1 Curso: Biotecnología Molecular

TRANSCRIPTÓMICA: TECNOLOGÍA DE MICROARRAY

Con el desarrollo de la secuenciación automatizada de los genomas completos de un sin número de organismos, se dio un
paso adelante en el entendimiento de la genómica funcional. Sin embargo, no es hasta que se desarrolla la técnica de
microarreglos de ADN (conjunto ordenado de genes en una pequeña superficie (10,000 individuos por cm2)) que esta
información puede ser utilizada de forma práctica, permitiendo determinar simultáneamente si todos los genes de un
organismo se están expresando o no en una condición determinada, proporcionándonos un fenotipo molecular capaz de
crear nuevas clasificaciones que no son posibles con los métodos tradicionales.

Transcriptómica

La transcriptómica es el estudio del conjunto de ARNs presentes en un organismo o tipo celular. El transcriptoma es
dinámico, y responde en gran medida a las condiciones ambientales. En este conjunto de transcritos no solo se incluye el
ARNm, reflejando en consecuencia los genes están siendo expresados de forma activa, sino también otros tipos de ARN
con actividad estructural, catalítca y reguladora.
Tecnología de Microarray

Microarrays: (micromatrices o microarreglos) representan una herramienta esencial para los estudios de las ómicas, que
permiten los análisis cualitativo y cuantitativo, en forma simultánea, masiva y miniaturizada, de genes y/o productos
génicos. Consiste en un formato experimental, basado en la síntesis o fijación de sondas, que representan los genes (o
proteinas, o metabolitos), sobre un sustrato sólido (cristal, plástico, silice,...), y expuestos a las moléculas diana (la
muestra).
Principio / Fundamento

El principio básico es la "hibridación de

ácidos nucleicos". En este proceso, dos
cadenas complementarias de un ADN se
unen mediante enlaces de hidrógeno para
formar una molécula de doble trenzado.
En los estudios de microarrays se combinan
las técnicas de hibridización de ácidos
nucleicos y detección por fluorescencia. De
esta manera, sólo en los puntos del
portaobjeto donde haya ocurrido
hibridización habrá fluorescencia y la
intensidad de la fluorescencia detectada será
proporcional al nivel de expresión del gen en
estudio.
Una condición indispensable es que cada uno
de los genes que esté representado sea
fácilmente distinguible de otros. En otras
palabras la porción del gen inmovilizada en el
portaobjeto debe llevar consigo,
independientemente de su tamaño, su
cédula de identidad.

Tipos de microarray

1. Microarrays de ADN
2. Microarrays de proteínas: analizar las interacciones anticuerpo-antígeno, proteína-proteína, proteína-ácido
nucleico, proteína-lípido y proteína-molécula pequeña, así como las interacciones enzima-sustrato. Hay 3 tipos de
micromatrices en proteínas: analíticas, funcionales y de fase inversa.
3. Microarrays de expresión: cDNA, oligonucleótidos
4. Microarrays de tejidos: consisten en bloques de parafina en los que se ensamblan hasta 1000 núcleos de tejido
separados en forma de matriz para permitir el análisis histológico múltiple.

Msc. Raquel Sotomayor Parián

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5. Microarrays celulares (microarrays de transfección)

6. Microarrays de compuestos químicos
7. Microarrays de anticuerpos y matrices de carbohidratos (glycoarrays)

Microarray DNA-DNA

Son colecciones de moléculas de ADN inmovilizadas sobre un soporte en localizaciones conocidas, empleados para el
estudio de la secuencia de genes conocidas, empleados para el estudio de la secuencia de genes conocidos, o bien para
determinar los niveles de expresión genética de un tipo celular o tejido.
Microarray DNA-RNA

Son arreglos de muestras que contienen fragmentos de ADN pero que son marcados con el ARN de una población celular
con fluorescencia o radioactividad, y se usa esta preparación para hibridar con el ADN de la micromatriz. Su uso las hace
herramientas poderosas para estudiar el papel del pequeño ARN no codificante (miARN, snoRNA y scaRNA) en
enfermedades complejas
Aplicaciones

 Estudio de transcriptomas y proteomas

 Diagnóstico de enfermedades a través del estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias
condiciones – Sanos/enfermos, mutantes/nativos, tratados/no tratados
 Clasificación molecular en enfermedades complejas
 Identificación de genes característicos de una patología (firma o “signature”)
 Predicción de respuesta a un tratamiento
 Detección de mutaciones y polimorfismos de un único gen (SNP)
 Medición de los cambios en el nivel de expresión génica.
 Expresión génica de los ARNm de una célula determinada en diferentes momentos
 Descubrimiento y desarrollo de fármacos
Diseño experimental

Es uno de los pasos críticos del experimento. El diseño experimental es esencial para la consecución de los objetivos
planteados por el investigador. El diseño incluye entre otros aspectos la selección del tipo de marcaje, la selección de las

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muestras de referencia (muy importante en el caso de marcaje de dos colores), el tipo de extracción de la muestra, número
de replicados y tipo de replicación (técnica o biológica).
Deben tomarse decisiones relativas a aspectos diversos implicados en el experimento:
a) Origen de la muestra: En el caso de utilizar organismos complejos o partes de ellos, la variabilidad genética puede
ser un factor que interfiere con las observaciones. Por tal motivo es recomendable hacer conjuntos de muestras
de diferentes individuos.
b) Comparación entre muestras: Para el caso de un experimento con una condición control y un problema,
simplemente una de las muestras se marcará con un color y la otra con un color diferente para hibridizar el
microarreglo y poder observar las diferencias entre ellas. Si se tienen dos o más condiciones problema y un control,
digamos A, B y C se debe establecer un circuito donde todas las muestras se comparen contra todas. En ningún
caso se debe inferir que al comparar una condición con otra el resultado se pueda extrapolar a una tercera
condición.
c) Confiabilidad de los resultados: Existe una gran controversia en cuanto a este punto y aunque no se han hecho
estudios serios, se puede decir que en un experimento simple, la confiabilidad es alrededor del 70 a 75 %; esto
quiere decir que de un 25 a 30 % de los datos obtenidos son falsos positivos; una forma de reducirlos es realizar
un experimento complementario donde se inviertan los colores para cada una de las muestras, a este experimento
se le conoce como swap.
d) Limitaciones físicas (coste)
 Número de arrays necesarios/posibles
 Cantidad de material necesaria/disponible

Fabricación de chips

Para diseñar y fabricar un microarreglo. Se deben considerar los siguientes aspectos:

1. La construcción o adquisición de
la biblioteca genómica,
conformada por alícuotas de
ADN de cada uno de los genes
del modelo de interés, ya sea
como productos de PCR u
oligonucleótidos sintéticos.
2. El diseño y construcción de la
base de datos del microarreglo;
en donde se describirá la
localización física y la
descripción de cada uno de los
genes para su plena
identificación en el microarreglo
(esta información es
fundamental ya que será
utilizada para el análisis e
interpretación de los datos de
expresión génica obtenidos con
los experimentos).
Marcaje con fluorócromos

La detección de la hibridación entre las sondes de ADN inmovilizadas en el soporte y los fragmentos de material genético
de la muestra requiere un marcaje previo para su posterior detección. El método más utilizado para marcaje de sondas o
dianas son los fluoróforos Cy3 y Cy5 (cianinas)
El uso de fluoróforos permite analizar varias muestras en el mismo “array”, eliminando la variabilidad que se produce
cuando se comparan los resultados de la hibridación de diferentes “array”.

Msc. Raquel Sotomayor Parián

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A) Marcaje de dos colores, la muestra experimental se marca con el fluorocromo Cy-5, y la muestra de referencia o
control, se marca con el fluorocromo Cy-3, y se hibridan ambas muestras en el mismo microarray.

B) Marcaje de un color, en el que todas las muestras se marcan con el fluorocromo Cy-3, y se hibrida una muestra en
cada microarray, de forma que las muestras experimentales y control se hibridan por independiente.
Hibridación de los chips

Consta de tres pasos:

a) Tratamiento de la laminilla. Durante el proceso de impresión, las sondas se secan rápidamente sobre la superficie
de la laminilla lo que ocasiona irregularidades en el spot.

b) Preparación de las sondas marcadas: Para este paso, se deben tomar 15 picomoles de cada uno de los ADNc
previamente marcados y mezclarlos, agregar la solución de hibridización, ajustar el volumen con TE dependiendo
del tamaño del microarreglo, mezclar perfectamente y desnaturalizar a 94 °C durante 5 minutos.
c) Hibridización: Aplicar la mezcla al microarreglo, cubriendo la superficie con un cubreobjetos, colocar en la cámara
de hibridación e incubar a 42 °C por 18 horas. Después de este tiempo, lavar la laminilla a temperatura ambiente
hasta desprender el cubre objetos y hacer dos lavados mas para eliminar el ADNc marcado que no hibridizó.
Finalmente secar la laminilla por centrifugación a 1500 rpm por 5 minutos

Lectura y procesado de los chips

Una vez que las sondas de ADNc son co-hibridizadas sobre el microarreglo y que la laminilla se lava y seca, es necesario
obtener la imagen producida por la fluorescencia de los spots que fueron reconocidos por el ADNc marcado. Para detectar
dicha fluorescencia se necesita contar con un lector para microarreglos.

Cada microarray es escaneado con un láser que produce para cada tinte un mapa digital o imagen con intensidades de
fluorescencia para cada pixel. Un láser típico opera con las siguientes funciones: excitación, recolección de la luz emitida,
evaluaciones espaciales, discriminación entre excitación/emisión y detección.

La captación de la imagen depende del sistema utilizado y normalmente se realiza por el servicio de hibridación. Lo que va
a realizar es:
• Comprobar la hibridación
• Identificar los puntos
• Cuantificar la intensidad del punto
• Cuantificar el fondo del array
• Dar un valor de intensidad media para cada punto.

El procesamiento de las imágenes escaneadas de microarreglos pueden ser divididos en tres tareas:
 Grillado: es el proceso de asignación de coordenadas a cada uno de los spots
 Segmentación: clasificación de los pixeles en foreground (señal) y background (fondo)
 Extracción de la intensidad: calcular para cada spot del arreglo los pares de intensidades de fluorescencia (R, G) y
medidas de calidad del spot.

Msc. Raquel Sotomayor Parián