la relación entre la columna de
glóbulos rojos y la columna completa se puede calcular a partir de las
mediciones obtenidas colocando el tubo contra papel cuadriculado
aritmético o contra una regla.
 24 Hematología práctica

Atrapamiento de plasma 2. Retire rápidamente los tubos de la centrífuga, colóquelos

La cantidad de plasma atrapado entre los glóbulos rojos, especialmente en
uno a uno contra el borde del portaobjetos de 25 mm y
el extremo inferior de la columna de glóbulos rojos, y la deshidratación de
colóquelo en la platina del microscopio.
los glóbulos rojos durante la centrifugación generalmente se contrarrestan
3. Asegúrese de que el tubo capilar esté alineado en una posición
entre sí y el error causado por el plasma atrapado generalmente no es más
horizontal verdadera en relación con el campo de visión y, con
de 0.01 unidades de PCV. Por lo tanto, en la práctica de rutina, no es
poca potencia, anote en la escala de nonio las longitudes del
necesario corregir el plasma atrapado, pero si se requiere la PCV para
tubo en las interfaces de (a) glóbulos rojos y selle, (b )
calibrar un analizador de células sanguíneas o para calcular el volumen de
glóbulos rojos y leucocitos y (c) plasma y aire.
sangre, la PCV observada debe reducirse en un factor de corrección del 2%
4. Calcule el PCV hilado = (B - a) / (C - a). Determinar la aceptabilidad de

después de haber sido centrifugado. durante 5 min o durante 10 min con

las medidas emparejadas: los duplicados deben coincidir dentro

sangre policitemica.22
de 0,007 unidades; si no es así, se deben repetir las pruebas

Sin embargo, es preferible utilizar el método de referencia sustituto.23 pareadas.

El atrapamiento de plasma aumenta en anemias macrocíticas,24 5. Calcule el PCV de referencia sustituto a partir de la
esferocitosis, talasemia, anemias hipocrómicas y anemia de células fórmula:
falciformes;25 puede llegar hasta el 20% en la anemia de células
falciformes si todas las células están falciformes.24
Hilado PCV -0.011.9
0.9736
Método de referencia del Consejo Esta fórmula se aplica solo a los tubos capilares especificados;
Internacional de Normalización en otros tubos requieren validación específica por el método de
Hematología referencia ICSH22 de modo que se pueda derivar una fórmula
apropiada. Si las mediciones de referencia sustitutas se van a
La concentración de hemoglobina se mide mediante el método de
utilizar para validar equipos o métodos, se requieren un mínimo
rutina en muestras de sangre con un rango de muestras de Hb. A
de seis muestras de sangre diferentes, al menos dos en cada uno
continuación, se toman muestras de las mismas muestras en tubos
de los rangos de PCV 0,20–0,25, 0,40–0,45 y 0,60–0,65. Si es
capilares de vidrio de borosilicato especiales, que se centrifugan
necesario, el PCV de las muestras normales puede ajustarse
durante 5 minutos o más para lograr el empaquetamiento completo
mediante la adición o eliminación apropiada de plasma autólogo.
de glóbulos rojos. Luego, los tubos se rompen en el punto medio del
concentrado de glóbulos rojos, se extrae sangre con una micropipeta
y se mide su concentración de hemoglobina. La PCV se calcula como la
relación entre la Hb de la sangre total y la del concentrado de células.
Rango de volumen de células empaquetadas en salud
Este método26 es apropiado para los fabricantes de instrumentos y
reactivos, pero requiere mucho tiempo, es potencialmente inseguro y Ver Capítulo 2, tablas 2-1, 2-2 y 2-3.
requiere una experiencia significativa, lo que lo hace impráctico para
su uso ocasional en laboratorios de rutina. En consecuencia, el
Consejo Internacional de Normalización en Hematología ha RECUENTOS DE CÉLULAS MANUALES E
desarrollado un "método de referencia sustituto".23 ÍNDICES DE CÉLULAS ROJAS
Los principios del recuento celular manual, el uso de la
Método de referencia sustituto cámara de recuento del hemocitómetro para el recuento
Equipo manual de glóbulos blancos y plaquetas y las limitaciones de
estas mediciones se describen en Capítulo 26.
• Centrífuga estándar de microhematocrito
Un RBC preciso permite calcular el MCV y MCH. En la mayoría de
• Tubos capilares de vidrio borosilicato con las siguientes
los laboratorios, donde estos índices los proporciona un sistema
especificaciones: longitud 75 ± 0,5 mm; diámetro interno
automatizado (ver pág. 35), tienen una importancia clínica
1,55 ± 0,085 mm; diámetro exterior 1,9± 0,085 mm
considerable y se utilizan ampliamente en la clasificación de la anemia.
(Drummond Scientific, Broomall, PA 19008: Catálogo
Cuando no se utilizan analizadores automáticos, los glóbulos rojos
# 1–000–751C; www.drummondsci.com)
manuales (y, en consecuencia, los cálculos de estos índices de
• Soporte de tubo capilar compuesto por 75 × Portaobjetos de vidrio de 25
glóbulos rojos) son tan imprecisos y requieren tanto tiempo que se
mm montado en un 75 × Diapositiva de 50 mm
han vuelto obsoletos.
• Microscopio equipado con una escala de nonio y una barra transversal
La única medición que puede obtenerse con una
ocular
precisión razonable mediante métodos manuales es
Método MCHC porque se deriva de la Hb y la PCV a partir de la
siguiente fórmula:
1. Tome muestras duplicadas de sangre bien mezclada en los
tubos capilares especificados y centrifugue como se describe
MCHC(g / l)= Hb(g / l) ¸ PCV(l / l).
en la página 23.
 3 Técnicas hematológicas básicas 25

Rango de MCHC en salud Linfocitos + Polimorfos

Ver Capítulo 2, tablas 2-1, 2-2 y 2-3.

Cola
DIFERENCIAL MANUAL
Cabeza Cuerpo

Película

RECUENTO DE LEUCOCITOS demasiado delgado

Película Espesor ideal

Los recuentos diferenciales de leucocitos se realizan ahora, al menos en
muy grueso
muestras esencialmente normales, mediante instrumentos automatizados.
También se pueden realizar mediante el examen visual de extensiones de FIGURA 3-2 Dibujo esquemático de un frotis de sangre realizado en una diapositiva.
La película se ha extendido de izquierda a derecha. Se da una indicación de la
sangre que se preparan en portaobjetos mediante la técnica de extensión o
forma en que se distribuyen los glóbulos blancos.
"cuña". Desafortunadamente, incluso en películas bien esparcidas, la
distribución de los distintos tipos de células no es totalmente aleatoria (ver
más abajo).
Para un recuento diferencial confiable de películas esparcidas en D
A A1
portaobjetos, la película no debe ser demasiado delgada y la cola de la
película debe ser lisa. Para lograr esto, la película debe hacerse con un
B B1
D1
movimiento rápido utilizando un esparcidor de vidrio liso. Esto debería
dar como resultado una película en la que hay algo de superposición Dirección de esparcimiento

de los glóbulos rojos, disminuyendo hasta la separación cerca de la
cola, y en la que los glóbulos blancos en el cuerpo de la película no se
encogen demasiado. Si la película es demasiado delgada o si se usa un
esparcidor rugoso, muchos de los glóbulos blancos, quizás incluso el
50% de ellos, se acumulan en los bordes y en la cola (Figura 3-1).
Además, la regla es una gran irregularidad cualitativa en la
distribución: los neutrófilos polimorfonucleares y los monocitos
predominan en los márgenes y la cola; Los linfocitos predominan en el
medio de la película (Figura 3-2). Esta separación probablemente
depende de las diferencias de pegajosidad, tamaño y gravedad
específica de los diferentes tipos de células.
Las diferencias en la distribución de los distintos tipos de
células probablemente siempre estén presentes en pequeña
medida, incluso en películas bien hechas. Se han defendido varios
sistemas para realizar el recuento diferencial, pero ninguno
puede compensar las grandes irregularidades en la distribución
de una película mal hecha. En películas bien hechas, se
recomienda la siguiente técnica de conteo.
FIGURA 3-3 Dibujo esquemático que ilustra el longitudinal
método de realización de recuentos diferenciales de leucocitos. La gota de
sangre original se esparce entre el esparcidor y el portaobjetos (D - D ). La película
1
está hecha de tal manera que tiras representativas de películas, como A - A
y B - B, se forman a partir de sangre originalmente en A y B,
1 1
respectivamente. Para realizar un recuento diferencial preciso, todos los
leucocitos en una o más tiras, comoA - Ainspeccionadoy B -y B, debiera
clasificado. ser
1 1
Método
Cuente las celdas usando un ×40 objetivo en una tira que
recorre toda la película. Evite los bordes laterales de la
película. Inspeccione la película desde la cabeza hasta la cola
y si se encuentran menos de 100 células en una sola tira
estrecha, examine una o más tiras adicionales hasta que se
hayan contado al menos 100 células. Cada tira longitudinal
representa la sangre extraída de una pequeña parte de la
gota de sangre original cuando se ha extendido.

A B

FIGURA 3-1 Película mal esparcida. Dos áreas de una película mal esparcida de un paciente con un recuento de glóbulos blancos de 20 × 109/ l mostrando (A) muchos
leucocitos en la cola y (B) muy pocos leucocitos en el cuerpo de la película.
 26 Hematología práctica
entre el tobogán y el esparcidor (Figura 3-3). Si se cuentan todas
las celdas en dicha tira, los totales diferenciales se aproximarán
mucho al conteo diferencial real. Esta técnica puede cometer
errores si no se pueden identificar las células de la parte gruesa
de la película; además, no permite ningún exceso de neutrófilos y
monocitos en los bordes de la película, pero esta preponderancia
es leve en una película bien hecha y en la práctica hace poca
diferencia en el resultado.
Esta técnica es fácil de realizar; con recuentos altos (10-30
× 109/ l), es deseable una película corta de 2-3 cm. En
pacientes con recuentos muy altos (como en la leucemia), el
método debe abandonarse y las células deben contarse en
cualquier área bien diseminada donde los tipos de células
sean fáciles de identificar. Otros sistemas de conteo, como el
conteo en "almenas", son más elaborados pero pueden
minimizar el error debido a la variación de la distribución de
las celdas entre el centro y el borde de la película. Los
resultados del recuento diferencial se pueden registrar
utilizando un registro manual múltiple o se pueden ingresar
directamente en una computadora.
La varianza del recuento diferencial depende no sólo de las
diferencias artificiales en la distribución debidas al proceso de
propagación, sino también de la distribución "aleatoria"; juntos son,
con mucho, las causas más importantes de recuentos diferenciales
poco fiables. La distribución aleatoria significa que, si se cuentan un
total de 100 células, con una proporción verdadera de neutrófilos del
50%, el rango (±2SD) dentro del cual caerá el 95% de los conteos es del
orden de ±14% (es decir, 36% -64%) de neutrófilos. Un recuento de 200
células puede proporcionar una estimación más precisa; en el ejemplo
anterior, el±El rango de 2SD estará entre el 40% y el 60%. En un
recuento de 500 células, el rango se reduciría a 44% -56% de
neutrófilos. En la práctica, se recomienda un recuento de 100 células
como procedimiento de rutina. Sin embargo, si las células anormales
están presentes en pequeñas cantidades, es más probable que se
detecten cuando se realizan recuentos de 200 a 500 células que con
un recuento de 100 células. Al cuantificar la proporción de células
blásticas cuando se sospecha un síndrome mielodisplásico o leucemia
mieloide aguda, se debe contar un mínimo de 200 células.
CUENTAS DE BASÓFIL Y
EOSINOFILO
Puede ser necesario un recuento manual de basófilos o eosinófilos
para validar un recuento automático o cuando las características
anormales de las células hacen que un recuento automático no sea
confiable (por ejemplo, con eosinófilos degranulados). Cuente el
porcentaje de eosinófilos o basófilos en un recuento diferencial de
todos los leucocitos en un frotis de sangre teñido. Si las células de
interés son poco frecuentes, se debe realizar un recuento diferencial
de 500 células. Si se ven menos de 500 células en la película, continúe
el recuento con una segunda película. Sin embargo, si el recuento de
eosinófilos está notablemente elevado, un recuento convencional de
100 células será suficiente para la mayoría de los propósitos. Calcule el
recuento de eosinófilos o basófilos por litro a partir del leucocito total
contar. Es esencial tener películas delgadas, preferiblemente cortas,
con los leucocitos distribuidos uniformemente por toda la película y
fácilmente identificables (ver pág. 25).
Rango de recuento de eosinófilos en salud
Ver Capítulo 2, tablas 2-1, 2-2 y 2-3.
Normalmente, existe una variación diurna considerable en el
recuento de eosinófilos y se han registrado diferencias de hasta el
100%. Los recuentos más bajos se encuentran en la mañana (10
soy al mediodía) y el más alto por la noche (de medianoche a las 4
soy).27,28 Para una revisión de las causas de la eosinofilia, vea Bain.
29
Rango de recuento de basófilos en salud
Ver Capítulo 2, Tabla 2-1. Gilbert y Ornstein30 informó una
distribución del 95% en sujetos normales de 0,01 a 0,08 × 109/
l. No hay diferencias de edad o género, aunque los recuentos en
serie han mostrado niveles más bajos durante la ovulación.31
INFORME DEL RECUENTO
DIFERENCIAL DE LEUCOCITOS
El recuento diferencial, expresado como el porcentaje de cada
tipo de célula, debe estar relacionado con el recuento total de
leucocitos y los resultados deben informarse en números
absolutos.(×109/ l). La única vez que se requiere el porcentaje de
un tipo celular es en el diagnóstico y clasificación de la leucemia
mieloide aguda, los síndromes mielodisplásicos y las neoplasias
mielodisplásicas / mieloproliferativas superpuestas. Los
mielocitos y metamielocitos, si están presentes, se registran por
separado de los neutrófilos. Las células en banda (apuñaladas)
generalmente se incluyen en el recuento de neutrófilos.
Normalmente constituyen <6% de los neutrófilos; un aumento
puede indicar un proceso inflamatorio incluso en ausencia de
leucocitosis absoluta.32 Sin embargo, el recuento de células de la
banda es impreciso y, aunque a veces se recomienda en
lactantes, se ha descubierto que no es útil para predecir la
bacteriemia oculta incluso en este grupo.33
Corrección del recuento de glóbulos rojos
nucleados
Cuando hay glóbulos rojos nucleados (NRBC), pueden
incluirse en el total de WBC, que en realidad es un "recuento
total de células nucleadas" (TNCC). En este caso, también
deben incluirse en el recuento diferencial, como un
porcentaje del TNCC y notificarse en números absolutos.(×109
/ l) de la misma forma que los diferentes tipos de leucocitos.
Si están presentes en cantidades significativas, el TNCC debe
corregirse para obtener el verdadero total de leucocitos. Así,
por ejemplo, si el total de WBC es 8.0× 109/ ly el porcentaje de
NRBC en el recuento diferencial es del 25%, luego
WBC corregido = 8- (8´25 / 100) = 6´109/ 1.

En otros casos, un instrumento automatizado produce un
verdadero WBC que no incluye NRBC; Los NRBC se enumeran
y expresan como un recuento absoluto. Los recuentos
absolutos de diferentes tipos de leucocitos se pueden calcular
a partir del recuento diferencial manual y el verdadero WBC.
Se debe tener cuidado para diferenciar los linfocitos pequeños
de los glóbulos rojos nucleados (p. Ej. Capítulo 5, Fig. 5-64).
Recuento diferencial de glóbulos blancos de referencia
Se requiere un método de referencia para validar la precisión de los
sistemas automatizados.34 (descrito más adelante). El método que se ha
utilizado ampliamente para este propósito es esencialmente similar al
procedimiento manual de rutina en frotis de sangre teñidos, pero para
garantizar una precisión adecuada, dos observadores independientes llevan
a cabo un recuento de 200 células, cada uno en dos películas preparadas a
partir de la misma muestra. . Sin embargo, esto todavía es demasiado
impreciso para las células con baja frecuencia; Se han hecho intentos para
establecer un método de referencia usando citometría de flujo con marcaje
de anticuerpos monoclonales específicos de los tipos de células específicos,
incluidos los leucocitos inmaduros.35,36
Los protocolos de citometría de flujo más recientes también
incluyen el recuento de células blásticas y linfocitos reactivos, la
diferenciación entre linfocitos B y T y el recuento de NRBC.37,38
Rango de glóbulos blancos diferenciales
en salud
Ver Capítulo 2, tablas 2-1, 2-2 y 2-3.
RECUENTO DE PLAQUETAS
El método para el recuento manual de plaquetas utilizando una
cámara de recuento se describe en la página 554. Si se dispone de un
RBC mediante un contador semiautomático, es posible obtener una
aproximación del recuento de plaquetas contando la proporción de
plaquetas a glóbulos rojos en una delgada parte de una película hecha
de una muestra de sangre anticoagulada con EDTA, utilizando el ×
Objetivo de inmersión en aceite de 100 y, si es posible, oculares
provistos de un diafragma ajustable, como para un recuento de
reticulocitos.
Rango de recuento de plaquetas en salud
Ver Capítulo 2, tablas 2-1, 2-2 y 2-3.
RECUENTO DE RETICULOCITOS
Los reticulocitos son glóbulos rojos juveniles; contienen restos del
ácido ribonucleico ribosómico (ARNr) que estaba presente en mayores
cantidades en el citoplasma de los precursores nucleados de los que
se derivan. Los ribosomas tienen la propiedad de reaccionar con
ciertos tintes básicos como el azul B, el azul de cresilo brillante o el
nuevo azul de metileno (ver más abajo) para formar un precipitado
azul o púrpura de gránulos o filamentos.
3 Técnicas hematológicas básicas 27
Esta reacción tiene lugar solo en preparaciones sin fijar
teñidas de forma vital. Las etapas de maduración se pueden
identificar por sus características morfológicas. Los reticulocitos
más inmaduros son los que tienen la mayor cantidad de material
precipitable; en el menos inmaduro, solo se ven algunos puntos o
hebras cortas. Los reticulocitos se pueden clasificar en cuatro
grupos, que van desde los reticulocitos más inmaduros, con un
gran cúmulo de reticulina (grupo I), hasta los más maduros, con
algunos gránulos de reticulina (grupo IV) (Figura 3-4). Si se deja
secar un frotis de sangre y luego se fija con metanol, los
reticulocitos aparecen como eritrocitos policromáticos, siendo
difusamente basófilos si el film se tiñe con uno de los colorantes
básicos.
La pérdida completa de material basófilo probablemente ocurre en el
torrente sanguíneo y, particularmente, en el bazo después de que las
células han abandonado la médula ósea.39 Se cree que esta maduración
tarda de 2 a 3 días, de los cuales aproximadamente 24 h se pasan en la
circulación.
El número de reticulocitos en la sangre periférica es un reflejo
bastante preciso de la actividad eritropoyética, suponiendo que
los reticulocitos se liberan normalmente de la médula ósea y que
permanecen en circulación durante el período de tiempo normal.
Estas suposiciones no siempre son válidas porque un mayor
estímulo eritropoyético conduce a una liberación prematura a la
circulación. El tiempo medio de maduración de estos reticulocitos
denominados "estresados" o estimulados puede ser de hasta 3
días. En tales casos, se encontrará una proporción mayor de lo
normal de reticulocitos inmaduros en la circulación. Es posible
una evaluación más precisa de la maduración de los reticulocitos
mediante citometría de flujo cuantitativa de su contenido de ARN.
Sin embargo, la información adecuada se obtiene generalmente
de un simple recuento de reticulocitos registrado como
porcentaje de los glóbulos rojos o, preferiblemente, cuando se
conoce el RBC, como un número absoluto por litro. Cuando hay
anemia severa, el recuento de reticulocitos puede corregirse por
la anemia y expresarse como un índice de reticulocitos.40
Índice de reticulocitos =% de reticulocitos observado
Hbor PCV medido
´
Hbor PCV normal apropiado
Tinciones de reticulocitos y recuento
Se obtienen resultados mejores y más fiables con el nuevo azul de
metileno que con el azul de cresilo brillante. El azul de metileno
nuevo es químicamente diferente del azul de metileno, que es
una mala tinción de reticulocitos. El nuevo azul de metileno tiñe el
material reticulofilamentoso de los reticulocitos de manera más
profunda y uniforme que el azul de cresilo brillante, que varía de
una muestra a otra en su capacidad de tinción. Azure B es un
sustituto satisfactorio del nuevo azul de metileno; tiene la ventaja
de que el tinte no precipita y está disponible en forma pura.41 Se
utiliza en la misma concentración y el procedimiento de tinción es
el mismo que con el nuevo azul de metileno.
 28 Hematología práctica

A B

C D

mi F

GRAMO H

FIGURA 3-4 Fotomicrografías de reticulocitos que muestran etapas de maduración. (A, B) Más inmaduros (grupo I); (CD) intermedio (grupo II);
(E, F) intermedio de etapa tardía (grupo III); (GRAMO) más maduro (grupo IV); y(H) anemia hemolítica, teñida supravitalmente con nuevo azul de metileno.

Solución de tinción
Disuelva 1,0 g de azul de metileno nuevo (CI 52030) (www.
sigmaaldrich.com) o azul B (CI 52010) (www.sigmaaldrich.com
) en 100 ml de solución salina de citrato trisódico al 3% (30 g
de citrato de sodio en 1 l de solución salina). Filtrar una vez
que el tinte se haya disuelto.
Método
Entregue 2 o 3 gotas de la solución de tinte en un 75 × Tubo de
plástico de 10 mm mediante pipeta Pasteur de plástico. Añada de 2 a 4
volúmenes de sangre anticoagulada con EDTA del paciente a la
solución de tinte y mezcle. Mantenga la mezcla a 37 ° C durante 15-20
min. Resuspenda los glóbulos rojos mezclando suavemente y haga
películas en portaobjetos de vidrio de la forma habitual. Cuando esté
seco, examine las películas sin fijar ni contrateñir.
El volumen exacto de sangre que se agregará a la solución de
tinte para una tinción óptima depende de la Hb. Debe añadirse
una mayor proporción de sangre anémica y una menor
proporción de sangre policitemica que de sangre normal. En una
preparación exitosa, el material reticulofilamentoso debe teñirse
de azul profundo y las células no reticuladas deben teñirse con
tonos difusos de azul verdoso pálido. Las películas no deben
teñirse con contrateñido. El material reticulofilamentoso no está
mejor definido después de la contratinción y la tinción precipitada
sobre las células que recubren las células puede causar
confusión. Además, los cuerpos de Heinz no serán visibles en
preparaciones fijas y contrateñidas. Si la preparación teñida se
examina con contraste de fases, tanto los eritrocitos maduros
como los reticulocitos están bien definidos. Por esta técnica, Los
reticulocitos tardíos caracterizados por la presencia de restos de
filamentos o hilos se distinguen fácilmente de las células que
contienen cuerpos de inclusión. Se pueden realizar recuentos
satisfactorios en sangre que se ha dejado reposar (sin teñir)
durante 24 h, aunque el recuento tenderá a disminuir después de
6 a 8 h, a menos que la sangre se mantenga a 4 ° C.
Contando reticulocitos
Se debe elegir un área de película para el recuento donde las
células no estén distorsionadas y donde la tinción sea buena. Un
error común es hacer que la película sea demasiado delgada; sin
embargo, las celdas no deben superponerse. Para contar las
celdas, use el×Objetivo de inmersión en aceite 100 y, si es posible,
oculares provistos de un diafragma ajustable. Si no se dispone de
oculares con diafragma ajustable, se puede insertar en un ocular
un diafragma de papel o cartón, en el centro del cual se ha
cortado un pequeño cuadrado con lados de aproximadamente 4
mm de longitud, y se puede utilizar como un sustituto menos
conveniente.
El procedimiento de recuento debe ser adecuado al número de
reticulocitos presentes. Es necesario examinar un gran número de
células si se quiere obtener un recuento razonablemente preciso
cuando solo hay un pequeño número de reticulocitos. Cuando el
recuento es <10%, un método conveniente es examinar campos
sucesivos hasta que se hayan obtenido al menos 100 reticulocitos.
3 Técnicas hematológicas básicas 29
contar y contar el total de glóbulos rojos en al menos 10 campos para
determinar el número promedio de glóbulos rojos por campo.
Cálculo
Número de reticulocitos en norte campos = XNúmero
medio de glóbulos rojos por campo = yNúmero total de
glóbulos rojos en norte campos = norte × yPorcentaje de
reticulocitos = [X ÷ (norte × y)] × 100 Recuento absoluto de
reticulocitos =% × RBC
Así, cuando el porcentaje de reticulocitos es 3.3 y el RBC es
5 × 1012/ l, el recuento absoluto de reticulocitos por litro es el
siguiente: (3,3 / 100) × 5 × 1012 = 165 × 109.
Es fundamental que la preparación de reticulocitos esté bien distribuida
para garantizar una distribución uniforme de las células en campos
sucesivos.
Cuando el recuento de reticulocitos supera el 10%, solo será
necesario examinar un número relativamente pequeño de células
para obtener un error estándar del 10%.
Un método alternativo se basa en el principio de muestreo
equilibrado, utilizando un ocular Miller (Graticules Ltd, Tonbridge,
Reino Unido; www.pyser-sgi.com). Este es un ocular que da un
campo cuadrado, en la esquina del cual hay un cuadrado reglado
más pequeño, una novena parte del área del cuadrado total (
Figura 3-5). Los reticulocitos se cuentan en el cuadrado grande y
el número total de glóbulos rojos se cuenta en el cuadrado
pequeño.
El número de campos que se deben estudiar para obtener
el grado de precisión deseado depende de la proporción de
reticulocitos (Tabla 3-3).
Es fundamental que la preparación de reticulocitos esté
bien esparcida y bien teñida. Otros factores importantes que
afectan la precisión del recuento son la agudeza visual y la
paciencia del observador y la calidad y poder de resolución
del microscopio. Los recuentos más precisos los realiza un
observador concienzudo que no tiene conocimiento del
supuesto nivel de reticulocitos, eliminando así el efecto del
sesgo consciente o inconsciente.
1/3
1/3
FIGURA 3-5 Miller ocular.
 30 Hematología práctica

TABLA 3-3

LA PRECISIÓN DE LOS CUENTOS DE RETICULOCITOS CON MILLER OCULAR

Reticulocitos Error estándar (σ)*

Porcentaje Proporción (pag) 2% 5% 10%

1 0,01 27 500 4400 1100
2 0,02 13 600 2180 550
5 0,05 5280 845 210
10 0,10 2500 400 100
25 0,25 835 135 35

* Las columnas 3 a 5 indican el número total de glóbulos rojos que se contarán en los pequeños cuadrados para dar el error estándar requerido a diferentes niveles de reticulocitos. Se
deriva de la siguiente ecuación: σ =√pag(1 - pag) / λ, donde pag = el número de reticulocitos en norte cuadrados grandes ÷ (el número de glóbulos rojos en norte pequeños cuadrados
× F); F = la proporción de cuadrados grandes a pequeños (es decir, 9); y λ = el número total aproximado de celdas ennorte cuadrados grandes.

Diferenciar entre reticulocitos y otras inclusiones de La tinción fluorescente combinada con citometría de flujo se ha
glóbulos rojos desarrollado como un método para el recuento automático de

La decisión sobre qué es y qué no es un reticulocito puede ser reticulocitos (consulte la pág. 42).

difícil porque los reticulocitos más maduros contienen sólo unos

pocos puntos o hilos de material reticulofilamentoso. Método de referencia manual
Afortunadamente, en preparaciones bien teñidas vistas bajo el
El método de referencia manual43,44 Es esencialmente el mismo
microscopio óptico, el tipo de material granular Pappenheimer
procedimiento que para el método de rutina, las películas teñidas
(que contiene hierro), generalmente presente como un solo
supravitalmente se examinan mediante microscopía de contraste de
punto pequeño, con menos frecuencia como puntos múltiples,
fase o de campo brillante. Los reticulocitos se identifican como
tiñe un tono más oscuro de azul que el material
glóbulos rojos no nucleados que contienen al menos dos partículas de
reticulofilamentoso del reticulocito. Como se describió
tinción azul o una partícula unida a un hilo filamentoso; todas las
anteriormente, el contraste de fase ayudará a distinguirlos. Si hay
células no nucleadas de cada campo deben clasificarse como glóbulos
alguna duda, los cuerpos de Pappenheimer pueden identificarse
rojos o reticulocitos. Se deben seleccionar tres frotis de sangre
al sobreteñir la película de hierro mediante la reacción de Perls.
adecuados para cada muestra y el recuento se realiza moviéndose de
La hemoglobina H sufre desnaturalización en presencia de nuevo
un campo a otro en un patrón de almenas hasta que se hayan contado
azul de metileno, lo que da como resultado cuerpos de inclusión
suficientes glóbulos rojos para satisfacer el requisito de precisión (
redondos que se tiñen de azul verdoso (ver Figura 14-4). Estos se
Tabla 3-3). El objetivo es una variación del 2%, pero esto no es práctico
pueden diferenciar fácilmente del material reticulofilamentoso (Figura
cuando la proporción de reticulocitos está en el rango de 0.01 a 0.02.
3-4).
Los cuerpos de Heinz también se tiñen con azul de metileno
nuevo, pero se tiñen con un tono de azul más claro que el
Rango de recuento de reticulocitos en salud
material reticulofilamentoso de los reticulocitos y se tiñen bien
con violeta de metilo (Figura 15-5). El rango de recuentos de reticulocitos en adultos y niños es de 50
a 100 × 109/ l (0,5% a 2,5%). Al nacer o en la sangre del cordón
umbilical, es de 120 a 400× 109/ l (2% a 5%).
Métodos de fluorescencia para realizar un
recuento de reticulocitos.
RECUENTO DE SANGRE AUTOMATIZADO
Los reticulocitos se pueden contar manualmente mediante microscopía de
fluorescencia en películas debidamente teñidas.42 Añada 1 volumen de
TÉCNICAS
solución de naranja de acridina (50 mg / 100 ml de 9 g / l de NaCl) a 1 Existe una amplia variedad de instrumentos automatizados para
volumen de sangre. Mezclar suavemente durante 2 minutos; hacer películas realizar recuentos sanguíneos. Los instrumentos semiautomatizados
en portaobjetos de vidrio, secar rápidamente y examinar con un requieren que el operador lleve a cabo algunos pasos (por ejemplo,
microscopio de fluorescencia. El ARN produce una fluorescencia de color dilución de una muestra de sangre). Los instrumentos completamente
rojo anaranjado, mientras que el material nuclear (ácido automatizados solo requieren que se presente una muestra de sangre
desoxirribonucleico, ADN) presenta una fluorescencia amarilla. Aunque la adecuada al instrumento. Los instrumentos semiautomatizados a
cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ARN, el brillo y el menudo miden una pequeña cantidad de componentes (por ejemplo,
color de la fluorescencia fluctúan y la preparación se desvanece WBC y Hb). Los instrumentos multicanal totalmente automatizados
rápidamente cuando se expone a la luz; además, requiere un microscopio suelen medir de 8 a 20 componentes para la FBC básica y el diferencial
de fluorescencia especial. Por lo tanto, no es adecuado para uso rutinario de glóbulos blancos, incluidas algunas variables que no tienen
para el recuento de reticulocitos. equivalente en las técnicas manuales. Automatizado

los instrumentos suelen tener un alto nivel de precisión que, para las
técnicas de recuento y dimensionamiento de células, es muy superior
al que se puede conseguir con técnicas manuales. Si los instrumentos
se calibran cuidadosamente y se asegura su correcto funcionamiento
mediante procedimientos de control de calidad, producirán resultados
de prueba que, en general, serán precisos. Cuando la sangre tiene
características anormales, los resultados de uno o más parámetros
pueden ser aberrantes; Los instrumentos están diseñados para que
tales resultados inconsistentes sean "marcados" para su revisión
posterior. Las características anormales que conducen a recuentos
inexactos varían entre instrumentos, por lo que es importante que los
operadores de instrumentos estén familiarizados con los tipos de
resultados facticios a los que son propensos sus instrumentos.
Los contadores de células sanguíneas pueden tener procedimientos
automatizados para el reconocimiento de muestras (por ejemplo, mediante
códigos de barras), para asegurar que se produce una mezcla adecuada de la
muestra, para tomar la muestra de prueba automáticamente y para la detección
de coágulos o muestras de tamaño inadecuado. Idealmente, la toma de muestras
de sangre se lleva a cabo perforando la tapa de un tubo cerrado para que las
muestras que conllevan un riesgo de infección se puedan manipular con la
máxima seguridad.
Los laboratorios que realizan un gran número de recuentos sanguíneos
cada día requieren contadores sanguíneos totalmente automatizados
capaces de producir rápidamente recuentos sanguíneos precisos y precisos,
incluidos recuentos de plaquetas y recuentos diferenciales, ya sea de tres
partes o de cinco a siete partes. El rendimiento de la muestra requerido
varía con la carga de trabajo y el momento de llegada de las muestras de
sangre al laboratorio, pero para la mayoría de los laboratorios grandes, se
requiere un rendimiento de 100 o más muestras por hora. El tamaño de la
muestra y la disponibilidad de un modo 'prediluido' son particularmente
relevantes si el laboratorio recibe muchas muestras pediátricas.
La elección de un instrumento para un laboratorio individual,
así como para los puntos de atención fuera del laboratorio (ver
pág. 522), debe tener en cuenta los gastos de capital y los costos
de funcionamiento, incluidos el mantenimiento y los reactivos;
tamaño del instrumento; requerimientos de servicios como agua,
aire comprimido, drenaje y suministro eléctrico con voltaje
estable; perturbación ambiental por generación de calor,
vibración y ruido; cualquier influencia en el rendimiento por la
temperatura y la humedad ambiente; requisitos de
almacenamiento para los reactivos a menudo voluminosos;
facilidad de operación; y el nivel probable de soporte que se
puede esperar del fabricante.
Se ha publicado una guía práctica sobre los principios de los
distintos sistemas,45 y existen pautas para ayudar en la elección de un
instrumento adecuado a las necesidades de un laboratorio individual y
también para evaluar su desempeño, en comparación con las
afirmaciones del fabricante, cuando se ha instalado y se está
utilizando en la práctica habitual.46 La elección del instrumento puede
ser ayudada por referencia a informes publicados de evaluaciones de
instrumentos y monografías relacionadas.45,47,48 Algunos instrumentos
semiautomáticos aspiran una muestra de volumen determinado con
precisión y, por lo tanto, pueden realizar recuentos celulares absolutos
y estimaciones precisas de Hb. La mayoría de los instrumentos
automatizados, sin embargo, cuentan para
3 Técnicas hematológicas básicas 31
un período de tiempo específico en lugar de medir un volumen exacto
de sangre; por lo tanto, requieren calibración mediante los recuentos
directos derivados de los instrumentos de recuento de células en un
volumen definido de sangre diluida. Para algunas variables, los
instrumentos son calibrados por el fabricante, pero otros requieren
calibración en el laboratorio. Las características de rendimiento de un
instrumento varían con el tiempo, por lo que se necesita una
recalibración periódica: tanto cuando los procedimientos de control de
calidad indican la necesidad como cuando se reemplazan ciertos
componentes.
HEMOGLOBINA
CONCENTRACIÓN
Algunos contadores automáticos aún miden la Hb
mediante una modificación del método HiCN manual
con reactivo de cianuro; sin embargo, los fabricantes
han cambiado sus métodos para permitir el uso de
una sustancia química no peligrosa, como el lauril
sulfato de sodio, imidazol, dodecil sulfato de sodio u
óxido de dimetil laurilamina, que evita posibles
peligros ambientales por la eliminación de grandes
volúmenes de desechos que contienen cianuro. Las
modificaciones incluyen alteraciones en la
concentración de reactivos y en la temperatura y pH
de la reacción. Se incluye un detergente no iónico para
asegurar una rápida lisis celular y reducir la turbidez
causada por las membranas celulares y los lípidos
plasmáticos. Las mediciones de la absorbancia se
realizan a varias longitudes de onda dependiendo del
hemocromógeno estable final, cianmetahemoglobina,
oxihemoglobina,
RECUENTO DE CÉLULAS DE SANGRE ROJA
Los glóbulos rojos y otros glóbulos se pueden contar en sistemas
basados en impedancia de apertura o tecnología de dispersión
de luz. Debido a que se puede contar rápidamente un gran
número de células, existe un alto nivel de precisión. En
consecuencia, los recuentos electrónicos han hecho que los
glóbulos rojos y los índices de glóbulos rojos derivados de ellos
(el MCV y el MCH) tengan una relevancia clínica mucho mayor de
lo que era posible cuando solo se disponía de un glóbulo rojo
manual lento e impreciso.
SISTEMAS DE CONTEO
Recuento de impedancia
El conteo de impedancia, descrito por primera vez por Wallace
Coulter en 1956,49 depende del hecho de que los glóbulos rojos
son malos conductores de la electricidad, mientras que ciertos
diluyentes son buenos conductores; esta diferencia forma la base
de los sistemas de conteo utilizados en Beckman Coulter, Sysmex,
Abbott, Horiba Medical y varios otros instrumentos.
 32 Hematología práctica
Para un recuento de células, la sangre se diluye altamente
en una solución de electrolitos tamponada. El caudal de esta
muestra diluida se controla mediante un sifón de mercurio
(como en el sistema Coulter original) o mediante el
desplazamiento de un pistón bien ajustado. Esto da como
resultado un volumen medido de la muestra que pasa a
través de un tubo de apertura de dimensiones específicas
(por ejemplo, 100 mm de diámetro y 70 mm de longitud).
Mediante una fuente de electricidad constante, se mantiene
una corriente continua entre dos electrodos, uno en el vaso
de muestra o en la cámara que rodea el tubo de apertura y
otro dentro del tubo de apertura. Cuando una célula
sanguínea atraviesa la abertura, desplaza parte del fluido
conductor y aumenta la resistencia eléctrica. Esto produce un
cambio correspondiente en el potencial entre los electrodos,
que dura lo que tarda el glóbulo rojo en pasar por la
abertura; la altura de los pulsos producidos indica el volumen
de las células que atraviesan la abertura. Los pulsos se
pueden mostrar en una pantalla de oscilografía. Los pulsos se
llevan a un circuito de umbral provisto de un discriminador
de amplitud para seleccionar la altura mínima del pulso, que
se contará (Figura 3-6). La altura de los pulsos se usa para
determinar el volumen de los glóbulos rojos.
Dispersión de la luz
Los glóbulos rojos y otros glóbulos se pueden contar por medio
de detectores electroópticos.50 Una suspensión celular diluida
fluye a través de una abertura para que las células pasen, en fila
india, frente a una fuente de luz; la luz es dispersada por las
células que pasan a través del haz de luz. La luz dispersa es
detectada por un fotomultiplicador o fotodiodo, que la convierte
en impulsos eléctricos que se acumulan y cuentan. La cantidad de
luz dispersada es proporcional al área de la superficie y, por lo
tanto, al volumen de la celda, de modo que la altura de los pulsos
eléctricos se puede utilizar para estimar el volumen de la celda.
Los rayos láser coherentes de alta intensidad utilizados en los
instrumentos actuales tienen ópticas superiores
Ruido de fondo
FIGURA 3-6 Efecto de la discriminación de umbral (eje horizontal) en la separación de señales de celda del ruido de fondo.
cualidades a la luz de tungsteno no coherente de instrumentos
anteriores. El flujo enfundado permite que las células fluyan en una
corriente axial con un diámetro no mucho mayor que el de un glóbulo
rojo; la luz puede enfocarse con precisión en este flujo de células. Los
detectores electroópticos se utilizan para medir y contar glóbulos
rojos en los sistemas Siemens (anteriormente Bayer-Technicon) y para
el recuento diferencial de glóbulos blancos en varios otros
instrumentos.
FIABILIDAD DE LOS CONTADORES
ELECTRÓNICOS
Los recuentos electrónicos son precisos, pero se debe
tener cuidado para que también sean precisos. El
recuento registrado en la misma muestra puede variar
de un instrumento a otro e incluso entre diferentes
modelos de instrumento del mismo fabricante. La
inexactitud puede introducirse por coincidencia (es
decir, por dos celdas que atraviesan un orificio
simultáneamente y se cuentan como una celda o por
un pulso que se genera durante el tiempo muerto
electrónico del circuito); por recirculación de células
que ya han sido contadas; por aglutinación de glóbulos
rojos (que hace que un grupo de células se cuente
como una sola célula); y contando burbujas, gotitas de
lípidos, microorganismos o partículas extrañas como
células. Un mantenimiento deficiente puede provocar
variaciones en el volumen aspirado o en el caudal.
Se puede aplicar una corrección estadística por coincidencia
(corrección de coincidencia); en algunos instrumentos, esto se realiza
automáticamente mediante edición electrónica. Los errores de
coincidencia se pueden detectar realizando una serie de mediciones
en varias diluciones de la misma muestra, trazando los datos en papel
cuadriculado y luego extrapolando el gráfico a la línea de base para el
valor real. Alternativamente, la necesidad de corrección de
coincidencia se puede evitar teniendo las dimensiones y
características de flujo de la abertura a través de la cual pasan las
celdas de tal manera que las celdas solo puedan pasar en una

expediente; esto se puede lograr mediante un flujo enfundado o un
enfoque hidrodinámico en el que se inyecta sangre diluida en una
envoltura de fluido a medida que fluye hacia la zona de detección. Esto
induce a las células a pasar por el centro de la zona de detección en
una sola fila y sin distorsiones. La coincidencia se puede reducir de
manera más efectiva con flujo enfundado y luz enfocada con precisión
en un detector electroóptico que en un contador de impedancia, de
modo que se necesita menos dilución de la muestra de sangre.46 Los
impulsos eléctricos generados por la recirculación de células pueden
eliminarse mediante edición electrónica; alternativamente, la
recirculación de células en la región de la abertura puede evitarse
mediante un "flujo de barrido" en el que una corriente dirigida de
diluyente barre las células y los residuos fuera de la abertura, evitando
así que las células se cuenten y los residuos se cuenten como células.
Los recuentos inexactos como consecuencia de la aglutinación
de glóbulos rojos suelen ser el resultado de las crioaglutininas. Se
reconocen como erróneos debido a una marcada elevación
facticia asociada del MCV. Se puede lograr un recuento correcto
precalentando la muestra de sangre y, si es necesario, también
precalentando el diluyente.
Un RBC correcto y, en particular, una medición correcta del
MCV dependen del uso de un diluyente apropiado. Para los
contadores de impedancia, el pH, la temperatura y la velocidad de
ionización deben estandarizarse y permanecer constantes porque
los cambios alteran el campo eléctrico y pueden provocar
alteraciones artificiales en el tamaño, la forma y la estabilidad de
las células sanguíneas en el diluyente. Los diluyentes deben estar
libres de partículas y dar un recuento de fondo de <50 partículas
en el volumen medido. Se debe utilizar el diluyente correcto para
cada instrumento individual; otros diluyentes, incluso los del
mismo fabricante, pueden no ser intercambiables. Cualquier
laboratorio que utilice diluyentes distintos a los recomendados
por el fabricante del instrumento debe asegurarse de que no se
está introduciendo ningún error.
Para el recuento de glóbulos rojos en contadores simples de un
solo canal, un diluyente adecuado requiere un pH de 7,0 a 7,5 y una
osmolalidad de 340 ± 10 mmol. La solución salina fisiológica (9 g / l
NaCl) o la solución salina tamponada con fosfato, ambas con las
ventajas de simplicidad y fácil disponibilidad, se pueden utilizar como
diluyente de glóbulos rojos, siempre que los recuentos se realicen
inmediatamente después de la dilución para evitar errores causados
por esfero. Las soluciones comerciales de solución salina (para uso
intravenoso) generalmente no contienen partículas. Otras soluciones
pueden requerir filtración a través de un filtro de microporos de 0,22 o
0,45 mm para eliminar el polvo.
Establecer umbrales de discriminación
Un RBC preciso requiere que se establezcan umbrales de modo que
todos los glóbulos rojos, pero un mínimo de otras células, se incluyan
en el recuento. Algunos contadores tienen un umbral inferior pero no
un umbral superior, por lo que los glóbulos blancos se incluyen en el
"RBC". Dado que el WBC suele ser muy bajo en relación con el RBC,
esto no suele tener importancia práctica; Sin embargo, se puede
introducir un error apreciable si el WBC se
3 Técnicas hematológicas básicas 33
muy elevado, sobre todo si el paciente también está anémico. El
establecimiento del umbral inferior es de considerable
importancia porque es necesario asegurar que los eritrocitos
microcíticos se incluyan en el recuento sin contar también las
plaquetas grandes.
Los instrumentos multicanal actuales, tanto los contadores de
impedancia como los contadores que utilizan tecnología de
dispersión de luz, tienen umbrales que están precalibrados por el
fabricante o que se ajustan automáticamente, según las
características de las muestras de sangre individuales. Los
instrumentos de impedancia de canal único capaces de realizar
un RBC directo requieren el establecimiento de umbrales para
separar los pulsos generados por los glóbulos rojos del ruido de
fondo y de los pulsos generados por las plaquetas. Esto se hace
ajustando la corriente de apertura y la amplificación del pulso. Un
método sencillo consiste en diluir una muestra de sangre fresca y
realizar recuentos sucesivos de la suspensión, mientras que el
control de umbral inferior se mueve de forma incremental desde
su posición máxima a su posición mínima. En la posición máxima,
el recuento debe ser cero o cercano a cero y los recuentos
aumentarán a medida que se reduzca la amplitud. Los recuentos
en cada ajuste se trazan en papel cuadriculado aritmético (Figura
3-7). El ajuste de umbral correcto está a la izquierda de la parte
horizontal del gráfico antes de que la línea comience a inclinarse.
Es importante comprobar que la configuración seleccionada sea
válida para células microcíticas. El umbral se puede definir con
mayor precisión para una muestra individual por medio de un
analizador de altura de pulso conectado al sistema de conteo. El
umbral inferior está configurado correctamente si más allá de
este punto hay <0,5% de los recuentos en el pico (modo) de la
curva de distribución del tamaño del pulso (Figura 3-6).
VOLUMEN CELULAR EMBALADO Y
VOLUMEN CELULAR MEDIO
Los contadores de células sanguíneos automatizados modernos
estiman el PCV / hematocrito mediante una tecnología que tiene poca
relación con el empaquetado de glóbulos rojos por centrifugación. Es
conveniente utilizar términos diferentes para distinguir las pruebas
manuales y automatizadas y, por esta razón, el ICSH ha sugerido que
para la medición automatizada se utilice el término
"hematocrito" (Hct) en lugar de volumen de células empaquetadas
(PCV). Sin embargo, cabe señalar que, en el pasado, estos dos
términos se han utilizado indistintamente para el procedimiento
manual.
Con los instrumentos automatizados, las derivaciones de RBC,
Hct y MCV están estrechamente relacionadas entre sí. El paso de
una celda a través de la apertura de un contador de impedancia o
a través del haz de luz de un instrumento de dispersión de luz
conduce a la generación de un pulso eléctrico, cuya altura es
proporcional al volumen de la celda. El número de pulsos
generados permite determinar los glóbulos rojos, como se
discutió anteriormente. El análisis de la altura del pulso permite
determinar el MCV o el Hct. Si se calcula la altura de pulso
promedio, esto es indicativo del MCV y el Hct puede derivarse
multiplicando el MCV estimado por el RBC.
 34 Hematología práctica
FIGURA 3-7 Método para establecer las condiciones de trabajo de los contadores de células. El ajuste correcto del umbral (en flecha) está destinado a excluir los
pulsos de ruido sin pérdida de los pulsos de señal producidos por las células sanguíneas.
De manera similar, si se suman las alturas de pulso, esta cifra
es indicativa del Hct y el MCV puede, a su vez, derivarse
dividiendo el Hct por el RBC.
Los instrumentos automatizados requieren calibración antes de
poder determinar el Hct o el MCV. La calibración del Hct puede
basarse en determinaciones manuales de PCV. Alternativamente, el
MCV puede calibrarse por medio de las alturas de pulso generadas
por perlas de látex, células estabilizadas o algún otro calibrante que
contenga partículas de tamaño conocido; sin embargo, los glóbulos
rojos humanos no fijados que son bicóncavos y flexibles no mostrarán
necesariamente las mismas características en un contador celular que
las partículas de látex o algún otro calibrante artificial. Las
preparaciones certificadas BCR (Bureau Communautaire de Référence)
están disponibles en el Instituto de Materiales y Medidas de
Referencia (IRMM) (https: //ec.europa. eu / jrc / es / institutos / irmm).
Los sistemas de impedancia de apertura miden un volumen aparente
que es mayor que el volumen real, siendo influenciado por un 'factor
de forma';52 este factor es menos de 1,1 para los glóbulos rojos
jóvenes y flexibles; Entre
1.1 y 1.2 para células bicóncavas fijas; y aproximadamente 1,5
para esferas, ya sean células fijas o esferas de látex.50,51
El MCV, y por lo tanto el Hct, según lo determinado por un
contador automático, variará con ciertas características de la celda
distintas del volumen. Como se indicó anteriormente, tales
características incluyen la forma, que a su vez está determinada en
parte por la flexibilidad. Con los contadores de impedancia, el glóbulo
rojo en forma de disco normal se alarga en forma de cigarro a medida
que pasa a través de la abertura; esto se debe a la deformación en
respuesta a la fuerza de corte, que se produce en las células de
flexibilidad normal. Las células con una concentración de hemoglobina
reducida sufren más elongación que las células normales; esto
conduce a un 'factor de forma' reducido, una altura de pulso reducida
en relación con el tamaño real de la celda y una subestimación
del MCV. Por el contrario, las células con membranas anormalmente
rígidas y las células como los esferocitos con una alta concentración
de hemoglobina sufrirán menos deformaciones de lo normal y se
sobrestimará el MCV. Los instrumentos de dispersión de luz anteriores
también subestimaron el volumen de glóbulos rojos con una
concentración de hemoglobina reducida porque la dispersión de luz
se vio afectada por la concentración de hemoglobina.52 Estos
artefactos se observan incluso con glóbulos rojos normales de
concentración variable de hemoglobina, pero son más evidentes con
glóbulos rojos de pacientes con defectos en la síntesis de
hemoglobina, como los de pacientes con deficiencia de hierro. Se han
desarrollado instrumentos de dispersión de luz para evitar artefactos
de este tipo. Las células están esféricas isovolumétricamente; Las
características de dispersión de luz de los glóbulos rojos esféricos son
predecibles y permiten el cálculo tanto del volumen celular individual
como de la concentración de hemoglobina intracelular utilizando un
mapa Mie calibrado que describe las características de dispersión y
refracción de las partículas esféricas en una fuente de luz
monocromática.53
La dispersión de luz de cada célula individual se mide en dos
ángulos: dispersión de ángulo bajo a 2–3 ° y dispersión de ángulo
alto a 5–15 grados, lo que permite calcular tanto el volumen
celular como la concentración de hemoglobina.52 La medida de la
hemoglobina celular se designa como la media de concentración
de hemoglobina celular (CHCM) para distinguirla de la MCHC
tradicional derivada de la Hb y la PCV. Si todas las mediciones son
precisas, el CHCM y el MCHC deberían dar los mismos resultados,
proporcionando así un mecanismo de control de calidad interno.
El MCV y Hct automatizados son propensos a ciertos
errores que no ocurren o son un problema menor con los
métodos manuales. Estos incluyen los resultantes de
microcoágulos o coagulación parcial de la muestra, extrema

microcitosis y presencia de crioglobulinas o aglutininas frías; la última
es una causa relativamente común de elevación facticia del MCV
porque los grupos de células tienen el tamaño como si fueran células
individuales. Debido a que se subestima el RBC, el Hct se ve menos
afectado, aunque también es inexacto. Es raro que las aglutininas
calientes causen un problema similar. La anemia falciforme puede
provocar un aumento facticio del MCV y del Hct, mientras que las
alteraciones de la osmolaridad plasmática que se producen, por
ejemplo, en la hiperglucemia grave, también provocan un aumento
facticio del MCV y del Hct.48,54,55
ÍNDICES DE CÉLULAS ROJAS
Los índices de glóbulos rojos han sido tradicionalmente los
parámetros derivados de MCV, MCH y MCHC; más recientemente,
también se ha incluido el ancho de distribución de glóbulos rojos
(RDW) y, para algunos instrumentos, el ancho de distribución de
hemoglobina (HDW). Estos índices pueden proporcionar una base
para clasificar las anemias y en diversas combinaciones se han
utilizado para ayudar a distinguir entre la deficiencia de hierro y
las talasemias.56–58 Sin embargo, es importante señalar que estas
fórmulas pueden no ser consistentes entre diferentes
instrumentos y su uso proporciona solo una guía para el
diagnóstico más probable. Cuando el diagnóstico es importante,
como en el cribado preconceptual o prenatal de talasemia, se
requieren pruebas definitivas, incluso en pacientes cuyos índices
de glóbulos rojos son más sugestivos de deficiencia de hierro.
Volumen celular medio
Como se describió anteriormente, en la mayoría de los sistemas
automatizados, el MCV se mide directamente, pero en los contadores
semiautomatizados, el MCV se calcula dividiendo el Hct por el RBC.
Así, por ejemplo, si el Hct es 0,45 (es decir, 0,45 l de glóbulos
rojos por litro de sangre) y el RBC es 5 × 1012 por litro:
Volumen de 1 celda = 0,45¸5´1012
= 90 femtolitros(Florida)
Hemoglobina celular media y concentración
de hemoglobina celular media
MCH se deriva de la Hb dividida por RBC.
Así, por ejemplo, si hay 150 g de hemoglobina y 5 × 10
12 glóbulos rojos por litro:
MCH = 150 ¸ 5´1012 = 3 ¸1011 gramo
= 30 picogramos(pg)
El MCHC se deriva de la manera tradicional (ver
pag. 24) a partir de la Hb y el Hct con instrumentos que
miden el Hct y calculan el MCV, mientras que cuando
se mide directamente el MCV y se calcula el Hct, el
3 Técnicas hematológicas básicas 35
MCHC se deriva de la Hb, MCV y RBC de acuerdo con la
siguiente fórmula:
Media pensión(g / l)´1000
MCHC(g / l)=
MCV(Florida)´RBC´10-12/ l
Por ejemplo, si la Hb es 150 g / l, el MCV es 90 fl y el
RBC es 5 × 1012/ l:
1000
MCH = 150 ´
90´5
= 333 g / l
Cuando se introdujeron los contadores automáticos, se observó
que una MCHC reducida, que con métodos manuales había sido un
indicador útil de hipocromía en la deficiencia de hierro temprana, era
un indicador menos sensible de desarrollar deficiencia de hierro. La
explicación de esto es compleja. En la deficiencia de hierro, no solo
hay hipocromía verdadera, sino que también aumenta el
atrapamiento de plasma dentro de la columna de glóbulos rojos en un
tubo de microhematocrito que aumenta la PCV y exagera la
disminución de la MCHC. El MCHC reducido es, por tanto, en parte un
fiel reflejo de la hipocromía y en parte un artefacto. Cuando la MCHC
se obtiene mediante contadores automáticos, el artefacto de un
mayor atrapamiento de plasma ya no está presente, pero los
instrumentos también son menos sensibles a una reducción real de la
MCHC debido a la subestimación del tamaño de los glóbulos rojos
hipocrómicos descrita anteriormente. Debido a que el MCHC se calcula
a partir de la fórmula dada anteriormente, la subestimación del MCV
conduce a una sobreestimación del MCHC. Por tanto, la MCHC
muestra poca alteración a medida que las células se vuelven
hipocrómicas. Donde está disponible CHCM, es un equivalente medido
más directamente del MCHC. Esto proporciona una mayor sensibilidad
a la deficiencia de hierro porque la verdadera MCHC y la CHCM
disminuyen a medida que se desarrolla la hipocromía.59
VARIACIONES EN LOS VOLÚMENES DE
CÉLULAS ROJAS: CÉLULA ROJA
ANCHO DE DISTRIBUCIÓN
Los instrumentos automatizados producen histogramas de
distribución de volumen que reflejan el grado de variación en el
tamaño de las células y permiten identificar la presencia de más de
una población de células. Los instrumentos también pueden evaluar el
porcentaje de células que se encuentran por encima y por debajo de
los umbrales de MCV dados y "marcar" la presencia de un mayor
número de microcitos o macrocitos. Tales medidas pueden indicar la
presencia de un aumento pequeño pero significativo en el porcentaje
de microcitos o macrocitos antes de que haya habido algún cambio en
el MCV.
La mayoría de los instrumentos también producen una medición
cuantitativa de la variación en el volumen celular, equivalente a la
evaluación microscópica del grado de anisocitosis. Este parámetro se
ha denominado 'distribución de glóbulos rojos
 36 Hematología práctica
ancho'. El RDW se deriva del análisis de la altura del pulso y se
puede expresar como la desviación estándar (SD) en fl o
como el coeficiente de variación (CV) (como porcentaje) de las
mediciones del volumen de glóbulos rojos. El RDW SD se
mide calculando el ancho en fl al nivel de altura del 20% del
histograma de distribución del tamaño de los glóbulos rojos,
y el RDW CV se calcula matemáticamente como el coeficiente
de variación; es decir, RDW (CV)% = (1SD / MCV)× 100.
La mayoría de los instrumentos expresan el RDW como SD,
pero los instrumentos Sysmex y el Beckman Coulter DxH lo
expresan tanto como SD como CV. El rango de referencia normal
es del orden del 12,8%± 1,2% como CV y 42,5 ± 3,5 fl como SD.
Sin embargo, se han informado rangos muy diferentes; por lo
tanto, es importante que los laboratorios determinen sus propios
rangos de referencia. Se ha encontrado que el RDW expresado
como el CV tiene algún valor para distinguir entre la deficiencia
de hierro (RDW generalmente aumenta) y el rasgo de talasemia
(RDW generalmente es normal) y entre la anemia megaloblástica
(RDW a menudo aumenta) y otras causas de macrocitosis (RDW
más a menudo normal) .
PORCENTAJE HIPOCRÓMICO
CÉLULAS ROJAS Y
VARIACIÓN EN LA HEMOGLOBINIZACIÓN
DE CÉLULAS ROJAS:
ANCHO DE DISTRIBUCIÓN DE
HEMOGLOBINAS
Los instrumentos que determinan la concentración de
hemoglobina de los glóbulos rojos individuales proporcionan el
porcentaje de glóbulos rojos hipocrómicos, con curvas de
distribución de la concentración de hemoglobina, y pueden
señalar la presencia de un mayor número de glóbulos
hipocrómicos o hipercrómicos. El porcentaje de glóbulos rojos
hipocrómicos depende de la concentración de hemoglobina en
las células individuales en lugar de ser una media, como MCH o
MCHC. Es un marcador más sensible de la disponibilidad de
hierro para la eritropoyesis porque se pueden medir pequeños
cambios en el número de glóbulos rojos con hemoglobina
inadecuada antes de que se produzca un cambio apreciable en la
MCHC. Los eritrocitos hipocrómicos se definen como células con
una concentración de hemoglobina inferior a 280 g / l (28 g / dl).60
En la población sana el porcentaje de eritrocitos hipocrómicos no
supera el 2,5% y valores superiores a éste son indicativos de
eritropoyesis por deficiencia de hierro.61 Se ha informado que es un
indicador útil de la deficiencia funcional de hierro (donde las reservas
de hierro reticuloendotelial son normales o incluso altas, pero el
hierro no se administra a los eritroblastos y, por lo tanto, no está
disponible para la eritropoyesis) en pacientes en hemodiálisis. Los
instrumentos de otros fabricantes tienen diferentes parámetros que
se informa que son equivalentes al porcentaje de glóbulos rojos
hipocrómicos, como la baja densidad de hemoglobina (LHD%) en
algunos instrumentos Beckman Coulter.62 LHD% se deriva de una
transformación sigmoidea
del MCHC y se ha propuesto como un parámetro para evaluar las
reservas de hierro disponibles para la eritropoyesis.
El grado de variación en la hemoglobinización de los
glóbulos rojos se cuantifica como HDW; este es el CV de las
medidas de concentración de hemoglobina de células
individuales. El rango normal del 95% es de 1,82 a 2,64.
Debido a que se determina el volumen de los eritrocitos
individuales, es posible distinguir entre microcitos
hipocrómicos, que son indicativos de un defecto en la síntesis
de hemoglobina, y macrocitos hipocrómicos, que a menudo
representan reticulocitos.63 Un mayor porcentaje de células
hipercrómicas puede resultar de la presencia de esferocitos,
células contraídas irregularmente o células falciformes.
RECUENTO DE GLÓBULOS BLANCOS
El WBC se determina en sangre completa en la que se han lisado
los glóbulos rojos. Se requiere que el agente lítico destruya los
glóbulos rojos y reduzca el estroma de los glóbulos rojos a un
residuo que no cause una respuesta detectable en el sistema de
recuento sin afectar a los leucocitos de tal manera que se altere la
capacidad del sistema para contarlos. Varios fabricantes
recomiendan reactivos específicos, y para los instrumentos
multicanal que también realizan un recuento diferencial
automático, el uso del reactivo recomendado es esencial. Para un
simple contador de impedancia de un solo canal, el siguiente
fluido es satisfactorio:
Cetrimida 20 g
Formaldehído al 10% (en 9 g / l de NaCl) 2ml
Ácido acético glacial 16ml
NaCl 6 g
Agua a 1 litro
También se encuentran disponibles instrumentos relativamente
simples que determinan la Hb y el WBC mediante mediciones
consecutivas en una sola muestra de sangre. El diluyente contiene un
reactivo para lisar los glóbulos rojos y otro para convertir la
hemoglobina en hemiglobincianuro. La Hb se mide mediante un
método HiCN modificado y los glóbulos blancos se cuentan mediante
tecnología de impedancia. Aparte de los reactivos especificados por
los fabricantes, se puede utilizar un diluyente que contenga cianuro de
potasio y ferricianuro de potasio junto con bromuro de
etilhexadecildimetilamonio.64,sesenta y cinco
Los instrumentos multicanal totalmente automatizados realizan
leucocitos mediante impedancia o tecnología de dispersión de luz, o
ambas. Las partículas residuales en una muestra de sangre diluida se
cuentan después de la lisis de glóbulos rojos o, en el caso de algunos
instrumentos de dispersión de luz, después de que los glóbulos rojos
se hayan vuelto transparentes. Los umbrales se establecen para
excluir las plaquetas normales del recuento, aunque se incluyen las
plaquetas gigantes. Por lo general, se incluyen algunos o todos los
NRBC presentes, de modo que cuando tales células están presentes, el
recuento se aproxima más al TNCC que al WBC.
En ocasiones, se producen glóbulos blancos automatizados con un bajo nivel real
como consecuencia de la aglutinación de leucocitos, el almacenamiento prolongado de
muestras o células anormalmente frágiles (por ejemplo, en la leucemia).
 3 Técnicas hematológicas básicas 37

Los recuentos facticiamente altos son más comunes y generalmente son el TABLA 3-4
resultado de una falla en la lisis de los glóbulos rojos. Con ciertos
instrumentos, esto puede ocurrir con las células de los recién nacidos o ser CONTADORES DE SANGRE AUTOMATIZADOS CON
consecuencia de uremia o de la presencia de una hemoglobina anormal UNA CAPACIDAD DE RECUENTO DIFERENCIAL DE
como la hemoglobina S o la hemoglobina C; Los recuentos altos también CINCO PARTES O MÁS*
pueden ser el resultado de microcoágulos, aglutinación de plaquetas o la
Instrumento y Tecnología utilizada para
presencia de una crioglobulina.
Fabricante Cuenta diferencial

Beckman Coulter GEN-S, Impedancia con baja frecuencia

Serie LH, DxH
DIFERENCIAL AUTOMATIZADO Impedancia de corriente
electromagnética con alta frecuencia
CONTAR Corriente electromagnética
Dispersión de luz láser
La mayoría de los contadores diferenciales automatizados Sysmex SE, serie X (XE, Impedancia con baja frecuencia
que están disponibles ahora utilizan citometría de flujo XT, XN) corriente continua
incorporada en un contador de sangre completo en lugar de Impedancia con radiofrecuencia
ser contadores diferenciales independientes. Cada vez más, Actual
los contadores automáticos de células sanguíneas tienen una Citometría de flujo de fluorescencia
capacidad de recuento diferencial, que proporciona un Serie Siemens Advia Dispersión de luz y absorbancia

recuento diferencial de tres partes o de cinco a siete partes. siguiente reacción de peroxidasa
Dispersión de luz de dos ángulos siguiente
Los recuentos se realizan en sangre completa diluida en la
stripping citoplásmico
que los glóbulos rojos se lisan o se vuelven transparentes. Un
diferencial
recuento diferencial de tres partes asigna células a categorías
Abbott Cell-Dyn 3500, Cuatro parámetros de dispersión de luz:
generalmente designadas (1) "granulocitos" o "células 4000, zafiro dispersión de luz hacia adelante,
grandes"; (2) 'linfocitos' o 'células pequeñas'; y (3) 'monocitos', dispersión de luz ortogonal, dispersión
'células mononucleares' o 'células intermedias'. En teoría, la de luz de ángulo estrecho y dispersión
categoría de granulocitos incluye eosinófilos y basófilos,66 de luz ortogonal despolarizada
Algunos otros diferenciales de tres partes clasifican a los
leucocitos como proporción de leucocitos-células pequeñas Pentra médico de Horiba Impedancia eléctrica con intacta
(equivalente a linfocitos), proporción de glóbulos blancos- serie células y después de la eliminación
citoplásmica diferencial
células medias (equivalente a monocitos, eosinófilos y
Absorbancia de luz
basófilos) y proporción de glóbulos blancos-células grandes
Serie Mindray BC Impedancia con baja frecuencia
(equivalente a neutrófilos).67
corriente continua
Los recuentos diferenciales de cinco a siete partes clasifican las Impedancia de citometría de flujo de
células como neutrófilos, eosinófilos, basófilos, linfocitos y monocitos Nihon – Kohden MEK fluorescencia con baja frecuencia
y en un recuento diferencial extendido también pueden incluir serie corriente continua
granulocitos inmaduros o células inmaduras grandes (compuestas de Citometría de flujo de fluorescencia
blastos y granulocitos inmaduros) y linfocitos atípicos (incluidos
* Además de los contadores de sangre que se enumeran aquí, hay un número cada vez mayor
blastos pequeños ). Los instrumentos automatizados que realizan
de instrumentos en el mercado, algunos de los cuales son pequeños analizadores de mesa,
recuentos diferenciales (que no enumeran granulocitos inmaduros o mientras que otros están diseñados para pruebas en el punto de atención, que son
NRBC por separado) pueden marcar o rechazar los recuentos de la capaces de proporcionar un diferencial completo o recuentos diferenciales parciales
mayoría de las muestras con NRBC, mielocitos, promielocitos, blastos utilizando diversas tecnologías.

o linfocitos atípicos. En menor medida, los instrumentos que

incorporan un recuento diferencial de tres partes, aunque no son
capaces de enumerar eosinófilos o basófilos como categorías
individuales de células, pueden marcar una proporción significativa de
muestras que tienen un número mayor de uno de estos tipos de
células.
Tanto los contadores de impedancia como los instrumentos de
dispersión de luz son capaces de producir recuentos diferenciales de
tres partes a partir de un solo canal; la categorización se basa en el
volumen diferente de varios tipos de células después de la lisis parcial
y la contracción citoplasmática. La mayoría de los recuentos
diferenciales de cinco a siete partes requieren dos o más canales en
los que el volumen celular y otras características se analizan mediante
diversas modalidades (Tabla 3-4). El análisis puede depender solo del
volumen y otras características físicas de la celda o también
sobre la unión de ciertos colorantes a los gránulos o la actividad de
enzimas celulares como la peroxidasa. Las tecnologías utilizadas para
estudiar las características de las células incluyen la dispersión de la
luz y las mediciones de absorbancia e impedancia con corriente
electromagnética de baja y alta frecuencia o corriente de
radiofrecuencia. Las células pueden haber estado expuestas a agentes
líticos o puede haber ocurrido una reacción citoquímica antes de que
se estudien las características de las células. El análisis de dos
parámetros o funciones discriminantes más complejas dividen las
células en grupos que pueden coincidir con la posición de los diversos
grupos de glóbulos blancos en la sangre normal. Los umbrales,
algunos fijos y otros variables, dividen los grupos entre sí, lo que
permite contar las células de cada grupo.
 38 Hematología práctica
Los contadores diferenciales automatizados que utilizan citometría de
flujo cuentan un número mucho mayor de células de lo que es posible con
un recuento diferencial manual. En consecuencia, los recuentos
automatizados son mucho más precisos que los recuentos manuales. La
precisión de los contadores automatizados es menos impresionante que su
precisión. Con todos los tipos de contadores, las características celulares
inusuales o el envejecimiento de una muestra de sangre pueden provocar
una clasificación errónea de las células. Aunque la mayoría de las muestras
que contienen células anormales están marcadas, no siempre es así; la
presencia de NRBC, granulocitos inmaduros, linfocitos atípicos y blastos
(incluso ocasionalmente un gran número de blastos) puede no dar lugar a
una bandera. Sin embargo, los observadores humanos que realizan un
recuento diferencial manual de 100 células también pasan por alto
anomalías significativas. En general, Los recuentos automatizados se han
comparado favorablemente con los recuentos manuales de rutina,
especialmente si a los instrumentos se les asignan solo dos funciones,
realizar recuentos diferenciales en muestras normales y marcar muestras
anormales. Si se señalan anomalías morfológicas, siempre debe realizarse
un examen microscópico de un frotis de sangre teñido.
El Sysmex XN tiene algunas tinciones y algoritmos diferentes para
mejorar el marcado, en comparación con las series XE y XT anteriores.
El canal diferencial de WBC tiene una mejor separación de los
linfocitos y monocitos, reduciendo el número de falsos positivos para
la bandera de linfocitos atípicos. En el canal de glóbulos rojos
nucleados de WBC, se realiza un recuento de NRBC en todas las
muestras sin la necesidad de volver a analizar la muestra. En el canal
de precursores de WBC, si el indicador combinado de linfocitos /
blastos anormales es positivo, se realizan más análisis reflejos para
distinguir los linfocitos anormales de los blastos y para eliminar el
indicador si es falsamente positivo. Hay recuentos extendidos
automáticos para glóbulos blancos bajos y plaquetas para mayor
exactitud y precisión.68 Se ha demostrado que el canal precursor de
WBC es útil en recién nacidos y niños, ya que hay muchos menos
linfocitos anormales y blast flags sin pérdida de sensibilidad o
especificidad.69
LA INMADURA AUTOMATIZADA
RECUENTO DE GRANULOCITOS
La mayoría de los analizadores totalmente automatizados ahora informan
un recuento de granulocitos inmaduros. Los promielocitos, mielocitos y
metamielocitos se incluyen todos en el recuento automático de
granulocitos inmaduros, pero no se identifican como clases separadas de
células. La presencia de un número reducido de granulocitos inmaduros se
detecta de forma más fiable en analizadores hematológicos automatizados
que mediante microscopía manual, debido al mayor número de células
contadas. A menudo, un número bajo de granulocitos inmaduros,
particularmente en muestras leucopénicas o cuando hay pequeños
porcentajes, se pasa por alto en un recuento diferencial de 100 células o en
una revisión de la película. Los granulocitos inmaduros pueden identificarse
mediante una combinación de absorbancia de luz (después de la tinción de
las células) e impedancia o mediante citometría de flujo para detectar la luz
de dispersión lateral y la fluorescencia de las células teñidas con un
colorante fluorescente. Medición
de granulocitos inmaduros puede ser clínicamente relevante. Se
ha encontrado, por ejemplo, que el porcentaje de granulocitos
inmaduros medido por el Sysmex XE-2100 es predictivo de
infección, aunque debe tenerse en cuenta que no es más
predictivo que el recuento absoluto de neutrófilos.70
Algunos instrumentos no cuantifican los granulocitos inmaduros y
aún se basan en un indicador de glóbulos blancos anormal generado
por el analizador para indicar su posible presencia en la muestra de
sangre.
Para los instrumentos que no informan un recuento de NRBC,
los recuentos diferenciales automatizados a menudo incluyen
algunos, pero no todos, los NRBC en el total de 'WBC'; por tanto,
en presencia de un número significativo de NRBC, el recuento
total no es un verdadero "WBC" ni un verdadero "TNCC" y los
recuentos absolutos de WBC calculados a partir del total serán
necesariamente algo erróneos. Esto difiere de la situación con
instrumentos anteriores que incluían cualquier NRBC en el 'WBC'.
Puede ser posible hacer alguna evaluación de la proporción de
NRBC incluidos en el recuento total mediante el estudio de la
salida gráfica del instrumento; de lo contrario, si se necesitan
recuentos absolutos precisos de diferentes tipos de leucocitos, es
necesario volver a instrumentos anteriores para proporcionar el
TNCC y corregirlo a un WBC por medio de un recuento diferencial.
EL RECUENTO AUTOMATIZADO DE
CÉLULAS ROJAS NUCLEADAS
La capacidad de los instrumentos de hematología para realizar
recuentos de NRBC automatizados precisos en todo el rango de
concentración en sangre periférica ofrece ventajas para el
laboratorio de diagnóstico. La enumeración de NRBC es
importante porque su presencia puede tener un efecto directo
sobre la precisión del WBC en algunos contadores de células
sanguíneas. El WBC correcto anteriormente solo se obtenía
mediante el examen de un frotis de sangre periférica. Los NRBC
se informan como el número por 100 glóbulos blancos y la resta
del número de NRBC del recuento total de nucleados da el WBC
correcto. La corrección morfológica del WBC puede ser inexacta
ya que si el tamaño nuclear de un NRBC cae por debajo del
umbral de glóbulos blancos del instrumento, estas células no se
incluyen en el WBC automatizado en primer lugar. Los
instrumentos actualmente en uso que cuentan automáticamente
los NRBC y corrigen el WBC para la interferencia de NRBC
incluyen el Abbott Sapphire; el Sysmex XE-2100, XE-500 y XN; el
Beckman Coulter LH750 y DxH; el Horiba Medical Pentra DX120 y
el Siemens Advia 2120.
Los instrumentos determinan los NRBC tiñéndolos con un
tinte nuclear y usando dispersión de luz láser de
fluorescencia o citometría de flujo para separarlos de WBC o
una combinación de impedancia y volumen celular. Los
instrumentos de Beckman Coulter utilizan mediciones de
dispersión y conductividad del volumen celular. El Siemens
Advia 2120 utiliza densidad nuclear y grado de tinción con
peroxidasa. El WBC y el diferencial se corrigen por la
presencia de NRBC cuando es necesario.

El método de recuento de NRBC en algunos instrumentos no
es una medida directa de las células y existe la posibilidad de que
otras sustancias interferentes en la sangre ocupen la posición de
firma de NRBC y produzcan resultados falsos positivos.
ANÁLISIS DE IMÁGENES DIGITALES
AUTOMATIZADO DE CÉLULAS SANGUÍNEAS
Durante los últimos 20 años, se han comenzado a introducir procesos
de obtención de imágenes automatizados en los que un microscopio
informático escanea las extensiones de sangre teñidas y clasifica los
leucocitos; Los primeros métodos eran lentos y tenían dificultades
para clasificar las células anormales y, como sólo se contaba una
pequeña cantidad de células en un tiempo razonable, la precisión del
recuento automático no era mejor que la del recuento manual.71 Sin
embargo, con la tecnología informática mejorada y con el uso de
redes neuronales artificiales, tales instrumentos (por ejemplo,
CellaVision DM96 AB, Lund, Suecia, www. cellavision.comy HemoFAXS,
Tissuegnostics GmbH, Wein, Austria, www.tissuegnostics.com) ahora
son capaces de proporcionar un recuento diferencial útil en muestras
de sangre, incluso aquellas que contienen células anormales.72 El
DM96 está compuesto por una unidad de escaneo de diapositivas y
una computadora. La unidad de escaneo consta de un microscopio
motorizado y una cámara de dispositivo de carga acoplada digital
(CCD). El instrumento escanea el frotis de sangre teñido, identifica
posibles glóbulos blancos, toma imágenes digitales de ellos y utiliza
un software basado en redes neuronales artificiales para analizar las
células. Se pueden procesar hasta 30 películas por hora. Las imágenes
digitales de las células preclasificadas se presentan al operador en una
pantalla de computadora para su conformación o reclasificación. El
operador del instrumento debe ser experto en morfología de células
sanguíneas para aceptar o reclasificar con precisión las células
presentadas.73
NUEVOS PARÁMETROS DE CÉLULAS BLANCAS
Muchos instrumentos pueden señalar la presencia de leucocitos anormales
mediante características como una alteración en el tamaño celular, el
tamaño nuclear o la granularidad celular que provocan cambios en la
impedancia o las características de dispersión de la luz. Los contadores
automáticos de glóbulos blancos también pueden analizar las
características de las células mediante tecnologías novedosas e identificar
los tipos de células por características que difieren mucho de las que se
utilizan cuando se examina visualmente un frotis de sangre. Es posible, por
ejemplo, identificar los eosinófilos por la capacidad de sus gránulos para
polarizar la luz.74 o para detectar un desplazamiento a la izquierda o la
presencia de blastos por la reducción de la dispersión de luz de los núcleos
de granulocitos más inmaduros. También existe la posibilidad de producir
información que no sea directamente análoga a la disponible en un
recuento diferencial manual. Recientemente, se ha informado que los
parámetros diferenciales de glóbulos blancos demuestran utilidad clínica en
el diagnóstico de algunas enfermedades. Las poblaciones de células
anormales que anteriormente solo habían activado una bandera, en
algunos instrumentos, ahora se pueden cuantificar.
3 Técnicas hematológicas básicas 39
Los datos numéricos (coordenadas) generados por los
analizadores Beckman Coulter que utilizan volumen, conductividad y
dispersión (VCS) ya están disponibles. Estas coordenadas, que indican
la posición y el tamaño del grupo celular en la gráfica diferencial de
VCS, están disponibles para neutrófilos, linfocitos, monocitos y
eosinófilos, y las células de cada tipo celular tienen valores normales.
Se cree que cualquier desviación de lo normal refleja diferencias en el
tamaño y la complejidad de las células y puede ser indicativo de un
proceso patológico potencial o específico de una característica
morfológica. Estos parámetros todavía son solo para uso de
laboratorio, pero es posible utilizarlos como indicadores avanzados
para enfermedades o afecciones específicas en determinadas
circunstancias clínicas. Los parámetros posicionales de los linfocitos se
pueden utilizar para distinguir entre diferentes trastornos
linfoproliferativos e infecciones virales.75 La conductividad de
neutrófilos y la dispersión de neutrófilos se pueden utilizar en la
detección de neutrófilos displásicos,76
con valores bajos para estos parámetros que se correlacionan con la
hipogranularidad de los neutrófilos.
El desplazamiento a la izquierda de neutrófilos asociado a sepsis puede
identificarse mediante un cambio de los valores normales del volumen de
neutrófilos y puede usarse como un indicador de infecciones bacterianas
agudas.77
Se ha sugerido que el VCS y otros parámetros del instrumento
utilizados para definir los tipos de leucocitos también podrían permitir
la detección de la presencia de pigmento de la malaria en los glóbulos
blancos o en monocitos más grandes de lo normal y se pueden utilizar
como prueba de detección de la malaria.78,79
De manera similar para otros instrumentos, utilizando luz de
dispersión directa y fluorescencia, se han desarrollado nuevos
parámetros sobre la base de las posiciones anormales de los
leucocitos en el diagrama de dispersión diferencial. Las células
plasmáticas aparecen en un área de alta fluorescencia del grupo
de linfocitos en el canal diferencial del Sysmex XE-2100 y se
señalan como linfocitos atípicos; ahora pueden cuantificarse.80 En
el mismo instrumento, NEUT-X es el valor medio de la difracción
de dispersión lateral de la población de neutrófilos; representa la
estructura interna de los neutrófilos. Se correlaciona con la
hipogranularidad de los neutrófilos y, cuando se toma en
consideración con la anemia, sugiere un síndrome
mielodisplásico.81 Los instrumentos como los analizadores
Siemens Advia que incorporan una reacción citoquímica brindan
información sobre la actividad enzimática expresada como el
índice medio de actividad peroxidasa (MPXI). Se ha observado un
aumento de MPXI en infecciones, en algunos síndromes
mielodisplásicos y leucemias, en el síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA) y en la anemia
megaloblástica, mientras que una reducción de MPXI ocurre en la
deficiencia de peroxidasa de neutrófilos heredada y adquirida.59,82
,83 Estos nuevos parámetros proporcionan valores numéricos para
los cambios que un operador experimentado puede ver en los
diagramas de dispersión de los instrumentos. Tales mediciones
tienen potencial de utilidad clínica y pueden permitir el desarrollo
de indicadores de enfermedades específicas y nuevos indicadores
de anomalías.
 40 Hematología práctica
INSTRUMENTO AUTOMATIZADO
GRÁFICOS
Los instrumentos totalmente automatizados producen una visualización
gráfica de gran parte de los datos producidos. Esto se muestra en un
monitor a color y se puede imprimir, ya sea en blanco y negro o en color. La
inspección de la pantalla gráfica puede proporcionar información adicional
más allá de la que está disponible a partir de la evaluación de los datos
numéricos. Las pantallas generalmente incluyen histogramas de glóbulos
rojos, glóbulos blancos y tamaño de plaquetas y, a veces, histogramas de
concentración de hemoglobina de glóbulos rojos y diagramas de dispersión
del tamaño frente a la concentración de hemoglobina. Los recuentos
diferenciales se representan gráficamente como diagramas de dispersión
de dos variables o diagramas de dispersión de funciones discriminantes
derivadas de más de dos variables.
Las impresiones típicas de histogramas o diagramas de dispersión de
los instrumentos automatizados actuales se muestran en Figura 3-8.
RECUENTO DE PLAQUETAS
Las plaquetas se pueden contar en sangre completa utilizando las
mismas técnicas de detección eléctrica o electroóptica que se
utilizan para el recuento de glóbulos rojos. Se necesita un umbral
superior para separar las plaquetas de los glóbulos rojos y un
umbral inferior para separar las plaquetas de los desechos y el
ruido electrónico. Debe evitarse la recirculación de glóbulos rojos
cerca de la apertura, porque los pulsos producidos pueden
simular los generados por las plaquetas. Se han utilizado tres
técnicas para establecer umbrales: (1) las plaquetas se pueden
contar entre dos umbrales fijos (por ejemplo, entre 2 y 20 fl);
(2) los pulsos entre umbrales fijos pueden contarse con el ajuste
posterior de una curva y extrapolación de modo que las plaquetas que
caen fuera de los umbrales fijos se incluyan en el recuento calculado; y
(3) los umbrales pueden variar automáticamente, dependiendo de las
características de las muestras de sangre individuales, para tener en
cuenta los glóbulos rojos microcíticos o fragmentados o las plaquetas
gigantes. Los recuentos de plaquetas de impedancia realmente baja
pueden ser el resultado de la identificación de plaquetas gigantes
como glóbulos rojos o de la aglutinación plaquetaria inducida por
EDTA o el satelitismo (v. Pág. 91). De manera engañosa, los recuentos
altos de plaquetas pueden deberse a glóbulos rojos marcadamente
microcíticos o fragmentados, a fragmentos de glóbulos blancos en la
leucemia84 oa bacterias u hongos.
Se ha introducido un recuento de plaquetas de fluorescencia
óptica en algunos analizadores Sysmex, además del recuento de
impedancia tradicional.85 Se utiliza un tinte para teñir el ARN de los
reticulocitos y las membranas y los gránulos de las plaquetas. La
tinción fluorescente de las plaquetas permite la exclusión de las
partículas no plaquetarias del recuento y también permite la inclusión
de plaquetas grandes o gigantes. Sin embargo, para las muestras de
pacientes sometidos a quimioterapia citotóxica, el recuento de
impedancia a veces es más preciso. Esto probablemente se deba a la
tinción errónea de los fragmentos de glóbulos blancos después de la
apoptosis.84 Se ha diseñado un algoritmo de conmutación en el
instrumento para informar el recuento de plaquetas más preciso, ya
sea óptico o por impedancia.
También se ha desarrollado un método de inmunofluorescencia
para el recuento de plaquetas mediante citometría de flujo.86 Las
plaquetas en una muestra de sangre se marcan de manera
fluorescente con un anticuerpo monoclonal específico o una
combinación de anticuerpos, y midiendo la proporción de glóbulos
rojos: plaquetas se puede calcular el recuento de plaquetas. Los
anticuerpos adecuados para los antígenos plaquetarios son CD41,
CD42 y CD61. Este método que utiliza CD41 y CD61 ha sido adoptado
por el ICSH como método de referencia.87 Los instrumentos Abbott
Cell-Dyn y Sapphire proporcionan un recuento inmunológico de
plaquetas automatizado para uso diagnóstico. Aunque los
instrumentos pueden contar plaquetas hasta niveles de 10× 109/ lo
menos, debe tenerse en cuenta que la precisión en estos niveles suele
ser deficiente, observándose CV de 22 a 66%88 y con conteos por
debajo de 10 × 109/ l difiere apreciablemente entre instrumentos y del
método de referencia ICSH.89
Recuento de plaquetas en salud
En salud, hay aproximadamente de 150 a 400 × 109 plaquetas por
litro de sangre. Los recuentos son algo más altos en mujeres que
en hombres,90 y hay ciclos, con recuentos ligeramente más bajos
aproximadamente en el momento de la menstruación.91 Se
observan recuentos de plaquetas más bajos en afro-caribeños y
africanos aparentemente sanos que en caucásicos.92
Volumen medio de plaquetas
Las mismas técnicas que se utilizan para medir el tamaño de los
glóbulos rojos se pueden aplicar a las plaquetas. El volumen
plaquetario medio (MPV) se deriva de la curva de distribución del
tamaño de las plaquetas por impedancia. El MPV depende en gran
medida de la técnica de medición y de la duración y las condiciones de
almacenamiento antes de analizar la sangre. Cuando el MPV se mide
mediante tecnología de impedancia, se ha encontrado que varía
inversamente con el recuento de plaquetas en sujetos normales. Si se
extrapola esta curva, se ha encontrado que los datos se ajustan a la
curva extrapolada cuando la trombocitopenia es causada por la
destrucción de plaquetas periféricas; sin embargo, el MPV es más bajo
de lo previsto cuando la trombocitopenia es causada por anemia
megaloblástica o insuficiencia de la médula ósea.93,94 Las plaquetas
grandes son hemostáticamente más activas que las plaquetas más
pequeñas y pueden ser más importantes funcionalmente que las
plaquetas más pequeñas. Se ha observado un aumento de MPV en
pacientes con riesgo de infarto de miocardio y después de este.95 e
infarto cerebral.96 Un MPV alto puede proporcionar una evidencia
importante de una macrotrombocitopenia hereditaria. El MPV es
generalmente mayor de lo normal en las neoplasias
mieloproliferativas, pero diferenciar la trombocitemia esencial de la
trombocitosis reactiva sobre esta base no ha tenido mucho éxito.
Otros parámetros plaquetarios que pueden calcularse mediante
contadores automáticos incluyen el ancho de distribución plaquetaria
(PDW), que es una medida de la anisocitosis plaquetaria, y el 'índice
plaquetario', que es el producto del MPV y el recuento plaquetario y,
por analogía con el hematocrito. , mayo
 3 Técnicas hematológicas básicas 41

5PD1 NRBC1 RETIC1 DIFF WBC / BASO

FSC
SFL
V R V
L
A
L
S
SSC SSC
IMI NRBC

RF

FSC
RLSn AL2 LLSn
jefe SFL
5PD2 NRBC2 RETIC2 RETIRADO PLT-O

FSC

FSC
V R V
U
METRO

A
L
S
SFL SFL
RBC PLT

Mensaje (s) de WBC IP

OP AL2 OP
Mensaje (s) IP de RBC / RET

Mensaje (s) IP PLT

A B

Diferencial de leucocitos Mono Poli I

9
0
L
Porox Boso 0 O
S B
I U
Z L
mi A
R
7 ° - COMPLEJIDAD 0 ° - TAMAÑO
0
LOW-Hi FL PLT óptico

RBCV / HC PC de volumen PLT 0

S
I
Z 9
mi 0
FL3 - ADN 7°
Impedancia RBC RETC

Volumen de RBC RBC HC Vol de plaquetas

Volumen (fl) FL1 - ARN

C D
FIGURA 3-8 Patrones de impresión del recuento sanguíneo de algunos sistemas automatizados. (A) Beckman Coulter DxH; (B) Sysmex XE-2100; (C) Siemens
Advia; (D) Abbot Cell-Dyn 4000.
 42 Hematología práctica
ser visto como indicativo del volumen de plaquetas circulantes en una
unidad de volumen de sangre. La proporción de células grandes de
plaquetas (P-LCR), informada por algunos instrumentos, es el número
de plaquetas que caen por encima del umbral de 12 fl en el
histograma de tamaño de plaquetas dividido por el número total de
plaquetas. Un P-LCR o PDW alto puede indicar la destrucción
inmunitaria periférica de las plaquetas.97 Se ha descubierto que la
PDW es de alguna utilidad para distinguir la trombocitemia esencial
(aumento de PDW) de la trombocitosis reactiva (PDW normal). El
criterio de plaquetas no parece proporcionar ninguna información de
valor clínico. Todos los parámetros de plaquetas derivados son muy
específicos de las tecnologías individuales, con diferentes analizadores
que tienen diferentes rangos normales.
Plaquetas reticuladas y fracción de
plaquetas inmaduras
Después de marcar con marcadores inmunológicos específicos y
un colorante fluorescente que se une al ARN, es posible
identificar plaquetas jóvenes con un mayor contenido de ARN
mediante citometría de flujo.87,98-100 Por analogía con el recuento
de reticulocitos, estos se han denominado "plaquetas
reticuladas", y se ha sugerido que un mayor número en la
circulación es una indicación sensible y temprana de recuperación
de la trombopoyesis en la anemia aplásica. Sin embargo, debido a
que existe un intercambio constante de plaquetas entre la
circulación y el bazo, no está claro si su presencia en la sangre
tiene el mismo significado que los reticulocitos.
En algunos instrumentos Sysmex se ha desarrollado un nuevo
método automatizado para cuantificar las plaquetas reticuladas,
expresado como fracción de plaquetas inmaduras (FPI). La
medición del IPF utiliza un tinte fluorescente que contiene
polimetina y oxazina. Estos dos tintes penetran en la membrana
celular y tiñen el ARN de los glóbulos rojos y las plaquetas, y
luego las células teñidas pasan a través de un rayo láser de diodo
semiconductor. Se miden la dispersión de luz directa resultante
(volumen celular) y la intensidad de fluorescencia (contenido de
ARN) y se identifican los reticulocitos y las plaquetas reticuladas.
La FPI aumenta en pacientes con consumo periférico /
destrucción de plaquetas (púrpura trombocitopénica autoinmune
y púrpura trombocitopénica trombótica) y es normal o baja en
pacientes con insuficiencia medular.101 Después de un trasplante
de células madre de sangre periférica, se ha informado que la FPI
aumenta 1 a 2 días antes de que aumente el recuento de
plaquetas.102,103
RECUENTO DE RETICULOCITOS
Se han desarrollado recuentos automatizados de reticulocitos utilizando el
hecho de que varios tintes y fluorocromos se combinan con el ARN de los
reticulocitos.40,104 Después de la unión del tinte, las células fluorescentes se
pueden enumerar usando un citómetro de flujo. La mayoría de los
contadores de sangre completamente automatizados ahora incorporan una
capacidad de conteo de reticulocitos, de modo que el uso de un contador
de reticulocitos independiente ya no es necesario y el uso de un citómetro
de flujo de uso general ya no es necesario.
apropiado. El Instituto de Estándares Clínicos y de
Laboratorio (CLSI) en colaboración con el ICSH ha
publicado un estándar internacional para este método.44
Los tintes utilizados en los diferentes sistemas incluyen
auramina O o polimetina con oxazina (Sysmex), naranja tiazol
(ABX), CD4K 530 (Abbott), así como tintes no fluorescentes
como la oxazina 750 (Siemens) y el tradicional nuevo azul de
metileno (Beckman). Coulter, Abbott).
Después de la tinción, es necesario separar los reticulocitos de los
glóbulos rojos no teñidos y, debido a que los colorantes también se
combinan con el ADN de las células nucleadas, estas células también
deben excluirse. El umbral para esta exclusión está determinado por
la intensidad de la fluorescencia y el tamaño de las partículas. Aunque
la separación de los reticulocitos de los eritrocitos maduros no
siempre es clara, el recuento automático de reticulocitos se
correlaciona bien con el recuento manual de reticulocitos; sin
embargo, los recuentos absolutos pueden diferir porque los recuentos
automáticos dependen de las condiciones de incubación y del método
de calibración del instrumento.104 La precisión es muy superior a la del
recuento manual porque se cuentan muchas más células, lo que ha
permitido marcar de forma fiable la reticulocitopenia y eliminar el
elemento subjetivo inherente al reconocimiento de los reticulocitos
tardíos. Las posibles fuentes de inexactitud son la inclusión de algunos
leucocitos y plaquetas y, con menos frecuencia, cuerpos de Howell-
Jolly o parásitos de la malaria en el recuento de 'reticulocitos'.
Los recuentos automatizados de reticulocitos son bastante estables en
sangre que se ha almacenado durante 1 a 2 días a temperatura ambiente o
hasta 3 a 5 días a 4 ° C.
Fracción de reticulocitos inmaduros
Los instrumentos totalmente automatizados proporcionan una
medida de los diversos grados de maduración de los reticulocitos
porque los reticulocitos más inmaduros, producidos cuando los
niveles de eritropoyetina son altos, tienen más ARN y emiten una
fluorescencia más intensa que los reticulocitos maduros normalmente
presentes en la sangre periférica. Una evaluación de la maduración de
los reticulocitos puede ser importante para diagnosticar la causa de la
anemia y evaluar el grado de eritropoyesis eficaz.
Por ejemplo, se ha observado un aumento en la intensidad de
fluorescencia media indicativo de la presencia de reticulocitos
inmaduros como un signo temprano de injerto después del
trasplante de médula ósea.
Las características de la producción de reticulocitos en diferentes tipos
de anemias pueden apreciarse especialmente a partir de un gráfico
bivariado de salida que relaciona la intensidad de la fluorescencia con el
recuento de reticulocitos.40 Como se describió anteriormente, el recuento
total bajo con una fracción de reticulocitos inmaduros (IRF) relativamente
alta es indicativo de una médula en regeneración, mientras que una
reticulocitopenia con IRF baja es típica de anemia aplásica grave o
insuficiencia renal. En la hemólisis aguda y la pérdida de sangre se produce
un recuento total alto con IRF alto, mientras que en la diseritropoyesis y
durante la respuesta temprana a la hematínica se produce un recuento
total de bajo a normal con un IRF alto.105-107 La aparición de reticulocitos con
alta fluorescencia también presagia

respuesta cuando la anemia aplásica grave se trata con terapia
inmunosupresora,105 y es una indicación confiable de la regeneración
hematopoyética después de la quimioterapia ablativa de la médula.
También se ha encontrado que un IRF alto es útil para predecir el
momento óptimo para la recolección de células madre en algunos
estudios, pero no en todos.108 Se ha sugerido un recuento total normal
con un IRF inesperadamente alto en atletas como método para
detectar el "dopaje" con eritropoyetina.109 También puede ser útil para
decidir si una anemia macrocítica es megaloblástica o no
megaloblástica.110 Cabe señalar que los rangos normales para el IRF
dependen en gran medida del instrumento.
Recuento de reticulocitos en salud
Los rangos de referencia informados para el recuento automático de
reticulocitos varían considerablemente entre los diferentes métodos
automatizados y pueden diferir significativamente de 50 a 100 ×109/ l
(0,5% a 2,5%) observado por microscopía. Por tanto, es importante
utilizar rangos normales específicos del instrumento y que los
laboratorios establezcan sus propios rangos.
Medición de hemoglobina de
reticulocitos
El recuento de reticulocitos proporciona una medida cuantitativa de la
eritropoyesis, pero no proporciona información sobre la calidad de la
eritropoyesis. Con el desarrollo de los analizadores de hematología de
celda de flujo, ahora es posible medir el volumen y el contenido de
hemoglobina de los reticulocitos. El parámetro de Siemens se
denomina CHr (es decir, el contenido medio de hemoglobina de
reticulocitos) y el de Sysmex, el Ret-H (es decir, la concentración
mi
de
hemoglobina de reticulocitos). El CHr se mide en los reticulocitos
teñidos usando dispersión de luz de dos ángulos y Ret-H es una
medida de lamidispersión hacia adelante de reticulocitos teñidos y tiene
una relación curvilínea con CHr.111
El contenido de hemoglobina de los reticulocitos proporciona una
medida indirecta del hierro funcional disponible para la producción de
nuevos glóbulos rojos durante los 3 a 4 días anteriores. Más
recientemente, otros instrumentos han desarrollado parámetros que
pueden proporcionar información equivalente a la hemoglobina de
reticulocitos; estos se basan en una medida del volumen medio de
reticulocitos (MRV). La hemoglobina de reticulocitos y el volumen de
reticulocitos pueden tener una utilidad clínica similar, pero el MRV
producido por diferentes instrumentos carece de estandarización, lo
que significa que los resultados numéricos de diferentes fabricantes
no son comparables. El factor de tamaño de glóbulos rojos (RSf) es un
nuevo parámetro proporcionado por Beckman Coulter, que se
relaciona con el volumen de eritrocitos y reticulocitos. Se ha
informado de una buena correlación entre CHr y RSf.112
INSTRUMENTOS DE PUNTO DE CUIDADO
Hay dos tipos de tecnología para respaldar las pruebas en el punto de
atención (POCT) (consulte la pág. 522): pequeños analizadores de mesa y
dispositivos portátiles. Los sistemas de sobremesa son a menudo versiones
más pequeñas de analizadores de laboratorio, que proporcionan un FBC
3 Técnicas hematológicas básicas 43
con índices de glóbulos rojos y un diferencial de glóbulos
blancos de cinco partes o un diferencial de tres partes.
Los analizadores de mesa están equipados con calibración
automatizada y control de calidad; sin embargo, son
demasiado grandes para su uso junto a la cama del
paciente y están diseñados para su uso en clínicas o
laboratorios pequeños. Se recomienda que se utilicen
instrumentos que empleen muestreo primario, en lugar
de instrumentos que involucren la dilución de sangre total
en la fase preanalítica.113 La prueba más utilizada con un
dispositivo manual es la medición de Hb, pero un
dispositivo, el sistema HemoCue WBC DIFF, que utiliza un
cartucho desechable, también cuenta leucocitos y
plaquetas y realiza un diferencial de tres partes en sangre
capilar. La gama de equipos disponibles se ampliará
inevitablemente a medida que se implementen más
POCT. Los dispositivos POCT deben generar resultados
comparables a los del laboratorio de referencia local. El
control de calidad interno (IQC) debe estar disponible
para todos los instrumentos POCT para detectar
desviaciones significativas del rendimiento aceptable. El
análisis del material de control antes de analizar las
muestras de los pacientes puede garantizar que el
sistema está funcionando correctamente.
Idealmente, también debería haber un método externo objetivo de
aseguramiento de la calidad, el control de calidad externo (EQA). EQA
implica el análisis de muestras recibidas de una fuente externa
acreditada con valores no revelados; esto podría ser de un fabricante
o de un sistema nacional acreditado. Los resultados están sujetos a la
evaluación del grupo de pares y al análisis estadístico para comparar
los resultados en diferentes sitios.
Los hematólogos / patólogos locales deben alentar a los
usuarios de POCT a participar en el EQA del laboratorio
supervisor.113
Los hematólogos deben ser conscientes del potencial de error si se
utilizan analizadores de gases en sangre en el lugar de atención para
estimar la Hb o el Hct. No se recomienda el uso de instrumentos
basados en mediciones de conductividad, ya que pueden producirse
discrepancias de 20 g / l en la Hb y 0,04 l / l en el Hct cuando la
concentración de proteínas plasmáticas es baja (p. Ej., Si se han
utilizado cristaloides para el reemplazo de sangre) y también hay un
sesgo a la baja cuando el Hct es inferior a 0,30 l / l.113
Además, la reproducibilidad de las mediciones de Hct puede ser deficiente.
Siempre que exista un control de calidad adecuado, los instrumentos
basados en espectrofotometría / cooximetría concuerdan más
estrechamente con las mediciones de laboratorio de Hb.113
CALIBRACIÓN DE CONTADORES DE CÉLULAS
SANGUÍNEAS AUTOMATIZADOS
Se recomiendan los siguientes métodos para calibrar un contador
automático de células sanguíneas:114,115
1. Uso de muestras de sangre normal fresca a las que se han
asignado valores de Hb, PCV, RBC, WBC y recuento de
plaquetas mediante métodos de referencia estandarizados.
 44 Hematología práctica

2. Uso de un calibrante estable (ya sea sangre conservada o

DF1 ´ DF 2 DF3
un sustituto) al que se hayan asignado valores apropiados Valor de calibrador corregido = AC ´ 3 ´
para el instrumento en cuestión en comparación con AF1 AF2 AF3
sangre normal fresca.
3. Uso de un calibrante comercial con valores asignados dónde
adecuados para el instrumento en cuestión. A C=medición del calibrador por contador automáticoA =
Por razones de conveniencia y economía, los materiales de control se medición
F
de las muestras de sangre fresca (1, 2 y 3)
utilizan comúnmente como calibradores; sin embargo, esta práctica no se por contador automatizado

recomienda. Dichos materiales no son lo suficientemente estables para D F= medición directa de las muestras de sangre fresca (1, 2
servir como calibradores y sus valores establecidos son a menudo y 3)
aproximaciones que no se asignan mediante métodos de referencia. Están
Se requiere un cuidado considerable para garantizar que las
diseñados para dar resultados de prueba dentro de un rango establecido
mediciones iniciales en sangre fresca sean lo más precisas
durante un período establecido en lugar de un resultado específico.
posible. Las diluciones deben realizarse con pipetas calibradas
individualmente y matraces aforados de grado A. El contador de
El procedimiento para asignar valores a muestras de sangre fresca
células debe calibrarse como se describe en la página 32, con una
e indirectamente a un calibrante estable es el siguiente:
relación señal / ruido de> 100: 1 y el recuento corregido por
1. Se obtienen muestras de sangre (4 ml) de tres coincidencia. El ICSH describe los detalles de los procedimientos
voluntarios hematológicamente normales y se que se utilizarán.116 El ICSH también ha publicado los
anticoagulan2
con K -EDTA. procedimientos para la verificación del rendimiento de los
2. El valor de Hb se asigna utilizando el método de analizadores multicanal por parte de los usuarios.46 y, en los
hemiglobincianuro y la media de dos mediciones. Estados Unidos de América, por el Comité Nacional de Estándares
3. El Hct se asigna por el método del microhematocrito, de Laboratorio Clínico.117
tomando la media de las medidas en cuatro tubos de
microhematocrito.
4. El RBC se asigna realizando recuentos en un contador de
SEÑALIZACIÓN DE AUTOMATIZADOS
impedancia de apertura de un solo canal capaz de realizar un CUENTAS DE SANGRE
recuento directo de células; se utiliza la media de dos
Flojo118,119 se refiere a una señal que indica que la muestra que se está analizando puede tener una anomalía significativa
diluciones, cada una contada dos veces.
porque una o más de las variables del recuento sanguíneo están fuera de los límites especificados (generalmente 2DE) o
5. El MCV se asigna mediante cálculo a partir de RBC y
existe una anomalía cualitativa que requiere un control de calidad y / o una investigación adicional. Las células anormales
PCV.
tienen características diferentes, como el tamaño nuclear y el contenido de gránulos, de las células normales. El
6. El WBC se asigna realizando recuentos en un instrumento de
instrumento detecta que una población de células tiene un tamaño o forma anormales mediante el análisis de grupos. En
impedancia de apertura de un solo canal capaz de realizar
estas circunstancias, se generan indicadores de celda anormales para alertar al usuario sobre la posibilidad de resultados
recuentos celulares directos; se utiliza la media de dos
inexactos. Las células anormales o las sustancias que interfieren pueden hacer que el diferencial automático sea inexacto o
diluciones, cada una contada dos veces.
imposible de informar. Será necesario examinar microscópicamente un frotis de sangre para verificar el recuento
7. El recuento de plaquetas se asigna usando un citómetro de flujo capaz de
automático y confirmar la presencia de células anormales. La mayoría de los analizadores de mesa en el punto de atención
medir la relación de plaquetas a glóbulos rojos; el recuento de
tienen la capacidad de generar indicadores en presencia de células anormales o sustancias que interfieren; sin embargo, la
plaquetas se calcula a partir de la relación y un RBC medido de forma
gama de indicadores de alerta disponibles en estos instrumentos es limitada y su sensibilidad y especificidad pueden no
independiente. Donde esté disponible el etiquetado de anticuerpos
ser tan buenas como las de los analizadores de hematología de laboratorio más sofisticados. Aunque teóricamente es
monoclonales fluorescentes, el método de referencia ICSH /
deseable que cada hemograma incluya el examen de una película teñida, esto se ha vuelto imposible como resultado del
International Society for Laboratory Hematology (ISLH)89 debería ser
aumento de la carga de trabajo; Por lo tanto, se ha necesitado una racionalización rentable y en el tiempo. Esto se ha visto
usado. En preparaciones destinadas a un recuento diferencial de
favorecido por la disponibilidad de analizadores automáticos que informan recuentos diferenciales de leucocitos en cada
leucocitos o un calibrador de recuento de reticulocitos, asigne los
muestra. En consecuencia, una cantidad significativamente menor de frotis de sangre la gama de indicadores de alerta
valores mediante los métodos del manual de referencia,34,43 como se
disponibles en estos instrumentos es limitada y su sensibilidad y especificidad pueden no ser tan buenas como las de los
describe en las páginas 27 y 30, respectivamente.
analizadores de hematología de laboratorio más sofisticados. Aunque teóricamente es deseable que cada hemograma

Para calibrar el contador automático directamente a partir de las incluya el examen de una película teñida, esto se ha vuelto imposible como resultado del aumento de la carga de trabajo;

tres muestras de sangre fresca, realice dos recuentos con cada Por lo tanto, se ha necesitado una racionalización rentable y en el tiempo. Esto se ha visto favorecido por la disponibilidad

muestra y tome los medios. Si los recuentos medidos difieren de los de analizadores automáticos que informan recuentos diferenciales de leucocitos en cada muestra. En consecuencia, una

asignados, vuelva a calibrar el contador de forma adecuada. cantidad significativamente menor de frotis de sangre la gama de indicadores de alerta disponibles en estos instrumentos

Para calibrar un calibrante estable, realice dos recuentos en el es limitada y su sensibilidad y especificidad pueden no ser tan buenas como las de los analizadores de hematología de

calibrante y en cada muestra fresca utilizando el instrumento laboratorio más sofisticados. Aunque teóricamente es deseable que cada hemograma incluya el examen de una película

automatizado, A, y tomar los medios. A partir de la relación entre teñida, esto se ha vuelto imposible como resultado del aumento de la carga de trabajo; Por lo tanto, se ha necesitado una

los resultados de la prueba en sangre fresca y los del calibrador, racionalización rentable y en el tiempo. Esto se ha visto favorecido por la disponibilidad de analizadores automáticos que

asigne valores corregidos al calibrador mediante los siguientes informan recuentos diferenciales de leucocitos en cada muestra. En consecuencia, una cantidad significativamente menor

cálculos: de frotis de sangre esto se ha vuelto imposible como resultado del aumento de la carga de trabajo; Por lo tanto, se ha necesitado una racionalización ren
 3 Técnicas hematológicas básicas 45

así como la consideración de cualquier circunstancia clínica específica.

CUADRO 3-1
Existen pautas publicadas anteriormente que describen los criterios
Solicitud de hemograma: ¿Es un recuento por primera vez o una repetición? de revisión de los frotis sanguíneos después de FBC y análisis
¿contar? diferencial,120 que puede adaptarse a las necesidades individuales del
Conteo por primera vez: ¿Es una prueba de detección de rutina o especial
laboratorio. Recuadro 3-1 es una guía para esta selección.
¿categoría?
Si es rutina: ¿Qué es el informe del analizador para el recuento sanguíneo?
¿solo? MICROSCOPÍA
Se requiere película si se señalan banderas.Se
requiere película de categoría especial: Componentes del microscopio
1. Pacientes con enfermedades de la sangre diagnosticadas Los componentes principales de la mayoría de los microscopios
2. Pacientes que reciben radioterapia y / o de rutina se ilustran en Figura 3-9. Los objetivos están marcados
quimioterapia, pero no a diario, solo si se observan con su poder de aumento. La distancia de trabajo del objetivo es
cambios en la verificación delta.
la distancia entre el objetivo y el objeto a visualizar. Cuanto mayor
3. Inicio reciente de enfermedad renal
sea el poder de aumento del objetivo, menor será la distancia de
4. Recién nacidos
trabajo (Tabla 3-5). Estas especificaciones significan que cuando
5. Pacientes de la unidad de cuidados intensivos

6. Si también se han solicitado pruebas especiales por se usa un cubreobjetos, si es demasiado grueso, no será
mononucleosis infecciosa, anemia hemolítica, posible enfocar con gran aumento. Por lo tanto, el cubreobjetos
enzimopatía, hemoglobinopatías no debe tener más de 0,15 mm de grosor para el examen de las
7. Si los detalles clínicos del formulario de solicitud preparaciones cubiertas por el×100 objetivo de inmersión en
indican linfadenopatía, esplenomegalia o ictericia o aceite. Además, si el portaobjetos de vidrio es demasiado grueso,
sugieren la posibilidad de leucemia o linfoma esto puede impedir el enfoque correcto de la trayectoria de la luz
8. Solicitudes específicas del médico a través del condensador hacia el objeto, como se describe más
Se requiere película de recuento repetido:
adelante.
1. Verificación delta positiva en comparación con el registro anterior
2. Cualquier bandera inesperada en el recuento actual
3. En cada ocasión para pacientes con enfermedades sanguíneas
conocidas, para recién nacidos y cuando los médicos lo soliciten TABLA 3-5
específicamente.
PODER DE AUMENTO OBJETIVO Y
DISTANCIA DE TRABAJO ASOCIADA
ahora se examinan microscópicamente. Por lo tanto, la decisión de Objetivo Distancia de trabajo
cuándo debe tomarse, teñirse y examinarse un frotis de sangre debe
×10 5-6 mm
tener en cuenta el marcado y la necesidad de garantizar la fiabilidad
×40 0,5–1,5 mm
analítica. Esto incluye una verificación de cualquier cambio ×100 0,15-0,20 mm
significativo de un recuento anterior reciente (verificación delta),

Ojo
piezas

Pieza de nariz
Cuadro

Escenario Soporte para diapositivas

Perilla para
Objetivos
mover escenario
Fuente de luz Bien y
enfoque grueso
Condensador y
diafragma del iris
Poder
ajustador
fuente
Fuente de luz

Control de escenario
Brillo
ajustamiento
Base
FIGURA 3-9 Diagrama de un microscopio, mostrando sus componentes.
 46 Hematología práctica
Configurar la iluminación del microscopio
1. Si el microscopio requiere una fuente de luz externa, usando el
espejo en la base, dirija la luz hacia el condensador. Si la
iluminación está incorporada, asegúrese de que el voltaje de
la lámpara esté disminuido antes de encender el microscopio;
luego encienda la lámpara hasta que esté enC.70% de la
potencia máxima.
2. Coloque un portaobjetos de un frotis de sangre con un cubreobjetos en el escenario.
3. Baje el condensador, abra completamente el diafragma
iris y enfoque la preparación del portaobjetos con el×
10 objetivo.
4. Verifique que los oculares estén ajustados al ancho
interpupilar del operador y que la muestra esté
enfocada para cada ojo girando el mecanismo de
enfoque en el ocular ajustable.
5. Cierre el diafragma y levante el condensador lentamente hasta
que el borde del círculo de luz se enfoque nítidamente y haya
un leve tinte azul en el borde del diafragma.
6. Usando los tornillos de centrado del condensador, ajuste su
posición de modo que el círculo de luz esté en el centro del campo.
7. Abra el diafragma completamente para que la luz llene todo el
campo de visión.
8. Retire los oculares, de modo que la lente superior del objetivo
se vea llena de un círculo de luz. Cierre el diafragma
lentamente hasta que el círculo de luz ocupe
aproximadamente dos tercios de la superficie.
9. Reemplace los oculares, vuelva a enfocar la muestra y, si es
necesario, reajuste la apertura del condensador y el brillo de
la lámpara para obtener la imagen más nítida posible.
Examen de portaobjetos
Baja potencia (×10). Comience con el objetivo justo encima de la
preparación de la diapositiva. Luego levante el objetivo con el
tornillo de ajuste grueso hasta que se vea una imagen clara en el
ocular. Si no hay suficiente iluminación, eleve ligeramente el
condensador.
Potencia media (×40). Coloque el condensador hasta la mitad; baje el
objetivo hasta que esté justo por encima de la preparación del
portaobjetos. Utilice el ajuste aproximado para elevar el objetivo muy
lentamente hasta que aparezca una imagen borrosa. Luego, enfoque
la imagen con el ajuste fino. Si es necesario, suba el condensador para
obtener suficiente iluminación.
Alta potencia: inmersión en aceite (×100). Coloque una
pequeña gota de aceite de inmersión en la pieza a examinar.
Acumule el condensador lo más que pueda. Baje el objetivo hasta
que entre en contacto con el aceite. Acérquelo lo más posible al
portaobjetos, pero evite presionar sobre la preparación. Mire por
el ocular y gire el ajuste fino muy lentamente hasta que la imagen
esté enfocada.
Después de usar el objetivo de inmersión en aceite, para
evitar rayar la lente o cubrir la ×40 lente con aceite, primero
mueva el ×10 objetivo (o un espacio de lente vacío en el
revólver) en su lugar antes de retirar el portaobjetos. Hasta
posible, use aceite solo cuando sea esencial (por ejemplo, para determinar
las especies de malaria) y examine los frotis de sangre para determinar la
morfología o el recuento diferencial de leucocitos con el ×40 lentes sin
aceite (o con ×50 o ×60 lentes cuando se necesita una observación de
detalles más finos).
Si no puede enfocar con la lente de inmersión en aceite, considere lo
siguiente:
El cubreobjetos puede ser demasiado grueso.
Es posible que se hayan aplicado accidentalmente dos cubreobjetos. Es
posible que haya invertido la diapositiva.
Mantenimiento de rutina del microscopio
El microscopio es un instrumento delicado que debe manipularse con
cuidado. Debe instalarse en un ambiente limpio alejado de productos
químicos, luz solar directa, fuentes de calor o humedad. Si el escenario
está contaminado con solución salina, debe limpiarse inmediatamente
para evitar la corrosión. Incluso en un clima templado, la humedad y
las altas temperaturas provocan el crecimiento de hongos, que
pueden dañar las superficies ópticas. Debido a que el almacenamiento
en un compartimiento cerrado fomenta el crecimiento de hongos, no
guarde el microscopio en su caja de madera, manténgalo de pie en el
banco protegido por una cubierta plástica liviana.
Después de usar el microscopio, limpie el objetivo de
inmersión en aceite con un paño para lentes, papel absorbente,
paño suave o algodón médico. Si otras lentes están manchadas
con aceite, límpielas con una pequeña cantidad de tolueno o una
solución de éter de petróleo al 40%, etanol al 40% y éter al 20%.
Las lentes nunca deben empaparse en alcohol porque esto
puede disolver el cemento.
Limpie las partes no ópticas con un detergente suave y
elimine la grasa o el aceite con éter de petróleo, seguido de
etanol al 45% en agua. Quite el polvo del interior y exterior de los
oculares con un soplador o un cepillo suave de pelo de camello.
Limpie el condensador de la misma manera que las lentes con un
paño suave o un pañuelo humedecido con tolueno y limpie el espejo
(si lo hubiera) con un paño suave humedecido con alcohol al 5%. El
diafragma del iris es muy delicado y si está dañado o muy corroído,
por lo general no se puede reparar.
Nunca fuerce los controles. Si el movimiento de los tornillos de
enfoque o de la platina mecánica se vuelve difícil, lubríquelos con una
pequeña gota de aceite de máquina. Todas las partes móviles
accesibles deben limpiarse ocasionalmente y darles un toque de aceite
para protegerlas contra la corrosión. No use aceites vegetales porque
se vuelven secos y duros. Mantenga siempre seca la superficie de la
platina fija porque mover los toboganes húmedos requiere una mayor
fuerza, lo que puede dañar la platina mecánica.
Para el cuidado de los microscopios en climas cálidos, húmedos y secos,
consulte la página 549.
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