Caracterización fitoquímica y evaluación del efecto tripanocida de extractos obtenidos de

Croton leptostachyus sobre Trypanosoma cruzi.

ANDRÉS FELIPE PÉREZ ALAIX

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial para optar por el título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
Bogotá D.C.
Noviembre de 2019
 NOTA DE ADVERTENCIA
“La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de
tesis. Solo velará por que no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis
no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la
verdad y la justicia”.

Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1996

Caracterización fitoquímica y evaluación del efecto tripanocida de extractos obtenidos de
Croton leptostachyus sobre Trypanosoma cruzi.

ANDRÉS FELIPE PÉREZ ALAIX

Concepción Judith Puerta Bula, Ph.D. Marcela Franco Correo, Ph.D.

Decana Directora
Facultad de Ciencias Carrera de Microbiología
Caracterización fitoquímica y evaluación del efecto tripanocida de extractos obtenidos de
Croton leptostachyus sobre Trypanosoma cruzi.

ANDRÉS FELIPE PÉREZ ALAIX

Daniel Andrés Pardo, Msc. Claudia L. Cuervo Patiño, Ph.D.

Asesor Bióloga
Directora

Jorge Eliecer Robles Camargo, Ph.D.

Biólogo
Jurado

AGRADECIMIENTOS
A mi abuela y mis padres por ser siempre un apoyo y motivación incondicional para lograr cada uno de
mis objetivos.
A Claudia Cuervo, por darme la confianza y la oportunidad de permitirme realizar este proyecto bajo su
dirección, siguiendo sus consejos y lecciones.
A Daniel Pardo, José Mateus, y Paola Nocua por su ayuda, sus consejos y disposición, así como por
darme las bases para realizar mi trabajo.
Al laboratorio de Inmunoparasitología Molecular y sus integrantes por acogerme.
A mis amigos y compañeros, por su compañía y apoyo durante toda la carrera.
Tabla de contenidos
1. Resumen…………………………………………………………………………………….7

2. Justificación– Planteamiento del problema……………………………………………….8

3. Marco teórico……………………………………………………………………………….8
3.1 Enfermedad de Chagas.
3.2 Agente etiológico.
3.3 Tratamiento.
3.4 Productos naturales

4. Objetivos……………………………………………………………………………………11
4.1. Objetivo general
4.2. Objetivo específico

5. Metodología………………………………………………………………………………11
5.1. Colecta y preparación de extractos
5.2. Determinación de la concentración a la cual se inhibe el 50% de la viabilidad (CI50) de los
epimastigotes la cepa Y de Trypanosoma cruzi tratados con los extractos totales de Croton
leptostachyus
5.3. Determinación de la capacidad citotóxica (CC50) de los extractos obtenidos de Croton
leptostachyus
5.4. Parámetros de aceptación de un ensayo
5.5. Identificación de los grupos de compuestos presentes en los extractos de Croton leptostachyus

6. Resultados………………………………………………………………………………….13
6.1 Evaluación de la capacidad tripanocida y citotóxica de los extractos totales de Croton
leptostachyus sobre epimastigotes de T. cruzi y células VERO.
6.2 Evaluación de la capacidad citotóxica de los extractos totales de Croton leptostachyus sobre
Células VERO.
6.3 Determinar la capacidad selectiva de los extractos obtenidos de Croton leptostachyus.
6.4 Tamizaje fitoquímico de los constituyentes presentes en los extractos de Croton
Leptostachyus.
6.5 Identificación de los compuestos de los extractos de Croton Leptostachyus usando
Cromatografía de gases acoplada a Espectrometría de masas.

7. Discusión…………………………………………………………………………………..21
8. Conclusiones ………………………………………………………………………………23
9. Recomendaciones…………………………………………………………………………23
10. Anexos……………………………………………………………………………………...23
11. Bibliografía………………………………………………………………………………...25
1. Resumen

La Enfermedad de Chagas es una infección crónica y sistémica causada por el parásito Trypanosoma cruzi,
el cual es transmitido al hombre principalmente a través de un insecto vector. Sin embargo, esta
enfermedad también puede ser transmitida congénitamente (de madre a hijo), por medio de
transfusiones de sangre, trasplantes de órganos y de manera oral por la ingestión de comidas o bebidas
contaminadas con las formas infectivas del parásito (1)

La infección es endémica en 21 países de Centroamérica y Suramérica, en donde se calcula que

alrededor de 17.4 millones de personas son infectadas y 100 millones están en riesgo de contraer la
enfermedad (2), sin embargo, las migraciones humanas desde áreas endémicas a áreas no endémicas han
hecho que la infección se distribuya mundialmente convirtiéndola en un problema de salud pública a
nivel global (1). En Colombia se estima que existen entre 700.000 y 1.200.000 personas infectadas y
aproximadamente 25 millones se encuentran en riesgo de infectarse con el parásito (3).

Actualmente existen dos fármacos para el tratamiento de la infección: Benznidazol y Nifurtimox. El

tratamiento es recomendado en individuos con infección aguda, pacientes con infección congénita,
niños menores de 18 años con infección crónica asintomática; no es recomendado en individuos que
posean insuficiencias renales, insuficiencias hepáticas y en mujeres embarazadas (4). La efectividad de
ambos medicamentos en la fase crónica de la infección es controversial (1,2,5). Adicionalmente, ambos
tratamientos deben ser suministrados en altas dosis y durante prolongados periodos de tiempo, como
consecuencia, los pacientes suelen manifestar efectos secundarios como anorexia, pérdida de peso,
desórdenes neurológicos, pancreatitis, afecciones digestivas, entre otras (6,7). Por lo anterior, la
búsqueda de nuevas moléculas que tengan la capacidad de eliminar el parásito y controlar la enfermedad
de Chagas es prioritaria.

En este sentido, las especies vegetales se caracterizan por poseer una fuente amplia de metabolitos, que
pueden tener actividad biológica frente a los diversos microorganismos (bacterias, virus, hongos y
parásitos) y que además puedan ser selectivos contra estos (8,9). Por otro lado, Colombia posee
alrededor del 10% de las especies vegetales del mundo, siendo estas una fuente abundante de
compuestos con actividades terapéuticas que en gran parte son atribuidos a sus metabolitos
secundarios.

La familia Euphorbiaceae está constituida por alrededor de 8.000 especies, agrupadas en 317 géneros y
dividida en aproximadamente 14 familias, entre las cuales se encuentra el género Croton (9). Las plantas
provenientes de la familia Euphorbiaceae han presentado propiedades antinflamatorias, antitumorales,
leishmanicidas y antimaláricas (10–12). Un estudio realizado por Neira y colaboradores en 2014, en
donde se evaluó la actividad biológica de los aceites esenciales (AE) y extractos obtenidos de plantas de
esta familia contra las formas extracelulares e intracelulares de T. cruzi, Leishmania (Viannia) panamensis,
L. (V.) braziliensis encontró que los AE de Croton pedicellatus y Croton leptostachyus inhibieron el
crecimiento de epimastigotes de T. cruzi y amastigotes de L. (V.) braziliensis, lo que sugiere la existencia de
metabolitos, en la familia Euphorbiaceae, con actividad antiparasitaria (13).

Teniendo en cuenta lo anterior, en el presente proyecto se realizó una caracterización química

preliminar y se evaluó la capacidad tripanocida y citotóxica de los extractos totales de Croton leptostachyus
sobre epimastigotes de T. cruzi y células VERO. Los componentes mayoritarios de los extractos fueron
los terpenos, las cumarinas y los cardiotónicos. Los extractos de hexano y diclorometano inhibieron el
crecimiento de epimastigotes de T. cruzi con una CI50 de 254,13 µg/mL ± 30,94 y 150,17 µg/mL ±
8.91, respectivamente. El extracto hidroalcohólico no mostró actividad contra los parásitos. Así mismo,
frente a las células VERO los extractos de hexano y diclorometano mostraron una CC50 de 57,65
µg/mL ± 15,94 y 34,04 µg/mL ± 6,80, respectivamente, siendo tóxicos los extractos obtenidos de C.
leptostachyus tanto para T. cruzi como para las células VERO, y no selectivos frente al parásito.
2. Justificación- Planteamiento del Problema

La enfermedad de Chagas es una infección que afecta de 6 a 7 millones de personas alrededor del
mundo, la cual es producida por el parásito T. cruzi [(14)]. Esta enfermedad es considerada como un
problema de salud pública en 21 países latinoamericanos donde es endémica, dentro de los cuales se
encuentra Colombia (3). Se estima que entre 10.000 - 12.000 personas mueren al año en el mundo
debido al daño cardiaco o gastrointestinal producto de la infección con el parásito (3), lo cual representa
un gasto global de alrededor de US$ 7 - 19 billones y en Colombia de $267 millones de pesos al año, en
términos del cuidado en la salud de los pacientes (15). A pesar del alto impacto que tiene la infección,
actualmente no existen vacunas para la prevención de la enfermedad de Chagas y los fármacos usados
para su tratamiento son tóxicos, deben ser suministrados en altas dosis y durante prolongados periodos
de tiempo (1–7). Así, la búsqueda de nuevas moléculas que tengan la capacidad de matar el parásito y
controlar la enfermedad de Chagas es prioritaria.

Teniendo en cuenta lo anterior, en el siguiente proyecto se propuso determinar la clase de compuestos

mayoritarios presentes y evaluar la capacidad tripanocida de los extractos de hexano, diclorometano y la
mezcla hidroalcohólica obtenidos de las raíces de C. leptostachyus sobre T. cruzi, como un primer paso
para la identificación de moléculas que puedan tener actividad sobre el parásito; que a futuro permitan
proponer una alternativa de tratamiento, menos tóxica y más efectiva, en pro de mejorar la salud y la
calidad de vida del paciente, y disminuir los gastos del sistema de salud.

3. Marco Teórico

3.1. Enfermedad de Chagas

La enfermedad de Chagas es una infección causada por el parásito protozoario Trypanosoma cruzi y se
caracteriza por cursar con dos fases: aguda y crónica (1). La fase aguda en la mayoría de los casos es
asintomática, sin embargo, en algunas ocasiones puede cursar con fiebre, inflamación en el sitio de
entrada del parásito, edema palpebral unilateral (signo de Romaña), linfoadenopatía o
hepatoesplenomegalia. Luego, usualmente los síntomas desaparecen gracias a la respuesta inmune
mediada por células y el individuo permanece en un estado de infección crónico, en donde la mayoría
de los pacientes no desarrollan síntomas, pero el parásito persiste en el paciente. Aunque en la mayoría
de los casos los pacientes permanecen en fase crónica asintomática durante toda su vida un porcentaje
(30-40%) de los pacientes en esta fase crónica asintomática, años después de la fase aguda desarrollan
síntomas cardiacos y/o digestivos como cardiomiopatías, megaesófago o megacolon, o mixtos (1,2). La
enfermedad de Chagas es endémica en 21 países latinoamericanos y entre estos se encuentra Colombia
(1–3). En Colombia el Instituto Nacional de Salud reportó para el año 2014, 8 millones de personas se
encontraban en riesgo de adquirir la infección y entre 700 mil y 1 millón se encontraban infectados, lo
cual anualmente representa un gasto de $267 millones de pesos al año en los cuidados prestados a
pacientes crónicos infectados.
Por lo cual, la migración de la población de áreas endémicas a no endémicas ha hecho que la infección
se presente en regiones donde no existe la presencia del vector, convirtiéndose en un problema de salud
a nivel mundial (1,2).

3.2. Agente etiológico

Trypanosoma cruzi es un parásito protozoario del filo Euglenozoa, del orden Kinetoplastidae y de la
familia Trypanosomatidae [4]. Este parásito está clasificado en 7 grupos génicos o Unidades Discretas
de tipificación (UDT), los cuales son diversos a nivel genético y fenotípico. En Colombia los grupos
denominados TcI y TcII son los que presentan mayor distribución en el país, siendo TcI el que se
encuentra con mayor frecuencia en la población colombiana (16–18).

Este protozoo posee un ciclo de vida digenético, el cual ocurre en un hospedero invertebrado, que
pertenece a la familia Triatominae (vector) y un hospedero mamífero. El ciclo de vida de este parásito
inicia cuando el vector hematófago consume las formas tripomastigotas sanguíneas, de un mamífero
infectado. En el interior del vector, los tripomastigotes migran al intestino medio y se diferencian al
estadio epimastigote, los cuales se dividen por medio de fisión binaria y migran a la región posterior del
intestino en donde se transforman en tripomastigotes metacíclicos, la forma infectiva del parásito para
el hospedero mamífero. Cuando el insecto se alimenta nuevamente de un mamífero, libera las formas
infectivas del parásito por medio de las heces, las cuales pueden ingresar a través de las mucosas o la
herida generada por la picadura del insecto y así distribuirse por el organismo del hospedero e infectar
cualquier célula nucleada. Ya en el interior de las células el parásito se diferencia nuevamente en la
forma replicativa, la forma amastigote. Luego de varios ciclos de replicación, cambia nuevamente a la
forma tripomastigote, el cual lisa la célula y es liberado al torrente sanguíneo; donde va a infectar otras
células para continuar su ciclo de infección o ser ingerido nuevamente por el insecto vector (1,2,5).

3.3. Tratamiento

Actualmente existen dos fármacos disponibles para el control de infección por T. cruzi: un nitrofurano
denominado Nifurtimox [3-metil-4 (nitrofurfurilideneamino)tetrahidro -4H-1,4-tiozina-1,1-dióxido] y
un compuesto que pertenece a los nitroimidazoles denominado Benznidazol (bz) [N-benzil2-
nitroimidazol acetamida], siendo este último el fármaco de elección para el tratamiento de la
enfermedad, debido a que es más tolerable que el Nifurtimox y presenta mejor penetración en el tejido
(1–3,18). Estos medicamentos deben ser administrados en elevadas concentraciones (5-10 o 5-20
mg/Kg/día de Benznidazol o Nifurtimox, respectivamente) y por prolongados periodos de tiempo (60
– 90 días para ambos) [5]. Se recomiendan para el tratamiento de la fase aguda de la infección en
pacientes con infección congénita, pacientes menores de 20 años en fase crónica asíntomática, pacientes
en fase crónica con reactivación de la infección debido a inmunosupresión, y en pacientes con infección
debido a exposición accidental a material contaminado con el parásito (4). La tasa de cura en la fase
crónica de la enfermedad para el Nifurtimox, en adultos es de 7 a 8 %; y, en niños menores de 14 años
de un 86%. Mientras que para Benznidazol las tasas de curación en esta misma fase, son de 2 a 40 % en
adultos y del 60 al 93 % en niños, (6,19–22). Sin embargo, el uso de estos tratamientos en la fase
crónica es controversial, estudios como el ensayo BENEFIT reportan que el tratamiento con
Benznidazol no reduce la incidencia de las formas cardiacas en pacientes infectados. Y la falta de
ensayos clínicos que involucren un seguimiento prolongado de la enfermedad en humanos en fase
crónica asintomática y sintomática no permiten tener un criterio homogéneo en cuanto a su
recomendación (22–24)

Adicionalmente, diversos efectos secundarios han sido asociados al uso de ambos fármacos. El
Benznidazol, además de causar problemas digestivos, que se inician típicamente en la primera semana
de tratamiento, puede causar efectos adversos, los cuales se han clasificado en tres grupos: a) Síntomas
de hipersensibilidad, dermatitis con erupciones cutáneas (normalmente aparecen entre los días 7 y 10 de
tratamiento), edema febril, linfadenopatía, artralgias y mialgias; b) Polineuropatía, parestesias y
polineuritis (normalmente aparecen a partir de la cuarta semana de tratamiento), y c) Depresión de
médula ósea (raro); púrpura trombocitopénica y agranulocitosis (normalmente aparecen a partir de la
segunda semana de tratamiento) (1,2,5,6). Adicionalmente, se ha descrito un efecto
mutagénico/carcinogénico en relación con el tratamiento prolongado con Benznidazol en modelos
murinos, aunque en este momento no existe ningún estudio que haya confirmado dicho efecto en
humanos (15, 16). Por otro lado, el Nifurtimox puede causar anorexia, pérdida de peso, desórdenes
neurológicos, manifestaciones digestivas, fiebre y también irritaciones (1,2,5,6). Los efectos secundarios
del medicamento se consideran motivos suficientes para interrumpir y retirar la administración del
fármaco, siendo preocupante puesto que no se controlaría la infección (1,2,5,6).

3.4. Productos Naturales

Los avances tecnológicos han permitido descubrir una gran cantidad de compuestos naturales
provenientes de animales, plantas, organismos marinos y microorganismos, entre otros, que son base
para el desarrollo de nuevos tratamientos (25–29). El uso de plantas medicinales hace parte importante
de las investigaciones en farmacología humana y animal, ya que estas proporcionan alternativas de bajo
costo para el tratamiento de múltiples enfermedades y tienen un gran potencial para el desarrollo
sostenible (30). Un ejemplo de lo anterior es la quinina, un compuesto activo contra Plasmodium sp., la
cual fue aislada de las plantas del género Cinchona sp.; y la Artemisina, obtenida de la planta Artemisia
annua para el tratamiento de parásitos resistentes a la quinina (31,32).

La familia Euphorbiaceae está constituida por alrededor de 8.000 especies, agrupadas en 317 géneros y
dividida en aproximadamente 14 familias, entre las cuales se encuentra el género Croton (13). Las
plantas provenientes de la familia Euphorbiaceae han presentado propiedades antinflamatorias,
antitumorales, leishmanicidas y antimaláricas (10–12). Algunas especies pertenecientes al género
Croton, han demostrado actividad antiparasitaria, entre ellas C. zambesicus, en la cual se encontró que los
extractos radiculares y las fracciones de n-hexano, cloroformo, etil-acetato y metanol inhibieron a
Plasmodium berghei berghei (33). También en un estudio realizado con otra especie del género Croton,
donde se investigó el efecto de los aceites esenciales (AE) de las hojas de Croton cajucara, se evidenció
que los AE de esta planta poseen actividad citotóxica frente a promastigotes de L. amazonensis (MIC de
85.0 pg/mL) (34).

Así mismo, un estudio donde se evaluó in vitro la actividad tripanocida y citotóxica de extractos
obtenidos de 23 plantas colombianas, mostró que Hieronyma antioquensis, una planta perteneciente a la
familia Euphorbiaceae tuvo actividad contra epimastigotes (CI50 <3,125), amastigotes (CI50 de 2,85) y
tripomastigotes (CI50 11,48±2,8) de T. cruzi, lo que indica la posible existencia de sustancias con
actividad biológica promisoria y justifica la investigación con la familia Euphorbiaceae (35).

Particularmente Croton leptostachyus, contiene una amplia gama de compuestos destacándose terpenos,
saponinas, compuestos fenólicos y alcaloides que están relacionados con actividad anti-inflamatoria,
antifúngica y antioxidante (36–38). En el estudio realizado por Pardo y colaboradores reportaron
alcaloides terpenos y fenoles para el extracto etanólico de Croton leptostachyus (43). Peralta y
colaboradores en el 2015 reportaron saponinas, fenoles, alcaloides y cumarinas en el extracto crudo de
Croton leptostachyus (45). Un estudio realizado por Neira y colaboradores en 2014, en donde se evaluó la
actividad biológica de los aceites esenciales y extractos obtenidos de plantas de la familia Euphorbiaceae
contra las formas extracelulares e intracelulares de T. cruzi, Leishmania (Viannia) panamensis y L. (V.)
braziliensis encontró que los AE de Croton pedicellatus y Croton leptostachyus inhibieron el crecimiento de
epimastigotes de T. cruzi y amastigotes de L. (V.) braziliensis, lo que confirma la existencia de
metabolitos, en la familia Euphorbiaceae, con actividad antiparasitaria pero la selectividad de los
extractos fue baja (IS de 0,85 en C. leptostachyus) lo cual indica una posible toxicidad de los mismos(13).

Teniendo en cuenta lo anterior, en el presente proyecto se plantea determinar la clase de compuestos

mayoritarios presentes en los extractos de hexano, diclorometano y la mezcla hidroalcohólica
etanol:agua de C. leptostachyus y evaluar la actividad tripanocida de los mismos, sobre el estadio
epimastigote de T. cruzi, con el fin de iniciar la búsqueda de los metabolitos responsables de la actividad
antiparasitaria.
4. Objetivos

4.1. Objetivo General

 Caracterizar químicamente y evaluar la capacidad tripanocida de los extractos de hexano,
diclorometano y etanol-agua obtenidos de Croton leptostachyus sobre Trypanosoma cruzi.

4.2. Objetivos Específicos

 Evaluar la capacidad tripanocida y citotóxica de los extractos totales de Croton leptostachyus

sobre epimastigotes de T. cruzi, células Vero.
 Determinar la capacidad selectiva de los extractos obtenidos de Croton leptostachyus.
 Identificar los grupos de compuestos mayoritarios presentes en los extractos de Croton
leptostachyus.

5. Metodología

5.1. Colecta y preparación de extractos

La colecta del material vegetal se realizó en el municipio San Luis, coordenadas 4°20´28´´N 75°6´8´´O
y contó con el “Permiso marco de recolección de especímenes de especies silvestres de la diversidad
biológica para investigación con fines no comerciales” otorgado a la Pontificia Universidad Javeriana
(Resolución 778 del 7 de julio de 2017), emitido por la Autoridad Nacional de Licencias Ambientales
(ANLA). Los especímenes colectados de la especie de Croton leptostachyus se enviaron al Herbario de la
Universidad del Tolima donde se realizaron los procesos de curaduría, para la identificación de la
especie (N° de voucher 009586).
Las raíces de Croton leptostachyus se secaron, trituraron, tamizaron. Luego de esto se pusieron en contacto
con los solventes en una relación (1:10) muestra(g)/disolvente(mL) con agitación continúa utilizando
como disolventes: hexano, diclorometano y etanol:agua (7:3), los extractos obtenidos se concentraron a
baja presión por rotaevaporación y el extracto de etanol:agua fue liofilizado, para luego ser almacenados
a 4 °C hasta su uso.
Los extractos obtenidos se usaron para la identificación de las clases de compuestos presentes en los
extractos y para evaluar su capacidad tripanocida y citotóxica por triplicado y en tres réplicas biológicas,
de acuerdo con las siguientes metodologías:

5.2. Determinación de la concentración a la cual se inhibe el 50% de la viabilidad (CI 50) de

los epimastigotes la cepa Y de Trypanosoma cruzi tratados con los extractos totales de
Croton leptostachyus

Para los ensayos se usaron 1x106 parásitos/pozo de un cultivo de epimastigotes (aislado Y, DTU II) de
T. cruzi, en fase de crecimiento exponencial (96 horas). Los parásitos fueron tratados con diluciones
seriadas 1:2 de los extractos, con concentraciones desde 1.000 hasta 31,25 µg/mL durante 48 horas a 26
°C [35,40]. Seguido a esto, se evaluó la viabilidad de los parásitos mediante la adición de 40 µL de MTT
(Método colorimétrico de la reducción metabólica del Bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-
difeniltetrazol) a una concentración de 10 mg/mL. Tras 4 horas de incubación a 26°C los tratamientos
fueron descartados por centrifugación a 2.500 rpm, durante 20 minutos. Finalmente, los cristales de
formazán generados se disolvieron usando 100 µL SDS 10% HCL 0,1 N. Por último, se midió la
absorbancia a una longitud de onda de 540 nm en un lector de microplacas. Como control positivo se
usó Nifurtimox a una concentración de 5 µMol. Cómo control negativo se usaron los parásitos sin
ningún tratamiento [19]. Se determinó la CI50 realizando un análisis de regresión no lineal mediante una
curva dosis respuesta en donde se interpoló el valor en el cual la concentración reduce la viabilidad de
los parásitos al 50 %, usando el programa GraphPad Prism 6.

5.3. Determinación de la capacidad citotóxica (CC50) de los extractos obtenidos de Croton

leptostachyus

Se usó la línea celular de riñón de mono verde africano (VERO), 5x103 células/pozo fueron cultivadas
en medio DMEM suplementado con SFB, HEPES, L-glutamina, aminoácidos esenciales y se montaron
en placas de 96 pozos. Las células se incubaron con concentraciones decrecientes de los extractos (500
µg/mL a 16,625 µg/mL) durante 48 horas a 37 °C [35,40]. Seguido a esto, se evaluó la viabilidad celular
mediante la adición de 50 µL de MTT a una concentración de 1 mg/mL. Tras 4 horas de incubación a
37°C los tratamientos se descartaron. Finalmente, los cristales de formazán generados fueron disueltos
usando DMSO. Por último, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 540 nm en un lector de
microplacas. Cómo control negativo se usaron las células sin ningún tratamiento (39). Se determinó la
CC50 realizando un análisis de regresión no lineal mediante una curva dosis respuesta en donde se
interpoló el valor en el cual la concentración reduce la viabilidad de los parásitos al 50 % usando el
programa GraphPad Prism 6.

5.4. Índice de selectividad.

Para evaluar la relación entre la citotoxicidad y la actividad tripanocida registrada se usó como indicador
el índice de selectividad (IS), el cual corresponde al cociente entre la CC 50 en células VERO y la CI50 en
epimastigotes de T. cruzi.

5.5. Parámetros para la aceptación de un ensayo

Cada experimento se realizó por triplicado y con el objetivo de asegurar un mínimo de error
experimental en los ensayos con los extractos y los controles, se determinaron los siguientes criterios:
viabilidad mayor al 95% en el control negativo, viabilidad del 50% en el control positivo, tendencia
entre el porcentaje de viabilidad y la concentración de los extractos (a menor concentración del
extracto, mayor viabilidad), un coeficiente de determinación de la recta (R 2) mayor o igual a 0,8 y un
coeficiente de variación entre los triplicados experimentales de cada réplica biológica menor al 20%.
Para el análisis de resultados, se seleccionaron las réplicas biológicas que cumpliesen con 4 de los 5
criterios.

5.6. Identificación de los tipos de compuestos presentes en los extractos de Croton

leptostachyus

Se realizaron diluciones seriadas con un factor de dilución de 1/2 de los extractos de: hexano,
diclorometano y etanol:agua (7:3) en tubos de ensayo y se sometieron a las pruebas enunciadas (Tabla
1), de acuerdo con la guía metodológica para la detección rápida de algunos núcleos secundarios y
caracterización de una droga cruda de Perez y colaboradores de la Universidad del Tolima (37).
 Tabla 1. Pruebas realizadas para la detección rápida de ciertos núcleos secundarios
NÚCLEO PRUEBA
Saponinas Espuma – Rosenthaler
Taninos Cloruro Férrico
Flavonoides Shinoda
Fenoles Folin Ciocateu – Atraquinona
Glicósidos Cardiotónicos Baljet – Keller Kiliani
Cumarinas Precipitación – Coloración
Terpenos Lieberman – Burchard

Seguido a esto se realizó un análisis en un cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas

(CG-EM) – TQ8040, SHIMADZU (Kyoto, Japon), equipado con una columna capilar SHRXI-
SSILMS con dimensiones de 30 m de longitud, 0,25 µm de diámetro interno y 0,25 µm de espesor de la
película. Las muestras fueron inyectadas (1 µL) a 250 °C en el puerto de inyección, con las siguientes
condiciones en el horno: 60 °C por un minuto, con una rampa de 10 °C/min hasta 190 °C,
manteniendo esta temperatura durante 5 min; posteriormente, a 10 °C/min hasta 320 °C por 10 min.
El gas de acarreo fue Helio 5,0 de alta pureza (99,999% mínimo) con un flujo de 1,1 mL/min. La
temperatura del detector fue de 280 °C. La energía de ionización fue de 70 Ev en un rango de escaneo
de masas de 45 m/z – 500 uma. Todos los ensayos fueron desarrollados en modo scan a razón de 3,9
scans/s. Los compuestos fueron identificados por comparación de sus respectivos espectros con la
base de datos NIST 14.

6. Resultados

6.1. Evaluación de la capacidad tripanocida y citotóxica de los extractos totales de Croton

leptostachyus sobre epimastigotes de T. cruzi y células VERO.

Para la evaluación de la capacidad tripanocida de los extractos de C. leptostachyus, se realizaron diluciones

seriadas de los extractos desde 1.000 µg/mL hasta 31,25 µg/mL y se incubaron con los parásitos por 48
horas. Como control negativo se usaron parásitos sin ningún tipo de tratamiento y como control
positivo se usaron parásitos sometidos a una concentración de Nifurtimox de 5 µM; puesto que
experimentos previos mostraron que esta es la CI50 del aislado Y de T. cruzi.

Para asegurar un mínimo de error experimental en cada uno de los ensayos, con los extractos; cada una
de las réplicas biológicas tenidas en cuenta para el cálculo de la CI 50 cumplió con al menos 4 de los 5
parámetros propuestos. En la figura 1 y tabla 2 se muestran los resultados obtenidos para una de las
réplicas biológicas realizadas para el extracto de hexano. En este ensayo en particular, se observa una
viabilidad mayor al 95% en el control negativo, viabilidad del 50% en el control positivo, tendencia, a
menor concentración del extracto, mayor viabilidad (CI50 = 251,17 g/mL), un coeficiente de
determinación igual a 0,94 y el coeficiente de variación entre los triplicados experimentales de cada
réplica biológica fue menor al 20% (tabla 2), para todas las concentraciones evaluadas.

Teniendo en cuenta que todas las réplicas cumplieron con al menos 4 de 5 parámetros establecidos,
para cada uno de los extractos se determinó la CI50 a partir de las tres replicas biológicas; así para el
extracto de hexano la CI50 fue de 254,13 µg/mL ± 30,94 (figura 2). Así mismo, para el extracto de
Diclorometano la CI50 fue de 150,17 µg/mL (figura 3) y por último para la mezcla hidroalcohólica se
encontró que esta no tiene actividad frente al parásito (figura 4).
 Tabla 2. Resultados de la actividad del extracto de hexano frente a epimastigotes del aislado Y de T.
cruzi, correspondientes a una réplica biológica
Extracto %Viabilidad 𝑿̅
[µg/mL] Pozo1 Pozo2 Pozo3 Viabilidad DS CV
1000 0 0 0 0 0 0
500 10,39 14,30 11,19 11,96 2,07 17,30
250 42,89 42,73 44,57 43,39 1,02 2,35
125 83,59 78,24 75,68 79,17 4,04 5,10
62,5 100 92,78 96,62 96,47 3,61 3,74
31,25 100 100 100 100 0 0
𝑥̅ : promedio; DS: desviación estándar; CV: coeficiente de variación.

Figura 1. (A) Resultados de la Viabilidad de epimastigotes del aislado Y de T. cruzi tratados

con el extracto de hexano de C. leptostachyus durante 48 horas, correspondiente a una de las
réplicas biológicas Las columnas representan la media y las barras la desviación estándar del
porcentaje de viabilidad observado para cada uno de los triplicados. En el eje Y se indica el porcentaje
de viabilidad y en el eje X las concentraciones evaluadas del extracto, en µg/mL, NFX: corresponde al
control positivo y control, corresponde al control negativo. (B) Regresión no lineal de la Inhibición
de epimastigotes del aislado Y de T. cruzi tratados con el extracto de hexano de C.
leptostachyus durante 48 horas. Los puntos representan la media. En el eje Y se indica el porcentaje
de inhibición y en el eje X las concentraciones evaluadas del extracto, en µg/mL.
Figura 2. Viabilidad de epimastigotes del aislado Y de T. cruzi tratados con el extracto de
hexano de C. leptostachyus durante 48 horas. Las columnas representan la media y las barras la
desviación estándar del porcentaje de viabilidad observado para cada uno de los triplicados, en las
tres réplicas biológicas. En el eje Y se indica el porcentaje de viabilidad y en el eje X las
concentraciones evaluadas del extracto, en µg/mL. Los colores de las barras (negro, gris claro y gris
oscuro) representan cada una de las réplicas biológicas.
 C I 5 0 = 1 5 0 ,1 7  8 . 9 1

150

% V ia b ilid a d
100

50

0
5 0 0 .0 0
2 5 0 .0 0
1 2 5 .0 0

5 0 0 .0 0
2 5 0 .0 0
1 2 5 .0 0

5 0 0 .0 0
2 5 0 .0 0
1 2 5 .0 0
6 2 .5 0
3 1 .2 5

6 2 .5 0
3 1 .2 5

6 2 .5 0
3 1 .2 5
1 0 0 0 .0 0

1 0 0 0 .0 0

1 0 0 0 .0 0
ppm
Figura 3. Viabilidad de epimastigotes del aislado Y de T. cruzi tratados con el extracto de
Diclorometano de C. leptostachyus durante 48 horas. Las columnas representan la media y las
barras la desviación estándar del porcentaje de viabilidad observado para cada uno de los
triplicados, en las tres réplicas biológicas. En el eje Y se indica el porcentaje de viabilidad y en el eje
X las concentraciones evaluadas del extracto, en µg/mL. Los colores de las barras (negro, gris claro
y gris oscuro) representan cada una de las réplicas biológicas.

Figura 4. (A) Viabilidad de epimastigotes del aislado Y de T. cruzi tratados con el extracto de
etanol:agua 7:3 de C. leptostachyus durante 48 horas. Las columnas representan la media y las
barras la desviación estándar del porcentaje de viabilidad observado para cada uno de los triplicados, en
una de las réplicas biológicas. En el eje Y se indica el porcentaje de viabilidad y en el eje X las
concentraciones evaluadas del extracto, en µg/mL.

6.2 Evaluación de la capacidad citotóxica de los extractos totales de Croton leptostachyus

sobre Células VERO

Para evaluar la toxicidad de los extractos de C. leptostachyus, diluciones seriadas de cada extracto desde
500 µg/mL a 16,625 µg/mL fueron expuestas frente a células VERO. La viabilidad se determinó de
acuerdo a lo descrito en la metodología.

Al igual que para los ensayos sobre epimastigotes, las réplicas biológicas debían cumplir con al menos 4
de los 5 parámetros establecidos para su aceptación. En la figura 5 y tabla 3, se observan los resultados
obtenidos para una de las réplicas biológicas realizadas para el extracto de hexano, la viabilidad del
control negativo fue mayor al 95%, se observó una tendencia, a menor concentración del extracto
mayor viabilidad, el coeficiente de determinación fue igual a 0,91 y el coeficiente de variación entre los
triplicados experimentales de cada réplica biológica fue menor al 20% (tabla 3), para todas las
concentraciones evaluadas.

Tabla 3. Resultados de la actividad del extracto de hexano frente a células VERO, correspondientes a
una réplica biológica.
Extracto %Viabilidad ̅
𝑿
[µg/mL] Pozo1 Pozo2 Pozo3 Viabilidad DS CV
500 7,13 7,52 6,93 7,19 0,30 4,15
250 6,83 6,44 6,74 6,67 0,20 3,05
125 6,64 6,15 8,10 6,96 1,02 14,59
62,5 48,52 57,21 52,23 52,65 4,36 8,28
31,25 89,81 76,05 98,60 88,15 11,37 12,89
15,625 98,41 95,87 99,58 97,95 1,90 1,94
; 𝑥̅ : promedio; DS: desviación estándar; CV: coeficiente de variación.

Figura 5. (A) Resultados de la viabilidad de células VERO tratadas con el extracto de hexano
de C. leptostachyus durante 48 horas, de una réplica biológica. Las columnas representan la media
y las barras la desviación estándar del porcentaje de viabilidad observado para cada uno de los
triplicados. En el eje Y se indica el porcentaje de viabilidad y en el eje X las concentraciones evaluadas
del extracto, en µg/mL. Control, indica el control negativo (B) Regresión no lineal de la Inhibición
de células VERO tratadas con el extracto de hexano de C. leptostachyus durante 48 horas. Los
puntos representan la media. En el eje Y se indica el porcentaje de inhibición y en el eje X las
concentraciones evaluadas del extracto, en µg/mL.

Teniendo en cuenta que todas las réplicas cumplieron con los parámetros establecidos, con tres replicas
biológicas se determinó que la CC50 para el extracto de hexano fue 62,95 µg/mL ± 6,77 (Figura 6). Así
mismo, para el extracto de Diclorometano se determinó una CC50 de 34,04 µg/mL ± 6,80 (Figura 7)

C I 5 0 = 6 2 ,9 5  6 , 7 7

100
R é p lic a N o . 1

80 R é p lic a N o .2
% V ia b ilid a d

R é p lic a N o .3
60

40

20

0
6 2 .5 0 0
3 1 .2 5 0
1 5 .6 2 5

6 2 .5 0 0
3 1 .2 5 0
1 5 .6 2 5

6 2 .5 0 0
3 1 .2 5 0
1 5 .6 2 5
5 0 0 .0 0 0
2 5 0 .0 0 0
1 2 5 .0 0 0

5 0 0 .0 0 0
2 5 0 .0 0 0
1 2 5 .0 0 0

5 0 0 .0 0 0
2 5 0 .0 0 0
1 2 5 .0 0 0

 g /m L

Figura 6. Viabilidad de Células VERO tratadas con el extracto de Hexano de C.

leptostachyus durante 48 horas. Las columnas representan la media y las barras la desviación
estándar del porcentaje de viabilidad observado para cada uno de los triplicados, en las tres réplicas
biológicas. En el eje Y se indica el porcentaje de viabilidad y en el eje X las concentraciones
evaluadas del extracto, en µg/mL. Los colores de las barras (negro, gris claro y gris oscuro)
representan cada una de las réplicas biológicas.
 C I 5 0 = 3 4 ,4 0  6 , 8

150
R é p lic a N o . 1
R é p lic a N o . 2
% V ia b ilid a d

100 R é p lic a N o . 3

50

0
6 2 .5 0 0
3 1 .2 5 0
1 5 .6 2 5

6 2 .5 0 0
3 1 .2 5 0
1 5 .6 2 5

6 2 .5 0 0
3 1 .2 5 0
1 5 .6 2 5
5 0 0 .0 0 0
2 5 0 .0 0 0
1 2 5 .0 0 0

5 0 0 .0 0 0
2 5 0 .0 0 0
1 2 5 .0 0 0

5 0 0 .0 0 0
2 5 0 .0 0 0
1 2 5 .0 0 0
 g /m L

Figura 7. Viabilidad de Células VERO tratadas con el extracto de Diclorometano de C.

leptostachyus durante 48 horas. Las columnas representan la media y las barras la desviación
estándar del porcentaje de viabilidad observado para cada uno de los triplicados, en las tres réplicas
biológicas. En el eje Y se indica el porcentaje de viabilidad y en el eje X las concentraciones
evaluadas del extracto, en µg/mL. Los colores de las barras (negro, gris claro y gris oscuro)
representan cada una de las réplicas biológicas.

6.3 Determinar la capacidad selectiva de los extractos obtenidos de Croton leptostachyus

De acuerdo con la evaluación de la relación entre la citotoxicidad y la actividad tripanocida se

determinó el índice de selectividad para los extractos que tuvieron actividad. Para el extracto de hexano,
el IS fue de 0,26 y para el extracto de diclorometano fue de 0,22 como se puede observar en la Tabla 4.
Tabla 4. Resultados de la capacidad selectiva de los extractos obtenidos de Croton leptostachyus.

T. cruzi Epimastigotes Células Vero

EXTRACTO
cCI50 dCC50 eIS
aCLHEX 254,13±30,94 65,95±6,77 0,25951285
bCLDIC 150,17±8,91 34,4±6,80 0,22907372
a Extracto de Hexano, b Extracto de Diclorometano, c Concentración Inhibitoria 50, d Concentración

citotóxica 50, e índice de selectividad.

6.4 Tamizaje fitoquímico de los constituyentes presentes en los extractos de Croton

Leptostachyus

En la tabla 5. se pueden observar los resultados obtenidos a partir de la marcha fitoquímica de los
extractos radiculares de C. leptostachyus. Se detectó la presencia de saponinas, fenoles, glicósidos
cardiotónicos, cumarinas, alcaloides y terpenos. La mezcla hidroalcohólica fue donde se encontró la
mayor presencia de compuestos, los cuales fueron fenoles, alcaloides, cardiotónicos y terpenos.
Adicionalmente las cumarinas sólo fueron encontradas en el extracto de diclorometano.

Tabla 5. Constituyentes químicos mayoritarios en los diferentes extractos obtenidos de la raíz de

Croton leptostachyus
Extractos
Metabolitos Pruebas Mezcla
Hexano Diclorometano
Hidroalcohólica
Espuma + + -
Saponinas
Rosenthaler + + -
Taninos Cloruro férrico - - -
Flavonoides Shinoda - - -
Folin-Ciocalteu - - +
Fenoles
Antraquinona - - +
Dragendorff - - +
Valser - +
Alcaloides
Mayer - - -
Wagner - - -
Baljet - - -
Cardiotónicos
Keller-Kiliani + + +
Cumarinas precipitación y coloración - + -
Terpenos Lieberman-Burchard + + +
+: presencia; -: ausencia.
6.5 Identificación de los compuestos de los extractos de Croton Leptostachyus usando
Cromatografía de gases acoplada a Espectrometría de masas.

A continuación, con el fin de cumplir el objetivo número tres, se presenta una tabla donde se pueden
observar los compuestos hallados por cromatografía de gases para los estractos de hexano y
diclorometano de Croton Leptostachyus.

Tabla 6. Identificación por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas de los

compuestos presentes en los extractos de C. leptostachyus

Cantidad Fórmula
Compuestos TR (min) Área
relativa química
a,b9-Octadecenamida,
9,227 90 C18H35NO 6,67
(Z)-
a13-Docosenamida, (Z)- 13,247 90 C22H43NO 48,24

a,bBis(2-etillhexil) Ftalato 10,313 90 C24H38O4 1,74

TR: tiempo de retención, min: minutos, a extracto de hexano, b extracto de diclorometano

7. Discusión

Teniendo en cuenta que los productos naturales son una fuente alternativa de metabolitos y pueden ser
usados para el tratamiento de enfermedades de origen infeccioso, aquellos productos naturales
provenientes de especies vegetales colombianas constituyen un amplio campo de estudio, con base a la
multidiversidad colombiana y a su extensa gama de compuestos bioactivos presentes en el ambiente,
que se pueden llegar a encontrar (13). En el presente trabajo se realizó la caracterización química y la
evaluación de la capacidad tripanocida de los extractos de hexano, diclorometano y etanol-agua
obtenidos de Croton leptostachyus sobre epimastigotes del aisado Y de Trypanosoma cruzi.

Con respecto al género Croton sp, se han reportado diversas actividades biologícas frente a T. cruzi; en el
año 2010 Mendonça-Filho y colaboradores, evidenciaron una actividad tripanocida del extracto
metanólico de Croton cajucara con una CI50 de 109.1 ± 11.5 en epimastigotes del aislado Y (39), y por
otro lado, en el año 2014 Neira y colaboradores reportaron actividad tripanocida de los aceites
esenciales de las especies C. pedicellatus y C. leptostachyus en el estadío epimastigote del aisaldo Silvio- X10
(13). Lo que respecta a la especie, C. pedicellatus, se reportó una CI50 de 8,78 ±0,67 y en cuanto a la
especie C. leptostachyus una CI50 de 8,64 ±0,33. Con base a los reportes de las anteriores investigaciones y
acerca de los resultados obtenidos en este estudio, se evidenció actividad tripanocida de la especie C.
leptostachyus frente a epimastigotes del aisaldo Y de T. Cruzi en dos de los tres extractos evaluados, estos
son: el extracto de hexano y de diclorometano, mientras que para el extracto de etanol:agua no se
presentó actividad, como se observó en las figuras 2, 3 y 4.

La actividad de los extractos obtenidos de plantas sobre T. cruzi ha sido diversamente objeto de estudio
(4,16)y aún así, sigue sin existir un acuerdo sobre la CI50 a la cual un extracto se puede considerar buen
candidato para estudios posteriores. La actividad de los extractos obtenidos de plantas puede ser
agrupada en cuatro categorías: muy activos para extractos con CI50 menores de 10 µg/mL, activos
aquéllos con CI50 entre 10 y 50 µg/mL, actividad baja para extractos con CI50 entre 51 y 100 µg/mL, y
extractos no activos, con CI50 por encima de 100 µg/mL (35). De acuerdo con lo anterior, teniendo en
cuenta que para los extractos de hexano y diclorometano obtenidos a partir de las raíces de C.
leptostachyus las CI50 fueron mayores a 100 µg/mL, estos extractos se pueden considerar no activos
contra el estadio espimastigote del aislado Y de T. cruzi. Por otra parte, desde un acercamiento químico
famacéutico, sobre las sustancias bioactivas, se clasifica a los extractos con CC50 > 100 µg/mL como
no activos contra el parásito (40), mientras que desde la vista de enfermedades infecciosas, se considera
que los extractos con IS mayores a 3 efectivamente pueden ser buenos candidatos para estudios
posteriores (35). No obstante, al determinar la selectividad de los extractos obtenidos de C. leptostachyus,
los IS fueron menores a 1, lo cual indicó la inactividad de estos extractos y que no fueron selectivos
contra el parásito. En consideración al índice de selectividad de los dos extractos que presentaron
actividad alguna, frente a epimastigotes, pese a que los resultados indican que los extractos no fueron
selectivos, según lo reportado por Fent, podría ser causa de que la respuesta citotóxica celular varía
según la línea celular usada y las condiciones de cultivo (41), por consiguiente, la toxicidad puede verse
afectada y el valor del índice de selectividad también y conforme a esto, se recomienda evaluar la
citotoxicidad en diferentes líneas celulares.

Finalmente, con el propósito de conocer los compuestos presentes en las raíces de C. leptostachyus y
asociar su actividad con un tipo de compuesto, en primer lugar, el proceso de realización de los
objetivos fue alternado en vez de ser biodirigido, posteriormente, se realizó una marcha fitoquímica de
los extractos de C. leptostachyus y una cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas.
Los extractos obtenidos de plantas de la familia Euphorbiaceae poseen una gran variedad de sustancias
y compuestos químicos, entre ellos se destacan su alto contenido de terpenos, flavonoides, ácidos
grasos y alcaloides (42,). En lo que corresponde a la tabla 5, se muestran en ella los compuestos de los
extractos evaluados, en los cuales se detectaron saponinas, taninos, terpenos, flavonoides, fenoles y
alcaloides, similar a lo reportado por Perea y Pardo. (43). Sin embargo, es pertinente destacar que los
reactivos empleados en las pruebas para la identificación de los compuestos, son cromógenos y esto
hace que la sensibilidad de detección varíe; además, se ha reportado que la edad del vegetal, la
temporada de cosecha, la ubicación geográfica y la polaridad del solvente extractor pueden ser factores
que alteren los resultados de las pruebas aplicadas para la detección de los compuestos, razón por la
cual se deben realizar metodologías más precisas para poder determinar la riqueza de compuestos o
metabolitos presentes en los extractos.

Con todo lo anterior, mediante la espectrometría de masas acoplada a la cromatografía de gases se

identificaron 3 compuestos que se pueden observar en la tabla 6, 9-Octadecenamida, (Z)-, 13-
Docosenamida, (Z)-l y Bis(2-etillhexil) Ftalato en el extracto de hexano y diclorometano. Respecto a la
9-Octadecenamida, esta es un compuesto derivado del ácido oleico usado en el recubrimiento de
plásticos. Por otro lado, también se ha reportado su presencia en la fracción aceitosa de Brachystegia
eurycoma, la cual fue activa frente a E. coli, activo frente a Salmonella typhi y Staphylococcus aureus. Debido a
la contaminación, se sugiere evaluar nuevamente la caracterización del componente volátil sin la
contaminación.

Es importante mencionar que en los extractos de hexano y diclorometano se encontraron 13-

Docosenamida y FTalatos, compuestos químicos que se emplean principalmente como plastificadores y
se ha reportado son tóxicos para las células (44). El Diclorometano, es un solvente que se descompone
formando gases tóxicos y corrosivos, los cuales se presume que degradaron el plástico del envase y
contaminaron la muestra usada para el ensayo. Asimismo, señal detectada para este compuesto (figuras
8 y 9; anexos) pudo solapar la señal emitida por los demás compuestos de los extractos, afectando de
esta manera la identificación de los compuestos. Teniendo en cuenta los resultados, y la literatura,
compuestos de baja polaridad como por ejemplo Terpenos, cumarinas, y saponinas pueden ser los
responsables de la toxicidad de los extractos.
Pese a la presencia de 2 agentes plastificantes se descarta que la toxicidad se deba a compuestos
plásticos ya que en el estudio de Neira y colaboradores en 2014 donde se usó la misma planta con
extractos de aceites esenciales que se caracterizan por tener polaridad similar a los extractos usados en
el estudio, también fueron activos frente a T. cruzi y tóxicos frente a Células VERO (13).

8. Conclusiones.

En este orden de ideas, de los tres extractos evaluados, el extracto de hexano y diclorometano tuvieron
actividad, mientas que no fueron selectivos frente al aislado Y de Trypanosoma cruzi.
Adicionalmente se encontró que Croton leptostachyus presenta compuestos del tipo fenoles, saponinas,
alcaloides, cardiotónicos, cumarinas y terpenos.

9. Recomendaciones

Profundizar en el uso de nuevas metodologías que permiten caracterizar mejor los compuestos, evaluar
nuevamente la caracterización del componente volátil de los extractos sin la contaminación de agentes
plastificantes y evaluar los extractos totales alcaloidales con el fin de descubrir posibles actividades
tripanocidas.

10. Anexos

Figura 8. Cromatograma del análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de

masas del extracto de hexano de las raíces de C. leptostachyus hasta 30 min. En el eje Y
se indica la abundancia del extracto y en el eje X el tiempo de retención en minutos.
Figura 9. Cromatograma del análisis por cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas
del extracto de diclorometano de las raíces de C. leptostachyus hasta 30 min. En el eje Y se
indica la abundancia del extracto y en el eje X el tiempo de retención en minutos.
11. Bibliografía

1. Pérez-Molina JA, Molina I. Chagas disease. Lancet. 2018;391(10115):82–94.

2. Rassi A, Rassi A, Marin-Neto JA. Chagas disease. Lancet [Internet]. 2010;375(9723):1388–402.
Available from: http://dx.doi.org/10.1016/S0140-6736(10)60061-X
3. Rueda K, Trujillo JE, Carranza JC, Vallejo GA. Transmisión oral de Trypanosoma cruzi: Una
nueva situación epidemiológica de la enfermedad de Chagas en Colombia y otros países
suramericanos. Biomedica. 2014;34(4):631–41.
4. SALUD MDLPSOPD LA. Guia de Atencion Clinica de la enfermedad de Chagas 2010. Minist
La Protección Soc Organ Panam La Salud [Internet]. 2010;(637):1–84. Available from:
https://www.minsalud.gov.co/Documentos y Publicaciones/Guia de atencion clinica de chagas
2010.pdf
5. Rassi A, Rassi A, Marcondes de Rezende J. American Trypanosomiasis (Chagas Disease).
Infectious Disease Clinics of North America. 2012.
6. Coura JR, De Castro SL. A critical review on chagas disease chemotherapy. Mem Inst Oswaldo
Cruz. 2002;97(1):3–24.
7. Castro JA, De Mecca MM, Bartel LC. Toxic side effects of drugs used to treat Chagas’ disease
(American trypanosomiasis). Hum Exp Toxicol. 2006;25(8):471–9.
8. Silva NCC, Fernandes Júnior A. Biological properties of medicinal plants: A review of their
antimicrobial activity. J Venom Anim Toxins Incl Trop Dis. 2010;16(3):402–13.
9. Ríos JL, Recio MC. Medicinal plants and antimicrobial activity. J Ethnopharmacol. 2005;100(1–
2):80–4.
10. Cala M, Stashenko E, Vásquez A, Martínez Morales J, Miranda I, Tafurt Garcia G. Actividad
antioxidante y contenido total de fenoles de los extractos etanólicos de salvia aratocensis, salvia
sochensis, bidens reptons y montanoa ovalifolia. Sci Tech. 2007;1(33):205–7.
11. Escobar P, Herrera L, Leal S, Durán C, Stashenko E. Composición química y actividad anti-
tripanosomal de aceites esenciales obtenidos de Tagetes (fam. Asteraceae), recolectados en
Colombia. Rev la Univ Ind Santander, Salud. 2009;41:280–6.
12. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to
proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods. 1983;65(1–2):55–63.
13. Neira LF, Stashenko E, Escobar P. Artículo de investigación e innovación Actividad
antiparasitaria de extractos de plantas colombianas de la familia Euphorbiaceae Activity of
Colombian plant extracts derived from the Euphorbiaceae family. Rev la Univ Ind Santander
Salud [Internet]. 2014;46(1). Available from:
http://www.scielo.org.co/pdf/suis/v46n1/v46n1a03.pdf
14. WHO. Fourth WHO report on neglected tropical diseases. World Health Organization. 2017.
Fact Sheet March 2017.
15. Lee BY, Bacon KM, Bottazzi ME, Hotez PJ. Global economic burden of Chagas disease: A
computational simulation model. Lancet Infect Dis [Internet]. 2013;13(4):342–8. Available
from: http://dx.doi.org/10.1016/S1473-3099(13)70002-1
16. Zingales B. Trypanosoma cruzi genetic diversity: Something new for something known about
Chagas disease manifestations, serodiagnosis and drug sensitivity. Acta Trop [Internet].
2018;184(April 2017):38–52. Available from: https://doi.org/10.1016/j.actatropica.2017.09.017
17. Brenière SF, Waleckx E, Barnabé C. Over Six Thousand Trypanosoma cruzi Strains Classified
into Discrete Typing Units (DTUs): Attempt at an Inventory. PLoS Negl Trop Dis.
2016;10(8):1–19.
18. Gascón J, Albajar P, Aparicio P, Cañavate C, Castro E, Coll O, et al. Diagnóstico y tratamiento
de la Enfermedad de Chagas importada. Med Clin (Barc) [Internet]. 2005;125(6):230–5.
Available from: http://dx.doi.org/10.1157/13077386
19. Estani SS, Segura EL, Ruiz AM, Velazquez E, Porcel BM, Yampotis C. Efficacy of
 chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease. Am
J Trop Med Hyg. 1998;59(4):526–9.
20. Yun O, Lima MA, Ellman T, Chambi W, Castillo S, Flevaud L, et al. Feasibility, drug safety, and
effectiveness of etiological treatment programs for Chagas disease in Honduras, Guatemala, and
Bolivia: 10-Year experience of Médecins Sans Frontières. PLoS Negl Trop Dis. 2009;3(7).
21. Cançado JR. Criteria of Chagas Disease Cure. Mem Inst Oswaldo Cruz. 1999;94(SUPPL.
1):331–5.
22. Fabbro DL, Streiger ML, Arias ED, Bizai ML, Del Barco M, Amicone NA. Trypanocide
treatment among adults with chronic Chagas disease living in Santa Fe City (Argentina), over a
mean follow-up of 21 years: Parasitological, serological and clinical evolution. Rev Soc Bras
Med Trop. 2007;40(1):1–10.
23. Morillo CA, Marin-Neto JA, Avezum A, Sosa-Estani S, Rassi A, Rosas F, et al. Randomized trial
of benznidazole for chronic chagas’ cardiomyopathy. N Engl J Med. 2015;373(14):1295–306.
24. Cançado JR. Long term evaluation of etiological treatment of Chagas disease with benznidazole.
Rev Inst Med Trop Sao Paulo. 2002;44(1):29–37.
25. Eftekhar F, Habibi Z, Malekzadeh R. Antibacterial Activity of Twenty Iranian Plant Extracts
Against Clinical Isolates of Helicobacter pylori. Iran J Basic Med Sci. 2009;12(42).
26. Igbinosa OO, Igbinosa EO, Aiyegoro OA. Antimicrobial activity and phytochemical screening
of stem bark extracts from Jatropha curcas (Linn). African J Pharm Pharmacol. 2009;3(2):058–
62.
27. Kayser O, Masihi KN, Kiderlen AF. Natural products and synthetic compounds as
immunomodulators. Expert Rev Anti Infect Ther. 2003;1(2):319–35.
28. Brady SF, Simmons L, Kim JH, Schmidt EW. Metagenomic approaches to natural products
from free-living and symbiotic organisms. Nat Prod Rep. 2009;26(11):1488–503.
29. Blunt JW, Copp BR, Munro MHG, Northcote PT, Prinsep MR. Marine natural products. Nat
Prod Rep. 2011;28(2):196–268.
30. Weckesser S, Engel K, Simon-Haarhaus B, Wittmer A, Pelz K, Schempp CM. Screening of
plant extracts for antimicrobial activity against bacteria and yeasts with dermatological relevance.
Phytomedicine. 2007;14(7–8):508–16.
31. Schwikkard S, van Heerden FR. Antimalarial activity of plant metabolites. Nat Prod Rep.
2002;19(6):675–92.
32. Kumar V, Mahajan A, Chibale K. Synthetic medicinal chemistry of selected antimalarial natural
products. Bioorganic Med Chem [Internet]. 2009;17(6):2236–75. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.bmc.2008.10.072
33. Okokon JE, Nwafor PA. Antiplasmodial activity of root extract and fractions of Croton
zambesicus. J Ethnopharmacol. 2009;121(1):74–8.
34. Rosa M do SS, Mendonça-Filho RR, Bizzo HR, Rodrigues I de A, Soares RMA, Souto-Padrón
T, et al. Antileishmanial activity of a linalool-rich essential oil from Croton cajucara. Antimicrob
Agents Chemother. 2003;47(6):1895–901.
35. Valencia L, Triana O, Muñoz DL, Robledo SM, Vélez ID, Echeverri F, et al. Trypanocidal and
cytotoxic activity of extracts of Colombian plants. Biomedica. 2011;31(4):552–9.
36. Peralta WFS, Ospina Giraldo LF, Jaramillo CCP, Arango WM, Arteaga JJM. Phytochemical
screening, free radical scavenging, and anti-inflammatory activity of croton leptostachyus kunth
leaf extracts. Asian J Pharm Clin Res. 2015;8(5):197–201.
37. Pérez-Jaramillo CC, Sánchez-Peralta WF, Murillo-Arango W, Méndez-Arteaga JJ. Acción
antioxidante conjunta de extractos etanólicos de Mollinedia lanceolata, Croton leptostachyus y
Siparuna sessiliflora. Rev la Acad Colomb Ciencias Exactas, Físicas y Nat. 2017;41(158):64.
38. Correa-Royero J, Tangarife V, Durán C, Stashenko E, Mesa-Arango A. Atividade antifúngica in
vitro e os efeitos citotóxicos de óleos essenciais e extratos de plantas medicinais e aromáticas
contra Candida krusei e Aspergillus fumigatus. Brazilian J Pharmacogn. 2010;20(5):734–41.
39. Azeredo CMO, Santos TG, Maia BHL de NS, Soares MJ. In vitro biological evaluation of eight
different essential oils against Trypanosoma cruzi, with emphasis on Cinnamomum verum
 essential oil. BMC Complement Altern Med. 2014;14(1):1–8.
40. Osorio E, Arango GJ, Jiménez N, Alzate F, Ruiz G, Gutiérrez D, et al. Antiprotozoal and
cytotoxic activities in vitro of Colombian Annonaceae. J Ethnopharmacol. 2007;111(3):630–5.
41. Fent K. Fish cell lines as versatile tools in ecotoxicology: Assessment of cytotoxicity,
cytochrome P4501A induction potential and estrogenic activity of chemicals and environmental
samples. Toxicol Vitr. 2001;15(4–5):477–88.
42. Cateni F, Falsone G, Zilic J. Terpenoids and Glycolipids from Euphorbiaceae. Mini-Reviews
Med Chem. 2005;3(5):425–37.
43. Murillo Perea E, Pardo-Rodriguez DA, Ortíz-Romero LT, Tacha AL, Mendez-Arteaga JJ,
Murillo-Arango W. Estudio químico y etnobotánico de Croton leptostachyus. Rev la Acad
Colomb Ciencias Exactas, Físicas y Nat. 2014;38(149):356.
44. Fekete Z, Rófusz T, Angyal V, Szabó-Révész P, Aigner Z. Gas chromatographic-mass
spectrometric analysis and subsequent quality improvement of plastic infusion packaging
materials. J Pharm Biomed Anal [Internet]. 2014;97:111–5. Available from:
http://dx.doi.org/10.1016/j.jpba.2014.04.031
45. Peralta WFS, Ospina Giraldo LF, Jaramillo CCP, Arango WM, Arteaga JJM. Phytochemical
screening, free radical scavenging, and anti-inflammatory activity of croton leptostachyus kunth
leaf extracts. Asian J Pharm Clin Res. 2015;8(5):197–201.