RESUMEN…………………….

12
INTRODUCCION……………………..14
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA……………………..16
2. JUSTIFICACIÓN …………………………………………………17
3. OBJETIVOS………………………………………………………..19
3.1 Objetivo General…………………………………………….19
3.2 Objetivos Específicos………………………………………………19
4. MARCO TEÓRICO………………………………..20
4.1 VALIDACIÓN DEL MÉTODO………………………….20
4.1.1 ESTANDARIZACIÓN DEL MÉTODO……………………..20
4.1.1.1 Linealidad…………………………………………………………21
4.1.1.2 Precisión………………………………………………………….21
4.1.1.3 Límite De Detección………………………………………………21
4.1.1.4 Exactitud………………………22
4.1.1.5 Límite De Cuantificación (LC)……………………….23
4.2 ACEITE DE PALMA……………………………..23
4.3 ANÁLISIS CUANTITATIVO DE LOS COMPONENTES……………26
4.4 CROMATOGRAFÍA DE GASES (CG)…………………………………..27
4.4.1 Temperatura de inyección………………………………………………28
4.4.2 Temperatura de análisis……………………………………………….28
4.4.3 Optimización de flujos en capilaridad split/splitless..29
4.4.4 Modalidad Split….30
4.4.5 Modalidad splitless……………………..30
4.4.6 Flujo de fase móvil…….31
4.4.7 Condiciones de las muestras a analizar ……………….32

4.5 DETECTOR DE IONIZACIÓN DE LLAMA (FID)……………………………………………..32

4.6 ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN………………………………………………….33
5 METODOLOGÍA………………………………………………………35
5.1 Materiales y reactivos…………………………………………………….35
5.2 Preparación de la muestra…………………………………………………………………35
5.3 Análisis cromatográfico (CG-FID)………………………………………………37
5.4 Cuantificación de escualeno y esteroles……………………………………………….38
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………….39
6.1 Exactitud…………………………………………48
6.2 Preparación de muestras para determinar límite de detección, cuantificación y
precisión…………………………………………………49
6.3 Coeficiente de correlación lineal………………………51

6.4 Rango de trabajo………………………………………………………….54

6.5 Precisión……………………………………………………………………………..54
6.5.1 Repetibilidad………………………………………………………………..55
6.5.2 Reproducibilidad……………………………………………………………55
6.6 Sensibilidad……………………………………………………………….55
6.7 Linealidad……………………………………………………………..57
7. CONCLUSIONES………………………………..57
8. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………58
9. ANEXOS………………………………………………………………….66
ANEXO 1. Cálculo del coeficiente de correlación lineal para la validación del estigmasterol…….66
ANEXO 2. Cálculo del coeficiente de correlación lineal para la validación del Escualeno…………………70
ANEXO 3. Valores de t para niveles de probabilidad………………….74

Martinez, J. (2017). Validación de un método químico analítico de HPLC en R.

Fundación universitaria los libertadores. Bogotá D.C.

Diaz., C., y Ferreira, L. (2011). Química Analítica: materiales docentes Grado de

Ingeniería Química 2º curso. Universidad de Santiago de Compostela. España.

El patrón interno (PI) no tiene que estar presente en las muestras, presentar características,
concentración y comportamiento análogo al del analito, no debe reaccionar con los
componentes de la muestra ni interferir en el análisis y tiene que representar el cociente
entre la señal de patrón y la del patrón interno frente a la concentración. (Diaz y Ferreira
(2011).

En los parámetros de calidad las condiciones más favorables para efectuar una medida se
tendrán a relaciones de señal/Ruido (S/R) altas (S/R ≥ 3). Se establece una relación S/R=3
para calcular el límite de detección. Se establece una relación S/R=10 para calcular el límite
de
cuantificación. (Diaz et al., 2011).

Ampliar este apartado con información relativa a los parámetros cromatográficos que son importantes
optimizar, por ejemplo, la temperatura de inyección, la temperatura de análisis (gradientes de
temperatura) la relación split/splitless, el flujo de fase móvil, entre otros. Esto es muy importante porque
son parámetros que tuvieron en cuenta durante los análisis.
También deben aclarar que una de las condiciones fundamentales de la técnica es que las sustancias a analizar
deben ser volátiles o deben derivatizarse antes para que lo sean. Hay que decir si los compuestos que ustedes
analizaron son volátiles o no y por qué.

Porque no se derivatizo
La columna utilizada proporcionó excelentes resultados sin la necesidad de derivatizar para
obtener los ésteres metílicos previo a su cuantificación. Al disminuir una etapa del análisis se evita
una posible fuente de error y se consigue un ahorro de tiempo

temperatura de inyección, la temperatura de análisis (gradientes de temperatura) la relación

split/splitless, el flujo de fase móvil, entre otros

http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_de_gases.pdf
XXXXXXXXX
Fase móvil
Es un fluido que penetra a través o a lo largo del lecho estacionario, en una dirección
determinada. Puede ser un líquido (cromatografía de líquidos) o un gas (cromatografía
de gases) o un fluido supercrítico (cromatografía de fluidos supercríticos). En
cromatografía de gases se puede utilizar la expresión gas portador para designar la
fase móvil, y en cromatografía de elución se puede utilizar la palabra eluyente para
designar esta misma fase.
XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

Un rasgo característico de la cromatografía es la presencia de dos fases;

dispuestas de tal manera que mientras una permanece estacionaria dentro del

sistema (fase estacionaria), la otra se desplaza a lo largo de él (fase móvil). La

clave de la separación en cromatografía es que la velocidad con la que se mueve

cada sustancia depende de su afinidad relativa por ambas fases (equilibrio de

distribución). Cromatografía de gases. En este caso la fase móvil es un gas

inerte (helio o nitrógeno) y la fase estacionaria es un sólido (cromatografía gas-

sólido) o un líquido “sostenido” por un sólido inerte (cromatografía gas-líquido).

Este tipo de cromatografía siempre es en columna, ya que es la única manera de

que la fase móvil gaseosa se mantenga fluyendo, confinada dentro del sistema. La

columna puede estar rellena con la fase estacionaria, en forma semejante a la

cromatografía líquida, o bien la fase estacionaria puede depositarse sobre las

paredes de un tubo muy delgado (0.25mm de diámetro) y largo (hasta 100m). Este

tipo de columnas se conocen como columnas capilares y proporcionan la mayor

capacidad de separación. (Pássaro, Rivera, Román, Cardona, Muñoz, Goméz,

Quiceno y Rojas, 2016).

Pássaro, C., Rivera, C., Román, M., Cardona, L., Muñoz, L., Goméz, D., Quiceno,

J., y Rojas, L. (2016). Guía sobre principios básicos de cromatografía y sus

aplicaciones. Servicio nacional de aprendizaje – SENA. Rionegro – Antioquia.

Recuperado de,

https://repositorio.sena.edu.co/bitstream/11404/4694/1/guia_cromatografia.pdf

La fase móvil, en la que irá disuelta la muestra, se forma por disolventes cuya naturaleza se elige

en función de los componentes que se pretenden separar. La fase móvil es líquida y la fase

estacionaria consiste en un sólido. La fase estacionaria será un componente polar y el eluyente

será por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se

desplacen con mayor velocidad serán los menos polares. La velocidad promedio de la fase móvil

también afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad óptima para obtener el máximo de

eficiencia. Generalmente se trabaja a flujos mayores de éste para no perder demasiado tiempo en

análisis

Universidad Nacional Autónoma de México Facultad de Química, diciembre de

2007, Técnicas Cromatográficas. Recuerdo de,

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/M.Cromatogrficos_6700.pdf

Optimización de flujos en capilaridad split/splitless

El proceso de la cromatografía de gases se optimiza cuando la sensibilidad y
resolución de las mezclas complejas es activado en el menor tiempo posible. Para
lograr esta calibración hay que tener en cuenta:
1) las soluciones estándar de diferentes concentraciones son lineales, 2) los
estándares a las mismas concentraciones se reproducen en un periodo de tiempo
específico y 3) bajos niveles de concentración de picos tempranos y tardíos,
acompañados con el menor ruido. Cumpliendo con este procedimiento podremos
tener un sistema optimizado. Un cambio directo en el flujo puede modificar
completamente la forma de los picos y alterar toda la eficiencia de la columna.
(Olquín y Rodriguez, 2004).
Complicaciones mayores se obtienen cuando se utiliza un sistema de dos
columnas y una de ellas afecta el funcionamiento de la otra. Desafortunadamente,
esto frecuentemente aumenta el tiempo de análisis. La dificultad con la
optimización es que esto involucra muchas variables: 1) parámetros fijados como
la longitud de la columna, diámetro interno, y capacidad de adhesión de la
película; 2) parámetros operacionales como la temperatura de la columna,
acarreador y flujo de gas, o los modos de inyección. (Olquín y Rodriguez, 2004).
Olquín. L. y Rodriguez, H. (2004). Métodos en biotecnología. Universidad nacional
autónoma de México. Recuperado de
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/cromatografia_de_gases.pdf

La Inyección en Splitless
El componente mayoritario, el solvente, se evapora y llena en parte el volumen
interno del inserto. Puesto que este volumen puede ser de 1 ml o más (ver Cálculo
de Flashback) y el caudal de gas portador en la columna suele ser de 1 ml/min,
puede deducirse que el tiempo mínimo necesario para la transferencia de los
vapores a la columna sea igual a:

En general este tiempo suele ser de 60” tras el cual se vuelve a abrir la válvula de split
para permitir evacuar los restos de vapores que pudieran estar todavía en el inyector. El
solvente usado y la temperatura de horno inicial son dos parámetros críticos para producir
el llamado Efecto Solvente que permite concentrar los componentes, especialmente más
volátiles, en bandas iniciales muy estrechas

Optimización de tiempo de purga y velocidad de Split

Para que ocurra la retención, la temperatura inicial del horno debe ser 20ºC abajo del punto de
ebullición del solvente. Sin embargo, con solventes como el cloruro de metileno (punto de
ebullición de 40ºC), la concentración del solvente no es práctica porque la temperatura inicial del
horno estará a menos de la temperatura del cuarto. En este caso, el analizador debe aceptar los
picos que 28 estén entre los solutos que eluyen al principio o tratar varias técnicas de inyección
que sean compatibles con el muestreo tipo splitless. Una cabeza del alineador desactivada, sin
lana de sílica es preferida para una mezcla ligera de la muestra con el solvente. Ocasionalmente, la
lana puede ser usada para ayudar a la volatilización de los componentes de alto peso molecular.
Un alineador de cuello de ganso es una alternativa viable para un alineador delgado, diseñado
específicamente para mejorar la eficiencia del splitless y disminuir la degradación de la muestra.
Una columna moderadamente polar desactivada, puesta 1 o 2 cm abajo del punto de inyección,
podría ser utilizada siempre con splitless para minimizar el pegado de los picos y para tener una
migración uniforme del solvente. Para tener un tiempo de purga óptimo, se comienza con un
rango de purga de 0.2 a 1.5 min. Si el tiempo es muy corto, menos de 0.1 min. los componentes
más pesados no se volatilizarán lo suficiente o no se crearía la “concentración del solvente”. Si hay
una gran diferencia entre el punto de ebullición del solvente y el del soluto, el tiempo de purga
necesitar estar cercano a 0.2 min. Ajustar el tiempo de purga en incrementos de 0.1 min. hasta
alcanzar el máximo de sensibilidad del soluto sin que haya trazas del solvente. El muestreo tipo
split es el método más popular porque inyectar muestras de 0.1 a 2 µl no impide que haya una
buena altura y sensibilidad en el pico. Si se obtiene la cantidad máxima de eficiencia de la
columna, las áreas del pico más pequeñas asociadas con el muestreo tipo split reflejan una
reducción en lo ancho lugar de lo alto del pico. Mejorar la simetría del pico permite una mejor
reproducibilidad y por lo cual da una mejor cuantificación del área de los picos. Otra ventaja del
split, es que se pueden usar columnas más estrechas para tener una mejor resolución sin tener
que volver a muestrear la columna. Quizá el único inconveniente del split es que la cantidad
inyectada a la columna podría no ser representativa si la muestra no es completamente
vaporizada. Esto es porque la muestra entra en el alineador con el respirador split abierto y el
extracto de la muestra y el acarreador son purgados antes de que entren a la columna. Por esta
razón, el método de inyección split puede ser monitoreado siempre corriendo soluciones
estándares de concentraciones conocidas y analizar su reproducibilidad. La cantidad purgada en el
respirador del split está determinado por la velocidad del split4 :

Una velocidad de 100:1 indica que el 99 % de la muestra, el solvente y el acarreador se purgaron a

través del respirador del split. Para incrementar el flujo a través del respirador se disminuye la
presión o el flujo del acarreador a través de la columna. Las diferencias en el peso molecular,
concentración de la muestra, temperatura inicial del programa y volumen de inyección afectan el
split. Algunas de estas discrepancias pueden ser minimizadas al seleccionar un alineador de
inyección adecuado. Un alineador inerte, empaquetado ligeramente con lana de sílica, es esencial
para completar la filtración de 29 residuos no analizables y garantizar el calentamiento adecuado,
mezclado y expansión del vapor. Esto es particularmente importante cuando se inyectan
componentes de alto punto de ebullición.

Para mejorar la velocidad del split, colocar la temperatura del horno a la temperatura inicial y
ajustar flujo del respirador del split hasta que esté en 10 a 15 ml/min. El flujo a través del
respirador de purga pude estar entre 0.5 a 6 ml/min. y el flujo del acarreador en 2 a 5 ml/min. al
final del detector.

Con la programación de la temperatura y presión se han optimizado y mejorado los

procedimientos de corrida. Los programas computarizados proveen aproximaciones más cercanas
para condiciones ya optimizadas. Esto no remplaza los métodos ya desarrollados, pero puede
eliminar los tiempos de corrida sesgados.

Aporte para anexar al documento

 Análisis cromatográfico de componentes menores utilizando gas XXXXX

La Tabla 1 y las Figuras 1 y 2 muestran la composición y los cromatogramas de los ácidos grasos
libres de los quesos Palmita y Semiduro. Se ha podido comprobar la presencia en los quesos de los
AGL saturados del butírico (C4) al palmítico (C18), así como de los mono-insaturados y poli-
insaturados, el ácido oleico (C18:1) y linoleico (C18:2) en concentraciones muy diversas entre 2.3
g/g (C6) en el queso Palmita y 185.1 g/g (C18:1) en el queso Semiduro, con el predominio de los
de mayor peso molecular, palmítico (C16) y oleico (C18:1), sobre los de menor peso