FARAUTE, Vol. 7, No.

2, 1-9, 2012 ISNN 1698-7418

Deposito Legal PP200402CA1617

Utilización de bacterias en el biotratamiento de licor negro.

Karina Chispman D.1 ; Noja Izzedin A. 2 , Rosmary Vargas M. 2 , Luis E. Amaiz F. 1,2 , Luı́s F. Medina T. 2 ,
Oscar E. Valbuena V. 1,2
1 Departamento de Biologı́a, Facultad Experimental de Ciencias y Tecnologı́a, Universidad de Carabobo, Venezuela
2 Centro
de Investigaciones Microbiológicas Aplicadas (CIMA), Facultad de Ciencias de La Salud (FCS). Universidad de
Carabobo. Valencia, Venezuela.
Autor de correspondencia: ovalbuena@uc.edu.ve

Recibido 13 Octubre 2009, Revisado 25 Noviembre 2010, Aceptado 08 junio 2011

Resumen
La fabricación de papel es considerada una de las actividades industriales más importante a
nivel mundial; siendo el licor negro el principal subproducto lı́quido contaminante. El objetivo
de este trabajo estuvo dirigido al aislamiento de bacterias del licor negro (LN) proveniente
de una empresa papelera y a la degradación del efluente por las bacterias aisladas. Se
aislaron 47 colonias, de las cuales 17 crecieron en agar suplementado con LN. Las cuatro
cepas de mayor crecimiento se identificaron como Bacillus megaterium, Stenotrophomonas
malthophilia, Chryseobacterium indologenes y Serratia marcescens, constituyendo el con-
sorcio bacteriano utilizado para el biotratamiento del LN. En 21 dı́as de biotratamiento, la
DQO y DBO5,20 disminuyeron un 57,14 y 29,74 % respectivamente, la actividad peroxidasa,
determinada sobre rojo fenol, oxidó 82 % del substrato. Los datos presentados parecieran
indicar que el consorcio bacteriano aislado de efluentes tóxicos podrı́a constituir herramientas
biotecnológicas apropiadas para su propia biorremediación.
Palabras Claves: bacterias, biorremediación, licor negro, peroxidasas.

Abstract
The paper fabrication is one of the most important industrial activities worldwide, being the
black liquor (BL) the principal contaminant liquid subproduct. The aim of this study was
the isolation of bacteria from the BL provided by a paper manufacturing company and the
degradation of this effuent by the isolated bacteria. 47 bacterial strains were isolated, out
of which 17 grew on agar plates supplemented with BL. 4 strains were identified as Bacillus
megaterium, Stenotrophomonas malthophilia, Chryseobacterium indologenes and Serratia
marcescens, and constituted the bacterial consortium for the biotreatment of BL. After 21 days
of incubations, the COD and BOD5,20 decreased in 57.14 and 29.74 % respectively and the
peroxidase activity oxidized 82 % of red phenol used as substrate. The data seems to indicate
that bacterial consortiums isolated from BL could be used as a biotechnological tool for its
bioremediation.
Keywords: bacteria, bioremediation, black liquor, peroxidases.

1
Utilización de bacerias en el biotratamiento de licor negro
Introducción
Por los múltiples usos del papel en la sociedad
moderna, la industria papelera es una de las más
abundantes y consecuentemente una de las más con-
taminantes a nivel mundial (Mishra y Thakur, 2010;
Kumar et al., 2012) En el proceso de blanqueo de
la pulpa de papel se emplean cantidades importantes
de agentes quı́micos, incluida agua, que reaccionan
fundamentalmente con la lignina, formando produc-
tos altamente recalcitrantes y tóxicos contenidos en
los efluentes generados por el proceso de fabricación
(Moraes et al., 2006). Estos efluentes denominados
licor negro son de coloración muy oscura, fuerte olor,
pH alcalino, presentan altos valores de las demandas
quı́mica y biológica de oxı́geno (DQO y DBO5,20 C
respectivamente) y se generan a temperaturas relati-
vamente altas (Mishra & Thakur, 2010). Los eleva-
dos valores de DQO y DBO5,20 C se deben, en una
alta proporción, a lignina y polisacáridos como he-
micelulosa y celulosa, incorporados a los efluentes
durante el proceso de fabricación del papel (Yang et
al., 2008). Antes de su descarga a los sistemas de
recolección de aguas servidas, estos efluentes, conte-
niendo más de 250 compuestos xenobióticos (Singh
et al., 2011), deben ser tratados adecuadamente, de
lo contrario las sustancias orgánicas, entre ellas mu-
chas tóxicas, se acumulan en los ambientes naturales
ejerciendo efectos no deseables, particularmente en
la biota acuática e inclusive en humanos (El-Hanafy
et al., 2008; Ziv, 2008). Entre los compuestos car-
bonados tóxicos presentes en el licor negro se han
identificado dioxinas (compuestos clorados), furanos
(derivados de los azucares), hidrocarburos aromáti-
cos policı́clicos y bifenilos clorados (provenientes
de la degradación de la lignina), los cuales son po-
tencialmente carcinogénicos y mutagénicos, además
de fragmentos de elevado peso molecular de lignina,
hemicelulosas y celulosa (Ali & Sreekrishnan, 2001;
Mishra & Thakur, 2010). Los fenoles clorados, tri,
tetra y pentaderivados, contribuyen a la recalcitrancia
del licor negro por inhibición de la degradación oxi-
dativa enzimática de la lignina (Chandra & Abhishek,
2011). La recalcitrancia se debe fundamentalmente
a la presencia de enlaces C-C y éter, particularmente
en los bifenilos, y al elevado peso molecular de la
lignina (Ali & Sreekrishnan, 2001; Mishra & Tha-
kur, 2010). Sin embargo, aún con tales propiedades,
del licor negro se han aislado comunidades bacteria-
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Oscar Valbuena ó y col.
nas que bajo condiciones apropiadas de laboratorio
son capaces de degradar los componentes carbonados
presentes en estos efluentes (Chandra et al., 2007; El-
Hanafy et al.., 2008; Yang et al., 2008; Chandra et al.,
2011; Kumar et al., 2012). Tal capacidad es debida a
la expresión y excreción, por parte da las bacterias,
de una variedad de moléculas enzimáticas (Li et al.,
2009; Niladevi, 2009; Bandounag et al., 2011), entre
ellas destacan la lignina peroxidasa, manganeso pero-
xidasa y lacasas que actúan sobre la lignina (Madhavi
& Lele, 2009; Mishra & Thakur, 2010; Chandra &
Abhisehk, 2011; Maki et al., 2012; Mongkolthanaruk
et al., 2012); además se han caracterizado celulasas,
xilanasas y pectinasas (Ko et al., 2007) que actúan
sobre polisacáridos. En este trabajo se describe el
aislamiento, caracterización e identificación de bac-
terias endógenas del licor negro, con capacidad para
degradar los componentes carbonados del efluente
al maximizar las condiciones de cultivo in vitro (pH,
temperatura y concentración de sales), determinándo-
se parámetros fisicoquı́micos (pH, DQO, DBO5,20 y
fenoles) y actividad de peroxidasas, al inicio y luego
de 21 dı́as de tratamiento con un consorcio bacteriano
constituido por las cepas bacterianas seleccionadas.
Materiales y Métodos
Aislamiento de bacterias del licor negro
Las muestras de licor negro (LN) fueron gentil-
mente suministradas por una empresa productora de
papel ubicada en Valencia, Estado Carabobo, Vene-
zuela. Las muestras se colectaron directamente de
la salida del sistema de blanqueo de pulpa de pa-
pel en envases previamente desinfectados y cerrados
herméticamente, y fueron trasladadas al Centro de
Investigaciones Microbiológicas Aplicadas (CSe es-
tablecieron dos tipos de cultivo, uno lı́quido (CL) y
otro sólido (CS). El CL se preparó mezclando, en
un tubo de ensayo, 500µL de LN con 5mL de caldo
nutritivo (Himedia, India) estériles, incubándose a
temperatura ambiente (22-25o C) durante 24h. Luego
de constatar turbidez en el cultivo, asadas del mismo
se estriaron en placas de agar nutritivo (Himedia, In-
dia) estériles, incubándose otras 24h a temperatura
ambiente. El CS consistió en estriar asadas de LN en
placas de agar nutritivo e incubación a temperatura
ambiente por
Las colonias obtenidas de los cultivos se trans-
firieron a un medio sólido, KLN, conteniendo agar-
2
Utilización de bacerias en el biotratamiento de licor negro
agar (Himedia, India), suplementado con LN centri-
fugado a 5000 rpm durante 5min a una concentración
final de 30 % v/v y esterilizado en autoclave, a 121o C,
1,5bar. Las placas se incubaron a temperatura am-
biente durante 5 dı́as o hasta la aparición de colonias
bacterianas.
Caracterización de colonias bacterianas
Las colonias aisladas del medio KLN se caracte-
rizaron en base a su macromorfologı́a (forma, color,
borde, brillo, elevación) mediante inspección con una
lupa estereoscópica (Wild M7A, Heerbrugo, Suiza) y
por la tinción de Gram mediante observación en un
microscopio óptico a 100X (Nikon HFX, Labophot-2,
Japón). Posteriormente las colonias seleccionadas se
identificaron por las siguientes pruebas bioquı́micas:
catalasa, fermentación de glucosa e indol (Mac Fad-
din, 2004; Browns, 2009); galerı́as API 50CHB; 20E;
20NE (bioMérieux, Francia). Luego fueron almace-
nadas en cuñas de agar nutritivo hasta su uso.
Determinación de condiciones de cultivo
para máximo crecimiento bacteriano
Se preparó un consorcio bacteriano (CB) cons-
tituido por 4 de las cepas bacterianas previamente
identificadas. Volúmenes de 100mL de LN se inocu-
laron con 3mL de CB, incubándose a temperatura
ambiente durante 24h con aireación constante. Culti-
vos con estas caracterı́sticas se utilizaron para deter-
minar el efecto de sales, compuestos orgánicos, pH y
temperatura sobre la carga bacteriana.
Efecto de sales minerales y compuestos
orgánicos sobre la carga bacteriana
Volúmenes de 245mL de LN se suplementa-
ron con: A) 25mL de medio mı́nimo mineral 10X
(MMM10X, constituido por: 1g de FeSO4 , 30g
de(NH4 )2 SO4 , 0,01g Cu2 SO4 , 0,014g MnSO4 .H2 O,
50g NaCl, 50g K2 HSO4 , 1,4g MgCl2 , 0,58g CaCl2
y 0,13g ZnCl2 por litro), denominándose este medio
MC y B) 25mL de sales 10X (constituido por: 0,014g
MnSO4 , 8g MgSO4 .7H2 O y 0,01g de Cu2 SO4 ), 100
microlitro de melaza (obtenida de distribuidores agro-
pecuarios locales) y 0,245 g de NPK (nitrógeno,
fósforo y potasio, 15:15:15. Pequiven, Venezuela).
Este medio se denominó MCM. Los medios MC y
MCM, esterilizados previamente, se inocularon con
3mL de CB y se incubaron durante 8 dı́as. La carga
bacteriana (UFC/mL), se determinó cada 24h, me-
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Oscar Valbuena ó y col.
diante la técnica de vertido en placas de agar nutriti-
vo.
Efecto del pH del medio de cultivo
Medios de cultivo MCM se suplementaron con
3mL de tampón fosfato 100mM, a diferentes valores
de pH (7, 9 y 11). Se incubaron durante 10 dı́as bajo
las condiciones señaladas, determinándose posterior-
mente la carga bacteriana.
Efecto de la temperatura de incubación
Medios de cultivo MCM se incubaron a 24, 28
y 32o C en un baño de agua termostatado (Memmert,
Din 40050-IP20, Alemania), durante 7 dı́as. La carga
bacteriana se determinó bajo las condiciones señala-
das.
Biotratamiento del licor negro
Una vez determinadas las condiciones del medio
de cultivo para el crecimiento máximo del consorcio
bacteriano (CB), se procedió al biotratamiento del
licor negro. El medio de tratamiento (MT), se pre-
paró mezclando 1.620mL de MCM; 22,5mL de CB;
22mL de tampón fosfato 10mM, pH 9,0; (relación de
CB/MT: 22,5/1665). El sistema se incubó a 28o C, en
aireación constante durante 21 dı́as, determinándose
la carga bacteriana cada 7 dı́as.
Determinación de parámetros fisicoquı́mi-
cos y bioquı́mico durante el biotratamiento
del licor negro
Alı́cuotas de los cultivos provenientes del biotra-
tamiento (sección 2.4), se retiraron a tiempos apropia-
dos para determinar las demandas quı́mica y biológi-
ca de oxı́geno (DQO y DBO5,20 , respectivamente),
cantidad de fenol y actividad de peroxidasa.
Demanda quı́mica de oxı́geno (DQO)
Se ensayó Alı́cuotas de 1mL de cultivo MT a
tiempo cero) y después de 21 dı́as de incubación. Este
mililitro de cultivo se diluyó 1/1000 con agua destila-
da. 20mL de estas diluciones se mezclaron con 19mL
de agua destilada; 0,4g de HgSO4 , 10mL de K2Cr2 O7
y 30mL de H2 SO4 . Adicionalmente, otros dos siste-
mas fueron ensayados, reemplazándose el volumen
de muestra por 20mL de agua destilada (sistema blan-
co) o por 20mL de licor negro (centrifugado y este-
rilizado). Todos los reactivos fueron grado analı́tico
(Riedel-de Häen, AG, Seelze-Hannover, Alemania).
3
Utilización de bacerias en el biotratamiento de licor negro
El procesamiento de los sistemas se efectuó de acuer-
do al método 5220B de Standard Méthods (Clesceri
et al., 1998).
Demanda biológica de oxı́geno (DBO5,20 )
Con la finalidad de cubrir el intervalo posible de
valores de DBO5,20 se prepararon dos series de dilu-
ciones (Metcalf y Eddy, 1996) del cultivo MT, una
correspondiente al inicio del biotratamiento (tiempo
cero) y la otra a 21 dı́as. A tales efectos, alı́cuotas
apropiadas provenientes del cultivo se diluyeron con
agua de dilución (conteniendo tampón fosfato pH 7,2;
MgSO4 ; FeCl3 y CaCl2 ) hasta completar el volumen
(325mL) del frasco de incubación (Clesceri et al.,
1998); las alı́cuotas preparadas fueron las siguientes:
0,065mL del cultivo (dilución 0,02 %); 0,32mL del
cultivo (dilución 0,1 %); 1,63mL del cultivo (dilu-
ción 0,5 %) y 6,5mL del cultivo (dilución 2,0 %). La
DBO5,20 se determinó de acuerdo al método 5210B
de Standard Methods (Clesceri et al., 1998), después
de incubación en oscuridad a 20o C durante 5 dı́as.
El oxı́geno disuelto se determinó con un detector
HANNA 9143 (Rumania).
Determinación de fenol
Al inicio y luego de 21 dı́as de biotratamiento,
volúmenes de 50mL de cultivos MT se ajustaron a
pH 4,0. Las soluciones resultantes se transfirieron a
un rotavapor R (Büchi. Brinkmann Instruments, N.Y.
USA) para su destilación durante 90 min, a 170o C;
obteniéndose destilados acuosos transparentes. El fe-
nol se determinó en éstos destilados mediante la reac-
ción del fenol con p-nitroanilina, generándose un
complejo de coloración roja cuantificada a 445nm
(Hydrocheck System, Phenol Spectra Kit. Cambrid-
ge, Reino Unido).
Actividad de peroxidasa
La determinación de la actividad de peroxidasa
se efectuó mediante un método colorimétrico usando
rojo fenol como substrato (Kuwahara et al., 1984).
El extracto enzimático se preparó de la siguiente ma-
nera: volúmenes apropiados del sistema de biotrata-
miento de 21 dı́as de incubación, se centrifugaron a
7.000rpm durante 15min a 4o C, el sobrenadante libre
de bacterias (SLB) se mezcló con un volumen igual
de tampón Tris-HCl 50mM, pH 9,0
El medio de reacción enzimático (5.000µL) con-
tenı́a: 500µL (equivalentes a 50ng) de rojo fenol 0,01
mg % m/v; 500µL de sales 10X; 2.000µL de extrac-
to de levadura; 58µL de H2 O2 2mM (previamen-
te esterilizados) y volúmenes variables de extracto
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enzimático y tampón Tris-HCl 50mM, pH 9,0. Los
volúmenes de extracto enzimático ensayados fueron
2.000; 1.500; 1.000 y 500 µL. Un sistema blanco,
sin extracto enzimático, también fue ensayado. Los
sistemas de reacción fueron incubados a temperatura
ambiente, durante 24h, deteniéndose la reacción al
agregar 50µL de NaOH 1N. Luego se midió la absor-
bancia a 610nm. La reacción positiva se evidenció por
el cambio de coloración de rojo intenso a rosado con
disminución de la absorbancia. La diferencia en ab-
sorbancia, al inicio de la reacción enzimática y luego
de 24h se expresó como ng de rojo fenol oxidado;
los cuales fueron obtenidos a partir de una curva de
calibración de rojo fenol en el intervalo de 2-14 ng.
Resultados y Discusión
Aislamiento de cepas bacterianas endóge-
nas de licor negro
La presencia de cepas bacterianas en el licor ne-
gro se evidenció por la turbidez desarrollada por los
cultivos después de 24h de incubación en el medio
CL y por la presencia de colonias bacterianas en los
cultivos CS (Fig. 1).
Figura 1. Microorganismos presentes en el licor negro
después de 72horas de crecimiento en medio CS.
Similarmente, cuando la población bacteriana to-
tal se transfirió a medio KLN, también se observó di-
versidad de colonias bacterianas (Fig. 2). Entre am-
bos medios de cultivo se lograron aislar 47 cepas
bacterianas. Poblaciones bacterianas heterogéneas
han sido descritas por otros autores (Chandra et al.,
2007; Yang et al., 2008; Chandra & Abhishek, 2011;
4
Utilización de bacerias en el biotratamiento de licor negro
Chandra et al., 2011; Kumar et al., 2012; Maki et al.;
2012). Sin embargo, solo 17 de estas cepas bacteria-
nas fueron capaces de crecer en medio KLN cuando
fueron sembradas individualmente.
Figura 2. Microorganismos presentes en el licor negro
después de 5 dı́as de crecimiento en medio KLN.
Los resultados indican que estas últimas cepas po-
seen la maquinaria enzimática para utilizar los com-
ponentes carbonados del licor negro, mientras las 30
cepas restantes pareciera que necesitan productos ge-
nerados en el evento degradativo primario efectuado
por las 17 cepas, actuando como bacterias oportunis-
tas. En agar nutritivo 10 cepas se clasificaron como
Gram(-); en agar KLN solo las cepas 5 y 15 resulta-
ron Gram (-), el resto fueron Gram (+). En el caso de
las cepas 2, 3, 7, 8 y 16 se detectó variación en la co-
loración de Gram de acuerdo al tipo de medio sólido
utilizado, situación que ha sido reportada para bacte-
rias degradadoras de lignina (Chandra et al., 2007).
La morfologı́a fue variada, detectándose 3 cepas de
tipo bacilos (cepas 1, 10 y 12), 8 de cocos (cepas
2, 3, 4, 9, 11, 13, 14 y 15), 5 de cocobacilos (cepas
5, 7, 8, 16 y 17) y una colonia de levadura (cepa 6).
Por sus elevadas tasas de crecimiento, las cepas 1,
7, 8 y 12 fueron seleccionadas para su identificación
mediante pruebas bioquı́micas y galerı́as API y pa-
ra conformar el consorcio bacteriano (CB) utilizado
para el biotratamiento del licor negro. Las caracterı́sti-
cas morfológicas de estas 4 cepas se detallan en la
tabla I y figura 3, las cuales fueron identificadas co-
mo Bacillus megaterium (cepa 1), Stenotrophomonas
maltophilia (cepa 7), Chryseobactericum indologe-
nes (cepa 8) y Serratia marcescens (cepa 12). Los
géneros Bacillus y Serratia han sido detectados y ca-
racterizados como organismos degradadores del LN
(Chandra et al., 2007; El-Hanafy et al., 2008; Yang et
al., 2008; Abd-Elsalam & El-Hanafy, 2009, Mishra
& Thakur, 2010; Chandra et al., 2011; Kumar el al.,
2012).
FARAUTE Ciens. y Tec., 7(2)2012
Oscar Valbuena ó y col.
Tabla 1. Caracterı́sticas morfológicas y bioquı́micas de
las cepas bacterianas degradadoras de licor negro.
Cepas Observaciones
Bacilos Gram (+), esporas terminales.
Colonias irregulares; elevación convexa.
1 Bordes ondulados; color blanquesino-pardas; viscosas.
Catalasa:+.Fermentación glucosa: +. Indol: -.
Identificación: Bacillus megaterium.
Cocobacilos Gram (-) en AN y Gram (+) en KLN.
Colonias circulares y pequeñas; elevación convexa.
7 Bordes enteros; color blanquesino-azuladas; viscosas.
Catalasa:-. Fermentación glucosa: +. Indol: -.
Identificación: Stenotrophomonas maltophilia.
Cocobacilos Gram (-) en AN y Gram (+) en KLN.
Colonias circulares y pequeñas; elevación convexa.
8 Bordes enteros; color crema-parduzcas; viscosas.
Catalasa:-. Fermentación glucosa: -. Indol: +.
Identificación: Chryseobactericum indolgenes.
Bacilos Gram (+), esporas terminales.
Colonias irregulares; elevación convexa.
12 Bordes ondulados; color fucsia o marrón oscura; viscosas.
Catalasa:+.Fermentación glucosa: +. Indol: -.
Identificación: Serratia marcescens.
Figura 3. Colonias bacterianas en medio KLN. A:Cepa
1. B:Cepa 7. C:Cepa 8. D:Cepa 12.
Determinación de condiciones de máximo
crecimiento bacteriano.
El comportamiento de CB en los medios de culti-
vo MC y MCM (suplementados con sales minerales
y compuestos orgánicos) se muestra en la Fig. 4. El
crecimiento fue siempre mayor en el medio MCM,
siendo máximo a las 48 h de incubación. Partiendo
de 106 UFC/mL se alcanzaron cargas bacterianas del
orden de 108 y 1010 UFC/mL en los medios MC y
MCM respectivamente. Debido a estos resultados, el
medio MCM fue empleado para la bioremediación
del licor negro. La Fig. 5 muestra el comportamien-
to de CB al variar el pH del medio MCM. La carga
bacteriana alcanzó valores más altos a pH 7,0 (24-
120h), y a tiempos tardı́os (144-216 h) el máximo
crecimiento se observó a pH 9,0. La situación podrı́a
5
Utilización de bacerias en el biotratamiento de licor negro
Figura 4. Crecimiento del consorcio bacteriano en
medios MC y MCM.
justificarse al considerar que al comienzo del cultivo,
la melaza suministra nutrientes carbonados fácilmen-
te metabolizables por las bacterias; al agotarse estos
nutrientes, las bacterias deberı́an consumir productos
carbonados del licor negro, lo cual ocurre a pH 9,0.
Es de hacer notar que el licor negro, al momento de
su recolección y su almacenamiento en el laboratorio
presentó pH 9,0. A pH 11,0 se observó un incremento
moderado de la biomasa obteniéndose valores máxi-
mos a las 48h; probablemente aunque el elevado pH
pareciera disminuir la reproducción bacteriana, la
melaza presente en el medio pudiese sustentar el cre-
cimiento relativamente alto hasta las 48h del cultivo.
Sin embargo, la biomasa disminuyó desde valores
de 106 UFC/mL hasta 104 UFC/mL durante el in-
tervalo de crecimiento del cultivo. Datos de otros
laboratorios indican actividad degradadora de lignina
a pH (6-8) cercanos a la neutralidad (Chandra et al.,
2007;Yang et al., 2008; Abd-Elsalam & El-Hanafy,
2009; Mishra & Thakur, 2010; Kumar et al., 2012)
mientras que otros autores (Mishra & Thakur, 2010)
reportan pH alcalinos como los mostrados en este
estudio. La Fig. 6 muestra los resultados al variar la
Figura 5. Crecimiento del consorcio bacteriano a
diferentes pH.
temperatura de incubación de los cultivos en medio
MCM. Los valores máximos de biomasa se obtuvie-
FARAUTE Ciens. y Tec., 7(2)2012
Oscar Valbuena ó y col.
ron a las 120h de cultivo alcanzándose valores del
orden de 1010 UFC/mL a 24 y 28o C. Para adecuar
el biotratamiento a las condiciones reales en que se
almacena el licor negro en las instalaciones de la em-
presa, los experimentos para el biotratamiento del
mismo se efectuaron a 28o C.
Figura 6. Crecimiento del consorcio bacteriano a
diferentes temperaturas.
Biotratamiento del licor negro.
La efectividad del biotratamiento del licor ne-
gro se evaluó al determinar las demandas quı́mica y
biológica de oxı́geno, la concentración de fenol y la
actividad de peroxidasa en el medio MT, al inicio y
después de 21 dı́as de tratamiento bacteriano.
Debido a que a los 7 dı́as de incubación la bioma-
sa a pH 9,0 fue superior que a pH 7,0 se decidió eva-
luar el comportamiento de CB a pH 9,0. En la Fig.
7 se muestra el comportamiento de CB al crecer en
licor negro como única fuente de carbono a pH 9,0 y
28o C. Hasta los 5 dı́as de incubación se observó un
incremento en la biomasa para luego descender a los
7 dı́as. Probablemente, esta situación se debe a la
utilización de nutrientes fácilmente metabolizables,
aportados por la melaza al inicio del cultivo; luego de
su agotamiento el cultivo deberı́a adecuar su maqui-
naria metabólica para utilizar el material recalcitrante
suministrado por el licor negro. Posteriormente, a 14
dı́as de incubación se constató un incremento de la po-
blación bacteriana y a los 21 dı́as ocurrió un descenso
en la biomasa, probablemente la fase de muerte; la
cual, podrı́a ser inducida por productos metabólicos
tóxicos (fenoles), provenientes de la degradación de
la lignina mediada por enzimas bacterianas (Lima-
yem & Ricke, 2012). La extensión de la degradación
de productos carbonados en el licor negro por el CB
fue demostrada mediante la determinación de las de-
mandas quı́micas y biológicas de oxı́geno. En la tabla
II se tabulan los niveles de DQO y DBO5,20 , al ini-
6
Utilización de bacerias en el biotratamiento de licor negro Oscar Valbuena ó y col.

o por procesos abióticos durante el tiempo de

biotratamiento. La elevación de los niveles de fenol
podrı́a justificar el descenso de la biomasa (Fig. 7)
observado a los 7 dı́as de biotratamiento, situación
que ha sido reportada (Chandra & Abhishek, 2011)
al inhibirse la degradación oxidativa de la lignina,
con la consiguiente acumulación de cloro fenoles
tóxicos.
En la tabla III se detallan los niveles de actividad
Figura 7. Crecimiento del consorcio bacteriano en
medio MT a pH 9,0 y 28o C. de peroxidasa en el medio MT a los 21 dı́as de trata-
miento, mostrándose únicamente los datos referentes
al sistema de reacción conteniendo 1mL de extracto
cio y después de 21 dı́as de biotratamiento del licor enzimático.
negro. Es de hacer notar que el extracto de levadura
resultó indispensable para la actividad enzimática,
Tabla 2. Variación de DQO y DBO5,20 y durante el
biotratamiento del licor negro. lo cual podrı́a justificarse al asumir que el extracto
suministró cofactores (flavinas) y minerales (Mg+2 ,
Dias de DQO DBO5,20 Mn+2 , Cu+2 ) necesarios para permitir una adecuada
Cultivo (mgO2 /L) (mgO2 /L) actividad de peroxidasa.
0 34.664 3.430
21 14.856 2.410 Tabla 3. Actividad de peroxidasa del consorcio
bacteriano en medio suplementado con licor negro

A B C D E
La DQO disminuyó un 57 % (1- 1,00 0,093 0,015 2,325 41,01 70,25
14856/34664)x100; y la DBO5,20 en un 29,7 % 0,75 0,072 0,009 1,800 31,80 54,47
(1-2410/3430)x100, lo que indicó disminución 0,50 0,047 0,006 1,175 20,76 35,56
parcial de los productos carbonados del licor 0,25 0,024 0,003 0,600 10,60 18,15
negro, implicando recalcitrancia elevada de estos
compuestos carbonados. La disminución de la DQO, A- Volumen (mL) del sobrenadante libre de bacterias (SLB) en
reportada para otros consorcios bacterianos, se el sistema enzimático.
ubicó entre un mı́nimo de 27,3 % (Yang et al., 2008) B- Variación de la absorbancia durante la incubación enzimática
y un máximo de 87 % (Kumar et al., 2012), con (Abs t0 - Abs t24 ) y la desviación estándar.
valores intermedios entre estos valores (Jain et al., C- Absorbancia correspondiente al volumen de SLB proveniente
1996; Gupta et al., 2001; Koctekaas et al., 1998; del medio de biotratamiento (MT). El valor se obtiene al
Chandra & Abhishek, 2011; Chandra et al., 2011; multiplicar la variación de la absorbancia por 25 (factor de
Kumar et al., 2012); y la DBO5,20 disminuyó 74-97 % dilución).
(Koctekaas et al., 1998; Chandra et al., 2011). Al D- Rojo fenol oxidado por el volumen de SLB en el sistema de
comparar los cocientesDBO/DQO al inicio y luego reacción. Los valores (ng), se obtienen al dividir la variación de
de 21 dı́as de tratamiento, se constató un incremento la absorbancia total entre la pendiente de la curva de calibración
de su valor, el cual de 0,1 (3.430/34.664) aumentó a (0,0566) descrita en Materiales y Métodos.
0,16 (2.410/14.856), indicando que el efluente E- Rojo fenol oxidado (µg) por el sistema de biotratamiento
biotratado es menos recalcitrante que el original. La MT. (Volumen Total 1.665 mL)
determinación de fenoles detectó un incremento en
su concentración después de 21 dı́as de incubar el Bajo las condiciones experimentales usadas, no
MT con el CB. De 0,24mg/L al inicio del tratamiento, es posible calcular la potencia enzimática de los SLB,
la concentración de fenol se situó en 0,437mg/L, debido a que ellos contienen cantidades no determi-
casi duplicando el valor inicial. Este aumento en nadas de lignina y sus fragmentos, no pudiéndose
fenoles es producido probablemente por degradación establecer la proporción en que se encuentran los dos
de la lignina mediante ataque enzimático bacteriano substrato disponibles para la(s) peroxidasa(s), el rojo

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Utilización de bacerias en el biotratamiento de licor negro
fenol y la lignina y sus derivados; tampoco se co-
noce las tasas de actividad de las enzimas sobre los
substratos disponibles en el medio de reacción. No
obstante, los datos indican actividad de peroxidasas
extracelulares. Estos resultados parecen indicar que
las poblaciones bacterianas presentes en efluentes
tóxicos podrı́an ser utilizadas como agentes biorre-
mediadores de los mismos.
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