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FACULTAD DE INGENIER/A
Aprobado por:
El objetivo general de esta investigación fue el producir etanol como combustible utilizando
Sacharomyces cerevisiae, a partir del bagazo de caña de azúcar hidrolizado térmicamente.
En un principio el fin del estudio de la hidrólisis térmica fue determinar las mejores condiciones para la
producción de etanol; sin embargo esta perspectiva cambió, al encontrarse que las concentraciones de
glucosa obtenidas al hidrolizarse térmicamente el bagazo fueron inferiores a 2 glL en todos los casos.
Con estos valores de glucosa, la fermentación anaeróbica se lleva a cabo con dificultad.
Entre las variables estudiadas para determinar el comportamiento ante la hidrólisis térmica, se tienen el
tiempo y la temperatura de hidrólisis. De estudios previos se fijaron variables como la concentración de
sustrato, la concentración y tipo de ácido[l6], además basándose en estos trabajos se le dio un
pretratamiento al bagazo de caña, al prehidrolizarlo antes de hidrolizarlo térmicamente, para facilitar el
rompimiento de las cadenas de celulosa a glucosa y eliminar sustancias inhibitorias de la fermentación.
En un reactor de 2 L se efectuaron las prehidrólisis térmicas a una temperatura de 153,2 "C, así mismo
las hidrólisis térmicas, cuyos niveles de temperatura escogidos fueron 170, 180 y 190 "C, con tiempos
de hidrólisis entre 5 y 40 minutos. Del estudio de la hidrólisis térmica, se tiene que conforme se eleva la
temperatura de hidrólisis, se observa una tendencia a aumentar las concentraciones de azúcares
reductores, siempre que los tiempos de hidrólisis no sobrepasen los 15 minutos.
APARTADO PAGINA
Epígrafe i
Comité asesor ii
Resumen iii
índice general v
índice de cuadros vi
índice de figuras xi
Capítulo 1
Introducción
Capítulo 2
Bagazo de la Caña de
Azúcar
Capítulo 3
Hidrólisis de Materiales
Lignocelulósicos
Capítulo 4
Fermentación
Capítulo 5
Metodología, Diagrama
y Equipo Experimental
Capítulo 6
Resultados y Discusión
Capítulo 7
Conclusiones y
Recomendaciones
Bibliografía
Nomenclatura
xii
CAPITULO
UNO
En casi todos los ingenios azucareros del país se encuentra que de la masa de la cana que entra en la
molienda, un 25 % de lo que queda es el bagazo de caña, del cual un 85 % se utiliza como combustible,
para suplir sus necesidades energéticas y generar energía eléctrica, mientras que el 15 % restante se
desecha o almacena para su uso posterior. Algunas opciones para su uso son: producción de
aglomeraciones, producción de furfural, producción de alcohol entre otras. Esta última opción es la que
se escogió, como tema de proyecto de graduación.
Lo que se pretende es determinar cuánto etanol se puede producir, mediante la hidrólisis térmica a
partir del bagazo de la caña de azúcar, utilizando Saccharomyce cerevisiae.
El alcohol producido se podrá aprovechar como combustible y no para consumo humano, para lo cual
haría falta realizar varias destilaciones, para poder asegurarse que todos los subproductos de la
hidrólisis se han eliminado.
BAGAZO DE LA CANA
DE AZÚCAR
2.1 GENERALIDADES
La cosecha de caña en Costa Rica tiene una duración aproximada de 115 días, iniciándose en enero y
finalizando en abril. Un 90 % de la corta de caña se realiza a mano, mientras que en las grandes
haciendas utilizan maquinaria especializada para esta labor. Uno de los aspectos negativos en la
recolección con máquinas es la basura y tierra que conlleva el producto cosechado. Sin embargo el
sistema de recolección por escoger dependerá de la tecnología y el costo de mano de obra disponible.
En el proceso de fabricación del azúcar, la caña se prepara y deposita en las bandas transportadoras,
que la conducen a los respectivos molinos, donde se le extrae el jugo. Posteriormente al producto
exprimido se le agrega agua y se somete a presiones elevadas, obteniéndose aproximadamente un
porcentaje de un 90 % al 98 % en la extracción de sacarosa. El residuo de esta operación es el bagazo.
En la producción de sacarosa, se obtienen además otros subproductos, que tienen o pueden tener
diversas aplicaciones en la industria. En el Cuadro 2.1 se presentan algunos de estos, como por
ejemplo la miel final, la cachaza y específicamente el bagazo, cuyo potencial de utilización no se ha
explorado mucho en Costa Rica
CAPITULO
2 BAGAZO DE LA CAÑA DE AZÚCAR 4
Cuadro 2.1 Productos obtenidos en la cosecha y en el proceso de producción de azúcar por 100 Mg
de caña.
Productos De caña en el cañaveral (Mg) De catía limpia en el ingenio (Mg)
Azúcar 9 12
Bagazo 50% humedad 19,5 26
Miel final 2,6 3,4
Cachaza 8 3,3
Hojas verdes 10,2 7
Hojas secas 8,9 7
Cogollo 819 7
Fuente: ICIDCA-MINAZA-1986
Debido a la inestabilidad del precio del azúcar a nivel internacional, algunos países productores de caña
de azúcar han tenido que tomar en consideración el potencial de alternativas, para el aprovechamiento
de los subproductos en la producción de la sacarosa. En lo que se refiere a Costa Rica, el bagazo sigue
siendo utilizado exclusivamente como combustible en el proceso.
Generalmente, cuando los molinos son eficaces, el producto que sale está prácticamente desintegrado,
con una longitud de las partículas inferior a 25 mm. La composición del bagazo al salir de estos molinos
es aproximadamente: 49 % de humedad, 6 % de sólidos solubles y 45 % de sólidos insolubles o fibra
cruda.
CAP~TULO2 BAGAZO DE LA CANA DE AZÚCAR 5
Como referencia, en Costa Rica los ingenios obtienen bagazo con humedades entre 48 y 50 %. Este
dato es importante, ya que un alto contenido de humedad en el bagazo significa poca extracción de
jugo y por ende un bajo rendimiento de azúcar extraído, por kilogramo de caña molida.
Otro dato fundamental, es la relación que existe entre el peso inicial de la caña con el bagazo. Se
espera que dicha relación se encuentre en un 24 - 28 %. Sin embargo en los datos encontrados en los
ingenios nacionales, este ámbito de porcentajes varía (23 - 39 %) de bagazo por peso de caña. Se ha
calculado que en ciertos ingenios, de 1 000 kg de caña, se obtienen entre 290 y 340 kg de bagazo.
El bagazo se compone de una fracción de fibras relativamente largas y de paredes gruesas, derivada
en gran parte, de la corteza, y en menor grado de los haces fibrovasculares dispersos en el interior del
tallo de la caña, y una segunda fracción medular derivada de las células de paredes delgadas del tejido
fundamental del tallo. Esas células de paredes delgadas en la caña viva almacenan el jugo dulce. En la
estructura del tallo de la caña esas fracciones están tan íntimamente asociadas entre sí que después de
la operación de la molienda solo puede efectuarse su separación en grado muy limitado. En el Cuadro
2.2 se presentan las composiciones aproximadas del bagazo entero, la fracción de fibra y la fracción de
médula.
En diversas comparaciones que se han realizado del tipo de fibra del bagazo de caña, se ha encontrado
una similitud con las fibras de la lana y algodón, ya que estas también tienen forma de espiralIl21.
La fibra pura de bagazo ha sido analizada por varios investigadores que han reportado valores medios
de 47 % de carbono, 6,5 % de hidrógeno, 44 % de oxígeno y 2,5 % de cenizas e indeterminados[I51.
En el almacenamiento del bagazo, se debe tener en cuenta, que es un material muy fácil de
descomponer. Generalmente se deposita al aire libre, en pilas que se encuentran levantadas de tal
forma que la ventilación sea adecuada. La parte superior de estas pilas se cubre con láminas metálicas,
que protegen al bagazo de la lluvia; además se le agrega ácido bórico y algunos fungicidas para una
conservación mejor.
Durante los primeros meses de almacenamiento, en el bagazo se produce ácido acético, debido a la
fermentación de azúcares, esto ocasiona que se den temperaturas altas, que lo esterilizan.
Dependiendo del uso que se le dará al bagazo, hay que tomar en cuenta la cantidad de humedad y
azúcares residuales, que pueden causar el desarrollo rápido de microorganismos, elevar la temperatura
y el deterioro posterior del bagazo; con base en lo anterior se debe escoger el método más adecuado
para su almacenamiento. Entre los métodos más comunes que se encuentran en la industria se tienen
los siguientes: a granel y los compactos.
CAP~TULO2 BAGAZO DE LA CAÑA DE AZUCAR 7
El método a granel es cuando se almacena el bagazo suelto en el patio, dentro de pilas con
capacidades de hasta 35 mil Mg de este material. En estas pilas se generan temperaturas altas y se
forma una zona anaeróbica, en donde el bagazo en su parte interna, llega a tener humedades de hasta
un 75 %.
En el método de almacenamiento compacto, se tiene dos tipos: pacas húmedas y pacas secas. El
almacenamiento de pacas húmedas, incrementa la fermentación, llegándose a temperaturas de
aproximadamente 65 "C, facilitando una combustión espontánea.
Por otro lado, el método de pacas secas, alcanza humedades de un 20 %, reduce el proceso
microbiológico, disminuye el deterioro elevado y pérdidas de almacenaje. También a diferencia del
método anterior, no se tienen índices de fermentación altos, por lo que se pueden confeccionar pacas
más grandes, bajando los costos de manipulación.
Otros usos del bagazo dependen de la capacidad y diversificación de la factoría que lo puede utilizar
como alimento para ganado, elaboración de pulpa, papel y furfural entre otros. Sin embargo aunque se
esté aprovechando cierta cantidad del bagazo en la industria azucarera, la producción excesiva de este
constituye un problema de transporte y de espacio en las instalaciones.
Dado que la densidad aparente del bagazo es muy baja, este material suelto alcanza densidades
aparentes promedio de 0,10 Mglm3 y cuando se apila, de 0,20 Mglm3, con un contenido de humedad
base de 45 %. Esta densidad baja hace prohibitivo el transporte del bagazo en esta forma. Una mejor
opción es el uso de prensas formadoras de pacas, que comprimen el material de forma, que
incrementan la densidad aparente en el orden de 0,40 - 0,70 Mglm3, dependiendo del tipo de prensa[*ol.
CAP~TULO2 BAGAZO DE LA CAÑA DE AZÚCAR 8
La mayoría del bagazo que se produce tanto en nuestro país como en el resto del mundo, equivale a la
cuarta parte de toda la caña que se muele. Debido a este problema de acumulación, sumado a los
precios internacionales del azúcar, se está pensando en la manera de diversificar o aprovechar de una
forma más eficiente los componentes potenciales de esta fibra para que no se desperdicie.
HIDRÓLISIS D E MATERIALES
LIGNOCELUL~SICOS
Los materiales celulósicos están formados básicamente de celulosa, hemicelulosa y lignina; la celulosa
es el componente principal, y constituye la fuente potencial más abundante de glucosa en la naturaleza.
Celulosa + Agua H+
P glu cosa
CAP/TULO 3 HIDR~LISISDE MATERIALES LIGNOCELUL~SICOS 10
CH20H
a)
---o
bQ-6 10,26 A
-0
4&-Q-Q
-0
e0--
CKOH
H OH
Los grupos OH- poseen una mejor disposición de disolverse en compuestos con grupos OH-, por
ejemplo, el agua disuelve al alcohol, no así al éter el cual no tiene grupos OH-. Otras sustancias como el
glicerol o el polialcohol son también solubles en agua. La celulosa es insoluble en agua, a pesar de
contener grupos OH-. Esto último es debido a que aproximadamente un 70 % de la celulosa de las
fibras naturales es cristalina, mientras que el 30 % restante, está formado de material muy hidrofllico.
Métodos como la Ultracentrifugación, la Viscosimetría o la Osmometría, sirven entre otras cosas para la
determinación de la cantidad de unidades de glucosa que se han combinado, en la formación de la
macromolécula de la celulosa.
La celulosa se puede identificar, si se añade una solución de NaOH al 17,5 % a la muestra, a una
temperatura de 200 OC, para obtener un producto que contiene:
9 a-celulosa: que corresponde a la parte insoluble de la celulosa.
j3-celulosa: parte soluble de la celulosa y que precipita en presencia de ácido.
CAP~TULO3 HIDRÓLISISDE MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS 11
Las hemicelulosas son polisacáridos de bajo peso molecular y se encuentran estrechamente ligados
con la celulosa y tienen además la característica de que se hidrolizan más rápido que esta, por la
acción de los ácidos. Los productos que se obtienen de la hidrólisis de la hemicelulosa, se muestran en
la siguiente fórmula:
Hemicelulosa + Agua H +
La hemicelulosa se localiza preferentemente en la pared celular, pero sobre todo en partes exteriores y
en su lámina media, es soluble en NaOH al 17,5 %, porción que es incluida en la a-celulosa.
La lignina es un compuesto formado por diversas unidades, de cadenas laterales de tres carbonos, es
aromática, por lo tanto su fórmula es diferente a las de las celulosas y hemicelulosas. Además es
resistente a la hidrólisis térmica, ya sea a concentraciones bajas o a altas de ácido; esta más bien
permanece como un residuo insoluble de la hidrólisis. Por medio del espectro infrarrojo, se determinó
que la estructura de la lignina forma parte de los productos de la degradación. El aislamiento de la
lignina se lleva a cabo con un procedimiento que utiliza solventes alcohólicos acidificados y dioxano[8].
CAP~TULO3 HIDRÓLISIS DE MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS 12
En tiempos de guerra, en algunos estados se utilizó el bagazo para producir azúcares fermentables por
medio de la hidrólisis ácida de la celulosa. Actualmente se realizan numerosas investigaciones sobre
cuán factibles resultan ser estos tratamientos en la elaboración de azúcares aprovechables para la
industria. Otra forma de obtener estos azúcares fermentables es mediante la utilización de cultivos
mixtos seleccionados de bacterias celulolíticas y fermentadoras, como las de Clostridium.
El bagazo de la caña está compuesto por polímeros de azúcar con una proporción de: 37,6 % de
celulosa y 31,l % de hemicelulosa.
En la práctica, una prehidrólisis con ácidos diluidos convierte a la hemicelulosa en sus componentes
azucarados. Posteriormente, una hidrólisis más enérgica, donde haya mayores concentraciones de
ácido o temperaturas más elevadas, convierte la celulosa en glucosa, separándose la lignina en la
misma forma que en el caso anterior.
Para lograr las condiciones de máximo rendimiento en las etapas de prehidrólisis e hidrólisis, se deben
considerar las aplicaciones posteriores de los productos obtenidos. Por esta razón, es importante el
estudio de las siguientes variables[*3]:
a) Grado de molienda
b) Relación sólido-líquido
c) Temperatura
d) Tiempo
e) Concentración de ácido
CAP~TULO3 HIDRÓLISIS DE MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS 13
Los parámetros cinéticos se pueden obtener realizando un análisis teórico, que optimizan el sistema de
hidrólisis, llevado a cabo en un reactor por tandas. Para ello se presentan las siguientes expresiones:
Lo que interesa del proceso de hidrólisis es llegar a producir la máxima cantidad de azúcares
fermentables. Por lo tanto del estudio cinético se tienen dos expresiones, la 3.8 y 3.9, con las que se
pueden calcular el tiempo máximo y la concentración máxima de dichos azúcares, obtenidos en ese
lapso[lgl.
CAP~TULO3 HIDR~LISISDE MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS 14
Los mejores resultados de la etapa de hidrólisis se obtienen cuando previamente se realiza una
prehidrólisis térmica, para eliminar la hemicelulosa presente en los materiales lignocelulósicos. Esto se
logra mezclando dichos materiales con una solución de ácido sulfúrico al 0,5 - 0,8 %. Luego el material
leñoso se introduce en un recipiente a presión, resistente, a una temperatura de 190 "C. La solución de
ácido se inyecta desde la parte superior del recipiente y se extrae a través de un filtro por su parte
inferior; de esta forma se descarta el líquido donde se encuentran los azúcares producto de la hidrólisis
de la hemicelulosa; todo el proceso se lleva a cabo en 3 minutos. Por otro lado los sólidos se secan,
para utilizarlos posteriormente en el proceso de hidrólisis de la celulosa presente en ellos.
De trabajos previos sobre la hidrólisis de la celulosa, se tienen las siguientes ecuaciones empíricas para
calcular las constantes de la velocidad de reacción[lgl:
Estas ecuaciones aplican para materiales lignocelulósicos como la madera de pino. Además la hidrólisis
se realiza en un ámbito de temperaturas de 170 "C a 190 "C, con una concentración de ácido sulfúrico
de 0,4 % a 1,6 % y una concentración de sustrato de 50 g/L a 100 g/L. Otro factor importante es el
tiempo de hidrólisis, que es aproximadamente 3 minutos.
En la práctica se sabe que la descomposición de celulosa es una reacción de primer orden, que
depende de la concentración de ácido y de temperatura. Investigaciones sobre este tema han logrado
determinar un aumento de la velocidad de descomposición, conforme se aumentaba la temperatura,
mientras que con temperaturas inferiores a 30 "C, la velocidad de descomposición es muy baja. Por
esta razón es recomendable, que al finalizar la etapa de hidrólisis, se evite que los azúcares producidos,
permanezcan mucho tiempo en contacto con el ácido hidrolizante, sobre todo si la temperatura es muy
alta.
CAP~TULO3 HIDRÓLISIS DE MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS 15
Otros factores por tomar en cuenta tanto en el diseño como en la ejecución de la hidrólisis son: la razón
liquido-sólido, y el efecto del tamaño de las partículas. En cuanto a la razón de líquido-sólido se refiere,
la relación más adecuada es mayor a 5 partes de líquido por una parte de sólido; si se trabaja con
sólidos muy divididos, una cantidad pequeña de líquido no sería suficiente para humedecerlos
completamente. Es importante destacar que el líquido utilizado es el ácido hidrolizante, por lo tanto
debe escogerse cuidadosamente tanto el tipo de ácido como su concentración.
Respecto al tamaño de la partícula sobre la velocidad de hidrólisis, se puede decir que a medida que se
disminuyen las dimensiones del sólido, el tiempo de hidrólisis se hace menor, para obtener la misma
cantidad de azúcares fermentables. Sin embargo el hecho de utilizarse partículas pequeñas, introduce
un costo adicional al proceso, a menos que se compense con un tiempo menor de hidrólisis que lo
justifique económicamente.
Con análisis posteriores se logra comprobar que el aumento tanto de la concentración de ácido como
de la temperatura, aumentan la conversión de la celulosa a glucosa. A su vez los efectos de la
velocidad de descomposición de esta última son mucho menores, en comparación con la
transformación que sufre la celulosa.
Entre los agentes destructores de materiales leñosos, se pueden mencionar los diferentes tipos de
hongos. La podredumbre se presenta de dos formas: La oscura, generalmente producida por hongos
que al destrozar la celulosa, la vuelven frágil al punto de pulverizar el material leñoso y la blanca que
ataca la lignina, (compuesto presente en este tipo de estructuras) y forman zonas bh-~cas.
CAP/TULO 3 HIDRÓLISIS DE MATERIALES LIGNOCELULÓSICOS 16
En cuanto a los hongos, se tienen los superiores como los Ascomicetos y Basidiomicetos, cuyo daAo
radica en manchas, por la formación de pigmentos. También se tienen los mohos, que están formados
por una gran cantidad de hongos[21].
Para prevenir la formación de los hongos es muy importante, tener conocimiento de cuáles son las
condiciones que favorecen su crecimiento; entre las que se pueden citar: sustancias nitrogenadas
(alimento de estos organismos), temperatura, cantidad de oxígeno, humedad y sobre todo ausencia de
la luz solar. Lugares con climas muy calientes y húmedos presentan dificultades al tratar de mantener
en buen estado los materiales leñosos. Por otro lado en sitios donde el ambiente es muy frío y la
humedad tiene un porcentaje menor a 20 %, la degradación de estos materiales se reduce.
La forma de ataque de los hongos, es mediante la segregación de enzimas, que destruyen los
materiales leñosos. La cantidad y la clase de enzima dependen de la temperatura, el pH, la especie de
hongo y la naturaleza del sustrato. Algunas de las enzimas más comunes son: la citasa, que ataca las
paredes celulares; la celulasa, hemicelulasa, ligninasa y catalasa entre otras[21].
CAPITULO
CUATRO
Las coenzimas son sustancias, que la mayoría de las veces son producidas por la misma célula o
alguna otra sustancia específica. A cada tipo de enzima, le corresponde una coenzima; su presencia es
muy importante, porque mediante esta combinación enzima-coenzima, se efectúan todas las fases de la
fermentación.
En las fermentaciones los microorganismos utilizados como las levaduras y hongos, únicamente
pueden obtener energía al alimentarse de materiales orgánicos.
La selección de la materia prima para realizar la fermentación, depende de varios factores, entre ellos el
costo y la disponibilidad de la misma; pero lo más importante por tomar en cuenta es su composición,
en especial el contenido de carbono y nitrógeno. La materia prima con una gran proporción de celulosa,
es poco aprovechable a nivel industrial, por la dificultad de encontrar microorganismos capaces de
utilizar la c e l u l ~ s a [ ~ ~ ] .
Entre los productos agrícolas y materiales celulósicos utilizados para la fermentación se tienen los
siguientes[4]:
Subproductos del procesamiento de las cosechas de azúcar (melazas, sorgo, dulce, jarabes,
líquidos sulfíticos agotados).
a Cosechas de azúcar (caña de azúcar, remolacha, sorgo).
Cereales (maíz, trigo, arroz).
a Tubérculos (mandioca, yuca, papa).
a Otras fuentes diversas (polisacáridos residuales de la extracción del aceite de nueces, etc).
Productos forestales directos (eucaliptos, pinos).
a Residuos celulósicos (aserrín, bagazo de caña, corteza, paja, virutas, papel usado).
La celulosa es un polisacárido formado por una cadena de restos de p-glucosa unidos por el átomo de
carbono 4, mediante enlace glucosídico, por ello su fermentación se puede llevar a cabo por
organismos aerobios, como bacterias y hongos o por organismos anaerobios como el tipo de bacterias
presentes en los intestinos. La celulosa puede convertirse en glucosa, por dos métodos posibles: una
hidrólisis ácida o una hidrólisis enzimática[l7].
La fermentación debe realizarse bajo ciertas condiciones, en que los microorganismos desarrollen toda
su capacidad fermentativa, orientada hacia la producción de alcohol. Dichas condiciones son las
siguientes:
1) Nutrientes y activadores
2) Temperatura
3) PH
4) Aeración
5) lnhibidores
En cuanto a los nutrientes y activadores, las levaduras requieren de azucares, de los cuales
adquieren energia, para sus procesos vitales y como fuente de carbono. Otros substratos necesarios
para su anabolismo son: nitrógeno, fósforo, azufre, potasio, magnesio, calcio y vitaminas. La carencia
de estos nutrientes causará un ataque contra las proteínas, liberandose H2S. También es importante la
presencia de esteroles y ácidos grasos insaturados de cadena larga, necesarios para que las
membranas celulares sean funcionales.
Las levaduras se clasifican como microorganismos mesófilos, por esta razón la fermentación se puede
llevar a cabo en un ámbito de temperatura desde los 13 "C hasta 35 "C. La ventaja de utilizar
temperaturas altas, es que el proceso ocurrirá a una velocidad mayor, sin embargo aumentará la
proporción de productos secundarios, así como el riesgo de una alteración bacteriana o la terminacidn
de la fermentación antes de tiempo, la razón de esto es que las membranas celulares de las levaduras
dejan de ser tan selectivas. Por otro lado con una temperatura baja, se logra obtener un mayor grado
alcohólico. La temperatura más adecuada para realizar la fermentación alcohólica se sitúa entre los 28 -
32 OC[*5].
Otro factor importante es el control del pH, tanto a la hora de realizar la inoculación de las levaduras
como cuando se empiece el proceso de fermentación. Un pH muy bajo no sería adecuado para la
existencia de las levaduras, que producen el alcohol; el ámbito que favorece satisfactoriamente este
proceso se encuentra entre 4 y 4,5. Sin embargo el pH recomendado por la Fábrica Nacional de Licores
para el buen crecimiento de levaduras como la Saccharomyce cerevisiae es de 4,8, y cuando estas
envejecen un poco, el pH debe bajarse a 4,4[11.
La cantidad de aire que se utilice en la fermentación, debe ser tal que favorezca la producción de
alcohol, esto se logra con cantidades pequeñas de aire, a lo que se conoce como un proceso anerobio,
provocando que el azúcar consumido sea el necesario para producir la proporción de células requeridas
para la fermentación. Por otro lado una aeración excesiva trae consecuencias como la obtención de
agua y anhídrido carbónico en lugar de alcohol, esto debido a que las levaduras, cuando viven bajo
estas circunstancias, no utilizan los azucares por vía fermentativa sino oxidativa, para obtener con ello
mucho más energía.
A toda costa, se debe eliminar o prevenir la presencia de inhibidores, restos de productos fitosanitarios
y ácidos grasos saturados de cadena corta, que pueden afectar el proceso de fermentación de alguna
forma, ya sea bajando la eficiencia del mismo o evitando por completo su realización. Entre los
principales inhibidores se pueden mencionar el Son, ácido aconítico, metales pesados y restos de
herbicidas o bacterias.
Las levaduras que tienen mayor aplicación técnica son las pertenecientes al grupo de las Ascomycetes,
entre las más importantes se puede mencionar a la Saccharomyces, cuyo papel en la fermentación
alcohólica es fundamental. Estos microorganismos se desarrollan más activamente en la oscuridad y
producen enzimas, mediante las cuales catalizan las reacciones propias de la fermentación.
De estudios de la fisiología del organismo se pudo determinar que cepas como la Saccharomyce solo
pueden utilizar hexosas, mientras que otras levaduras que sirven para producir forraje, no se limitan en
lo que respecta a su fuente de carbono.
La Única forma de obtenerse un crecimiento rápido de estas levaduras, así como un rendimiento alto en
el proceso y productos estables, es que se tome en consideración toda la información disponible sobre
las propiedades de la producción fermentativa. Dichas propiedades dependen de genes que participan
en los ciclos de la glicólisis, de los ácidos tricarboxílicos, del metabolismo del nitrógeno y la síntesis de
hidratos de carbono de reserva.
En los Últimos años la industria se ha preocupado por mantener con éxito cualquier medio que impida
cualquier cambio en las propiedades bioquímicas de los microorganismos, garantizando la estabilidad
de los mismos. Entre los medios empleados se tienen los siguientes[25]:
1) Mantenimiento en medios de cultivos sólidos y repiques periódicos, bajo condiciones frescas,
2) bajo aceite mineral,
3) congeladas a -20 "C y después a -55 "C en medios que contienen leche o glicerol,
4) liofilización,
5) mantenimiento a muy baja temperatura, en nitrógeno líquido (-196 "C).
La Saccharomyce cerevisiae utiliza como principales fuentes de carbono la glucosa y la sacarosa. Sin
embargo también puede utilizar la fructuosa, galactosa, maltosa y por supuesto el etanol. Además del
carbono y el nitrógeno, el cual se suministra por la urea o el nitrato de amonio, existen otros elementos
importantes como: el fósforo (proporcionado por el ácido fosfórico), magnesio (que se obtiene del
sulfato de magnesio), calcio, hierro, zinc y vitaminas como la tiamina y biotina, entre otras.
En las fermentaciones industriales, los medios deben contener todos los elementos requeridos para la
síntesis del material celular, para lo que es necesario un crecimiento de los microorganismos y
finalmente la formación del producto por las células maduras. En la producción de etanol los métodos
más utilizados se basan en la fermentación de carbohidratos por medio de levaduras, aunque a la vez
se pueden obtener productos secundarios de bajo peso molecular como el butanol, acetona y otros.
En plantaciones de azúcar se generan tanto lignoceluosa como azúcares sencillos. En estas producen
etanol por medio de la fermentación de soluciones diluidas de glucosa, a pesar de que tienen datos de
que más del 70 por 100 de la lignocelulosa consiste en polímeros de hexosas y pentosas que contienen
residuos de lignina y otros materiales[24].
En todo proceso de fermentación alcohólica, la productividad máxima del proceso y calidad del
producto, dependen tanto del reactor que se utilice como de las condiciones de operación en las
diferentes etapas de la fermentación. El proceso de fermentacibn, consta básicamente de tres etapas:
1) Propagación de cultivos: que comienza generalmente en recipientes que contienen una cantidad de
microorganismo o un tubo liofilizado, donde se conserva la cepa de interks, previamente
seleccionada. Este material constituye el punto de partida, el cual se debe aumentar mediante
trasvases constantes a frascos de volúmenes crecientes, que se operan en agitadores de vaivén.
3) Procesos de separación y purificación de los productos; que comprenden las siguientes: a) por
filtración, decantación o centrifugación, separación de sólidos insolubles; b) separaciones primarias
por extracción o absorción; c) purificación por extracción a dos fases acuosas y d) aislamiento del
producto.
El etanol, alcohol etilico o alcohol de grano, se puede producir a partir de tres principales tipos de
materias primas:
Materias ricas en sacarosa como la caña de azúcar, la melaza y el sorgo dulce.
1) Materias ricas en almidón como los cereales y los tubérculos.
2) Materias ricas en celulosa como la madera y los residuos agrícolas.
La caña de azúcar, desde el punto de vista práctico, es una de las materias primas más utilizadas para
producción de alcohol, porque los azúcares que contiene, se presentan en su forma más simple, es
decir en carbohidratos fermentables. Sin embargo la desventaja de emplear esta materia prima, radica
en los costos de producción.
Los sustratos celulósicos se encuentran entre las materias primas con más potencial para la producción
del alcohol, no obstante los procesos de hidrolisis ácida y enzimática, para lograr la conversión de los
azúcares en carbohidratos fermentables, están poco desarrollados en la industria, a pesar de ello se
espera que en años próximos se den importantes avances.
CAPITULO
CINCO
METODOLOGÍA, DIAGRAMA
Y EQUIPO EXPERIMENTAL
El objetivo general de este proyecto es producir etanol como combustible mediante fermentación,
utilizando Saccharomyces cerevisiae a partir del bagazo de la caña de azúcar hidrolizado térmicamente.
Para lograr los objetivos, se describirán a continuación las pruebas preliminares realizadas, con las que
se pudo determinar cual debe ser la metodología del procedimiento experimental más adecuado,
designándose también los materiales y equipo.
En la primera etapa del procedimiento, se lleva a cabo una prehidrólisis del bagazo de la caña, para
eliminar la hemicelulosa presente. Mientras que en la segunda etapa se prepara el sustrato con el
bagazo prehidrolizado, procediéndose a realizar la hidrólisis térmica, para obtener los azúcares
reductores; en esta parte se efectúan las fermentaciones de los sustratos hidrolizados y finalmente se
destila el alcohol que se produzca.
5.1 MATERIALES
5.1.3 Reactivos
Para realizar las diversas pruebas, el equipo usado y sus especificaciones, se describe en el Cuadro
5.2.
Los diagramas experimentales del equipo se muestran en las Figuras 5.1y 5.2.
NOMENCLATURA
1 Ea60 termico
2 Bomba penstattica
3 Entrada de agua
4 Agitador
5 Toma de muestra
6 Fennentador
7 Sustrato de bagazo
de caña
8 Control del agitador
I
:¡gura 5.2 Diagrama del equipo utilizado en la fermentación en un reactor de 5 L.
A partir del bagazo seco obtenido del procedimiento anterior, se pesaron 3 g de sólidos y se colocaron
en un crisol tarado con anterioridad. Esta prueba se realizó por triplicado introduciendo cada crisol en la
mufla, a una temperatura de 500 "C por 5 horas. El resultado corresponde a las cenizas del bagazo de
caña.
CAPITULO
5 METODOLOG~A,DIAGRAMA Y EQUIPO EXPERIMENTAL 28
La concentración de los azúcares reductores se le determinó tanto a los hidrolizados como a los
fermentados, previamente filtrados. Esta variable se determinará mediante el método de Nelson
Somogyi, que se encuentra detallado en el Apéndice D.
Esta variable se determina después de efectuar las fermentaciones de los hidrolizados. El valor
numérico se calcula al medirse primero el índice de refracción en un refractómetro, luego con la ayuda
de una curva de calibración se determina el porcentaje de volumen de alcohol de cada muestra. El
procedimiento de esta medición se explica en el Apéndice D.
Con el fin de determinar el comportamiento del bagazo de la caña de azúcar ante la hidrólisis térmica se
realizaron dos diseños experimentales preliminares, sin previo tratamiento del bagazo, por lo que dicha
materia prima se utilizó tal y como se obtuvo del Ingenio. Los resultados fueron de utilidad para lograr
establecer los niveles de algunas de las variables de diseño. Las variables de respuesta elegidas para
esta investigación fueron: concentración de azúcares reductores y concentración de glucosa.
CAP~TULO5 METODOLOG~A,DIAGRAMA Y EQUIPO EXPERIMENTAL 29
El primer diseño se realizó en un autoclave a una presión fija de 138 kPa (20 psig); las variables de
diseño en estudio para este caso fueron las de pH, tiempo y la relación bagazolagua del sustrato, sus
niveles se presentan en el Cuadro 5.3. El ácido clorhídrico se utilizó para regular el pH a los niveles
escogidos.
Cuadro 5.3 Condiciones experimentales del primer diseño experimental. (Pruebas preliminares)
(A) Niveles utilizados Inferior Superior
(-1 (t)
Relación (bagazolagua), (glg) 121105 12195
Según los resultados obtenidos se tiene que las mejores condiciones de hidrólisis se dan a un pH de
1,5, una relación de bagazo1 agua de 12 g de bagazo 1 95 g de agua. En cuanto al tiempo de hidrólisis
en este primer diseño no quedó muy claro cuál es su influencia. Debido a esto, para el segundo diseño
se utiliza un reactor de 2 L, con una capacidad de presión máxima de 13,8 MPa (2 000 psig); se estudió
el efecto tanto del tiempo de hidrólisis como el de la temperatura, y de esta manera se tiene una idea
más aproximada del comportamiento del bagazo de caña ante una hidrólisis térmica. En el Cuadro 5.4,
se muestran las condiciones de este diseño.
Otra prueba efectuada a modo de facilitar la metodología experimental por seguir fue el de fermentar
algunos sustratos hidrolizados, e indagar cuánto de los azúcares reducidos en la etapa de hidrólisis se
utilizan para la producción de alcohol. Antes de la hidrólisis térmica del bagazo, este se prehidrolizó tal
como se establece en el apartado 5.4.2; mientras que con la fermentación se procedió como se explica
en la sección 5.4.3.
CAP~TULO5 METODOLOG~A,DIAGRAMA Y EQUIPO EXPERIMENTAL 30
El pretratamiento del bagazo de la caña de azúcar, consiste en un tratamiento térmico, que se realiza
con el objeto de eliminar la hemicelulosa presente; la razón de esta separación, es porque la
hemicelulosa no permite un apropiado contacto entre la celulosa y la disolución ácida, en el momento
de llevarse a cabo la hidrólisis térmica, lo que minimizaria la eficiencia de este proceso. Además la
hemicelulosa al hidrolizarse produce sustancias, que pueden inhibir de una u otra forma, el proceso
posterior de fermentación[lgl. Es importante mencionar que el bagazo, se molió antes de este
tratamiento, para disminuir el tamaño de las partículas y que el contacto sólido-líquido sea mejor,
aumentando la eficiencia del proceso de hidrólisis. El tamaño del bagazo molido varía; un 2 % del
bagazo a utilizar tiene 1,41 mm de dimensión, un 18 % de 841 pm, 65 % de 300 p m y un 16 % del que
pasó a través de un último tamiz de 300pm.
o Se introduce en el reactor una tanda a la vez y se lleva a una temperatura de 153,2 "C.
o En el momento que llega a esta temperatura, el equipo se apaga y se saca inmediatamente el
reactor, colocándose en un baAo de agua, para evitar que el proceso de hidrólisis continúe por más
tiempo.
o El contenido del reactor se filtra al vacío, se le hacen tres lavados con 100 mL de agua destilada,
para eliminar todos los residuos de ácido y de azúcar reductor del bagazo prehidrolizado.
o Los residuos sólidos de todas las tandas se secan en un horno a 60 "C por un día, luego todos los
sólidos se mezclan.
o A los líquidos filtrados se les determina la concentración de azúcares reductores y la concentración
de glucosa.
Este sólido pretratado es el que se utilizará para realizar las corridas experimentales de la hidrólisis
térmica.
5.5.3.1 Objetivo
5.5.3.2 Variables
2. Nivel de agitación: la reacción de la hidrólisis ocurre sin agitación. Para reacciones en serie el
reactor tubular da mejores resultados que en uno de agitación continua[lgl, sin embargo en este
trabajo se utilizará un reactor batch, el cual no está provisto de un sistema de agitación.
3. Concentración de ácido: después de analizar la información bibliográfica, se determinó el utilizar el
ácido sulfúrico a una concentración de 1,2 %.
4. Concentración de sustrato: para esta variable se escogió trabajar con 80 gramos de bagazo en un
800 mL de solución de ácido sulfúrico; valor que se encuentra dentro del ámbito recomendado.
Variables de diseño:
1. Temperatura: de trabajos realizados por Saeman, J (1945), se sabe que el ámbito de temperatura
para este tipo de procedimiento, se encuentran entre 170 "C y 190 "C, por esta razón se escogió
realizar varias corridas a 170 "C, 180 "C y 190 "C.
2. Tiempo: para el estudio de esta variable se escogieron valores entre 5 y 40 minutos; basándose en
el hecho que las partículas del bagazo son pequeñas, los tiempos para efectuar la hidrólisis
disminuyen, ya que el proceso de ruptura de la cadena de celulosa a unidades de glucosa es más
simple. De las pruebas preliminares se encontró que a tiempos mayores a 40 minutos el sustrato se
descompone, porque si bien es cierto que a mayores temperaturas y tiempos de hidrólisis, se
rompe la celulosa en su monosacárido constituyente, que es la glucosa[lgl; esta última puede sufrir
un proceso de polimerización, al estar bajo condiciones excesivas, como lo es la exposición
prolongada en ácido. Por otro lado se tiene conocimiento que el tiempo real de hidrólisis se
encuentra cerca de los 3 minutos[lgl.
Variables de respuesta:
1. Concentración de azúcares reductores: esta variable se determinará mediante el método de Nelson
Somogyi. Este método se encuentra en el Apéndice D.
2. Concentración de glucosa: se determinará utilizando el método enzimático de Trinder [Laboratorios
Ticolab, 2003). El método se encuentra en el Apéndice D.
3. Concentración de etanol: para la obtención de esta variable es necesario realizar las
fermentaciones de todos los sustratos hidrolizados. El procedimiento de esta medición se explica en
el Apéndice D.
A los caldos de la fermentación se les determinará a su vez, tanto las concentraciones de azúcares
reductores como de glucosa.
La concentración de los nutrientes tanto para el medio de cultivo como para el inoculo se presenta en el
Cuadro 5.5.
Los sustratos utilizados fueron los obtenidos de cada una de las hidrólisis térmicas a diferentes
temperaturas y tiempos de residencia, las que se muestran en el Cuadro 5.6.
Lo que se pretende en esta parte del trabajo es sondear el comportamiento de estas levaduras al
fermentar el sustrato hidrolizado vía térmica.
La corrida escogida al azar para llevar a cabo este sondeo fue la número 8 del Cuadro 5.6, que
corresponde a la temperatura de hidrólisis de 180 "C a un tiempo de hidrolización de 10 min. El sustrato
hidrolizado obtenido se separó en tres erlenmeyers de 250 mL, en cantidades iguales. La única
diferencia en su preparación para la fermentación, fue que a dos de los erlenmeyers se les agregó la
cepa productora de alcohol, mientras que al tercero se le añadió la levadura panificadora.
Sobre la marcha de esta investigación se decidió efectuar dos corridas mas de la hidrólisis a la
temperatura de 180 "C y 10 minutos; pero esta vez variando el pH de la concentración del sustrato
antes de hidrolizar, los valores escogidos fueron de 2,00 y 3,OO. El fin de estas pruebas nuevas fue el
de obtener un registro de la tendencia o comportamiento de la fermentación ante el nivel de acidez del
sustrato por hidrolizar. Los dos sustratos obtenidos se prepararon de igual manera que las corridas
anteriores, pero en este caso se utilizó para la fermentación de los mismos, la levadura panificadora.
Para efectuar las fermentaciones en el reactor de 5 L, los sustratos se hidrolizaron a las condiciones
que se muestran en el Cuadro 5.7.
Cuadro 5.7 Condiciones de la hidrólisis térmica, para efectuar posteriormente las fermentaciones
alcohólicas en el reactor de 5 L.
Variable Valor
Temperatura, T("C) 190
Tiempo de hidrolisis, tt-, (min) 15
Para obtener los 5 L de sustrato hidrolizado, se realizaron ocho corridas de la hidrólisis, a las mismas
condiciones descritas en el cuadro anterior, utilizando un reactor de 2 L de capacidad.
CAP¡TULO 5 METODOLOG~A,
DIAGRAMA Y EQUIPO EXPERIMENTAL 37
Los 5 L del sustrato hidrolizado se separaron en dos partes iguales, adicionándolos en dos erlenmeyers
de 3 000 mL cada uno.
Las variables para el seguimiento cinético y sus valores, en esta etapa, son las mismas que se
escogieron, para efectuar todas las fermentaciones en los erlenmeyers de 250 mL. Sin embargo el
microorganismo utilizado para estas corridas a mayor escala, fue el de la levadura productora de
alcohol. Además se llevó a cabo una agitación del sustrato durante todo el proceso de fermentación,
con una velocidad aproximada de 4,13 rps.
El inoculo se preparó 24 horas antes de utilizarse, para que en este tiempo, el microorganismo se
reprodujera. A continuación se describe el procedimiento de su elaboración:
o Se pesan 12,5 g de glucosa en un erlenmeyer de 500 mL, se añade en 350 mL de agua destilada.
o Se regula el pH a 4,5.
o Se agregan todos los nutrientes del Cuadro 5.5, se tapa con papel aluminio y se esteriliza en el
autoclave por 15 minutos a 55 kPa (8 psig).
o Después de enfriar se le agrega el microorganismo bajo condiones asépticas.
o Al erlenmeyer se le coloca un tapón con dos puertos, uno de los cuales sirve para evacuar el
dióxido de carbono, mientras que el otro sirve para introducir el oxígeno al medio.
Finalmente se coloca en un baño de agua a 31 "C, por 24 horas.
El procedimiento para cada una de las corridas en este reactor, se describe a continuación:
o A los sustratos en cada erlenmeyer de 3 L, se les agregan los nutrientes del Cuadro 5.5, luego se
sellan con papel aluminio y se esterilizan en un autoclave a 55 kPa (8 psig) durante 15 minutos.
o Cuando se hayan enfriado por completo, uno de los erlenmeyer se pone en refrigeración para
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
~eferencia" 45 50 2140
'Contenido de ceniza en el bagazo seco
" Fuente: Kirk-1961
Al comparar los datos tomados de la literatura con los resultados obtenidos experimentalmente, se
observa que estos últimos son mayores a 3,5 % en el contenido de sólidos, 1,5 O
h en el porcentaje de
humedad y 0, 59 O
h en el contenido de cenizas. Estas diferencias pequetias radican en el hecho que las
condiciones de almacenaje varían entre las muestras de bagazo, analizadas experimentalmente de las
que se tomaron de trabajos previos[l*].
La experimentación preliminar resultó de gran utilidad, porque se estableció un criterio para la hidrólisis
CAP~TULO6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 40
térmica.
del bagazo de caña. Las primeras pruebas se efectuaron en un autoclave a una presión máxima fija de
138 kPa (20 psig), cuya temperatura corresponde a unos 126 "C. Los valores de pH para el estudio, se
escogieron, con base en proyectos de graduación anteriores[ii< 201 En cuanto a las relaciones
bagazolagua ("concentración de sustrato") se seleccionaron en forma experimental. Finalmente, la
designación de los tiempos de hidrólisis, se fundamentaron en el hecho de compensar en alguna
medida, que el equipo con que se contaba en esos momentos, no permitía valores mayores, necesario
para una eficiencia mejor del proceso de hidrólisis térmica. Los resultados se muestran en el Cuadro
6.2.
Cuadro 6.2 Resultados de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa, del primer estudio
g
Concentración
Tiempo de Relación Concentración
de azucares
hidrólisis (bagazolagua) reductores de glucosa
Corridas PH
Th L
cr
c,
(h) glg (,,,gmL] ~"'glmL)
- -
1 3 121105 24,99 1,34
Observando los resultados de este primer ensayo, se puede decir que las condiciones que favorecen
esta etapa, se dan a un p H de 1,5, una relación de sustrato de 12195 y un tiempo de hidrólisis de 4
horas. Este comportamiento se ve reflejado en todas las corridas a tiempos de 4 horas, donde en
general las concentraciones de azúcares reductores y de glucosa son un poco mayores.
Un inconveniente que presentaba el equipo con que se Ilevó a cabo este ensayo, fue la imposible
manipulación de la temperatura, que resulta ser una variable muy importante en el estudio de este
proceso de hidrólisis térmica. En este punto del proyecto, se adquirió un reactor con una capacidad de 2
L, que permite trabajar a temperaturas mucho mayores, por lo que se decidió efectuar otras pruebas;
estas se centraron en determinar los efectos de la temperatura y tiempo de hidrólisis; mientras que se
fijaron los valores de pH en 1,5 y relación de sustrato en 12195 g de bagazo 1 g de agua, obtenidos de
las primeras pruebas.
Basándose en estudios realizados previamente por autores como Saeman[lgl, se escogieron las
temperaturas y tiempos de hidrólisis. Además esta segunda prueba se Ilevó a cabo tomando como base
un diseño factorial de 32, donde las temperaturas para las hidrólisis térmicas del bagazo de caña son
mucho mayores que las utilizadas en el primer ensayo, permitiendo de esta manera emplear tiempos de
hidrólisis inferiores. En el Cuadro 6.3 se muestran los resultados de esta segunda etapa de pruebas.
Cuadro 6.3 Promedio de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa, del segundo
estudio experimental, utilizando un reactor de 2 L. (Pruebas preliminares)
Concentración de Concentración de
Temperatura Tiempo de hidrólisis reductores
glucosa
Corridas T fh e e
'Jr 'Jg
("C) (min) (m@mL] (mglmL)
1 169,9 20 8,97 1,77
En esta segunda etapa para tiempos de hidrólisis de 20 minutos, se encuentra en términos generales,
que las concentraciones de azúcares reductores y de glucosa tienden a ser un poco mayores que las
CAP/TULO6 RESULTADOS Y DISCUSI~N 42
obtenidas a los otros tiempos. Además a la temperatura de 169,9"C aproximadamente, los valores de
estas concentraciones fueron los más altos al compararlos con los correspondientes, de las
temperaturas de 179,8 y 185,5 "C. Al igual que en el primer estudio experimental, los resultados del
análisis estadístico correspondiente a este segundo diseño factorias 32, no fueron muy confiables
puesto que indican que solo la temperatura de hidrólisis es significativa, dejando de lado la variable de
tiempo de hidrólisis. Esto último no queda claro al observar en conjunto los resultados, que muestran
claramente una marcada tendencia al diminuir los valores en las concentraciones de azúcares
reductores conforme aumenta el tiempo de hidrólisis.
Con estas pruebas se encontró evidencia que explica un poco el comportamiento de este tipo de
sustrato ante la hidrólisis térmica. Las concentraciones de azúcares reductores disminuyen, conforme el
tiempo y la temperatura de hidrólisis aumentan. Si la exposición del producto de hidrólisis es mayor
puede presentarse reacciones de reversión o polimerización. Lo anterior se ve reflejado en la
disminución de los valores de las concentraciones a tiempos mayores de 40 minutos y temperaturas de
179,8 "C.
Al comparar los resultados, mostrados en el Cuadro 6.3, con los correspondientes de las corridas
efectuadas en el autoclave a la presión fija de 138 kPa (20 psig), una temperatura de 126 "C y tiempos
de 3 y 4 horas, se encuentra que las concentraciones de azúcares reductores y de glucosa fueron
mucho mayores. Dicha diferencia se le puede atribuir al empleo de una temperatura de hidrólisis inferior
en el autoclave; que no es crítica aun cuando se utilizan mayores tiempos que no causaron reacciones
reversible o de polimerización.
Con el objetivo de estimar cuáles serian los resultados de la etapa de fermentación, en esta clase de
sustratos hidrolizados térmicamente, se procedió a hacer dos tipos de sondeos, los cuales se examinan
a continuación.
Los resultados obtenidos al fermentar durante 40 horas los hidrolizados, se muestran en los Cuadros
6.4 y 6.5. Las pruebas experimentales se efectuaron bajo los mismos tiempos de hidrólisis de 10
minutos y temperaturas de 180 "C. Las corridas del Cuadro 6.4 se prepararon para la etapa de hidrólisis
a un pH de 1,2 y se utilizaron dos tipos de levaduras, la panificadora y la productora de alcohol (Cepa
CAPITULO
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 43
Sacharomyces Cerevisiae), obviamente con esta Última se obtienen mejores resultados. Debe
puntualizarse que para todas las corridas, la cantidad de azúcar reductor consumido es muy poca, al
igual que la concentración de alcohol producido en comparación con la cantidad de azucares reductores
disponibles para producir etanol por medio de la fermentación. No se tienen suficientes datos para
concluir al respecto; sin embargo entre algunas causas posibles para este comportamiento se pueden
mencionar, la presencia de sustancias inhibidoras propias de este tipo de mecanismo, o que no todos
los azucares reductores son fermentables[161.
Hidrólisis a un pH de 2,00
1 y fermentación con 9,03 7,33 18,83 7,65
levadura panificadora
Hidrólisis a un pH de 3,00
2 y fermentación con 1,32 0,63 57,27 O
levadura panificadora
+ Se refiere a la concentración de azúcares reductores producidos en la etapa de la hidrólisis termica.
+k
Se refiere a la concentración de azúcares reductores despues de efectuarse la fermentación alcohólica (que tuvo una duranción de 40
horas).
Según lo recomendado por autores como Saeman, el tiempo para un proceso de prehidrólisis es de 3
minutos a una temperatura de 190 "C; pero al no contarse con un equipo capaz de efectuar este
procedimiento, se vio la necesidad de practicar ciertos cambios. El diseno del reactor utilizado no
permitía trabajar a tiempos tan cortos, por lo tanto, para compensar este hecho, se redujo la
temperatura de prehidrólisis y por consiguiente la presión. La temperatura elegida se logró despues de
varios ensayos, en los cuales, se tuvo especial cuidado con la materia prima, para que no perdiera sus
propiedades; esto se logró al controlar que su apariencia (color y textura), no cambiara mucho con
respecto a su forma original. Además, después de la filtración del sólido, se procedió a lavarlo y secarlo
adecuadamente, listo para proceder con su hidrólisis.
La temperatura de prehidrólisis fue de 153,2 "C, siendo la presión de 662 kPa (96 psig); por otro lado el
tiempo que el equipo tardaba en llegar a este valor era aproximadamente 24 minutos.
Cuadro 6.6 Promedio de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa, producidos en la
etapa de prehidrólisis.
Concentración de azúcares reductores Concentración de glucosa
En el cuadro 6.6 se presentan las concentraciones promedio, 2,21 mglmL de azúcares reductores y
0,49 mglmL de glucosa producidas en esta etapa preliminar. A pesar que esta cantidad de glucosa
pudo utilizarse en la etapa de fermentación, se sabe que junto con este azúcar fermentable se produce
otro tipo de azúcares como la xilosa, que puede producir furfural, que resulta ser una sustancia
inhibitoria para las levaduras, razón por lo que el liquido se descarta por
CAP~TULO6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
El estudio de la hidrólisis térmica del bagazo de la caña de azúcar se realizó con el fin de evaluar el
comportamiento de este material lignocelulósico ante el proceso de hidrólisis térmica. Los niveles
escogidos de las variables de temperatura y tiempo de hidrólisis, se establecieron con base en la
teoria[l6'l91y en las experimentaciones preliminares; de donde se sabe que a temperaturas y tiempos
mayores a 190 "C y 40 min, respectivamente, se presenta una disminución en la concentración de los
azúcares reductores. El hidrolizado también presentó una pigmentación negra, producto de reacciones
secundarias que se llevan a cabo.
Para lograr una visión más completa de este estudio, se determinó efectuar todas las etapas
experimentales de principio a fin, para cada una de las corridas, en los erlenmeyers de 250 mL,
iniciando con la prehidrólisis del bagazo, luego hidrolizándolo térmicamente, seguido por la
fermentación, filtración y destilación.
En las Figuras 6.1 y 6.2 se presentan, respectivamente, las concentraciones de azúcares reductores y
de glucosa en mglmL, con respecto al tiempo de hidrólisis, producidos al hidrolizar térmicamente el
bagazo de caña, para cada una de las corridas a las temperaturas de hidrólisis de 170, 180 y 190 "C.
Las concentraciones máximas de azúcar reductor se tienen a los 15, 10 y 5 minutos a las temperaturas
de 170, 180 y 190 "C respectivamente. Paralelamente al examinar la Figura 6.2, se tiene que a estas
mismas condiciones de temperatura y tiempo, las concentraciones de glucosa son las mayores.
Los valores mayores de las concentraciones se presentan a la temperatura de 170 "C, mientras que a
190 "C se dan los valores menores. Las diferencias en los resultados de las concentraciones
producidas entre las temperaturas de 170 "C y 190 "C, van desde los 2 mglmL aproximadamente, para
el caso de las corridas a 10 minutos de hidrólisis, hasta 6 mglmL a tiempos de 30 minutos. Es decir, que
conforme se incrementan los tiempos de hidrólisis, estas diferencias son más grandes. La causa más
fiable ante este comportamiento como se ha mencionado en trabajos previosllgl, es que después de
cierto tiempo y temperatura en el hidrolizado que contiene azúcares, ocurren reacciones de reversión o
polimerización.
En la Figura 6.2 se observa que las concentraciones de glucosa son muy bajas e incluso inferiores a 2
mglmL, lo que constituye un problema al presentarse una represión catabólica, originando que el
metabolismo de la levadura cambie del proceso anaeróbico, al aeróbico[9], cuyas condiciones son
la producción de etanol.
Los resultados hasta aquí considerados muestran que el ámbito del tiempo de hidrólisis se encuentra
entre los 5 y 15 minutos. Para saber exactamente cuál puede ser este valor, así como también la
temperatura de hidrólisis más conveniente, se prosiguió con el análisis de las corridas de fermentación.
En el Cuadro 6.7 se muestran los valores de concentraciones de alcohol producidas y los porcentajes
de azúcares reductores consumidos durante la etapa de fermentación, de los sustratos del bagazo de
caña, prehidrolizados e hidrolizados térmicamente a temperaturas de 170, 180 y 190 "C, para tiempos
de hidrólisis entre 5 y 40 min. Dichos porcentajes de azúcarares consumidos, presentaron una
tendencia a aumentar, conforme lo hacían los tiempos de hidrólisis.
En cuanto a las temperaturas de hidrólisis, se pude decir que los hidrolizados a 170 "C, fueron los que
consumieron más azúcares en la fermentación, al compararlos con los resultados de las otras
temperaturas. Lo ocurrido se justifica, tomando como base los estudios de trabajos previos[l6], en donde
se menciona que así como las temperaturas altas favorecen los procesos de hidrólisis, también los
pueden perjudicar, causando una descomposición parcial o total del material por hidrolizar,
disminuyendo los azúcares utilizables.
En estos resultados, no se observa relación entre las concentraciones de etanol producidas y los
azúcares reductores consumidos, debido a que los mayores porcentajes de estos azúcares
consumidos, no fueron los que dieron origen a las producciones máximas de etanol. l a explicación se
CAPITULO
6 RESULTADOS Y DISCUSI~N 49
basa en que dichos azúcares, no solo se utilizan en el proceso de fermentación para producir etanol,
sino también masa celular^^. Por lo tanto se deduce que para algunas corridas de fermentación, los
azúcares reductores se utilizaron principalmente en la producción de masa celular. Lo anterior se
evidencia en los resultados de la fermentación del hidrolizado a 170 "C y 40 min, en donde no se
produjo etanol, a pesar de ser la corrida en la que se consumieron más azúcares. Otro ejemplo de este
comportamiento, lo desempeña la fermentación del hidrolizado a 190 "C y 30 min, de donde se obtuvo
la menor concentración de alcohol.
Es importante recordar, que muchos de los azúcares reductores no son fermentables[lgl; razón por la
que generalmente en todas las corridas se consumieron muy pocos. Es probable, aunque no se haya
comprobado, que en el proceso de la hidrólisis, los rompimientos de las cadenas de celulosa a unidades
simples de glucosa, se efectuaran parcialmente, manteniéndose la unión de varias unidades de
glucosa; no obstante sus extremos se convirtieron en terminales reductoras, imposibles de fermentar y
de esta forma disminuyó la posibilidad de obtenerse una cantidad mayor de etanol. Para estudios
posteriores, se sugiere analizar la constitución tanto de los hidrolizados como los destilados y
determinar de forma más precisa cuán eficiente es el proceso de hidrólisis térmica del bagazo de caña
de azúcar para la obtención de etanol vía fermentativa.
Cuadro 6.7 Resultados sobre los porcentajes de azúcares reductores consumidos durante la
fermentación y las concentraciones de alcoholes producidas en las corridas a 170, 180 y
190 "C.
-.
Tiempo de
Temperatura de hidrólisis
Hidrólisis .r
Ih
th
(min) Vc)
170 "C
180 "C 190 "C
Porcentaje Porcentaje Porcentaje
de azucares Concentración de de azucares Concentración de azúcares Concentración
reductores etanol reductores de etanol reductores de etanol
consumidos CA consumidos CA consumidos CA
CAPITULO
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN So
En el Cuadro 6.7 además se observa que la producción de alcohol llega a un máximo, para la
fermentación de los hidrolizados a tiempos de 15 minutos y temperaturas de 180 y 190 "C; mientras que
para el caso de los hidrolizados a 170 "C, el tiempo de hidrólisis, al que se obtuvo mayor concentración
fue a 20 minutos. De la disminución en las concentraciones de alcohol, que presentan la fermentación
de los hidrolizados a tiempos de hidrólisis superiores a los 15 y 20 minutos, se deduce que ante
periodos más prolongados de la hidrólisis térmica, los azúcares fermentables disponibles se fueron
reduciendo, debido a una descomposición prematura.
. . - -.
+ J e m peratura 170°C
i. -+=Temperatura 180°C
-Temperatura 190°C.
O 5 1O 15 20 25 30 35 40
Tiempo de hidrólisis, k (rnin)
Figura 6.3 Comparación de las concentraciones de alcohol producidas en la etapa de
fermentación, por los hidrolizados, a los diferentes tiempos y temperaturas de hidrólisis en
estudio.
mientras que las del bagazo no pasaron del 0,56 mglmL*h. De esta diferencia, se puede decir, que el
bagazo a las condiciones utilizadas no resultó ser una materia prima superior al banano, en cuanto a su
utilización para la producción de etanol.
Cuadro 6.8 Datos de las productividades de etanol para las tres temperaturas de hidrdlisis escogidas.
Productividad de etanol a Productividad de etanol a Productividad de etanol a
Tiempo
Ih
170°C 180°C 190°C
D D D
(min)
(mglmL*h) (mglmL*h) (mglmL*h)
5 0,27 0,28 0,38
La fermentación a mayor escala se hizo por duplicado, en un reactor con una capacidad de 5 L;
utilizándose un volumen de 2,5 L para cada corrida. Para obtener la cantidad necesaria de hidrolizado,
fue necesario llevar a cabo varias corridas, preparadas bajo las mismas condiciones de hidrólisis:
temperaturas de 190 "C a tiempos de 15 minutos.
La Figura 6.4 presenta el comportamiento con respecto al tiempo de la primera corrida de fermentación,
en cuanto a la producción de etanol y consumo de los azúcares reductores y glucosa. En la Figura 6.4a,
se muestra la disminución de los azúcares reductores durante el transcurso de la fermentación; al inicio
se tiene una concentración de azúcares reductores de 6,98 mglmL, para luego bajar a 6,75 mglrnL a las
5 horas. Los valores de estas concentraciones fueron disminuyendo lentamente, hasta que entre tas 26
y 32 horas se dio el mayor descenso, pasando de los 5,65 mglmL a 2,46 mglmL y durante este misno
tiempo, se obtuvo la concentración máxima de etanol. Al comparar las concentraciones de los azúcares
CAPITULO
6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 52
reductores con las concentraciones de glucosa, presentados en la Figura 6.4b, se observa que la curva
sigue una tendencia muy similar, ya que la glucosa es uno de los azúcares reductores obtenidos de la
etapa de hidrólisis, esta es la que se utiliza primero en los procesos de fermentación, sin embargo estos
no fueron consumidos en su totalidad.
O 5 10 15 20 25 30 35 40 O 5 10 15 20 25 30 35 40
T i m o de fermentación, tt (h) i k p o de femtación, tt (h)
Figura 6.5 Seguimiento de la concentración de oxígeno disuelto y de pH con respecto al tiempo para la
primera fermentación en el reactor de 5 L.
La segunda corrida de fermentación se realizó bajo las mismas condiciones que la primera. Los gráficos
de la Figura 6.6, muestran las tendencias con respecto al tiempo, de las concentraciones de azúcares
reductores (Figura 6.6a), la concentración de glucosa (Figura 6.6b) y la concentración de etanol (Figura
6.6~).En general los resultados obtenidos fueron muy similares a los de la primera fermentación; los
azúcares reductores y glucosa fueron disminuyendo conforme la fermentación se llevaba a cabo. Al
inicio, las concentraciones fueron de 6,90 mg/mL y 2,33 mg/mL para los azúcares reductores y glucosa,
respectivamente. Al compararse con los datos de la primera corrida, se tiene que fueron un poco más
bajos; esta diferencia se debió a que los hidrolizados utilizados provenían de
corridas de hidrólisis distintas, a pesar de que las condiciones en las que se llevaron a cabo dichas
hidrólisis fueron las mismas.
Figura 6 . 6 ~
Figura 6.6 Seguimiento cinbtico para la segunda corrida de fermentación en un reactor de 5 L
CAP~TULO6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 56
De estos resultados se puede decir que en la segunda corrida de fermentación, el proceso fue un poco
más acelerado que en la anterior, en el sentido de que se produjo la misma cantidad de etanol a
tiempos menores de fermentación, a pesar de que la cantidad utilizada, tanto de los azúcares
reductores como de glucosa, fueron inferiores. En el Cuadro 6.9 los resultados mostrados evidencian
este proceder, en donde para la primera corrida de fermentación a las 32 horas, se produjeron 22,55
mglmL de etanol con una productividad de alcohol de 0,70 mglmL*h, mientras que esta concentración
se alcanzó en la segunda a las 28 horas para una productividad de alcohol correspondiente de 0,81
mglmL*h.
La razón del comportamiento anterior, podría estar sujeto a que la fermentación se llevó a cabo bajo un
medio más anaerobio, por lo que el metabolismo fue mucho más acelerado[131. No obstante, al final del
proceso, los porcentajes de azúcares reductores y glucosa consumidos fueron de 39,88 % y 12,43 %,
que representan aproximadamente la mitad de los utilizados en la primera fermentación. De esta
información se puede deducir, que en la segunda corrida de fermentación se efectuó un mejor
aprovechamiento de los azúcares reductores disponibles.
Durante el tiempo en que la concentración de alcohol permaneció constante en 15,IO mglmL, desde las
3 hasta las 26 horas, se siguieron consumiendo azúcares, lo que es razonable considerar que ellos se
utilizan para los procesos metabólicos de la levadura. Un factor que pudo afectar los resultados de
ambas fermentaciones en el reactor de 5 L, al igual que las llevadas a cabo en los erlenmeyers de 250
mL, fue la presencia de sustancias inhibidoras, provenientes de todo el proceso de hidrólisis térmica[l91,
entre las que se tienen al metano1 y el furfural, la presencia de este último se evidencia por la coloración
intensa adquirida por el sustrato fermentado. Por otro lado los azúcares no fermentables, al
descomponerse pueden causar algún tipo de envenenamiento del sustrato, debido a la formación de
productos de condensación, que traen como consecuencia una inhibición en el crecimiento de los
microorganismos durante la etapa de fermentación.
En la Figura 6.7 se tienen las gráficas de las concentraciones de oxígeno disuelto y de pH con respecto
al tiempo de fermentación, cuyas tendencias fueron muy parecidas a las presentadas en la primera
CAP~TULO6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
corrida de fermentación. El período en el que el oxígeno disminuye, se sabe que ocurre porque las
levaduras lo consumen junto con el azúcar para metabolizarlo. Al respecto es importante mencionar que
durante todo el proceso de fermentación se presentó una espuma muy densa sobre la superficie del
sustrato, dificultando una oxigenación adecuada y homogénea.
O 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo de fermentación, tr(h) Tiempo de fermentación, tf (h)
- .- - l -. . -. .
- . - . .
Para esta segunda corrida de fermentación el pH disminuyó un poco más que en la primera, pero al
igual que en ese caso, dichos valores no se encuentran fuera de los límites, que pudiesen afectar
negativamente el proceso de la fermentacion alcohólica.
Si se comparan estos resultados con los obtenidos de la corrida llevada a cabo a una temperatura y
tiempo de hidrólisis respectivamente de 190 "C y 15 min, fermentada posteriormente bajo las
condiciones estipuladas en la metodología experimental, se tiene que la concentración de etanol
alcanzada a las 40 horas de fermentacion fue de 18,86 mglmL, mientras que en las dos corridas
efectuadas en el reactor de 5 L fueron de 22,55 mglmL de etanol a las 32 h para la primera corrida de
fermentación y a las 28 h para la segunda corrida. De lo anterior se puede decir que al aumentar de
escala no se presentaron efectos negativos.
CAPITULO
SIETE
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
7.1 CONCLUSIONES
De las pruebas preliminares sobre la hidrólisis térmica del bagazo de caña de azúcar, se concluye lo
siguiente:
P Las corridas donde se obtuvieron las concentraciones de azúcares reductores y concentraciones
de glucosa mayores fueron las efectuadas en el autoclave a tiempos de hidrólisis de 4 horas.
P Los valores de pH, donde la hidrólisis térmica presenta un mejor desempeño, fueron alrededor de
1,5.
P La relación de 12 g bagazo 195 g de agua produjo los valores más altos de las concentraciones de
azúcares reductores y glucosa.
P Para tiempos de hidrólisis mayores a 40 minutos se origina una disminución en la concentración de
los azúcares reductores.
P Las mayores concentraciones de azúcares reductores y concentraciones de glucosa se obtuvieron
a una temperatura de hidrólisis de 170°C.
De las corridas de las fermentaciones efectuadas en erlenmeyers de 250 mL, se concluye que:
P A una temperatura de hidrólisis de 190°C, se tiene en forma general, que fueron mayores las
concentraciones de etanol después de la fermentación. Además esto se comprobó al calcular las
productividades de alcohol, las que para esta temperatura resultaron las más altas.
P Las fermentaciones de todas las corridas, bajo las condiciones de hidrólisis, no fueron muy buenas
para los hidrolizados a un tiempo superior a 20 minutos.
P El tiempo de hidrólisis en el que obtuvieron las concentraciones de alcohol superiores resultaron ser
de 15 minutos, para las corridas efectuadas a temperaturas de hidrólisis de 180 y 190°C.
P La concentración de etanol que se obtuvo fermentando en un erlenmeyer de 250 mL, el hidrolizado
a las condiciones de 190 OC y 15 minutos, fue de 18,86 mg/mL a las 40 horas de haberse iniciado el
proceso de fermentación
P Las dos corridas efectuadas en el reactor de 5 L fueron de 22,55 mg/mL de etanol a las 32 h para la
primera corrida de fermentación y a las 28 horas para la segunda corrida; el aumento de escala no
presentó efectos negativos.
P La máxima concentración de etanol producida a lo largo de las dos tantas de fermentación fue de
22,55 mglmL.
7.2 RECOMENDACIONES
9 Incluir como variable de diseño en el estudio de la hidrólisis térmica, el tamaño de partícula del
bagazo de la caña de azúcar.
9 Efectuar la hidrólisis térmica en un reactor con un sistema de percolación en serie, en donde el
líquido hidrolizado fluya más facilmente, minimizándose la degración del mismo.
9 Llevar a cabo la etapa de fermentación con otra levadura capaz de fermentar tanto pentosas como
la xilosa, como lo es la Pichia stipitis y así comparar los resultados obtenidos con los de la
Sacharomyce cerevisiae.
9 Eliminación de sustancias inhibidoras que corresponden a productos secundarios del proceso de
hidrólisis, sometiéndolas a presiones de aproximadamente de 2 atm, para que estos compuestos se
vaporicen[l7].
9 La lignina proveniente del bagazo, se obtiene al filtrar el hidrolizado y queda en el papel del filtro. A
esta se le puede retirar todo el ácido que aún lleva impregnado y emplearse en formulaciones de
adhesivos y lubricantes.
9 Analizar la composición tanto de los hidrolizados como los destilados y determinar de forma más
precisa cuán eficiente es el proceso de hidrólisis térmica del bagazo de caña de azúcar para la
obtención de etanol vía fermentativa.
9 Debido a los resultados obtenidos sería bueno plantearse la posibilidad de efectuar una hidrólisis
enzimática en lugar de la térmica, realizada en este proyecto, para lograr comparar tanto la
eficiencia, como la cantidad de alcohol producido al final del proceso.
1. REFERENCIAS
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aumento en la capacidad de producción, Proyecto de Graduación, Licenciatura en Ingeniería
Química, Universidad de Costa Rica, San José, 1996.
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1993.
7. Cunniff, P., Official Methods of Analvsis of AOAC lnternational Volume 1 and 11, Décima sexta
edición, AOAC, Arlington, Virginia, USA, 1995.
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University of Washington, U.S.A., 1971.
10. Elizondo, G., Estudio de prefactibilidad para autosatisfacer las necesidades de energía eléctrica,
Proyecto de Graduación, Licenciatura en Ingeniería Química, Universidad de Costa Rica,
San José, 1988.
11. González R.G., Obtención de alcohol a partir de desechos de madera, Proyecto de Graduación,
Licenciatura en Ingeniería Química, Universidad de Costa Rica, San José, 1985.
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13. Lehninger, A,, Curso breve de bioquímica, Omega. Barcelona, España, 1976.
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sustratos diferentes preparados a partir de banano maduro, Proyecto de Graduación,
Licenciatura en Ingeniería Química, Universidad de Costa Rica, San José, 1998.
15. Meade, G., Manual del azúcar de caña. Novena edición. Montanes y Simon, S.A. Barcelona,
España, 1967.
18. Quesada, R.A., Análísís enerqético de un Ingenio Azucarero en Costa Rica, Proyecto de
Graduación, Licenciatura en Ingeniería Química, Universidad de Costa Rica, San José,
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19. Quintero, R., Inqeniería Bioquímica, Tercera edición, Editorial Alhambra Mexicana, S.A. México,
1993.
20. Robello, J., Caracterización del bagazo como fuente para producir enerqia electrica, Proyecto de
Graduación, Licenciatura en Ingeniería Química, Universidad de Costa Rica, San José,
1989.
21. Sadermann, H,W., Las industrias químicas de la madera v economía de estas industrias en América
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22. Scragg, A., Biotecnoloqía para lnqenieros en Sistemas Biolócricos en Procesos Tecnolócricos,
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Madrid: Junta de Energía Nuclear, España, 1983.
25. Vong Tsoi, A.M., Estudio de la producción de etanol mediante la fermentación de tres susfrafos
diferentes obtenidos a partir del banano, Proyecto de Graduación, Licenciatura en Ingeniería
Química, Universidad de Costa Rica, San José, 1996.
26. Ward Owen, P., Biotecnolo~íade la fermentación: principios, procesos v productos, Zaragoza:
Acribia, España, 1989.
Subíndices
A: Se refiere al etanol
H: Se refiere a la humedad
N: Se refiere al crisol mas muestra
P: Se refiere a la cápsula de porcelana
c: Se refiere al crisol
d: Se refiere a azúcares consumidos
f: Se refiere a la fermentación
g: Se refiere a la glucosa
h: Se refiere a la hidrólisis
i: Se refiere a la cápsula de porcelana más la muestra sin tratar
P: Se refiere a la solución patrón
q: Se refiere a muestra calcinada
r: Se refiere a los azúcares reductores
S: Se refiere a los sólidos
t: Se refiere a la cápsula de porcelana más la muestra tratata
u: Se refiere a la glucosa consumida
z: Se refiere a las cenizas
Superíndices
20: Se refiere a ese valor de temperatura en "C
DATOS EXPERIMENTALES
A.1 DATOS PARA LA CARACTERIZACIÓNDEL BAGAZO
Cuadro A.1.2 Datos para la determinación del contenido de cenizas en el bagazo seco.
Masa crisol Masa crisol con muestra Masa crisol calcinado
Corrida WC WN wq
Cuadro A.2.1 Datos para las curvas de calibración utilizadas en la determinación de azúcares
reductores en las pruebas preliminares.
Concentración de azúcar reductor Volumen Absorbancia*
Cr V Ar
(mglmL) (mL) (adim)
o o o
0,035 7 1,047
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
APÉNDICE A DATOS EXPERIMENTALES 66
Cuadro A.2.2 Datos de las absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y
glucosa, de las corridas del diseño experimental 23".
Absorbancia* para los azúcares
Absorbancia* para la glucosa
reductores
Corridas
Ar Ag
(adim)
(adim)
1 0,642 0,544
1* 0,636 0,544
2 0,687 0,546
2* 0,684 0,563
3 0,418 0,146
3* 0,406 0,165
4 0,396 0,147
4* 0,418 0,164
5 0,659 0,659
5* 0,677 0,723
6 0,743 0,746
6* 0,755 0,730
7 0,570 0,324
7* 0,554 0,320
8 0,607 0,364
8* 0,638 0,346
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
* Se refiere a los valores de la rbplica.
" En autoclave a presión de 138 kPa.
Cuadro A.2.3 Datos de las absorbancias para la determinación de azúcares reductores y glucosa, de
las corridas del diseño experimental 32, utilizando un reactor de 2 L.
Abs.* para los Abs.* para la Abs.+ para los Abs.+ para la
azúc. glucosa azúc. reductores glucosa
Corridas reductores Ag Corridas Ar Ag
Ar (adim) (adim) (adim)
(adim)
1 0,290
5* 0,206 0,403
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
* Se refiere a los valores de la rbplica.
APÉNDICE A DATOS EXPERIMENTALES 67
Cuadro A.3.1 Datos de las absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y de
glucosa, de los sustratos prehidrolizados, para ser hidrolizados posteriormente a tres
diferentes temperaturas.
Absorbanciat para la glucosa Absorbanciat para los azúcares reductores
Tanda de
prehidrólisis Ag Ar
(adim) (adim)
1 0,261 0,087
0,035 7 1,116
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
Cuadro A.4.2 Datos de las absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y
glucosa, de las corridas a una temperatura de hidrólisis de 170 "C, utilizando un reactor
de 2 L.
Tiempo de hidrólisls Absorbanciat para la glucosa Absorbanciat para los azúcares reductores
th & A,
(min) (adnm) (adlm)
5 0,451 0,208
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
APÉNDICE A DATOS EXPERIMENTALES 68
Cuadro A.4.2 Datos de las absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y
glucosa, de las corridas a una temperatura de hidrólisis de 170 "C, utilizando un reactor
de 2 L. (Continuación)
Tiempo de hidrólisis Absorbanciat para la glucosa Absorbancia' para los azúcares reductores
th A4 A,
(min) (adim) (adim)
1O 0,659 0,237
15 0,729 O,284
20 0,611 0,267
30 0,599 0,240
40 0,381 0,223
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
Cuadro A.4.3 Datos de las absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y
glucosa, de las corridas a una temperatura de hidrólisis de 180 "C, utilizando un reactor
- - - -.
5 0,588 0,269
1O 0,720 0,286
15 0,476 0,246
25 O,345 0,170
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
Cuadro A.4.4 Datos de las absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y
glucosa, de las corridas a una temperatura de hidrólisis de 190 "C, utilizando un reactor
de 2 L.
Tiempo de Absorbanciat para la glucosa Absorbanciat para los azúcares reductores
hidrólisis
th Ag A,
(adim) (adim)
(min)
5 0,643 0,204
1O 0,412 0,167
15 0,323 0,163
20 0,337 O, 132
30 0,175 0,074
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
APÉNDICE A DATOS EXPERIMENTALES 69
Cuadro A.5.1 Datos para la curva de calibración utilizada en la determinación del porcentaje de etanol,
de las corridas experimentales provenientes de sustratos hidrolizados a 170 "C.
Porcentaje de etanol índice de refracción
E n20
~IOVIV) (adim)
O 1,333
Cuadro A.5.2 Datos para la curva de calibración utilizada en la determinación del porcentaje de etanol,
de las corridas experimentales provenientes de sustratos hidrolizados a 180 "C, 190 "C y
las dos corridas en el reactor de 5 L. ,-
Porcentaje de alcohol lndice de refracción
E n20
phvlv). (adim)
O 1,332
2 1,333
3 1,333 50
5 1,334 75
8 1,336 50
- 1O 1,337 O
40 O, 126 1,333
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
APÉNDICE A DATOS EXPERIMENTALES 70
25 O, 184 1,332 50
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
30 0,066 1,332 25
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
Cuadro A.6.1 Datos de las absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y
glucosa, además se muestran los valores de índices de refracción para calcular los
porcentaies de etanol producidos; a diferentes tiempos de fermentación de la primera
corrida en el reactor de'5 L.
Tiempo de Absorbanciat para los Absorbanciat para la índice de refracción
fermentación azúcares reductores glucosa n20
11--
tf Ar Ag (adim)
(h) (adim) (adim)
O 0,226 0,989 1,332 25
Cuadro A.6.3 Absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y glucosa, además
se muestran los valores de índices de refracción para calcular los porcentajes de etanol
producidos; a diferentes tiempos de fermentación de la segunda corrida en el reactor de 5
L.
Tiempo de Absorbancia* para los Absorbancia* para la índicede refracción
fermentación azúcares reductores glucosa
n20
tf Ar Ag
(adim)
(h) (adim) (adim)
O 0,224 0,949 1,332 25
3 0,216 0,919 1,333
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
APÉNDICE A DATOS EXPERIMENTALES 72
Cuadro A.6.3 Absorbancias utilizadas para la determinación de azúcares reductores y glucosa, además
se muestran los valores de índices de refracción para calcular los porcentajes de etanol
producidos; a diferentes tiempos de fermentación de la segunda corrida en el reactor de 5
L. (Continuación)
Tiempo de Absorbanciat para los Absorbanciat para la indica de refraccid,,
fermentación azúcares reductores glucosa
n20
tf Ar Ag
(adim)
(h) (adim) (adim)
6 0,180 0,869 1,333
9 0,168 0,859 1,333
11 O, 165 0,843 1,333
24 O, 147 0,836 1,333
26 0,147 0,835 1,333
28 O, 132 0,831 1,333 5
31 0,121 0,793 1,333 5
35 0,130 0,800 1,333 5
+Las absorbacias se midieron a 500 nm
Cuadro 6.2.2 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa,
de todas las corridas del diseño experimental 23, utilizando un autoclave.
Conc. de azúc. Conc. de Conc. de azúc. Conc. de
reductores glucosa Corridas reductores glucosa
Corridas
Cr Cg Cr Cg
(mglmL) (mglmL) (mglmL) (mglmL)
1 25,13 1,34 5 25,81 1,62
Cuadro 8.2.3 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa,
~ ~
5* 7,20 0193
* Se refiere a los valores de la rbplica.
8.3 RESULTADOS INTERMEDIOS DE LA ETAPA DE PREHIDRÓLISIS TÉRMICA DE LOS
SUSTRATOS DE BAGAZO DE CARA.
Cuadro B.3.1 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa,
de los sustratos prehidrolizados, para hidrolizarlos posteriormente a tres diferentes
temperaturas.
Conc. de glucosa Conc. de azúc. reductores
Tanda de
prehidrólisis cg Cr
(mglmL) (mgímL)
1' o64 1,57
2" o,% 4,06
3"' 0,45 1,68
4"' 0,44 1,88
5" o# 1,88
* Sustratos prehidrolizados que se utilizaron posteriormenteen las corridas de hidróliis a 170 "C
" Sustratos prehidroliizados que se utilizaron posteriormenteen las comdas de hidrólsis a 180 "C
m
Sustratos prehidrolizados que se utilizaron postehamente en las cmidas de hidrólisi a 190 "C
Cuadro 8.4.2 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa,
de todas las corridas a temperaturas de hidrólisis de 170 'C, utilizando un reactor?e 2 L.
Tiempo de
Conc. de glucosa Conc. de azúc. reductores
hidrólisis
T. cg Cr
lh
(mglrn~) (mglmL)
(min)
5 1,25 6,28
Cuadro 8.4.3 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa,
de todas las corridas a temperaturas de hidrólisis de 180 "C, utilizando un reactor de 2 L.
Tiempo de
Conc. de glucosa Conc. de azúcares reductores
hidrólisis fi
Cr
lh
(mgh~) (mglmL)
(min)
5 1.63 9,73
Cuadro 8.4.4 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y glucosa,
de todas las corridas a temperaturas de hidrólisis de 190 'C, utilizando un reactor de 2 L.
Tiempo de
Conc. de glucosa Conc. de azúc. reductores
hidrólisis
Th Cg Cr
(min) (mglmL) (mglmL)
5 1,77 6,89
APÉNDICE B RESULTADOS INTERMEDIOS 77
Cuadro B.5.1 Ecuación de la curva de calibración para la determinación de los porcentajes de etanol,
de las corridas experimentales provenientes de sustratos hidrolizados a 170 "C.
Coeficiente de
Pendiente
Intercepto correlación
Figura Datos de origen a b
R2
(%vlv) (adim)
(adim)
B.4.1 Cuadro A.4.1, columnas 1 y 2 1 859,73 -2 478,12 0,984
Cuadro B.5.2 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y etanol,
producidas en las fermentaciones de 40 horas, de todas las corridas provenientes de
sustratos hidrolizados a temperaturas de hidrólisis de 170 "C.
Tiempo de Conc. de azúc. Porcentaje de etanol Conc. de etanol
hidrólisis reductores PA CA
fh cr (%v/v) (mglmL)
(min) (mglmL)
5 6,23 1,37 10,81
APÉNDICE B RESULTADOS INTERMEDIOS 78
Figura 8.5.2 Curva de calibración para la determinación de los porcentajes de etanol, de las
corridas experimentales provenientes de sustratos hidrolizados a 180 "C, 190 "C y las
dos corridas en el reactor de 5 L.
Cuadro B.5.3 Ecuación de la curva de calibración para la determinación de los porcentajes de etanol,
de las corridas experimentales provenientes de sustratos hidrolizados a 180 "C, 190 "C y
las dos corridas en el reactor de 5 L.
Coeficiente de
Pendiente Intercepto
correlación
Figura Datos de origen a b
R*
(%vlv) (adim)
(adim)
B.4.2 Cuadro A.4.2, columnas 1 y 2 1 889,53 -2 516,83 0,996
Cuadro 8.5.4 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y etanol,
producidas en las fermentaciones de 40 horas, de todas las corridas provenientes de
sustratos hidrolizados a temperaturas de hidrólisis de 180 "C.
Tiempo de Conc. de azúc. Porcentaje de etanol Conc. de etanol
hidrólisis reductores PA CA
fh Cr (%v/v) (mglmL)
(min) (mglmL)
5 7,87 1,44 11,36
APENDICE B RESULTADOS INTERMEDIOS 79
Cuadro 0.5.5 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores y etanol,
producidas en las fermentaciones de 40 horas, de todas las corridas provenientes de
sustratos hidrolizados a temperaturas de hidrólisis de 190 "C.
Tiempo de Conc. de Porcentaje de etanol Conc. de etanol
hidrólisis azúc.reductores PA CA
fh Cr (%v/v) (mglmL)
(min) (mglmL)
5 6,12 1,91 15,07
1O 4,25 1,91 15,07
15 4,09 2,39 18,86
20 3,09 0,97 7,65
30 0.84 0.5 3.95
Cuadro 0.6.1 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores, glucosa y
etanol, a diferentes tiempos de fermentación de la primera corrida en el reactor de 5 L.
Tiempo de Conc. de Conc.de glucosa Porcentaje de Conc. de etanol
fermentación azuc.reductores co etanol cA
tf Cr (mglmL) PA (mglmL)
Cuadro 0.6.2 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores, glucosa y
etanol, a diferentes tiempos de fermentación de la segunda corrida en el reactor de 5 L.
Tiempo de Conc. de azúc. Conc. de glucosa Porcentaje de Conc. de etanol
fermentación reductores co etanol CA
tf Cr (mglmL) PA (mglmL)
(h) (mglmL) (%vlv)
O 6,90 2,33 0,OO
3 6,59 2,26 1,91 15,IO
6 5,19 2,14 1,91 15,IO
APÉNDICE B RESULTADOS INTERMEDIOS 80
Cuadro 8.6.2 Resultados de los cálculos de las concentraciones de los azúcares reductores, glucosa y
- corrida en el reactor de 5 L.
etanol, a diferentes tiempos de fermentación de la segunda
(Continuación)
Tiempo de Conc. de azúc. Conc. de glucosa Porcentaje de Conc. de etanol
fermentacibn reductores cg etanol CA
tf Cr (mglmL) PA (mglmL)
(h) (mglmL) (%vlv)
9 4,72 2,11 1,91 15,lO
11 4,60 2,07 1,91 15,lO
24 3,90 2,05 1,91 15,lO
26 3,90 2,05 1,91 15,lO
28 4,15 2,04 2,86 22,55
31 2,89 1,95 2,86 22,55
35 3,24 1,97 2,86 22,55
MUESTRA D E CÁLCULO
C.l CALCULO DE LA CONCENTRACIÓN DE GLUCOSA
El cálculo del contenido de glucosa en las muestras prehidrolizadas e hidrolizadas, se realiza mediante
la aplicación de la siguiente ecuación:
Sustituyendo en la relación anterior el dato del Cuadro A.3.1, columna 2, fila 2 para Agl un valor de f = 1,
un valor de Cp = 1 mglmL y un valor de Ap = 0,407 se tiene que:
Este valor corresponde al dato del Cuadro B.3.1, columna 2, fila 2. De igual forma se calculó la
concentración de glucosa de las otras muestras.
Sustituyendo en la ecuación C.2 el dato del Cuadro A.3.1, columna 3, fila 2 para A, con los valores de a
y b del Cuadro 8.4.1, columnas 3 y 4, fila 2; un valor de f = 1 406,25 para las determinaciones de los
azucares reductores después de la hidrólisis térmica y f = 1 250 para calcular los correspondientes de
las etapas de prehidrólisis y fermentación. Se tiene que:
Este valor corresponde al dato del Cuadro 8.3.1, columna 3, fila 2. De igual forma se calculó la
concentración de azúcares reductores de las otras muestras.
El cálculo del contenido de alcohol etílico, se realiza mediante la aplicación de la ecuación de la curva
de calibración para determinar el porcentaje de etanol en función del índice de refracción, que se
presenta a continuación:
P, = u n 20 - b (C.3)
Los parámetros de esta curva para obtener los porcentajes de etanol producidos para las corridas de
hidrólisis a 170 "C luego de sus fermentaciones, se muestran en el Cuadro 8.5.1, columnas 2 y 3, fila 2.
Mientras que los correspondientes para las restantes corridas se encuentran en el Cuadro 8.5.3,
columnas 2 y 3, fila 2.
Para el dato del índice de refracción del Cuadro A.5.3, columna 3, fila 2, al aplicar la ecuación C.3, se
obtiene que:
PA = (1 859,73). (1,333 25)- 2 478,12 = 1,37 % v l v
Este valor se encuentra en el Cuadro 8.5.2, columna 3, fila 2. De igual forma se calculó el porcentaje de
etanol de las otras muestras.
APÉNDICE C MUESTRA DE CALCULO 83
Sustituyendo en la ecuación C.4 el dato del Cuadro 8.5.2, columna 3, fila 2 para PA,se tiene que:
Este valor corresponde al dato del Cuadro 8.5.2, columna 4, fila 2. De igual forma se calculó la
concentración de etanol de las otras muestras.
El calculo del porcentaje de los azucares reductoes consumidos, se realiza mediante la aplicación de la
siguiente ecuación:
Para la determinación del porcentaje de azúcares reductores consumidos, se sustituye en esta fórmula,
los valores del Cuadro 8.4.2, columna 3, fila 2 y Cuadro 8.5.2, columna 2, fila 2, se tiene que:
Este valor corresponde al dato del Cuadro 6.7, columna 2, fila 4. De igual forma se calculó el porcentaje
de azucares reductores consumidos de las otras muestras.
AP~NDICEC MUESTRA DE CALCULO 84
Para la determinación de la productividad de etanol, se sustituye en esta fórmula, el valor del Cuadro
B.5.2, columna 4, fila 2, para un tiempo de fermentación de 40 horas, se tiene que:
Este valor corresponde al dato del Cuadro 6.8, columna 2, fila 2. De igual forma se calculó la
productividad de etanol de las otras muestras.
D.1 DETERMINACIÓN DE MUCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DE NELSON-SOMOGYI
D.1.2 Determinación
1. Deben correrse un blanco y una serie de patrones con cada serie de muestras desconocidas.
2. Ponga O, 1, 2, 3,4, 5,6 y 7 mL de la solución estándar si va a realizar la curva patrón, o 2 mL de la
solución prueba y 2 mL del reactivo de cobre en cada tubo. Agite bien en conjunto y tape los tubos.
3. Ponga el lote de tubos en un baño de agua en ebullición por 10 minutos y luego enfríe por 5
minutos en agua de cañería.
4. Añada 1 mL del reactivo de arsenomolibdato y después mezcle haciendo uso de un agitador de
tubos.
5. Diluya el contenido de los tubos a un volumen definido de 10 mL o 15 mL. Vuelva a mezclar.
6. Mida la absorbancia a 500 nm.
Notas
$ El color azul que se desarrolla es muy estable.
Q Las condiciones de calentamiento deben estandarizarse rígidamente y todos los tubos en una serie
deben ponerse en el baño de maría, removerse y enfriarse simultáneamente. El baño de maría en
ebullición debe calentarse de tal manera, que solamente deje hervir unos pocos segundos cuando
los tubos se introducen en él.
D.2.1 Fundamento
La glucosa oxidasa convierte la glucosa en ácido D-glucónico y peróxido de hidrógeno. La peroxidasa
cataliza la oxidación de la 4-aminofenazona y su subsecuente reacción con un fenol. El producto final
absorbe a 500 nm. La intensidad del color rosado es directamente proporcional a la concentración de
glucosa.
D.2.2 Reactivos
Reactivo de color de qlucosa
Glucosa oxidasa 15 kUIL, peroxidasa 1,2 kUIL, 4-AAP 1,O mM, p-hidroxibenzoato 15 mM,
estabilizadores y detergentes. El reactivo es estable hasta la fecha que aparece en la etiqueta. Al
utilizarlo, se debe mezclar suavemente para disolver porque la agitación fuerte puede desnaturalizar la
enzima. Se debe proteger de la luz y el reativo es estable por tres meses en refrigeración.
Solución estándar de qlucosa
Tomar 1 g de glucosa previamente secada a 110 "C por dos horas, disolver en agua destilada y aforar a
1 litro. De esta solución se toman 0, 10, 20, 30 y 40 mL y se aforan a 100 mL con agua destilada para
hacer la curva de calibración.
D.2.3 Determinación
1. Deben correrse un blanco y una serie de patrones con cada serie de muestras desconocidas.
2. Se colocan 3 mL del reactivo de color para glucosa en tubos etiquetados: blanco, patrones y
muestras.
3. Agregar 20 p L de agua destilada, patrones de glucosa y muestras a los tubos correspondientes.
Agite bien en conjunto y tape los tubos.
4. Ponga el lote de tubos en un baño de maría a 37 "C por 10 minutos.
5. Mida la absorbancia a 500 nm.
Notas
+ Los detergentes comerciales no iónicos causan una decoloración del producto final de la reacción.
Toda la cristalería lavarse bien con agua destilada antes de usarse.
+ La linealidad se mantiene hasta 500 mgldL, usando cubetas de 10 mm de paso de luz y un
espectrofotómetro digital.
+ La muestra debe leerse durante los 30 minutos siguientes al desarrollo del color.
D.3 DETERMINACI~NDEL PORCENTAJE DE ETANOL
El procedimiento consiste en filtrar el mosto fermentado, luego se toma una alícuota de 50 mL del
filtrado por medio de una pipeta para trasladarla a un balón de 100 mL, el cual se afora con agua
destilada. La destilación se realiza hasta obtener un volumen de 50 mL de destilado; luego se determina
el índice de refracción a una temperatura de 20 "C, utilizando un refractómetro. Se debe disponer de
una curva de calibración del índice de refracción, para disoluciones de etanol en agua hasta de un 10 %
vlv.