CAPITULO 7

7.1 Vasijas de cultivo y Sustratos

7.1.1 Apego y crecimiento.
La mayoría de las células de vertebrados cultivadas in vitro crecen como monocapas sobre
un sustrato artificial. Por lo tanto, el sustrato debe estar correctamente cargado para
permitir la adhesión celular, o al menos para permitir la adhesión de factores de unión
derivados de células, lo que a su vez permitirá la adhesión y propagación de las células.
Aunque el crecimiento espontáneo en suspensión está restringido a líneas celulares
hematopoyéticas, tumores de ascitis en roedores y algunas otras líneas celulares
seleccionadas, como el cáncer de pulmón de células pequeñas humanas [Carney et al.,
1981], muchas líneas celulares transformadas pueden crecer en suspensión e
independizarse de la carga superficial sobre el sustrato. Sin embargo, la mayoría de las
células normales necesitan extenderse sobre un sustrato para proliferar [Folkman y
Moscona, 1978; Ireland et al., 1989; Danen y Yamada, 2001; Frame & Norman, 2008;
Zhang et al., 2008], y la difusión inadecuada debido a la mala adherencia o el
hacinamiento inhibirán la proliferación. Se dice que las células que requieren una unión
para el crecimiento dependen del anclaje; las células que han sufrido transformación a
menudo se vuelven independientes del anclaje (consulte la Sección 17.5.1) y puede crecer
en suspensión (ver Sección 12.4.5) cuando se agita o se mantiene en suspensión con
medios semisólidos como el agar.

7.1.2 Materiales de sustrato comunes.

Plástico desechable. Los matraces de poliestireno estériles de un solo uso, las placas de
Petri o las placas de múltiples pocillos proporcionan un sustrato simple y reproducible
para el cultivo. Por lo general, son de buena calidad óptica y la superficie de crecimiento
es plana, lo que proporciona cultivos de monocapa reproducibles y distribuidos
uniformemente. Tal como está fabricado, el poliestireno es hidrofóbico y no proporciona
una superficie adecuada para la unión celular, por lo que los plásticos de cultivo de tejidos
se tratan mediante descarga corona, irradiación γ o químicamente, para producir una
superficie cargada y humectable. Debido a que el producto resultante puede variar en
calidad de un fabricante a otro, las muestras de varias fuentes deben analizarse
determinando la tasa de crecimiento y la eficiencia de siembra de las células en uso actual
(consulte los Protocolos 20.7–20.10) en el medio apropiado que contenga
concentraciones limitantes de suero o suero libre. (Las concentraciones séricas altas
pueden enmascarar imperfecciones en el plástico; consulte la Sección 22.2.4.).
Para probar un nuevo sustrato, haga crecer las células en él como una monocapa regular,
con y sin tratar previamente la superficie (vea Sección 7.2.1), y luego clonar las células (ver
Protocolo 20.10). El PTFE se puede usar en forma cargada (hidrófila) o no cargada
(hidrófoba) [Janssen et al., 2003; Lehle et al., 2003]; La forma cargada se puede utilizar
para células de monocapa normales y cultivo organotípico (Biopore, Millipore; Transwell,
Corning) y los cargados para macrófagos [von Briesen et al., 1990] y algunas líneas
celulares transformadas.

Vidrio. Este fue el sustrato original debido a sus propiedades ópticas y carga de superficie,
pero ha sido reemplazado en la mayoría de los laboratorios por plástico (generalmente
poliestireno), que tiene una mayor consistencia y propiedades ópticas superiores. Ahora el
vidrio se usa raramente, aunque es barato, se lava fácilmente sin perder sus propiedades
de soporte del crecimiento, se puede esterilizar fácilmente por calor seco o húmedo, y es
ópticamente transparente. El tratamiento con álcali fuerte (por ejemplo, NaOH o
detergentes cáusticos) hace que el vidrio sea insatisfactorio para el cultivo hasta que se
neutralice con un lavado con ácido (consulte la Sección 10.3.1). El vidrio de alta calidad
óptica es alcalino y, a menudo, tiene un alto contenido de plomo, lo que puede reducir el
crecimiento celular, por lo tanto, es posible que los portaobjetos y los cubreobjetos deban
lavarse con ácido y / o recubrirse para obtener mejores resultados (consulte la Sección
7.2.1).

7.1.3 Sustratos Alternativos

Otros plásticos. Aunque el poliestireno es, con mucho, el sustrato plástico más común y
más barato, las células también se pueden cultivar en policloruro de vinilo (PVC),
policarbonato, politetrafluoroetileno (PTFE; Teflon), Melinex, Thermanox (TPX), poli (metil
metacrilato) (PMMA; Plexiglas, Perspex, Lucite) [Gottwald et al., 2008], y un número de
otros plásticos.
Fibras. Rayón, Nylon, ácido poli-L-láctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) y seda a menudo
se usan para construcciones de dos y tres dimensiones en ingeniería de tejidos (consulte la
Sección 25.1.3; Fig. 25.2), particularmente PLA, PGA , y la seda, ya que son
biodegradables.
Derivatización. Los sustratos que no son naturalmente adhesivos se pueden derivar con el
tripéptido RGD, generalmente como el pentapéptido GRGDS para permitir la interacción
con integrinas en la superficie celular (ver Sección 2.2.1). EDC (hidrocloruro de 1-etil-3- (3-
dimetilaminopropil) carbodiimida) y La N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo NHS) se ha
utilizado para derivar la seda procesada para construir andamios para la ingeniería del
tejido óseo [Hofmann et al., 2006] y este tratamiento es potencialmente aplicable a varios
sustratos diferentes [p. Ej. Lao et al., 2008] (ver también la Sección 7.2.1 en Colágeno).

Metales. Las células se pueden cultivar en discos de acero inoxidable [Birnie & Simons,
1967] u otras superficies metálicas [Litwin, 1973]. La observación de las células en un
sustrato opaco requiere microscopía de interferencia de superficie, a menos que se
utilicen películas metálicas muy finas. Westermark [1978] desarrolló un método para el
crecimiento de fibroblastos y glía en paladio. Utilizando equipos de microscopía
electrónica de sombreado, produjo islas de paladio en agarosa, que no permiten la unión
celular en medios fluidos. El tamaño y la forma de las islas se determinaron mediante
máscaras hechas por fotograbado y el paladio se aplicó a la sombra al vacío, tal como se
utiliza en la microscopía electrónica. Porque la capa era muy delgada, se mantuvo
transparente.
7.2 SUPERFICIES TRATADAS
7.2.1 Recubrimiento de sustrato
Acondicionamiento. La unión celular y el crecimiento pueden mejorarse mediante el
tratamiento previo del sustrato [Barnes et al., 1984a]. Una pieza bien establecida en el
cultivo de tejidos dice que la cristalería usada apoya el mejor crecimiento que la nueva
[Paul, 1975]. Si eso es cierto, puede deberse a un grabado de la superficie o pequeños
rastros de residuos que quedan después del cultivo. El crecimiento de células en un
matraz también mejora la superficie para una segunda siembra, y este tipo de
acondicionamiento puede deberse al colágeno, fibronectina u otros productos de la matriz
[Crouch et al., 1987] liberados por las células. El sustrato también se puede acondicionar
tratándolo con medio gastado de otro cultivo [Stampfer et al., 1980], con suero o con
fibronectina o colágeno purificados (ver Protocolo 22.9).

Polímeros, nanopartículas y fotograbado. McKeehan y Ham [1976a] encontraron que era

necesario recubrir la superficie de los platos de plástico con 1 mg / ml de poli-D-lisina
antes de clonar en ausencia de suero (consulte las Secciones 13.2.1). La misma técnica
también se utiliza para promover el crecimiento de neuritas. (ver 22.4.1), por lo que
algunos efectos del acondicionamiento pueden estar relacionados con la carga superficial.
El isómero D se usa con preferencia a la L, ya que se digiere con menor facilidad por las
proteasas extracelulares, pero se han usado los isómeros tanto D como L. Los pesos
moleculares más altos se vuelven más viscosos para manejar, pero tienen más sitios de
unión; Están disponibles tanto 100 kD (MP Biomedicals) como 500 kD (BD Biosciences).
Las nanopartículas de diamante también se han utilizado para modificar el sustrato para la
proliferación y diferenciación de las células madre neurales [Chen et al., 2010] y la
configuración de la superficie de crecimiento también se puede alterar mediante
fotograbado [Ploss et al, 2010].

Colágeno y gelatina. Tratamiento del sustrato con el colágeno desnaturalizado mejora la

unión de muchos tipos de células, como las células epiteliales, y el gel sin desnaturalizar
puede ser necesario para la expresión de funciones diferenciadas (consulte las Secciones
2.2.3, 16.7.3, 22.2.1). Se ha encontrado que el recubrimiento de gelatina es beneficioso
para el cultivo del músculo [Richler y Yaffe, 1970] y las células endoteliales [Folkman et al.,
1979] (consulte la Sección 22.3.6), y es necesario para algunos teratomas de ratón. El
recubrimiento con colágeno desnaturalizado se puede lograr usando colágeno de cola de
rata o alternativas suministradas comercialmente (por ejemplo, Vitrogen) y simplemente
vertiendo la solución de colágeno sobre la superficie del plato, drenando el exceso y
dejando que el residuo se seque. Debido a que este procedimiento a veces conduce al
desprendimiento de la capa de colágeno durante el cultivo, se diseñó un protocolo por
Macklis et al. [1985] para asegurar que el colágeno permanezca firmemente anclado al
sustrato, mediante la reticulación al plástico con carbodiimida. El colágeno también se
puede usar junto con la fibronectina.
El colágeno también se puede aplicar como un gel sin desnaturalizar (ver Sección 16.7.3),
un tipo de sustrato que se ha demostrado que apoya el crecimiento de neuritas en los
ganglios de la columna vertebral [Ebendal, 1976] y la diferenciación morfológica de las
células mamarias [Nicosia y Ottinetti, 1990 ; Berdichevsky et al., 1992] y hepatocitos
[Sattler et al., 1978; Fiorino et al., 1998], y para promover la expresión de funciones
específicas del tejido de varias otras células in vitro (por ejemplo, queratinocitos [Maas-
Szabowski et al., 2002]; ver la Sección 23.1.1). Diluir el colágeno concentrado 1:10 con
medio de cultivo y neutralizarlo a pH 7,4 hace que el colágeno se gelifique, por lo que la
dilución y la dispensación deben ser rápidas. Es mejor agregar el medio de crecimiento al
gel durante 4 a 24 h más para garantizar que el gel se equilibre con el medio antes de
añadir las células. En esta etapa, se puede agregar al medio fibronectina (25–50 μg / mL) o
laminina (1–5 μg / mL), o ambos se pueden añadir al medio.
mata

Matrices. Los matrices disponibles comercialmente (consulte la Tabla 7.1), como Matrigel
™ (Becton Dickinson) del sarcoma de Engelbreth – Holm – Swarm (EHS), contienen
laminina, fibronectina y proteoglicanos, con predominio de la laminina (ver también la
Sección 16.7.3). Otros productos de matriz incluyen Pronectina F (Protein Polymer
Technologies), laminina, fibronectina, vitronectina entactina (UBI), heparan sulfato, EHS
Natrix (BD Biosciences), ECL (US Biological) y Cell-tak (BD Biosciences). Algunos de estos
productos se purifican, si no están completamente definidos químicamente; otros son una
mezcla de productos de matriz que han sido mal caracterizados y también pueden
contener factores de crecimiento unidos. Si el objetivo principal es la adhesión celular
para la supervivencia y los sustratos definidos son inadecuados, el uso de estas matrices
es aceptable, pero si se están realizando estudios mecanísticos, solo pueden ser una etapa
intermedia en el camino hacia un sustrato completamente definido.

La matriz extracelular. Aunque el recubrimiento inerte de la superficie puede ser

suficiente, puede resultar necesario usar una monocapa de un tipo de célula apropiado
para proporcionar la Matriz correcta para el mantenimiento de algunas células
especializadas. Gospodarowicz et al. [1980] fueron capaces de hacer crecer el endotelio
en la matriz extracelular (MEC) derivado de monocapas confluentes de células 3T3 que se
habían eliminado con Triton X-100. Esta ECM residual también se ha utilizado para
promover la diferenciación en las células de la granulosa del ovario [Gospodarowicz et al.,
1980] y en el estudio del comportamiento de las células tumorales [Vlodavsky et al.,
1980].

7.2.2 Capas del alimentador

Aunque el recubrimiento de matriz puede ayudar al apego, el crecimiento y la
diferenciación, algunos cultivos de células más exigentes, particularmente a bajas
densidades celulares [Puck y Marcus, 1955], requiere el apoyo de células vivas (por
ejemplo, fibroblastos de embrión de ratón; ver Protocolo 13.3). Esta acción se debe en
parte a la suplementación del medio por la pérdida de metabolitos o la secreción de
factores de crecimiento de los fibroblastos (en realidad células mesenquimáticas
primitivas y no fibroblastos), pero también puede deberse al acondicionamiento del
sustrato por los productos celulares. Las capas de alimentación crecidas como una
monocapa confluente pueden hacer que la superficie sea adecuada, o incluso selectiva,
para la unión de otras células (consulte las Secciones 13.2.3, 24.5.2; Protocolos 22.1, 22.4).
La supervivencia y extensión de las neuritas por centrales y las neuronas periféricas
pueden potenciarse cultivando las neuronas en una monocapa de células gliales, aunque
en este caso el efecto puede deberse a un factor difusible en lugar del contacto directo
con las células [Seifert & Muller, 1984].

Después de que un cultivo de monocapa alcanza la confluencia, la proliferación

subsiguiente hace que las células se desprendan del sustrato artificial y migren sobre la
superficie de las monocapas. La morfología de las células puede cambiar (Fig. 7.1): las
células pueden volverse menos diseminadas, teñirse más densamente y ser más
diferenciadas. Al parecer, y no demasiado sorprendente, la interacción de una célula con
una capa inferior celular es diferente de la interacción de la célula con un sustrato
sintético. Lo primero puede causar un cambio en la morfología y reducir el potencial de la
célula para proliferar.

7.2.3. Sustratos no adherentes. A veces la unión de las células es indeseable. La

selección de colonias viralmente transformadas, que son independientes del anclaje, se
puede lograr mediante la siembra de células en agar [Macpherson y Montagnier, 1964], ya
que las células no transformadas no forman colonias fácilmente en esta matriz. Hay dos
principios involucrados en un sistema de este tipo: (1) la prevención de la unión en la base
del plato, donde ocurriría la expansión y el crecimiento dependiente del anclaje, y (2) la
inmovilización de las células de modo que las células hijas permanezcan asociadas con la
colonia, incluso si no son adhesivas. Comúnmente se usa agar, agarosa o metocel
(metilcelulosa de viscosidad 4000 cP) (ver Sección 13.3). Los dos primeros son Geles, y el
tercero es un sol de alta viscosidad. Debido a que el Metocel es un sol, las células se
sedimentarán lentamente a través de él. Por lo tanto, se utiliza con una capa inferior de
agar (ver Protocolo 13.5). Los platos que no son de grado de cultivo de tejidos se pueden
usar sin una base de agar, pero puede ocurrir algo de adherencia y propagación.

7.3 ELECCIÓN DEL BUQUE DE CULTIVO

Algunos recipientes de cultivo típicos se enumeran en la Tabla 7.2. El rendimiento
anticipado de células HeLa se cotiza para cada vaso; el rendimiento de una línea celular
finita (por ejemplo, fibroblastos diploides) sería de aproximadamente una quinta parte a
una décima parte de la cifra de HeLa. Varios factores gobiernan la elección del recipiente
de cultivo, incluyendo (1) la masa celular requerida, (2) si las células crecen en suspensión
o como una monocapa, (3) si el cultivo debe ser ventilado a la atmósfera o sellado, (4) la
frecuencia de muestreo, (5) el tipo de análisis requerido, y (6) el costo.

7.3.1 Rendimiento celular.

Para los cultivos en monocapa, el rendimiento celular es proporcional al área de superficie
disponible del matraz (Fig. 7.2). Los volúmenes pequeños y las repeticiones múltiples se
realizan mejor en placas de múltiples pocillos (Fig. 7.3), que puede tener un gran número
de pozos pequeños (p. Ej., Placas de microtitulación con 96 o 144 pozos, 0,1 a 0,2 ml de
medio y área de crecimiento de 0,25 cm2 o "platos de placas" de 24 pocillos con 1 a 2 mL
de medio en cada pozo, 1.75-cm2. área de crecimiento) hasta placas de 4 pocillos con
cada pocillo de 5 cm de diámetro y utilizando 5 ml de medio de cultivo (consulte la Tabla
7.2). La mitad de la gama de tamaños abarca ambas placas de Petri (Fig. 7.4) y matraces
de 10 a 225 cm2 (fig. 7.5). Los matraces se designan generalmente por su área de
superficie (por ejemplo, 25 o 175 cm2, a menudo abreviado como T25 o T175,
respectivamente), mientras que las placas de Petri se mencionan por diámetro (por
ejemplo, 3,5 o 9 cm).
Las botellas de vidrio son más variables que el plástico porque generalmente se obtienen
de suministros farmacéuticos estándar.

Las botellas de vidrio deben tener (1) una superficie razonablemente plana, (2) un tapón
de rosca profundo con un buen sellado y un forro no tóxico, y (3) hombros con poca
pendiente para facilitar la recolección de las células en monocapa después de la
tripsinización y para mejorar la eficiencia del lavado.

Si necesita rendimientos de células grandes (por ejemplo, carcin 1 × 10^9 células HeLa de
carcinoma cervical o 2 × 10^8 diploides MCR-5 humanos fibroblastos), y luego aumentar el
tamaño y el número de botellas convencionales se vuelve engorroso, y se requieren vasos
especiales. Frascos con superficies onduladas (Corning, Becton Dickinson) o matraces de
varias capas (Corning, Nunc) ofrecen un paso intermedio para aumentar el área de la
superficie (Fig. 7.6). Los rendimientos celulares más allá de eso requieren grandes
superficies múltiples propagadores o botellas de rodillos en bastidores especiales
(consulte la Sección 26.2.2). Aumentar el rendimiento de las células que crecen en
suspensión solo requiere que se aumente el volumen del medio, siempre que las células
en cultivo profundo se mantengan agitadas y rociadas con 5% de CO2 en el aire (consulte
la Sección 26.1). Si necesita rendimientos de células grandes (por ejemplo, carcin 1 × 10^9
células HeLa de carcinoma cervical o 2 × 10^8 MCR-5 diploides humanos fibroblastos), y
luego aumentar el tamaño y el número de botellas convencionales se vuelve engorroso, y
se requieren vasos especiales. Frascos con superficies corrugadas (Corning, Becton
Dickinson) o frascos de varias capas (Corning, Nunc) ofrece un paso intermedio para
aumentar el área de superficie (Fig. 7.6). Los rendimientos celulares más allá de eso
requieren grandes propagadores multisuperficiales o botellas de rodillos en bastidores
especiales (consulte la Sección 26.2.2). Aumentar el rendimiento de las células que crecen
en suspensión solo requiere que se aumente el volumen del medio, siempre que las
células en cultivo profundo se mantengan agitadas y rociadas con 5% de CO2 en el aire
(ver Sección 26.1).

7.3.2 Cultura de suspensión

Las células que crecen en suspensión se pueden cultivar en cualquier tipo de matraz, placa
o placa de Petri que, aunque estéril, no necesita tratamiento para la unión celular. Las
botellas de agitador se utilizan cuando se requiere agitación para mantener las células en
suspensión. Estas botellas están disponibles en una amplia gama de tamaños,
generalmente en vidrio (Bellco, Techne). La agitación es generalmente por un top-
accionado paleta suspendida o péndulo que contiene un imán, cuya rotación es impulsada
por un agitador magnético (Fig. 7.7; ver también Figs. 12.7, 25.1). La velocidad de rotación
debe mantenerse baja, Alrededor de 60 rpm, para evitar daños por esfuerzo cortante. En
general, el diseño del péndulo es preferible para minimizar el corte, aunque una paleta se
hace preferible a medida que aumenta la escala. Los cultivos de suspensión se pueden
configurar como réplicas o se pueden muestrear repetitivamente desde un brazo lateral
del matraz. También se pueden usar para mantener una cultura de estado estable
agregando y eliminando el medio continuamente (consulte la Sección 26.1.1).

7.3.3 Desfogue
Las placas Multiwell y Petri, elegidas para el muestreo o clonación por duplicado, tienen
tapas de ajuste holgado para facilitar el acceso al plato. Por consiguiente, no están
sellados y requieren una atmósfera húmeda con la concentración de CO2 controlada
(consulte la Sección 8.2.2). Como se puede formar una capa delgada de líquido alrededor
del interior de la tapa, sellando parcialmente algunos platos, se deben usar tapas
ventiladas con soportes de plástico moldeado en el interior (Fig. 7.8a, flecha). Si se
requiere un sello perfecto, algunos platos de varios pocillos se puede sellar con película
autoadhesiva (ver Apéndice II: Selladores de placas). Los matraces pueden ser ventilados
aflojando las tapas una vuelta completa, cuando se encuentran en una incubadora de
CO2, para permitir que el CO2 entre o para permitir que el exceso de CO2 se escape en el
exceso de líneas celulares productoras de ácido. Sin embargo, son preferibles los
casquillos con filtros permeables que permitan el equilibrio con la fase gaseosa, ya que
permiten Difusión de CO2 sin riesgo de contaminación (Fig. 7.8b). Las tapas sólidas, o
"tapones", todavía deben usarse en una incubadora o sala caliente que no sea CO2.

7.3.4 Muestreo y análisis.

Las placas de múltiples pocillos son ideales para cultivos repetidos si todas las muestras se
eliminan simultáneamente y se procesan de la misma manera. Si, en cambio, las muestras
deben extraerse en diferentes momentos y procesarse de inmediato, puede ser preferible
usar recipientes separados (Fig. 7.9; consulte también la Sección 20.8). Los pocillos
individuales en placas de microtitulación se pueden muestrear por corte y eliminando solo
esa parte del sellador de placa adhesiva que cubre los pocillos a muestrear.
Alternativamente, las placas de microtitulación están disponibles con pozos removibles
para procesamiento individual (Nunc). Si desea utilizar células adherentes, debe
asegurarse de que estos pozos se traten para cultivo de tejidos.
La observación microscópica de baja potencia se realiza fácilmente en matraces, placas de
Petri y placas de múltiples pocillos con el uso de un microscopio invertido. Cuando se usa
contraste de fase, sin embargo, se pueden encontrar dificultades con las placas de
microtitulación debido al tamaño del menisco en relación con el diámetro del pozo;
Incluso se pueden observar placas de 24 pocillos. Satisfactoriamente por contraste de fase
en el centro del pozo. Si la microscopía jugará un papel importante en su análisis, puede
ser ventajoso usar un portaobjetos (consulte la Sección 15.5.3; Fig. 15.3). Las botellas
grandes de rodillos dan problemas con algunos microscopios; Por lo general, es necesario
quitar el condensador, en cuyo caso el contraste de fase no estará disponible.

Si el procesamiento de la muestra implica la extracción en acetona, tolueno, acetato de

etilo u otros disolventes orgánicos, surgirá un problema con la solubilidad del poliestireno.
Como este problema se asocia a menudo con los disolventes orgánicos utilizados en los
procedimientos histológicos, Lux (Bayer, MP Biomedicals) suministra cubreobjetos de
plástico Thermanox (TPX) resistentes a los disolventes, adecuados para histología, que
encajan en placas de varios pocillos (que no necesitan ser de grado de cultivo de tejidos).
Sin embargo, estos cubreobjetos son de mala calidad óptica y son impermeables a los
rayos UV, por lo que deben montarse en portaobjetos con células superiores y un
cubreobjetos de vidrio convencional en la parte superior.
Los vasos de vidrio son necesarios para procedimientos como las extracciones de ADN con
ácido perclórico caliente. Los tubos de ensayo de lados lisos o los matraces Erlenmeyer
(sin borde), utilizados junto con la cinta de sellado o los tapones Oxoid, son rápidos de
usar y se guardan mejor en una atmósfera húmeda controlada por CO2. Vaso regular los
viales de centelleo, o "miniviales", también son buenos recipientes de cultivo porque son
de fondo plano. Sin embargo, una vez que se utilizan con líquido de centelleo, no deben
reutilizarse para el cultivo.

7.3.5 Crecimiento desigual.

Algunas veces, las células se pueden distribuir inadvertidamente de manera no uniforme a
través de la superficie de crecimiento. Vibración, causada por la apertura y el cierre de la
incubadora, un motor de ventilador defectuoso o la vibración del equipo pueden
perturbar el medio, lo que puede provocar la resonancia u ondas estacionarias en el
matraz, lo que a su vez, el resultado de un patrón de onda en la monocapa (Fig. 7.10) crea
variaciones en la densidad celular. Eliminar la vibración y minimizar la entrada en la
incubadora ayudará a reducir el crecimiento desigual. Colocar un peso pesado en la
bandeja o caja con las placas y separarlo del estante con espuma plástica también puede
ayudar a aliviar el problema [Nielsen, 1989], pero se debe tener mucho cuidado para lavar
y esterilizar tales almohadillas de espuma, ya que tienden a albergar contaminación.

7.3.6 Costo.
El costo siempre tiene que ser equilibrado contra la conveniencia; por ejemplo, las placas
de Petri son más baratas que los matraces con una superficie equivalente, pero requieren
condiciones húmedas y controladas con CO2 y son más propensas a las infecciones. Sin
embargo, son más fáciles de examinar y procesar. Las botellas de vidrio de soda baratas,
aunque no siempre son de buena calidad óptica, a menudo son mejores para el cultivo
que el Pyrex de grado superior, o el vidrio ópticamente transparente, que generalmente
contiene plomo. Una desventaja importante del vidrio es que su preparación requiere
mucho trabajo, ya que debe lavarse y reesterilizarse cuidadosamente antes de poder
reutilizarse. La mayoría de los laboratorios ahora usan plástico. Por su comodidad, claridad
óptica y calidad.

7.4 Sistemas especializados.

7.4.1 Soportes permeables.
Las membranas semipermeables se utilizan como sustratos permeables a los gases y
también permitirán el paso del agua y las moléculas pequeñas (<500–1000 da), una
propiedad que se explota en algunos biorreactores a gran escala (consulte las Secciones
25.3.2, 26.2.5). El crecimiento de células en un sustrato permeable al agua aumenta la
difusión de oxígeno, CO2 y nutrientes. La unión de las células a un sustrato natural como
el colágeno puede controlar la expresión fenotípica debido a la interacción de los
receptores de integrinas en la superficie celular con sitios específicos en la matriz
extracelular (consulte las Secciones 2.2.1, 2.2.3, 16.7.3). El crecimiento de células en
colágeno flotante [Michalopoulos y Pitot, 1975; Lillie et al., 1980] se ha utilizado para
mejorar la supervivencia de las células epiteliales y promover la diferenciación terminal
(ver Secciones 16.7.3, 25.3.8).

Filtrar los pozos. La permeabilidad de la superficie a la que está anclada la célula puede
inducir polaridad en la célula simulando la membrana basal. Dicha polaridad puede ser
vital para la expresión funcional completa en epitelios secretores y muchos otros tipos de
células [Gumbiner y Simons, 1986; Chambard et al., 1987; Artursson & Magnusson, 1990;
Mullin et al., 1997]. Los soportes permeables están disponibles en forma de insertos de
pozos de filtro desechables de diferentes tamaños, materiales y porosidades de
membrana (consulte el Apéndice II: Insertos de pozos de filtro). También están disponibles
los insertos recubiertos previamente con colágeno, laminina u otros materiales de matriz
(por ejemplo, Matrigel, BD Biosciences). Las inserciones de los filtros se han utilizado
ampliamente en estudios de interacción célula-célula, interacción célula-matriz,
diferenciación y polaridad, permeabilidad transepitelial y modelado de tejidos (ver
Sección 25.3.6).

Fibras huecas. Knazek et al. [1972] desarrolló la técnica de crecimiento de células en la

superficie exterior de haces microcapilares de plástico (Fig. 7.11; consulte la Sección
25.3.2). El plástico permite la difusión de nutrientes y gases disueltos desde un medio
perfundido a través de los capilares. Las células crecerán hasta llegar a varias células en el
exterior de los capilares, y está implícita una analogía con todo el tejido. Las fibras huecas
también se utilizan en biorreactores a gran escala (ver Sección 26.2.5).

7.4.2 Matrices tridimensionales.

Es evidente que muchas características funcionales y morfológicas se pierden durante el
subcultivo en serie, debido a la pérdida de la arquitectura del tejido y la interacción célula-
célula (consulte la Sección 2.4.2). Estas deficiencias fomentaron la exploración de matrices
tridimensionales, como el gel de colágeno [Douglas et al., 1980], esponja de celulosa (ya
sea sola o recubierta con colágeno) [Leighton et al., 1968], o Gelfoam (ver Sección 25.3.1).
Los coágulos de fibrina fueron uno de los primeros medios que se usaron para el cultivo
primario y todavía se usan como coágulos de plasma en bruto (ver Sección 11.3.1) o como
fibrinógeno purificado mezclado con trombina. Ambos sistemas generan un gel
tridimensional en el que las células pueden migrar y crecer, ya sea en la interfaz sólido-gel
o dentro del gel [Leighton, 1991].
Las matrices tridimensionales se utilizan ampliamente en ingeniería de tejidos [Vunjak-
Novakovic y Freshney, 2006] y pueden ser inorgánicas, como el fosfato de calcio, u
orgánicas, como Gelfoam (ver Sección 25.3.1). Además de permitir la unión celular, la
proliferación y la diferenciación, se requiere que tales matrices, o armazones, se degraden
in vivo y se reemplacen por una matriz endógena.

Los microprocesadores hechos de poliestireno, Sephadex, poliacrilamida y colágeno o

gelatina están disponibles en forma de perlas para la propagación de células dependientes
del anclaje en suspensión (consulte la Sección 26.2.3; Tabla 26.1; Apéndice II). Aunque
técnicamente tridimensional, el crecimiento en muchos de estos es funcionalmente una
monocapa bidimensional, modificada por el radio de curvatura de la cuenta. Sin embargo,
algunos microportadores son porosos (ver Secciones 26.2.3, 26.2.4), por lo que las células
crecen dentro de los intersticios de la matriz. El crecimiento tridimensional en perlas de
alginato se produce por encapsulación, en lugar de la penetración de la matriz (ver
Sección 25.3.5), permite un alto nivel de interacción célula-célula y facilita la
diferenciación en condrocitos (ver Protocolo 22.16) y neuronas (vea Sección 25.3) .5), y se
ha utilizado para mejorar la producción de anticuerpos por hibridomas [Zimmermann et
al., 2003].