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RESUMEN
El objetivo de este estudio fue optimizar el proceso de secado por atomización para la producción de microencapsulados
Lactobacillus pentosus con máxima viabilidad utilizando una mezcla de almidón-pulque. Se utilizó un modelo central con un diseño rotatorio compuesto por
dos factores: temperatura del aire de entrada (92-148 ° C) y sólidos totales en la mezcla (2431%). Las condiciones más óptimas del proceso de secado
fueron una temperatura de entrada de aire de 100 ° C con un 30% de sólidos totales con un 98% de encapsulación e ffi eficiencia. Las propiedades de los
polvos obtenidos fueron buenas con valores bajos de contenido de humedad (3%), actividad de agua (0,26) e higroscopicidad (7,0 g / 100 g). Para las células
microencapsuladas, la resistencia a las sales biliares obtenida fue> 98,9% y la resistencia a pH bajo fue del 100%. La supervivencia de
L. pentosus fue alto durante el almacenamiento a 4 ° C. La mezcla de un modi comercial fi El almidón ed (N-Lok) con pulque mostró buenas
características como material encapsulante.
Parmenter y Fisk, 2014 ). Para que los probióticos tengan un beneficio fi cial e ff ect en
∗ Autor correspondiente.
https://doi.org/10.1016/j.lwt.2018.04.075
Recibido el 15 de diciembre de 2017; Recibido en forma revisada el 23 de abril de 2018; Aceptado el 24 de abril de 2018
la savia fresca conocida como Aguamiel (hidromiel) extraída de varias especies de plantas de Agave ° C) y sólidos totales en la mezcla (24 - 31%).
(maguey) que crecen en la meseta central de México. Actualmente, el pulque se produce, Prueba Temperatura (° C) Solidos totales (%)
comercializa y consume en los barrios populares de la Ciudad de México y zonas rurales. El producto
1 120 27,5
fermentado es una bebida líquida de color blanco lechoso, viscosa y ligeramente ácida con una
2 120 27,5
graduación alcohólica entre 4 y 7ºG ( Escalante et al., 2016 ). El pulque se produce a partir de la savia
3 120 27,5
dulce, amarillenta y ligeramente turbia extraída de agaves maduros de 8 a 10 años que están a punto 4 120 27,5
de dar su fruto. fl orescencia, que, una vez productiva, dura solo de 90 a 120 días, con una producción 5 120 27,5
total de 200 - 1000 L por planta ( LappeOliveras et al., 2008 ). Las propiedades funcionales, como la 6 100 25
7 92 27,5
actividad prebiótica, están relacionadas con el contenido de fructooligosacáridos en hidromiel y
8 140 25
pulque ( Escalante et al., 2016 ; Ortiz-Basurto et al., 2008 ). En este contexto y considerando que se
9 120 31
trata de una bebida con alto potencial de industrialización en el área de alimentos, el objetivo de este 10 100 30
estudio fue optimizar el proceso de secado por aspersión para la microencapsulación de Lactobacillus 11 148 28
bacterias usando una mezcla de almidón y pulque como material de pared. 2.4. Encapsulación e ffi eficiencia
2. Materiales y métodos Para el recuento bacteriano, los polvos de microcápsulas que contienen L.
pentosus se dispersaron (1 g) en 9 ml de una solución estéril de citrato de sodio al 2% (Golden Bell
2.1. Materiales Reactivos, México, DF). Las muestras dispersas se sometieron posteriormente a diluciones en serie
con 9 ml de peptona (0,1%, p / v). Cada dilución se colocó en 22 ml de agar MRS. Las colonias se
La cepa de Lactobacillus pentosus resistente a rifampicina fue proporcionada por el Laboratorio cultivaron en condiciones aeróbicas a 37 ° C durante 48 h. Encapsulación e ffi La eficiencia (EE%) se
de Microbiología de Alimentos del Área Académica de Química de la Universidad Autónoma del calculó de acuerdo con la ecuación propuesta por Rajam y Anandharamakrishnan (2015) :
2.2. Caracterización del pulque donde N • y N representan el número de bacterias viables antes y después del proceso de secado por
pulverización, respectivamente.
Wf - Wi x 100
% humedad =
2.3. Microencapsulación de Lactobacillus pentosus Wisconsin
donde W I y W F son los pesos de las formulaciones probióticas secas antes y después de la
La cultura de Lactobacillus pentosus se obtuvo después de la activación mediante dos
deshidratación a 105 ° C, respectivamente.
transferencias sucesivas en Lactobacillus Caldo MRS a 37 ° C durante 24 h. Para obtener el paquete
Para la actividad del agua, se pesaron 2 g de muestra y se colocaron en contenedores Aqualab LITE
celular, la suspensión celular (con ≈ 10 9 CFU / mL como fi concentración bacteriana final) se centrifugó
(Washington, EE. UU.) A 25 ° C.
a 2250 × g durante 20 min. Modi fi Se mezcló almidón (N-lok) y pulque (100 ml) como solución de
vehículo mediante agitación a 350 rpm (StableTemp, Cole-Parmer, Chicago; EE.UU.) durante 60 min.
Se añadió el paquete celular a la mezcla de almidón y pulque, y la solución total se ajustó a un pH de 2.6. Higroscopicidad
7. Finalmente, la mezcla se homogeneizó a 6000 rpm durante 1 min en un Ultra Turrax
T-Homogeneizer 25-SI (IKA Works, Wilmington, NC , EE.UU). El total de sólidos se ajustó según el La higroscopicidad fue determinada por la ganancia de humedad en 2 g de
diseño experimental ( tabla 1 ) y se consideró la suma de los sólidos totales contenidos en el paquete muestras de polvo después de colocar las muestras sobre el Na 2 ASI QUE 4 solución de saturación durante
celular, almidón y pulque. El proceso de microencapsulación se realizó utilizando un secador por una semana. La humedad higroscópica se expresó como g de
pulverización de laboratorio Buchi B-191 Labortechnik AG (Flawil, Suiza). La temperatura de entrada humedad por 100 g de sólidos secos (g / 100 g) para determinar la higroscopicidad ( Sulieman,
se ajustó de acuerdo con el diseño experimental y la temperatura de salida varió proporcionalmente Elamin, Elkhalifa y Laleye, 2014 ).
con la temperatura de entrada del aire. El líquido fl el caudal fue de 4 ml / min y el diámetro de la
boquilla fue de 0,5 mm. (Wf - Wisconsin) × 100
Higroscopicidad • g / 100g
• • •=( Wi X (100 - humedad / 100)
• •
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2.7. Morfología de microcápsulas Y yo = B 0 + B 1 X 1 + B 2 X 2 + B 12 X 1 X 2 + B 11 X 1 + B 22 X 2
La resistencia al pH se midió de acuerdo con Rondón et al. (2008) con modi fi cationes. La
4. Resultados y discusión
resistencia al pH se midió utilizando bacterias libres y encapsuladas. Para las células libres, la cepa
se inoculó en 3 ml de caldo MRS con un pH de 6,5 y agar y se incubó a 37 ° C durante 24 h. Luego,
4.1. Caracterización del pulque
se utilizó 1 ml para el recuento de viables en agar MRS con un pH de 6,5 con rifampicina añadida
(bacterias libres de control). Después de recolectar 1 ml de la cepa a 3219 xg, se descartó el
El pH del pulque fue 4,1 ± 0,2 debido a la fermentación realizada por microorganismos
sobrenadante y el sedimento se resuspendió en 9 ml de caldo MRS ajustado a pH 2 o 3. Los cultivos
presentes de forma natural en el producto (bacterias y levaduras). El contenido de humedad fue de
se incubaron durante 1, 2 y 3 ha 37ºC. El recuento de viables se realizó utilizando agar MRS con un
91,8% ± 0,01, similar al informado por Dante León et al., 2012 . El contenido de proteína fue de 2.71%
pH de 6,5 con rifampicina en las condiciones descritas anteriormente. Para las células
± 0.05 db, superior al reportado por la
microencapsuladas, se procesó 1 g de polvo como bacteria libre. El porcentaje de resistencia a pH 2
y 3 se determinó utilizando la ecuación propuesta por
Ministerio de Economía, 1972 , y Dante León et al., 2012 . Esta fi El hallazgo puede ser importante en el
proceso de microencapsulación porque se ha informado que las proteínas forman estructuras con
buenas propiedades de encapsulación probiótica ( Picot y Lacroix, 2004 ). El porcentaje de etanol (%)
fue de 5,8 ± 0,4, valor que depende de la diversidad de levaduras en el pulque. Ambos Saccharomyces
Kociubinski, Perez, Añon y De Antoni (1999) :
y no Saccharomyces
( PH de UFC 2 o 3)
% Resistencia = 100 × ( Control de pH CFU)
especies han sido identi fi ed y propuesto como levadura fermentativa esencial responsable de la
producción de etanol, aminoácidos, vitaminas y volátiles fl compuestos de sabor que participan en las
propiedades sensoriales de la bebida ( Lappe-Oliveras et al., 2008 ). No se detectaron coliformes
2.9. Resistencia a las sales biliares
totales. Este punto es muy importante porque el proceso de elaboración del pulque es artesanal.
Para evaluar la resistencia de la cepa a las sales biliares, las células libres fueron fi Primero se
reactivó en caldo MRS y se incubó a 37 ° C durante 24 h. Se inoculó un mililitro del cultivo en tubos
con 9 mL de caldo MRS con 0,5 y 1,5% de sales biliares (LP0055, Oxoid - Thermo Fisher Scienti fi c,
4.2. Microencapsulación de Lactobacillus pentosus
Monterrey, México), y el control fue MRS sin sales biliares. Para el caldo MRS, previamente se
agregaron 1,38 mL de ácido acético. La incubación se realizó durante 3, 12 y 24 ha 37 ° C en
4.2.1. Encapsulación e ffi eficiencia (EE%)
condiciones estáticas. Se realizó el mismo procedimiento mencionado anteriormente para las células
El en fl uencia de la temperatura y el contenido de sólidos en la encapsulación e ffi eficiencia
encapsuladas. El porcentaje de supervivencia con respecto al control ( Kociubinski, Pérez y De
(EE%) se ilustra en Figura 1 una. En general, la temperatura del aire de entrada fue el factor que más
Antoni, 1999 ) se calculó con la siguiente ecuación:
impactó el EE%, y se observó que a mayor temperatura de secado (140 ° C), la viabilidad de las
bacterias disminuyó (78,7%). Se obtuvo una viabilidad de casi el 98,9% de las bacterias a una
temperatura de entrada de aire de 100 ° C y una temperatura de salida de 50 ° C. Estos resultados
son favorables ya que la supervivencia que se obtuvo fue mayor que la encontrada en Rajam y
(( CFU / mL) MRS + sales biliares) Anandharamakrishnan, 2015 . Durante el secado por aspersión, la temperatura de salida tiene una
% Resistencia = 100 ×
( CFU / mL MRS) mayor e ff sobre el secado de partículas que la temperatura del aire de entrada ( Anandharamakrishnan,
Rielly y Stapley, 2008 ). La alta temperatura de salida tiene un secado rápido en fl influencia sobre la
supervivencia celular después del secado y durante el almacenamiento ( Dolly, Anishaparvin, Joseph
2.10. Viabilidad de L. pentosus microencapsulado durante el almacenamiento a 30 y 4 ° C y Anandharamakrishnan, 2011 ; Rajam y Anandharamakrishnan, 2015 ).
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Figura 1. mi ff efecto de la temperatura (° C) y sólidos totales (%) en a) el e ffi encapsulación de eficiencia (EE%) yb) el contenido de humedad (%) de microencapsulado Lactobacillus pentosus.
Tabla 2
Coeficiente estimado ffi clientes del modelo ajustado y nivel de significación fi cance para la encapsulación E ffi eficiencia (%), contenido de humedad (%), actividad de agua y respuesta de higroscopicidad (g / 100 g).
B0 B1 B2 B 12 B 11 B 22
Modelo en el que b 1 = temperatura de entrada del secador (° C), b 2 = Solidos totales (%).
peroxidación y rotura y colapso de la membrana celular debido al agua ( Santivarangkna, Kulozik y El contenido de humedad disminuyó de 4.4 a 1.4% con el aumento en la temperatura de secado (140
Foerst, 2008 ). El e ff El efecto de los sólidos totales no se representó en el rango que se utilizó (24 - 31%) ° C), y el contenido de 25% de sólidos totales fue el valor más bajo obtenido (1.4%). El análisis de
en este trabajo usando modi fi almidón ed (N-lok). Falfan y col., 2014 , informó este almidón para la varianza para el contenido de humedad (%) mostró un signi fi modelo de regresión de canto con un
encapsulación de Lactobacillus casei ATCC 334 con el método de secado por aspersión, pero no valor de R 2 ≥ 0,75, un coe ffi ciente de variación de 11,96 y un valor de p <0,0001. La falta de ajuste
informó la encapsulación e ffi eficiencia. fue signi fi cant (0.02). El coeficiente de regresión ffi cientes para el contenido de humedad se
muestran en Tabla 2 . El rango de actividad del agua obtenido fue de 0,18 - 0,30 ( Tabla 3 ). Para
La mezcla de almidón y pulque fue e ff eficaz para la protección de
L. pentosus. Esta protección se debe a la presencia de proteínas pulqueras y fructooligosacáridos en
la matriz de la pared que brindan doble beneficio. fi ts, como la formación de una capa protectora en la la actividad del agua, el análisis de varianza mostró una R 2 valor de 0.12, un coe ffi ciente de variación
pared celular bacteriana y el reemplazo parcial de los sitios de las moléculas de agua en las células de 13,79 y un valor de p de 0,10. El modelo propuesto no se ajustó ( Tabla 2 ). Valores bajos de
durante el secado, respectivamente. Estas características ayudan a evitar la ruptura de la membrana actividad de agua y contenido de humedad residual (<4 - 5% p / p) son requisitos previos para la
celular durante el proceso de secado por atomización, lo que a su vez aumenta la efectividad de la producción comercial de polvos secados por aspersión con buenas características de manipulación,
encapsulación ( Rajam y Anandharamakrishnan, 2015 ). Se realizó una prueba en condiciones tales como fl fluidez, baja pegajosidad y aglomeración, así como para una máxima viabilidad
similares a las del tratamiento seis (tratamiento con mayor e ffi ciency al 98,41%), pero el almidón solo probiótica ( Barbosa, Ortega, Juliano y Yan, 2005 ).
se dispersó en agua sin pulque, y la encapsulación e ffi La eficiencia fue del 89,72%, lo que corrobora
la importancia de la protección del pulque sobre la viabilidad de las bacterias. Finalmente, el análisis
de varianza de EE% mostró una signi fi modelo de regresión de canto con un valor de R 2 ≥ 0.85, un coe ffi
ciente de variación de 2,69 y valor de p <0,0001. La falta de ajuste no fue signi fi cant (0,7051). El
4.2.3. Higroscopicidad
coeficiente estimado ffi Los clientes del modelo ajustado se muestran en Tabla 2 .
El rango de higroscopicidad obtenido fue de 7,6 - 8,7 g / 100 g,
( Tabla 3 ). En general, en este trabajo, los valores obtenidos fueron inferiores a los reportados en
otros estudios debido al uso de di ff diferentes materiales de pared para la encapsulación (almidón
N-lok con propiedades hidrófobas e hidrófilas) y rango de temperatura (92 - 140 ° C) en el proceso de
secado por atomización. Las altas temperaturas de secado hacen que el producto tenga un menor
contenido de humedad y sea más higroscópico porque absorbe más agua, lo que favorece el
4.2.2. Contenido de humedad y actividad del agua. gradiente de concentración de agua entre el producto y el aire ( Tonon, Brabet y Hubinger, 2008 ). Cai
El e ff El efecto de la temperatura (° C) y los sólidos totales (%) sobre el contenido de humedad de y Corke
los productos encapsulados obtenidos se ilustra en Figura 1 B.
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Tabla 3
Encapsulación e ffi eficiencia (EE%), contenido de humedad (%), actividad del agua, higroscopicidad (%) y temperatura del aire de salida, para los 14 ensayos del diseño experimental.
Prueba Encapsulación e ffi eficiencia (EE%) Contenido de humedad (%) Actividad del agua Higroscopicidad (g / 100 g) Temperatura de secado de salida (° C)
(2000) valores obtenidos de 45,4 - 49,2 g / 100 g para polvos de betacianina secados por 30% de sólidos totales para una viabilidad del 99,1% de las bacterias. Los valores predichos fueron
pulverización. Sin embargo, se utilizaron maltodextrinas como material de pared con temperaturas de contenido de humedad de 3.3%, actividad de agua de 0.25 e higroscopicidad de 7.9 (g / 100 g). Para
secado por pulverización de entrada entre 150 y 210 ° C. Tonon et al., 2008 , obtuvo valores de la microencapsulación obtenida con condiciones de secado óptimas experimentalmente, se encontró
higroscopicidad de 12,48 - 15,79 (g / 100 g), y estos autores microencapsularon el açai. El proceso se una viabilidad de 98% de bacterias, un contenido de humedad de 3.0%, una actividad de agua de
llevó a cabo en un minisecador por atomización y se utilizó maltodextrina como agente de transporte. 0.26 y una higroscopicidad de 7.0 (g / 100 g).
El análisis de varianza para higroscopicidad (g / 100 g) mostró que el modelo de regresión no fue
signi fi no puedo con una R 2 ≥ 0,05, coe ffi ciente de variación de 4.60 y valor p de 0.10. La falta de
ajuste no fue signi fi cant (0,11).
4.3.1. Morfología de microcápsulas
La forma de las microcápsulas era característica de las producidas por secado por atomización ( Fig.
3 a), con concavidades en la superficie como consecuencia de la rápida evaporación del agua. Varios
autores informaron resultados similares ( Rodríguez-Huezo et al., 2007 ; Ying et al., 2010 ). Aunque no
4.3. Optimización del proceso de microencapsulación
se determinó el tamaño promedio de las micropartículas, las micrografías SEM permitieron estimar el
tamaño de las microcápsulas en menos de ≈ 20 μ metro. Esta característica puede contribuir a reducir
El proceso se optimizó para aplicaciones industriales y para fi nd el mejor rendimiento para el
el impacto en la textura cuando se incorpora a un sistema de modelo alimentario. La alta e ffi La
proceso de secado por aspersión (temperatura del aire de entrada y sólidos totales) para una
eficacia de la encapsulación también se puede corroborar porque no se observaron bacterias en la
producción más viable de microencapsulados
superficie de las cápsulas.
Lactobacillus pentosus. La variable respuesta que mostró un estadísticamente significativo fi no puedo ff ect
fue e ffi eficiencia de encapsulación (EE%). Figura 2 muestra el área que corresponde a las mejores
condiciones de secado. Las condiciones óptimas de secado fueron una temperatura de entrada en el
secador de 100 ° C con
Se obtuvieron 98,9 y 97,8% de resistencia, respectivamente. Los resultados obtenidos mostraron que
el proceso de microencapsulación protege la L. pentosus células del estrés causado por altas
concentraciones de sales biliares, y resultados similares fueron reportados por Dimitrellou et al., 2016 .
La resistencia a pH bajo y sales biliares es de gran importancia en el crecimiento de bacterias en el
tracto gastrointestinal y, por lo tanto, se considera un requisito previo para evaluar las posibles cepas
probióticas.
Figura 2. El área que corresponde a las mejores condiciones de secado para la encapsulación de L. pentosus utilizando el
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Fig. 3. Micrografías de encapsulado Lactobacillus pentosus y tiempo de almacenamiento a 4 ° C. a) Tiempo 0, b) semana 4, c) semana 8 yd) semana 12, 1500 X.
e higroscopicidad (7,0 g / 100 g), que se evidenció durante el almacenamiento de las cápsulas a 4 °
C. Encapsulación o ff Proporciona una mayor protección a la célula cuando se expone a altas
concentraciones de sales biliares. El pulque es una materia prima con alto potencial de
industrialización.
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