MICROSCOPÍA LÁSER CONFOCAL

1.- INTRODUCCIÓN

La microscopía láser confocal es una nueva técnica de observación microscópica que está
logrando excelentes resultados en diversas ramas de la ciencia (medicina, biología,
materiales, geología, etc.) Su éxito se debe a las indudables ventajas que ofrece frente a la
microscopía óptica tradicional (imágenes de mayor nitidez y contraste, mayor resolución
vertical y horizontal, etc.) (fig 1) y, sobre todo, a la posibilidad de obtener "secciones
ópticas" de la muestra, lo que permite su estudio tridimensional.

Fig. 1. Fibras de celulosa de un trozo de papel observadas con microscopía de fluorescencia (izq.) y la misma
zona observada con microscopía laser confocal (dcha.)

Aunque el principio de la microscopía confocal fue patentado hace varios años (1957) y
los primeros microscopios basados en esta técnica que demostraron su validez fueron
descritos en 1968, su gran aceptación y espectacular desarrollo no ha tenido lugar hasta
hace unos pocos años con el desarrollo del láser y de los ordenadores personales.

2.- TIPO DE MUESTRAS

En general las muestras a observar en el microscopio confocal deben ser planas, bien sean
cortes de material biológico o muestras pulidas de materiales sólidos. El microscopio es
invertido por lo tanto las muestras deben ir provistas de un cubreobjetos. De este modo
se optimiza el funcionamiento de los objetivos al mismo tiempo que se protegen. En el
caso de cultivos o disoluciones éstos deben estar contenidos en un recipiente (tipo placa
Petri) cuyo fondo sea de 0.17 mm de grosor, lo que equivaldría al cubreobjetos en el caso
de cortes
3.- FUNDAMENTO DE LA TÉCNICA

El microscopio confocal añade el principio de iluminar el espécimen punto por punto y

elimina la luz proveniente de los planos no enfocados. Para ello se necesita una fuente de
luz muy potente, así como también un filtro con un agujero que se coloca en el trayecto
del rayo de luz (fig1). Se solía utilizar una lámpara de arco de zirconio, pero en los
microscopios modernos se emplea un rayo láser, cuya longitud de onda puede estar
disponible en un amplio rango de frecuencias.

Figura 2.-Esquema que muestra de manera simplificada el principio del microscopio confocal y el trayecto de
la luz. El rayo láser (luz azul) es filtrado por un agujero y un espejo dicroico; luego es enfocado mediante un
lente objetivo sobre el espécimen y estimula la fluorescencia presente en el mismo (luz verde). La
fluorescencia es recolectada por el objetivo y dirigida al espejo dicroico que la refleja y dirige hacia un
detector. Un segundo filtro con agujero se coloca frente al detector y sólo deja pasar la luz proveniente del
plano de enfoque (línea continua). La fluorescencia fuera de foco de las zonas que están por encima y por
debajo del plano de enfoque (en líneas discontinuas) no pasa por el agujero y por lo tanto no formará parte
de la imagen

La luz coherente del rayo láser es dirigida por espejos hacia el espécimen (el cual ha sido
previamente tratado mediante marcadores fluorescentes) iluminándolo punto por punto
y de manera seriada; la fluorescencia resultante es medida también punto por punto. Para
obtener la información completa, el rayo láser debe ser desplazado por todo el espécimen
(en los planos x, y, z) y este proceso es lo que se conoce como escaneo o barrido. Para
reconstruir las imágenes a partir de los datos obtenidos, se emplean programas de
computación adecuados

4.- COMPONENTES DEL MICROSCOPIO CONFOCAL

El Microscopio Confocal es un microscopio óptico que incluye:

a) Tres fuentes de luz:

- Lámpara de luz visible standard de cualquier microscopio que nos permite

localizar muestras en campo claro o contraste de fases.

- Lámpara de vapor de mercurio. Se suele usar para observar las muestras y

localizar aquellas zonas de interés para ser escaneadas en condiciones de
confocalidad.

- Láser. El más empleado es el de argón-kriptón que da tres líneas de salida. Es

posible montar simultáneamente varias fuentes láser. En las instalaciones donde
existe más de un láser, el segundo suele ser uno que emite en el ultravioleta. El uso
de una fuente de luz focalizada en un solo punto de la muestra, un láser, por esta
razón la imagen final de la muestra se obtiene tras sucesivos barridos de la misma.

b) Un sistema electrónico que ayuda a la captación de imágenes y un software

especializado que permite mejorar la calidad de la imagen por disminución de la
sensibilidad de los fotodetectores a intensidades bajas de fluorescencia, con lo que se
reduce el ruido de fondo.

c) Un diafragma de iluminación, localizado tras la fuente luminosa denominado Pinhole

de Excitación, cuya utilidad es eliminar la luz proveniente de planos superiores e inferiores
al plano focal, aumentando con ello la claridad y resolución de la imagen; y

d) Un diafragma de detección, de tamaño variable situado delante del fotodetector,

denominado Pinhole de Emisión
 Fig. 3. Imagen del Microscopio Láser Confocal Leica TCS SP2 AOBS.

5.- VENTAJAS DE LA MICROSCOPÍA CONFOCAL.

Las principales ventajas de la microscopía confocal frente a la microscopía óptica

tradicional son las siguientes:

- Mayor resolución. Es posible alcanzar resoluciones de hasta 0.14 µm en horizontal y

0.23 µm en vertical

- Mayor contraste. Debido a que se elimina la luz procedente de las zonas fuera de foco.

- Posibilidad de realizar secciones ópticas. Variando el plano de enfoque el sistema es

capaz de tomar imágenes a diferente profundidad sin dañar la muestra. Lo que permite
obtener información tridimensional de la misma.

- Análisis de imágenes. Al obtenerse la imagen de modo electrónico es posible digitalizarla

y aplicar sobre ella toda una serie de técnicas de análisis de imágenes como: mejorar su
calidad, comparar cambios en el tiempo, medida de intensidades, medidas morfométricas,
etc.

- Reconstrucción 3D. A partir de las secciones ópticas es posible aplicar técnicas de

reconstrucción 3D que nos permitan visualizar las estructuras, y así realizar perfiles de
superficie, medir profundidades y definir parámetros.

- Imágenes multidimensionales. El microscopio confocal nos permite estudiar imágenes

en 2 y 3 dimensiones a lo largo del tiempo. Es posible programar el equipo para obtener
imágenes durante un periodo de tiempo determinado.
6.- APLICACIONES

Las aplicaciones de la técnica son muy numerosas principalmente dentro de las ciencias
biológicas: biología celular, biología molecular, fisiología, etc. Ya que permite identificar y
localizar componentes moleculares específicos con la particularidad de que al no ser una
técnica destructiva permite una observación in vivo. 

Dentro de la ciencia de materiales también encuentra aplicación en la observación de la

morfología o los defectos en sólidos como componentes microelectrónicos, polímeros,
resinas, depósitos, minerales, cerámicas, metales, etc.

Algunos ejemplos específicos de la utilización de esta técnica son:

o Estudios de fibras de celulosa.

o Estudio de poros y microsfisuras en rocas.
o Estudio de Streptomyces antibioticus.
o Imágenes de cerebro de Drosophila
o Estudio de cultivos neuronales

7.- NUEVOS DESARROLLOS

Una de las principales limitaciones de los microscopios confocales punto a punto es el

tiempo de obtención de las imágenes (entre 2 y 3 imágenes por segundo). Esta lenta
velocidad de adquisición supone un problema cuando se trata de observar organismos en
movimiento (por ejemplo bacterias) o procesos de dinámica celular que ocurren en un
corto intervalo de tiempo. En la actualidad ya existen equipos en los que el láser incide
simultáneamente en toda una línea de la imagen en lugar de en un único punto
obteniéndose velocidades superiores a 200 imágenes por segundo. Estos microscopios
denominados Confocal Live, precisan de equipos informáticos con una gran capacidad de
proceso y almacenamiento para poder manejar los cientos de imágenes que podemos
obtener en unos pocos segundos.

8.- BIBLIOGRAFÍA

 UNIVERSIDAD DE OVIEDO, Servicios Científicos-Técnicos,

http://www10.uniovi.es/spi/trabajosconfocal.htm
http://octubre.sct.uniovi.es/tutoriales/confocal/
 CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER, Unidad de Microscopía, España,
 http://cicwebserver.dep.usal.es/confocal/web/WEB/apartados%20web
%20%20micro/aplicaciones%20confocal.dwt
 Daniel J. Narváez Armas, “La Microscopía: Herramienta para estudiar células y
tejidos”,
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo6_7.htm
 UNIVERSIDAD DE ALICANTE, Servicios Técnicos de Investigación, “Microscopía confocal”,
2009,
http://www.ua.es/es/investigacion/sti/servicios/analisis_instrumental/microscopia/confo
cal.html#equipamiento