TEMA 5: Procesamiento del ARN.

Modificación del
transcrito primario. Eliminación de secuencias.
Intrones y exones. Variedades de splicing. Síntesis
de la caperuza y poliadenilación.
1. Introducción
Nos centraremos en aquellas modificaciones sobre los transcritos primarios de ARN
que portan la información codificante de proteínas (pre-ARNm) en organismos
eucariotas.
La adición de la Cap, la cola de Poli (A) y el proceso de corte y empalme (splicing)
ocurren de manera simultánea al proceso de transcripción (procesamiento nuclear).
Las enzimas responsables cabalgan sobre la “cola” fosforilada (CTD) de la ARN pol II a
medida que se transcribe un ARN y procesan el transcrito de manera secuencial a
medida que este emerge de la ARN polimerasa.
Cuando algún transcrito presenta una edición de ARNm, esta tiene lugar sobre el
transcrito maduro y puede tener lugar en el núcleo o el citoplasma, siempre después
de la transcripción.

2. Adición de la estructura Cap o caperuza

La estructura Cap consiste en un ribonucleótido de 7-metil-guanosina unido al
nucleótido 5’ terminal del ARNm mediante un enlace poco común, enlace 5’-5’
trifosfato.
Secuencia de actuación de diferentes enzimas:
1) Fosfohidrolasa hidroliza el P es posición γ del nucleótido en el extremo 5’.
2) A partir de un ribonucleótido de guanosina trifosfato (GTP), la enzima
guanililtransferasa promueve la formación de un nuevo enlace fosfoanhidro entre
el P en posición α del residuo de guanosina monofosfato (GMP) y el P en posición
β del nucleótido en el extremo 5’, liberando pirofosfato.
3) Posteriormente, la enzima guanina-7-metiltransferasa metila la base guanina en el
átomo de N en posición 7, transfiriendo un grupo metilo desde el co-sustrato S-
adenosil-L-metionina, liberando S-adenosil-Lhomocisteína.
4) Otros dos grupos, pueden (no en todos los transcritos) ser añadidos metilo son
añadidos a los grupos OH unidos al C2’ de los primeros nucleótidos adyacentes a la
CAP mediante la enzima 2-O-metiltransferasa.
Todas estas reacciones tienen lugar durante los primeros estadios de la transcripción,
después de añadir los primeros 20-30 nucleótidos del transcrito.
Las enzimas responsables de la formación de la Cap (fosfohidrolasa,
guanililtransferasa, guanina-7-metiltransferasa y 2-O-metiltransferasa) están asociadas
al dominio CTD de la ARN pol II formando un complejo proteico denominado complejo
de síntesis de la Cap (CSC; cap-synthesizing complex).
Este complejo se libera del extremo 5’ del transcrito y la Cap permanece unida a la
región CTD mediante su asociación al complejo de unión de Cap (CBC; cap-blinding
complex o CBP cap-binding Proteins).
Funciones de la CAP:

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 - Facilita la unión de los ribosomas en el extremo 5’ del transcrito de ARNm
(reconocimiento ribosomas).
- Protege al transcrito de la acción de las 5’exonucleasas (incremento de su
estabilidad).
- Facilita la exportación del transcrito desde el núcleo.
- Potencias el splicing.

3. Corte y empalme (Splicin). Eliminación de intrones.

Existen diferentes tipos de intrones:
- Clase I y clase II: aunque difieren de sus mecanismos de corte y empalme,
comparten la característica que son autocatalíticos, es decir no necesitan enzimas
proteicos, ni dependiente de ATP para el corte y empalme. Clase I: en algunos
genes nucleares, mitocondriales. Clase II: en los transcritos primarios de ARNm de
mitocondrias.
- Clase IV: requiere para el corte y empalme ATP, u a endonucleasa y la posterior
acción de ligasa. Se encuentran en ciertos ARNt.
- Clase III (intrones de espliceosoma): se encuentras en los transcritos primarios de
ARNm nuclear. Requiere ATP para el ensamblaje del complejo de corte y empalme,
pero no parece que parece que para las reacciones de corte y empalme.
Espliceosoma
Macrocomplejo proteico que se forma durante los procesos de corte y empalme del
ácido ribonucleico mensajero para eliminar los intrones.
Formado por 5snRNPs (small nuclear riibunucleoprotein particles, constituidas por
snRNA más una posción proteica), con actividad endonucleasa y ligasa, junto a cientos
de proteínas anejas conocidas como factores de splicing (splicing factors).
En un intrón tipo III suelen encontrarse 3 elementos fundamentales para el proceso de
splicing:
1) Secuencia consenso que comienza por el dinucleótido GU en el extremo 5’, marca
el sitio de corte-empalme en el extremo 5’ del intrón. Reconocida por el snRNA U1
de la snRNP U1.
2) Secuencia consenso que finaliza por el dinucleótido AG en el extremo 3’, marca el
sitio de corte-empalme en el extremo 3’ del intrón.
3) Secuencia de ramificación, ccon un ribonucleótido de A situado a 20-50
nucleótidos aguas arriba del extremo 3’ del intrón. Reconocida por el snRNA U2 de
la snRNP U2.
Comienza la unión de la snRNP U1 al extremo 5’ del intrón.
Seguidamente tiene lugar la unión de la snRNP U2 al sitio de ramificación. Esta unión
es dependiente de la hidrólisis de ATP.
Posteriormente las subunidades (snRNP U4 + snRNP U6) + snRNP U5 preensambladas
se unen a las dos anteriores.
snRNP U5 interactúa con la secuencia 5’ del intrón y posteriormente con la 3’,
acercando ambos extremos.
snRNP U6 se separa de snRNP U4 (inhibidor de la actividad catalítica de snRPN U6
hasta que este se posicione correctamente), sufriendo un cambio conformacional que
le permite por un lado interaccionar con snRNP U2 y por otro desplazar snRNP U1 del
extremo 5’ del intrón.
La liberación de snRNP U4 y snRNP U1 es dependiente de la hidrólisis de ATP.
Las subunidades snRNP U6 + snRNP U2 forman el centro catalítico del espliceosoma.

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 Tiene ahora lugar la primera reacción de transesterificación, en el que OH unido al C2’
del residuo de A en la secuencia de ramificación induce un ataque nucleofílico sobre el
P que forma parte del enlace fosfodiéster que mantiene unido el extremo 5’ del intrón
al exón previo. Esto induce la formación de enlace fosfodiéster atípico en el sitio de
ramificación generando una estructura en forma de lazo.
Seguidamente snRNP alinea el extremo 3’OH del primer exón posicionándolo cerca del
P que forma parte del enlace fosfodiéster que mantiene unido el extremo 3’ del intrón
al exón posterior. Este grupo OH induce un ataque nucleofílico sobre el P que forma
parte del enlace fosfodiéster que mantiene unido al último nucleótido del intrón
(siempre una G) y el primero del exón. Generando la segunda reacción de
transesterificación, uniendo los dos exones mediante un enlace fosfodiéster.
Posteriormente snRNP U5, snRNP U6 y snRNP U2, se liberan unidos al lazo.
Durante el proceso de splicing un grupo de proteínas denominadas EJC (Exon Junction
Complex) permanecen unidas al sitio de corte y emplame.
Este complejo maraca físicamente el lugar donde ha tenido el proceso de corte y
ayudan a estabilizar el transcrito de RNA.

4. Adición de la cola de Poli A

La maduración concluye con la modificación del extremo 3’ del transcrito al que se le
añade una cola de poliA (30-250 o más residuos seguidos de ribonucleótidos A). Estos
nucleótidos no están codificados en el ADN, se añaden tras la transcripción.
Esta adición está mediada por un complejo enzimático multimérico de factores de
poliadenilación asociados a CTD.
Además es necesaria la presencia en el transcrito de ARN de la secuencia consenso
AAUAAA posicionada 10-30 nucleótidos aguas arribas del sitio de corte y una
secuencia rica en U y G a 20-40 nucleótidos aguas abajo del sitio de corte.
Dos factores de poliadenilación multiméricos asociados al CTD denominados CstF
(cleavage stimulation factor) and CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor)
son de especial importancia.
CPSF reconoce la secuencia AAUAAA en el transcrito primario. CstF se sitúa de manera
adyacente y forman un complejo que permite la llegada de factores de corte como una
endonucleasa dimérica compuesta por las subunidades CFI y CFII (factor de escisión:
Cleavage Factor) que corta el mRNA 10 a 30 nt más abajo.
El corte de la endonucleasa deja un 3’OH que es reconocido por la enzima
Poliadenilato polimerasa (PAP), que solo acepta ATP como sustrato y añade hasta 250
ribonucleótidos de A.
A esta cola de poliA se le unen de manera específica una serie de proteínas
denominadas PBP (PoliA Blinding Protein) que ayudan a su estabilización y su posterior
reconocimiento por los ribosomas.
Visión integrada de los tres procesos

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 El transporte de los ARNm desde el núcleo hacia el citoplasma a través de los poros
nucleares es altamente selectivo, de manera que solo los ARNm correctamente
procesados son exportados.
Para ello el ARNm debe esta unido a un set de proteínas concretas que hemos venido
mencionando, CBP (cap-blinding Proteins), EJC (Exon Junction Complex) y PBP (Poli A
Binding Protein).

5. Modificaciones del proceso general

Splicing alternativo y sitios alternativos de poliadenilación

Permite obtener a partir de un

mismo transcrito primario de
ARN, distintas isoformas de ARNm
maduro y proteínas, las cuales
pueden tener funciones
diferentes (aumento de la
diversidad fenotípica).

Nunca se altera la linealidad

(orden).

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6. Edición de la secuencia de ARNm maduro
Cambios discretos a las secuencias específicas de nucleótidos dentro de una molécula
de ARN después de la ARN polimerasa, lo que afecta al mensaje del transcrito cuando
es traducido a proteína.
Puede incluir la inserción, eliminación y sustitución de bases de nucleótidos en la
molécula de ARN editados, siendo los más comunes en animales la desaminación de
adenina para producir isosina (A-I) y la desaminación de citosina para producir uracilo
(C-U).