INVESTIGACION ORIGINAL

publicado: 22 de octubre de 2018 doi:

10.3389 / fmicb.2018.02496

Microbiota bacteriana y carácter metabólico de la

crema agria y la mantequilla tradicionales en
Buriatia, Rusia
Jie Yu, Lanxin Mo, Lin Pan, Caiqing Yao, Dongyan Ren, Xiaona An, Tsedensodnom
Tsogtgerel, Heping Zhang y Wenjun Liu *

Laboratorio clave de biotecnología e ingeniería de productos lácteos, Ministerio de Educación, Laboratorio clave de procesamiento de productos lácteos, Ministerio

de Agricultura, Universidad Agrícola de Mongolia Interior, Huhhot, China

La crema agria y la mantequilla tradicionales son productos lácteos fermentados muy populares en Rusia por su
sabor y nutrición, y contienen una rica biodiversidad microbiana, particularmente en términos de bacterias del ácido
láctico (BAL). Sin embargo, pocos estudios han descrito las comunidades microbianas y el carácter metabólico de
la crema agria y la mantequilla tradicionales. El objetivo de este estudio fue determinar la microbiota bacteriana y el
carácter metabólico de ocho muestras recolectadas de pastores en Buryatia, Rusia. Utilizando técnicas de
secuenciación en tiempo real de una sola molécula (SMRT), identificamos un total de 294 especies y / o
subespecies en 169 géneros bacterianos, pertenecientes a 14 filos. El filo dominante fue Firmicutes (81,47%) y el
género dominante fue Lactococcus ( 59,28%). Hubo diferencias entre las composiciones bacterianas de las
Editado por:
Chunbao Li, muestras de crema agria y mantequilla. Las abundancias relativas de Lactococcus lactis, Lactococcus raf fi nolactis,
Universidad Agrícola de Nanjing, China
y
Revisado por:
Lianzhong Ai,
Universidad de Shanghai para la ciencia
Acetobacter cibinongensis eran significativamente más altos en crema agria que en mantequilla, y la abundancia de Streptococcus
y tecnología, China thermophilus fue significativamente menor en crema agria que en mantequilla. Utilizando un método de cultivo puro,
Yujun Jiang,
se aislaron e identificaron 48 cepas para representar siete géneros y 15 especies y / o subespecies. Entre estos
Universidad Agrícola del Noreste,
China aislados,

* Correspondencia: Lactococccus lactis subsp. lactis 22,50%) fue la especie BAL dominante. Se utilizó cromatografía líquida de ultra
Wenjun Liu
rendimiento, cuadrupolo, tiempo de espectrometría de masas de vuelo a energía elevada en combinación con
wjliu168@163.com
métodos estadísticos para detectar diferencias de metabolitos entre la crema agria tradicional y la mantequilla. Se
Sección de especialidad: detectaron un total de 27.822 metabolitos en todas las muestras, y Lys-Lys, isohexanal, ácido palmítico, Leu-Val y
Este artículo fue enviado a
2′-
Microbiología alimentaria,

una sección de la revista la desoxicitidina fueron los metabolitos más dominantes encontrados en todas las muestras. Además, se detectaron 27
Frontiers in Microbiology metabolitos significativamente diferentes entre las muestras de crema agria y mantequilla, incluidos péptidos cortos, ácidos
Recibido: 22 de junio de 2018 orgánicos y aminoácidos. Basándonos en análisis de correlación entre las especies bacterianas más prevalentes y los
Aceptado: 28 de septiembre de 2018
principales metabolitos en la crema agria, llegamos a la conclusión de que puede haber una conexión entre las especies BAL
Publicado: 22 de octubre de 2018
dominantes y estos metabolitos. Este estudio combinó técnicas ómicas para analizar la diversidad bacteriana y el carácter
Citación:
Yu J, Mo L, Pan L, Yao C, Ren D, An X, metabólico de la crema agria y la mantequilla tradicionales, y esperamos que nuestros hallazgos enriquezcan las bibliotecas de
Tsogtgerel T, Zhang H y Liu W (2018)
recursos de especies y proporcionen recursos valiosos para futuras investigaciones sobre el sabor de los productos lácteos.
Microbiota bacteriana y carácter metabólico
de la tradición
Crema agria y mantequilla en Buriatia,
Rusia. Frente. Microbiol. 9: 2496. doi:
10.3389 / fmicb.2018.02496 Palabras clave: Buriatia, crema agria, mantequilla, microbiota bacteriana, carácter metabólico

Fronteras en microbiología | www.frontiersin.org 1 Octubre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2496

Yu y col.
INTRODUCCIÓN
La crema agria rusa, un producto de crema fermentado muy popular, juega un papel
importante en la dieta de los rusos. La crema agria tiene un color blanco lechoso, un
aroma fragante y un sabor delicioso. Se puede comer directamente con pan, y se
utiliza mucho como condimento, en la cocina y en la repostería de varios tipos de
repostería. Rusia consta de 193 grupos étnicos y pueblos indígenas diferentes, y cada
región tiene su propia cultura y costumbres únicas, así como sus propios tipos y
métodos de preparación de productos lácteos. La técnica de procesamiento utilizada
para hacer crema agria ( susegei)
en Buriatia, Rusia, es simple: la leche cruda se almacena en barriles en una habitación
oscura y seca durante 3-4 días. La fermentación natural conduce a la formación de
capas de la leche fermentada, siendo la capa superior la crema agria. La adición de agua
caliente y la agitación se realizan para hacer mantequilla ( tohon), que luego se almacena
en un estómago de oveja. La mantequilla se ha consumido durante miles de años en
Buriatia. Evidentemente, en estos procesos de fermentación intervienen muchos
microorganismos naturales procedentes de la leche cruda y del medio ambiente. Por lo
tanto, un análisis completo y sistemático de las complejas comunidades bacterianas
dentro de la crema agria y la mantequilla en Rusia sería útil en la comercialización de
estos productos.
En estudios anteriores, se han utilizado métodos de cultivo tradicionales para
investigar las comunidades microbianas en productos lácteos fermentados
tradicionalmente ( Mathara y col., 2004 ; Elionora Hantsis-Zacharov, 2007 ; Giannino et
al., 2009 ). Sin embargo, las comunidades microbianas descritas únicamente sobre la
base del cultivo a menudo están incompletas, ya que muchas especies no son
cultivables o están mal representadas por el proceso de cultivo ( Duniere et al., 2017 ).
Con el desarrollo de la tecnología de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las
técnicas alternativas independientes del cultivo han facilitado las investigaciones de la
compleja microbiota microbiana en los productos lácteos tradicionales. Entre ellos, la
secuenciación metagenómica del ADN microbiano es un método importante
independiente del cultivo que podría proporcionar un perfil de microbiota completo
independiente de los rasgos fenotípicos y la capacidad de cultivo de microbios
individuales. Este enfoque molecular moderno se ha utilizado para identificar la
microbiota de diferentes tipos de productos lácteos fermentados tradicionales, como el
queso artesanal irlandés ( Quigley y col., 2012 ), Queso italiano Plaisentif ( Dalmasso et
al., 2016 ), Queso Herve belga ( Delcenserie et al., 2014 ), Leche de vaca de Mongolia
fermentada naturalmente ( Liu et al., 2015 ) y yogures de Xinjiang ( Xu et al., 2015 ).
Recientemente, se desarrolló una nueva herramienta de secuenciación de alto
rendimiento, la tecnología de secuenciación en tiempo real (SMRT) de molécula única
de Paci fi c Biosciences (Menlo Park, CA, Estados Unidos) de tercera generación, para
generar lecturas largas y permitir una alta resolución taxonómica en el nivel de especie
cuando se combina con la secuenciación de genes de ARN ribosómico 16S (ARNr) de
longitud completa ( Mosher y col., 2014 ). Esta técnica se ha aplicado con éxito para
evaluar la seguridad de las fórmulas infantiles ( Zheng et al., 2016 ) y para investigar los
perfiles bacterianos en koumiss fermentados tradicionales ( Gesudu et al., 2016 ) y queso
artesanal de Kazajstán ( Li et al., 2017 ). Hasta donde sabemos, los estudios de
microbiota se han centrado en quesos y leches fermentadas; no se han realizado
estudios simultáneos de las comunidades microbianas de la crema agria y la
mantequilla tradicionales.
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Microbioma y metaboloma de la crema tradicional
Dada la gran popularidad de la crema agria y la mantequilla tradicionales rusas, y que
la región de Buriatia mantiene los métodos tradicionales de procesamiento de productos
lácteos, recolectamos muestras de crema agria y mantequilla tradicionales de hogares
locales en Buriatia, Rusia. Primero usamos la tecnología de secuenciación SMRT para
evaluar la población bacteriana presente en las muestras de crema agria y mantequilla, y
probamos las diferencias en la composición bacteriana entre la crema agria y la
mantequilla. Luego, aislamos bacterias del ácido láctico (LAB) utilizando métodos de cultivo
con el objetivo de preservar estos valiosos recursos de LAB para investigaciones
posteriores y aplicaciones industriales. En tercer lugar, para comprender mejor las
características nutricionales de la crema agria y la mantequilla, realizamos espectrometría
de masas de cromatografía líquida de ultra rendimiento-cuadrupolo-tiempo de vuelo
(UPLC-Q-TOF) a energía elevada (MS MI) para detectar los metabolitos de la crema agria y
la mantequilla.
MATERIALES Y MÉTODOS
Coleccion de muestra
Se recogieron un total de cinco muestras de crema agria tradicional (BL9, BL11,
BL17, BL21 y BL26) y tres de mantequilla (BL14, BL18 y BL20) de seis regiones
diferentes de Buriatia, Rusia. Los valores de pH de estas muestras oscilaron entre
4,51 y 5,03. Las muestras se recolectaron en recipientes esterilizados y se
transportaron al laboratorio en un 4 ◦ Frigorífico montado en un vehículo C.
Aislamiento e identificación de LAB
Se aislaron cepas de bacterias del ácido láctico de las ocho muestras utilizando un
método de cultivo descrito anteriormente ( Yu et al., 2015 ). De las muestras se
obtuvieron un total de 48 aislamientos grampositivos y catalasa negativos. Los aislados
se conservaron en leche que contenía glutamato de sodio al 0,1% y se almacenaron a - 40
◦ C.
Identi fi camos los 48 aislamientos utilizando tecnología de secuenciación de
genes de rRNA 16S. Los cebadores del gen de ARNr 16S utilizados fueron
16S-FA (GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAG AGTTTGATCCTGGCTCAG) y
16S-RA (AGCGGATCA CTTCACACAGGACTA CGGCTACCTTGTTACGA).
Genómico
La extracción de ADN y la amplificación por PCR se realizaron como se describió
anteriormente ( Yu y col., 2011 ). La secuenciación del ADN fue realizada por
Majorbio Bio-Pharm Technology Corporation Limited (Shanghai, China). Se
construyó un árbol filogenético basado en las secuencias generadas usando el
software MEGA v. 7.0 1.
Secuenciación PacBio SMRT y análisis
bioinformático
Centrifugamos 3 gramo muestras de crema agria y mantequilla en
10,000 × gramo durante 20 min en una centrífuga Eppendorf 5810R. Luego se
eliminó el sobrenadante y la crema unida al tubo se eliminó usando hisopos
estériles. El sedimento restante se resuspendió en 500 ml de agua estéril; Se
agregaron 500 mg de lisozima antes de la incubación durante 12 ha 37 ◦ C para
maximizar la extracción de ADN bacteriano. El ADN genómico se extrajo
utilizando el DNeasy Mericon Food Kit (69514, Qiagen, Hilden, Alemania) de
acuerdo con las instrucciones del fabricante.
1 http://www.megasoftware.net
2 Octubre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2496
Yu y col.
La concentración y pureza del ADN se evaluaron mediante electroforesis en gel de
agarosa al 0,8% y densidad óptica utilizando un espectrofotómetro NanoDrop ND-1000
(Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, Estados Unidos).
Se utilizó ADN genómico como molde para la amplificación por PCR del gen de
ARNr 16S de longitud completa para la secuenciación SMRT. Los cebadores y las
condiciones de reacción se realizaron como se describió anteriormente ( Hou et al., 2015 ). y la deconvolución, y el conjunto de datos resultante se importó al software EZinfo.
La calidad de los productos de PCR se verificó utilizando el kit Agilent DNA 1000 y un
bioanalizador Agilent 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, Estados Unidos). Se
utilizaron productos de PCR purificados para construir bibliotecas de ADN con el kit de
preparación de plantillas de Paci fi c Biosciences 2.0. Se utilizó la química P6-C4 del
instrumento PacBio RS II (Paci fi c Biosciences) para secuenciar los productos de ampli
fi cación purificados.
Crudo secuencia datos fueron generado utilizando los
Protocolo RS_ReadsO fi nsert.1 disponible en el portal SMRT (v. 2.7) ( Hou et al.,
2015 ). Se usó el paquete Quantitative Insights into Microbial Ecology (QIIME) (v.
1.7) para extraer secuencias de alta calidad, y estas secuencias luego se alinearon
bajo un agrupamiento de identidad de secuencia del 100% para obtener
secuencias representativas usando los sistemas PyNAST y UCLUST ( Caporaso et
al., 2010 ; Edgar, 2010 ). Las secuencias se clasificaron posteriormente en unidades rDNA 16S de los aislados de LAB se enviaron a la base de datos del Centro Nacional
taxonómicas operativas (OTU) por debajo de un umbral del 97% utilizando el
software UCLUST ( Lozupone y col., 2006 ). La base de datos Ribosomal Database
Project II se utilizó para asignar la taxonomía de cada secuencia representativa de
OTU a un umbral de confianza del 80% ( Cole et al., 2007 ). UNA de novo El árbol
taxonómico se construyó usando un OTU representativo establecido en el software
FastTree para el análisis posterior ( Price et al., 2009 ). los α- la diversidad se evaluó RESULTADOS
utilizando Shannon-Wiener, la diversidad de Simpson, Chao1 y los estimadores de
rarefacción. Lenguaje de programación R v. 3.1.2 2 y origen
Se utilizó el software v. 8.5 para probar correlaciones y producir gráficos.
Determinación de metabolitos por
UPLC-Q-TOF MS mi
Los productos lácteos se centrifugaron a 4000 × gramo durante 10 min, y se recogió
1 mL de suspensión después de descartar la capa de grasa. Agregamos 7 mL de
solución de acetonitrilo a la suspensión, que luego se agitó durante 2 min antes de
centrifugar a alta velocidad a 12,000 × gramo. El sobrenadante se concentró en un
concentrador de vacío, se reconstituyó en 500 µ L de solución de acetonitrilo al 40%
(v / v), filtrado a través de una µ m membrana microporosa insoluble en agua, y
almacenada en - 20 ◦ C. Se utilizó un sistema de cromatografía ACQUITY UPLC /
Xevo G2 Q TOF-MSE (Waters Corp., Milford, MA, Estados Unidos) para extraer los
picos espectrales de MS de productos lácteos; estaba equipado con una fuente de
ionización por electropulverización (ESI) que operaba en modos de iones positivos y
negativos (ESI + y ESI -). Las muestras de leche pretratadas se cromatografiaron
usando un sistema C18-UPLC. La columna fue HSS T3 (2,1 mm × 100 mm × 1.8 µ m,
Waters Corp.), la velocidad de flujo fue de 0,45 ml / min y la temperatura de la
columna fue de 40ºC. ◦ C. El modo de exploración de iones, líquido
2 https://www.r-project.org/
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Microbioma y metaboloma de la crema tradicional
Los ajustes de fase, espectrometría de masas y volumen de muestra se
seleccionaron de acuerdo con un estudio anterior ( Pan et al., 2018 ). Datos
brutos obtenidos por UPLC-Q-TOF MS mi
se recogieron en modo continuo y se procesaron utilizando el software MassLynx y
Progenesis QI (Waters Corp.). Se completaron los procedimientos de
preprocesamiento de datos, incluida la alineación de picos, la identificación de picos
A continuación, se realizaron PCA y proyecciones ortogonales para análisis
discriminante de estructuras latentes (OPLS-DA) en el conjunto de datos. Se
determinaron diferencias significativas en metabolitos entre productos lácteos
cuando VIP ≥ 1, doble cambio ≥ 2, y P < 0,05. Los metabolitos diferenciales
seleccionados se identificaron utilizando la base de datos del metaboloma humano
(HMDB 3), Enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) 4, ChemSpider 5, y
METLIN 6
bases de datos.
Número de acceso a la secuencia de nucleótidos
Todos los datos de secuenciación de PacBio SMRT informados en este estudio se
depositaron en Metagenomic Rapid Annotations utilizando la base de datos de
Subsystems Technology (número de acceso mgp83644) 7. Todas las secuencias de
de Información Biotecnológica (números de acceso MF784091 – MF784111 y
MF784124 – MF784150).
Enumeración e identificación de LAB
Los recuentos viables de BAL presentes en las ocho muestras lácteas de mantequilla
y crema agria oscilaron entre 5,19 ± 0,01 hasta
8,37 ± 0,01 lg UFC / g. Obtuvimos 48 aislamientos por cultivo puro, que fueron
presuntamente identificados como BAL en base a fenotipos grampositivos y
catalasa negativos. La secuenciación parcial del gen ARNr 16S se utilizó además
para identificar estos aislamientos pertenecientes a siete géneros y 15 especies,
incluyendo
Enterococcus casseli fl avus ( 2 cepas), E. italicus ( 2 cepas),
E. faecium ( 2 cepas), Lactobacillus fermentum ( 2 cepas),
Lactobacillus paracasei ( 1 cepa), Lactobacillus plantarum ( 7 cepas), Lactobacillus
curvatus ( 1 cepa), Lactococcus lactis
(16 cepas), Lactococcus garvieae ( 2 cepas), Leuconostoc mesenteroides ( 3
cepas), Leuconostoc ajoum ( 2 cepas),
Leuconostoc lactis ( 1 cepa), Pediococcus acidilactici ( 2 cepas),
Streptococcus thermophilus ( 4 cepas), y Weissella hellenica ( 1 cepa) ( Figura
1).
Diversidad y riqueza de la comunidad bacteriana
en mantequilla y crema agria
Un total de 81,730 lecturas de secuenciación SMRT de alta calidad (promedio:
10,216 lecturas / muestra, rango: 7,034-15,783, desviación estándar
3 http://www.hmdb.ca/
4 www.genome.jp/kegg
5 www.chemspider.com
6 http://www.metlin.scripps.edu/
7 http://metagenomics.anl.gov/
3 Octubre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2496
Yu y col. Microbioma y metaboloma de la crema tradicional

FIGURA 1 | Árbol de unión de vecinos que muestra las relaciones filogenéticas entre los aislamientos y las cepas tipo de géneros relacionados según las secuencias del gen 16S rRNA. Bacillus subtilis fue utilizado como

un grupo externo.

[SD]: 2.875) se obtuvieron de las ocho muestras. Seguimiento (SD: 551.18) para cada muestra individual. El número de agrupaciones de identidad de secuencia y
alineación, 7.301 OTU fueron lecturas, especies observadas (155.34-1689.80), índice Chao1 (484.77– generado con un promedio de 912.63 OTU representativas
13724.40), índice de Simpson (0.267–0.909) y Shannon-Weiner

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Yu y col.
índice (1.275–6.314) de las ocho muestras se muestran en
Tabla 1. Como se muestra en Figura 2, las curvas de diversidad y rarefacción de
Shannon sugieren que los fenotipos bacterianos generales se capturaron bien en
la profundidad de secuencia actual.
Composición bacteriana de mantequilla y crema
agria
Identi fi camos nueve filos bacterianos en muestras de mantequilla y 14 en muestras
de crema agria. Los principales filos bacterianos (con una abundancia relativa
promedio> 1%) en todas las muestras fueron Firmicutes (81,47%), Proteobacteria
(16,11%) y Bacteroidetes (2,05%); no hubo diferencias significativas en la
abundancia relativa de bacterias entre las muestras de mantequilla y crema agria. A
nivel de género, se detectaron 75 y 155 géneros bacterianos en mantequilla y crema
agria, respectivamente. Lactococcus ( 77,73%),
Acetobacter ( 7,80%), Leuconostoc ( 4,10%), Lactobacillus ( 3,09%), y Curvibacter ( 1,92%)
origen indica una mayor contribución de esa variable a la diferencia de grupo, así como
fueron los géneros dominantes en las muestras de mantequilla, mientras que Lactococcus ( 48,21%),
Estreptococo ( 23,63%),
Curvibacter ( 8,15%), Acinetobacter ( 5,43%), Lactobacillus
(2,21%), Chryseobacterium ( 1,90%), Pseudomonas ( 1,71%), y
Carnobacterium ( 1,13%) fueron los géneros dominantes en las muestras de crema agria.
Las abundancias relativas de Lactococcus y Acetobacter
eran significativamente más altos en crema agria que en mantequilla, y los de Streptococcus,
Curvibacter, y Acinetobacteras fueron significativamente más bajos en crema agria que
en mantequilla ( Figura 3A).
A nivel de especie, se identificaron un total de 110 y 267 especies bacterianas
diferentes en mantequilla y crema agria, respectivamente ( Cuadro complementario
S1). En las muestras de mantequilla, las especies más abundantes (con abundancia
relativa promedio> 1%) fueron
Lactococcus lactis ( 53,48%), Lactococcus ra ffi nolactis ( 20,00%),
Acetobacter cibinongensis ( 7,72%), Lactococcus chungangensis
(3,30%), Lactobacillus helveticus ( 2,72%), Leuconostoc lactis
(2,48%), y Leuconostoc mesenteroides ( 1,43%). Las especies más abundantes
(con abundancia relativa promedio> 1%) en las muestras de crema agria fueron Lactococcus
lactis ( 39,39%),
S. thermophilus ( 10,60%), Lactococcus ra ffi nolactis ( 6,11%),
Acinetobacter lwo ffi i ( 3,07%), Lactococcus chungangensis
(1,76%), Acetobacter cibinongensis ( 7,72%), y Acinetobacter johnsonii ( 1,38%). Las
abundancias relativas de Lactococcus lactis, Lactococcus ra ffi nolactis, y Acetobacter
cibinongensis eran significativamente más altos en crema agria que en mantequilla,
y los de
S. thermophilus fueron significativamente más bajos en crema agria que en mantequilla ( Figura
3B).
Comparación de las estructuras de la comunidad bacteriana
de la mantequilla y la crema agria
Para comparar las comunidades bacterianas de la mantequilla y la crema agria, realizamos
un análisis de coordenadas principales de UniFrac ponderado y no ponderado (PCoA)
basado en la tabla de abundancia de OTU. Como se muestra en Figura 4, tanto no
ponderadas (los componentes principales PC1 y PC3 representaron el 20,08 y 15,99% de
la varianza total, respectivamente) como ponderadas (PC1 y PC3 representaron el 66,41 y
el 7,49% de la varianza total, respectivamente) Las distancias UniFrac revelaron diferencias
estructurales aparentes entre las comunidades bacterianas en las muestras de mantequilla
y crema agria.
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Microbioma y metaboloma de la crema tradicional
Perfiles de metabolitos de muestras de mantequilla y
crema agria
Se detectó un total de 27,822 metabolitos (1,182 y 26,640 identificados por modo de
iones positivos y negativos, respectivamente) en las ocho muestras. Entre estos,
Lys-Lys, isohexanal, ácido palmítico, Leu-Val y 2 ′ - la desoxicitidina fueron los
metabolitos más dominantes en todas las muestras. Para visualizar las diferencias
metabólicas entre la crema agria y la mantequilla, se realizó un PCA sin supervisión en
el metaboloma ( Figura 5A). Los componentes principales 1 y 2 representaron el 67,7 y
el 23,6% de la varianza total, respectivamente. En los gráficos de puntuación de PCA,
los símbolos que representan muestras por triplicado de crema agria y mantequilla no
se separaron claramente, lo que indica la presencia de muchos metabolitos similares
en las muestras de crema y mantequilla. Estos datos se procesaron adicionalmente con
un OPLS-DA supervisado para identificar metabolitos diferenciales. La gráfica de
puntuación y las gráficas S se muestran en Figura 5B, lo que demuestra un claro patrón
agrupado entre los dos grupos de muestras. Todas R 2 Y y Q 2 los valores fueron
superiores a 0,75, lo que indica una gran aptitud y capacidad de predicción. En el
gráfico S, cada punto representa una variable; una mayor distancia entre un punto y el
una mayor confianza. De acuerdo con el principio de detección, las variables
diferenciales metabólicas coincidentes con la condición se analizaron e identificaron en
mayor profundidad; Finalmente, se detectaron 27 metabolitos significativamente
diferentes entre las muestras de crema agria y mantequilla ( Tabla 2).
Entre estos, las abundancias de piperidina, Gly-Ser, Asn-Tyr, treonina, NORTE- acetilo-
L- leucina, Gln-Thr, Ser-Asn, ácido tartárico, treonina, His-Ala, Pro-Asn, purina,
ácido butírico y hexanal eran más altos en mantequilla que en crema agria,
mientras que los de Met-Tyr, His-Asn, L- xilulosa, ácido decanoico, cistina, L- cisteína
L-
lisina, Lys-Val, Tyr-Cys, L- alanina, uridina, ácido aspártico, serina y
Gly-Ser-Pro-Met-Phe-Ala-Val fueron mayores en la crema agria que en la mantequilla.
Correlación entre la abundancia relativa de
bacterias dominantes y metabolitos en la crema
agria
Para investigar la relación entre las bacterias dominantes y los metabolitos en las
muestras de crema agria, realizamos un análisis de correlación entre las especies
bacterianas más prevalentes (abundancia relativa promedio> 0.5%) y 19
metabolitos principales en la crema agria. Debido a que había menos muestras
de mantequilla, fue difícil calcular la correlación entre las especies bacterianas y
los metabolitos en estas muestras. Como se muestra en Figura 6, la especie
predominante L. lactis se correlacionó positivamente con los 12 metabolitos que
eran de mayor abundancia relativa, incluidos el ácido decanoico, el ácido
palmítico, L- xilulosa, isohexanal y algunos aminoácidos, y se correlaciona
significativamente negativamente con L- lisina. La especie subdominante S.
thermophilus se correlacionó positivamente con cistina, ácido aspártico, uridina L- lisina,
Lys-Lys, Tyr-Cys y His-Asn, y correlacionadas significativamente negativamente
con L- xilulosa. L. chungangensis se correlacionó de manera significativa y positiva
con la cisteína, y A. johnsonii se correlacionó significativamente negativamente
con la uridina. L. ra ffi nolactis, L. delbrueckii,
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Yu y col. Microbioma y metaboloma de la crema tradicional

TABLA 1 | Unidades taxonómicas operativas (OTU) número de secuencia y OTU, diversidad microbiana e índices de riqueza de muestras de crema agria y mantequilla.

Tipo de ejemplo Nombre de la muestra No. de lecturas No. de OTU Índice Chao1 Índice de Shannon Índice de Simpson Especies observadas

Mantequilla BL14 7034 903 5253.110 5.378 0.909 902.700

BL18 10595 598 1390.210 4.277 0,823 453.480

BL20 15783 265 484.769 1.275 0,267 155.340

CCrea agria BL9 8396 949 3605.430 4.518 0,800 841.800

BL11 8168 799 3973.450 4.292 0,743 744.200

BL17 8148 592 1134.260 5.215 0,898 548.140

BL21 13808 943 2856.540 2.532 0.454 544.320

BL26 9798 2252 13724.40 6.314 0,886 1689.80

Media ± Dakota del Sur 10216.25 ± 2874,91 912.63 ± 551.18 4052.77 ± 3952.15 4.23 ± 1,51 0,72 ± 0,22 734,97 ± 423,94

FIGURA 2 | Análisis de rarefacción ( UNA) y diversidad de Shannon ( SEGUNDO) estimaciones de las lecturas de secuenciación SMRT de bacterias en muestras de crema agria y mantequilla.

FIGURA 3 | Diagramas de caja de la abundancia relativa de bacterias de alta abundancia (> 1%) detectadas en muestras de crema agria y mantequilla en los géneros ( UNA) y nivel de especie

(SEGUNDO) con diferencias signi fi cativas.

y Carnobacterium divergens fueron significativamente positivamente correlacionados significativamente negativamente con el ácido decanoico, Lys- correlacionado con el péptido
Gly-Ser-Pro-Met-Phe-Ala-Val, y Val y Met-Tyr. Macrococcus caseolyticus se correlacionó significativamente de forma negativa con el ácido decanoico. A. lwo ffi i correlacionado
positivamente con Leu-Val, y correlacionado negativamente con

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Yu y col.
FIGURA 4 | Análisis de coordenadas principales ponderado UniFrac (PCoA) de las comunidades bacterianas en muestras de mantequilla y crema agria. Cada símbolo representa la microbiota de mantequilla y crema agria de una
muestra; La muestra de mantequilla y crema agria está representada por el color respectivo.
FIGURA 5 | (UNA) Gráficos de puntuación del análisis de componentes principales (PCA) del metaboloma de la crema agria y la mantequilla. Versión en color disponible online. ( SEGUNDO) Análisis discriminante de mínimos cuadrados ortogonales parciales
(OPLS-DA): gráficos en S de los datos para muestras de crema agria y mantequilla.
His-Asn. Los resultados indican que algunos de los metabolitos de la crema agria eran
productos de fermentación de las especies con las que estaban correlacionados.
DISCUSIÓN
Los productos lácteos tradicionalmente fermentados ofrecen un sabor y una nutrición
únicos, que están estrechamente relacionados con la composición bacteriana y el
recurso lácteo. Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue combinar técnicas ómicas
para analizar la diversidad bacteriana y el carácter metabólico de la crema agria y la
mantequilla tradicionales recolectadas en Buriatia, Rusia. Se aislaron un total de 48
cepas de LAB y se identificaron como siete géneros y 15 especies. Un mayor número de
cepas se identificaron como Lactococcus lactis, Lactobacillus plantarum, y S.
thermophilus que como otras especies. Los resultados de la secuenciación SMRT
también indicaron que Lactococcus lactis y S. thermophilus fueron las especies más
abundantes en las muestras de crema agria y mantequilla ( figura 3 y Cuadro
complementario S1). Este resultado es similar al de un estudio anterior sobre la crema
agria tradicional, que informó Leuconostoc mesenteroides, Lactococcus lactis,
Lactobacillus plantarum, y Lactobacillus helveticus
cepas como los aislados dominantes en la crema agria de Kalmykiya y Tuva,
respectivamente ( Yu et al., 2015 ). Además, las 15 especies aisladas se detectaron
mediante secuenciación SMRT, pero estas
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Microbioma y metaboloma de la crema tradicional
representó sólo el 5,1% (15/294 especies) de todas las especies detectadas por
secuenciación SMRT. Se sabe que aproximadamente el 99% de los microorganismos en
el medio natural no se pueden cultivar fácilmente con los métodos de cultivo tradicionales
( Amann y col., 1995 ). Aunque la plataforma PacBio SMRT es indispensable para la
investigación sistemática de la diversidad bacteriana y la estructura de la comunidad en
muestras ambientales, se puede combinar con la secuenciación completa del rRNA 16S
para determinar los perfiles bacterianos a nivel de especie. Usando los datos de
secuenciación de SMRT, podríamos mejorar los componentes del medio y las
condiciones de cultivo para aislar las cepas deseables en un estudio futuro.
El perfil de ARNr 16S de la microbiota encontró ligeras variaciones en las
composiciones microbianas de las muestras de crema agria y mantequilla. Las
abundancias relativas de Lactococcus lactis y S. thermophilus eran signi fi
cativamente diferentes ( P < 0.05) entre las muestras de mantequilla y crema agria,
y no hubo diferencias significativas entre las de las otras especies entre los tipos de
muestra. Todas estas muestras se prepararon con leche de vaca y la región de
muestreo fue más aislada; especulamos que estas condiciones llevaron a las
similitudes en la microflora indígena entre los tipos de muestras. Liu y col. (2015) investigó
poblaciones microbianas en muestras de leche de vaca fermentada naturalmente
de las repúblicas rusas de Kalmykia y Chita utilizando pirosecuenciación 454
dirigida a genes ribosomales. Lactobacillus y Lactococcus
fueron los géneros predominantes en las muestras de Kalmykia
7 Octubre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2496
Yu y col. Microbioma y metaboloma de la crema tradicional

TABLA 2 | Metabolitos significativamente diferenciales entre las muestras de crema agria y mantequilla.

RT M/Z Identidad de metabolitos diferenciales Fórmula molecular Peso molecular (Da) Doblar-cambiar

7.2721 635.3858 gly-ser-pro-met-phe-ala-val C 29 H 45 norte 7 O 7 S 635.7750 0,0005

6.2968 89.0540 L- Alanina C 3 H 7 NO 2 89.0930 0,0010

5.1123 269.1236 his-asn C 10 H 15 norte 5 O 4 269.2570 0,0033

1.4752 240.1018 Cistina C 6 H 12 norte 2 O 4 S 2 240.3005 0.0158

5.1591 312.1913 met-tyr C 14 H 20 norte 2 O 4 S 312.3850 0.0620

6.3737 245.1136 Lys-val C 11 H 23 norte 3 O 3 245.3190 0.0824

5.8707 133.0824 Ácido aspártico C4H7NO 4 133.1027 0.1007

8.1102 172.0855 Ácido decanoico C 10 H 20 O 2 172.265 0.1182

4.4586 105.0292 Serina C 3 H 7 NO 3 105.0926 0.1719

1.4497 150.0533 L- xilulosa C 5 H 10 O 5 150.1300 0.1829

5.6630 284.1233 tyr-cys C 12 H dieciséis norte 2 O 4 S 284.3310 0.2205

2.6256 121.0253 L- cisteína C 3 H 7 NO 2 S 121.1580 0.2451

5.8045 244.1284 Uridina C 9 H 12 norte 2 O 6 244.2010 0.2571

2.6700 146.0581 L- lisina C 6 H 14 norte 2 O 2 146.188 0.2656

14.6074 88.0701 Ácido butírico C4 H8 O2 88.1050 2.5255

1.6908 100.0710 Hexanal C 6 H 12 O 100.1590 2.7060

6.7740 120.0772 Purina C 5 H 4 norte 4 120.1120 2.7497

16.1911 119.0818 Treonina C 4 H 9 NO 3 119.1192 2.9109

1,9344 226.1910 His-ala C 9 H 14 norte 4 O 3 226.2320 4.8151

8.3437 229.1532 pro-asn C 9 H 15 norte 3 O 4 229.2330 5.1604

14.2835 150.1104 Ácido tartárico C4 H6 O6 150.0868 5.9013

9.4422 247.1445 gln-thr C 9 H 17 norte 3 O 5 247.2480 15.1180

9.4265 219.1488 Ser-asn C 7 H 13 norte 3 O 5 219.1950 16.4850

5.8235 173.1270 NORTE- Acetilo- L- leucina C 8 H 15 NO 3 173.2100 22.7870

2.2355 162.0737 Gly-ser C 5 H 10 norte 2 O 4 162.1440 46.2500

4.0346 295.1642 asn-tyr C 13 H 17 norte 3 O 5 295.2910 50.7320

2.3423 85.0050 Piperidina C 5 H 11 norte 85.1470 59.0590

y Chita en el presente estudio. Sin embargo, Lactococcus ( 51,46%) y Estreptococo durante el proceso de fermentación ( Kimotonira et al., 2012 ). Sin embargo, vale la pena
( 17,81%) son las especies bacterianas más dominantes en el requesón tradicional
de Buriatia ( Jin et al., 2018 ). Los resultados de ese estudio indicaron que la leche
cruda, el entorno externo, el método de procesamiento y la ubicación geográfica
se atribuyen a las diferencias en la composición microbiana entre los productos
lácteos tradicionales. Al igual que en nuestro estudio, informes anteriores han
confirmado que la exposición de los productos lácteos tradicionales a diferentes
entornos externos durante el proceso de fabricación afectó la composición de la
microbiota de los productos finales ( Feurer y col., 2004; Quigley y col., 2012 ).
Además, la abundancia de lactococos, como especies de
Lactococcus, Leuconostoc, y Estreptococo, fueron más altos que los lactobacilos en la
crema agria y la mantequilla en el presente estudio. Concluimos que los lactococos pueden
adaptarse mejor a ambientes ricos en grasas que los lactobacilos. Aunque los LAB tienen
una capacidad baja para hidrolizar la grasa, podrían sobrevivir en crema agria y
mantequilla. Por lo tanto, estas cepas deben ser examinadas más a fondo como cultivos de
partida para la producción industrial de crema agria.
Streptococcus thermophilus y Lactococcus lactis son
reconocidos como los microorganismos más importantes en la industria láctea, y
comúnmente aislados de los productos lácteos fermentados tradicionales. Se ha
informado que Lactococcus ra ffi nolactis
junto con Lactococcus lactis podría usarse como un nuevo cultivo iniciador en la leche
fermentada debido a su fuerte complementariedad
señalar que se detectaron bajas abundancias relativas para ciertos taxones en el
presente estudio, incluidos los géneros
Acetobacter, Pseudomonas, y Chryseobacterium, y especies
Acinetobacter lwo ffi i, Acinetobacter johnsonii, Carnobacterium divergens, y Macrococcus
caseolyticus. Acetobacter puede oxidar el alcohol o los azúcares de forma incompleta a
ácido formacético, que se encuentra ampliamente en los alimentos fermentados
tradicionales ( Ishida y col., 2005 ; Kiryu y col., 2012 ). Miembros del género Pseudomonas demuestran
una amplia diversidad metabólica y, en consecuencia, son capaces de colonizar una amplia
gama de nichos. Pseudomonas es un factor bacteriano activo dominante que contribuye al
deterioro en condiciones aeróbicas, incluso a temperaturas de refrigeración ( Ercolini et al.,
2011 ), y algunas especies son patógenos oportunistas humanos y vegetales ( Palleroni,
2010 ). Algunos tolerantes al frío Chryseobacterium especies, incluyendo
C. oranimense, C. haifense, y C. bovis, se han detectado en la leche cruda en
Israel ( Hantsis-Zacharov y Halpern, 2007 ).
Acinetobacter lwo ffi i y Acinetobacter johnsonii ocurren comúnmente en peces marinos y
en el agua, y se consideran patógenos oportunistas para los peces. Carnobacterium
divergens, una bacteria psicrotrófica y microaerofílica pero tolerante al oxígeno ( Leisner y
col., 2007 ), predomina en los alimentos industriales y se asocia frecuentemente con el
deterioro de productos cárnicos y de pescado refrigerados ( Barakat y col., 2000 ). Estos
patógenos potenciales pueden contaminar de forma cruzada a través de varias vías,
incluidos los cuerpos de los animales,

Fronteras en microbiología | www.frontiersin.org 8 Octubre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2496

Yu y col.
FIGURA 6 | Mapa de calor que muestra las relaciones de correlación entre los géneros bacterianos más prevalentes (con una abundancia relativa media de> 0,5%) y los principales metabolitos en las muestras de crema agria.
heces y entornos de procesamiento. Por lo tanto, sugerimos que los pastores estén
atentos a las condiciones sanitarias durante la producción lechera.
Es bien sabido que la leche de vaca contiene, en promedio,
87,3% de agua, 3,4% de proteína, 3,6% de grasa y 4,6% de lactosa por 100 g ( Guy y
Fenaille, 2006 ). Sin embargo, Boudonck y col. (2009) encontraron que la leche de vaca
contiene una mezcla compleja de metabolitos, e identificaron 223 metabolitos por
métodos de cromatografía líquida y de gases / espectrometría de masas, incluyendo
aminoácidos, lípidos, carbohidratos, nucleótidos, metabolitos energéticos, vitaminas,
cofactores y péptidos cortos. La fermentación es un proceso metabólico que conduce a
la liberación de diferentes sustancias químicas como metabolitos, y estos metabolitos
resultan de la actividad de los microorganismos presentes en el alimento, cuya
concentración cambia con el tiempo desde la fabricación de un alimento fermentado
hasta su consumo. Por lo tanto, más estudios se están enfocando ahora en la detección
de huellas dactilares metabólicas y comunidades bacterianas de alimentos fermentados
para evaluar su calidad ( Lee et al., 2015 ; Young et al., 2016 ). Hasta la fecha, los
informes sobre la identificación de metabolitos en la crema agria y la mantequilla
fermentadas tradicionalmente son limitados. El estudio actual detectó 27.822
metabolitos y cantidades significativas de Lys-Lys, isohexanal, ácido palmítico, Leu-Val
y 2 ′ - se detectó desoxicitidina en las muestras de crema agria y mantequilla rusas. El
ácido palmítico, el ácido graso saturado más común, está presente de forma natural en
la mantequilla, el queso, la leche y la carne, así como en la manteca de cacao, el aceite
de soja y el aceite de girasol. La Organización Mundial de la Salud indicó que el
consumo de ácido palmítico aumenta el riesgo de desarrollar enfermedad
cardiovascular y puede aumentar los niveles de LDL en la sangre.
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Microbioma y metaboloma de la crema tradicional
Además, se ha informado que el ácido palmítico tiene el efecto más fuerte en aumentar el
potencial metastásico de las células iniciadoras de metástasis CD36 + ( Pascual et al.,
2016 ). Además, se detectaron 27 metabolitos significativamente diferentes entre las
muestras de crema agria y mantequilla ( Tabla 2). Debido a que la crema agria y la
mantequilla poseen ricos recursos bacterianos y diversidad de comunidades bacterianas,
la co-fermentación de todas las cepas presentes en los productos alimenticios puede
conducir a diferencias metabólicas entre las muestras de crema agria y mantequilla.
Para comprender mejor las relaciones de correlación entre las especies
bacterianas más prevalentes y los principales metabolitos, se realizó un análisis de
correlación entre las especies bacterianas más prevalentes (abundancia relativa
promedio de> 0,5%) y 19 metabolitos principales en la crema agria. La especie
predominante,
L. lactis, se correlacionó positivamente con los 12 metabolitos con mayor abundancia
relativa, incluyendo ácido decanoico, ácido palmítico, L- xilulosa, isohexanal y algunos
polipéptidos de cadena corta, y se correlacionan significativamente negativamente con
algunos aminoácidos. Se han detectado ácido decanoico y ácido palmítico en el perfil
metabólico de L. lactis subsp. cremoris MG1363 en diferentes condiciones de cultivo ( Azizan
et al., 2012 ). Un estudio anterior sobre huellas dactilares metabólicas del metabolismo
bacteriano en un queso modelo también demostró que algunos aminoácidos o
metabolitos volátiles se pueden vincular fácilmente a L. lactis metabolismo ( Le Boucher
y col., 2013 ). L. lactis tiene muchos requisitos nutricionales, incluido el aminoácido,
que fue la razón de algunos aminoácidos libres negativos con L. lactis. Los resultados
revelaron que las especies bacterianas prevalentes se correlacionaron con los
principales metabolitos. Sin embargo, una explicación detallada de la correlación
9 Octubre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2496
Yu y col.
La relación entre las especies bacterianas y los metabolitos en la crema agria debe
realizar la secuenciación metagenómica y el análisis de las vías metabólicas en un estudio
futuro.
Analizamos las comunidades bacterianas y el carácter metabólico de la crema
agria y la mantequilla rusas utilizando una combinación de técnicas de secuenciación
SMRT y espectrometría de masas UPLC-Q-TOF. Este estudio mostró claramente que
la comunidad bacteriana de la crema agria y la mantequilla es diversa y abundante, y
las composiciones bacterianas tienen diferencias entre las muestras de crema agria y
mantequilla. Mientras tanto, se detectaron un total de 27.822 metabolitos en todas las
muestras, y se detectaron 27 metabolitos significativamente diferentes entre las
muestras de crema agria y mantequilla, incluidos péptidos cortos, ácidos orgánicos y
aminoácidos. Basándonos en análisis de correlación entre las especies bacterianas
más prevalentes y los principales metabolitos en la crema agria, llegamos a la
conclusión de que puede haber una conexión entre las especies BAL dominantes y
estos metabolitos. Adicionalmente, Se aislaron 48 cepas mediante el método de
cultivo puro y se identificaron en siete géneros y 15 especies y / o subespecies. Esos
aislamientos de LAB podrían usarse para cribar cepas probióticas y diseñar un cultivo
iniciador. En conclusión, este estudio combinó técnicas ómicas para analizar la
diversidad bacteriana y el carácter metabólico de la crema agria y la mantequilla
tradicionales, y esperamos que nuestros hallazgos proporcionen información valiosa
para la producción industrial de crema fermentada tradicional.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
WL y HZ diseñaron los experimentos. JY, XA, LM y CY realizaron los
experimentos. LP y DR analizaron los datos. JY y
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Microbioma y metaboloma de la crema tradicional
TT redactó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito
final.
FONDOS
Esta investigación fue apoyada por la Fundación de Científicos Jóvenes Excelentes de la
Universidad Agrícola de Mongolia Interior de China (Beca No. 2017XYQ-4), el Sistema de
Investigación Agrícola de China (Beca CARS-36) y la Fundación Nacional de Ciencias
Naturales de China (Beijing, China; Beca No. 31671871). Los financiadores no tuvieron
ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación e interpretación de datos o la decisión
de enviar el trabajo para su publicación.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Los autores agradecen a los miembros del Laboratorio Clave de Biotecnología
e Ingeniería Lecheras de la Universidad Agrícola de Mongolia Interior, Hohhot,
por su apoyo técnico.
MATERIAL SUPLEMENTARIO
El material complementario de este artículo se puede encontrar en línea en:
https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fmicb.
2018.02496 / full # material-suplementario
FIGURA S1 | Abundancias relativas y diversidad de bacterias en las muestras de crema agria y mantequilla en el
género ( UNA) y especies SEGUNDO) nivel.
TABLA S1 | Contenido de todas las especies de muestras de mantequilla y crema agria.
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Declaración de conflicto de intereses: Los autores declaran que la investigación se realizó en
ausencia de relaciones comerciales o financieras que pudieran interpretarse como un posible conflicto
de intereses.
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11 Octubre de 2018 | Volumen 9 | Artículo 2496