APLICACIONES DEL PCR

Sylvie Le Borgne
Miércoles 30 de mayo de 2007

Introducción
• El PCR es una forma rápida y económica de
copiar y amplificar fragmentos de DNA
específicos a partir de cantidades diminutas de
DNA (templado) aun y cuando el DNA templado
es de mala calidad.

– Preparar el DNA
– Mezclarlo con primers + DNA polimerasa
– Detectar los productos de reacción

Etapas
• Desnaturalización

• Annealing

• Extensión

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 Condiciones adecuadas
• Desnaturalización completa del DNA templado
• Temperatura optima para el annealing
• Temperatura optima para la extensión
• Numero de ciclos
• Extensión final
• Evitar contaminación
– Controles: sin templado
sin primers

Condiciones de reacción
“Cóctel” de reacción
– H2O desionizada estéril
– Buffer de PCR10X
– dNTPs
– Primers (F y R)
– Taq DNA polimerasa
– MgCl2
– Templado de DNA

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 Instrumentación
• Micro-pipetas y puntas (resistentes a
aerosoles)
• Termocicladores
• Cámaras de electroforesis
• Fuentes de poder
• Equipos de foto-documentación

DNA polimerasas
• Taq DNA polimerasa (Thermophilus aquaticus)
– Realizar 30-40 ciclos de PCR sin tener que abrir el
tubo para agregar más enzima
– Errores
– Adición de una A en el extremo del producto (“TA
cloning”)
• Pfu DNA polimerasa (Pyrococcus furiosus)
– Estabilidad y proofreading (corrección)
– Más lenta en polimerizar
– No adiciona A

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 5'--3' 95°C
3'--5' Time (s)
DNA Biological Exonucleas Half- Extension Rate Error
Exonuclease to 1kb
Polymerase Source e life (nucleosides/s) Rate
Activity (72°C)
Activity (min)

75
Thermusa
Taq + - 40 (Produce fragmentos 1 in 10^3 32
aquaticus
de hasta 5 kb)

Pyrococcus 1 in 1.3 x
Pfu - + 120 60 60-120
furiosus 10^6

Pyrococcus
Pwo - + N/A N/A N/A N/A
woesei

Thermas
Tfl - - Produce fragmentos de hasta 15 kb
flavus

Themus Produce fragmentos de hasta 20 kb, actividad

rTth + - 20
thermophilus reverse transcriptasa en presencia de Mn

Thermus Alta
Tli - + 400
litoris fidelidad

Análisis de productos de PCR

1.5 kb

Electroforesis en gel de agarosa

PCR de colonia
• Screening de colonias (clonas) de
bacterias (E. coli) o levaduras para buscar
productos de ligación y plásmidos
correctos.
– Seleccionar colonias con palillo estéril o punta
de pipeta.
– Colocar esta biomasa en agua para diluirla o
directamente en un cóctel de PCR.

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 PCR In situ
Directo

Dirigido a RNA
Indirecto

Hot Start PCR

• Las DNA polimerasas presentan una actividad
polimerasa, aunque muy baja, a temperatura ambiente
la cual amplifica fragmentos no específicos y tiende a
disminuir el rendimiento del producto esperado.
• La actividad exonucleasa 5'-3' degrada los extremos 5’
libres del DNA presente (templado y primers).
• El PCR Hot Start esta diseñado para inhibir la actividad
de las DNA polimerasas durante los preparativos de la
reacción de PCR.
• Modificación química de la Taq polimerasa que se
revierte con calor al realizar la desnaturalización inicial.

Secuenciación directa de
productos de PCR
• Asegurarse de que se amplifico el
fragmento correcto
– Digestión con una enzima de restricción.
• Remover nucleótidos y primers.
• Concentración del producto de PCR.

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 Clonación de productos de PCR
• “TA cloning”

• “Blunt”

• Introducción de sitios de restricción

durante el PCR >>> sitio de clonación
múltiple de algún vector

Aislamiento de genes

• Se conoce la secuencia en otros

organismos y se busca un gene similar.

• Diseño de primers por búsqueda y

comparación de secuencias de interés.

• PCR o RT-PCR

RT-PCR
Reverse transcription PCR

Oligo dT
Primers aleatorios
Primers específicos

PCR

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Análisis de expresión de genes
• RT-PCR
Tanto en procariontes como en eucariontes, se
puede seguir la expresión de ciertos genes
haciendo RT-PCR
• Con primers específicos para genes específicos
• Con primers aleatorios para despliegue diferencial de mRNA

y usando como templado el mRNA total de

cultivos realizados en diferentes condiciones por
ejemplo.

PCR en tiempo real (q-PCR)

(RT-PCR… confuso)

• Cuantitativo
• Cantidades muy pequeñas de templado
• Seguimiento de la reacción de PCR en tiempo
real
• Detección de fluorescencia

El SYBR-Green fluorece solo cuando esta unido a DNA de

doble cadena (nuevas cadenas formadas durante el PCR)

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 AFLP-PCR
Amplified Fragment Length Polymorphism – PCR

Detección de polimorfismos en el DNA

• El DNA celular es digerido con una o varias enzimas de

restricción.
– Se combinan dos enzimas, una que reconoce 4 bases + una
que reconoce 6 bases.
• Se ligan “linkers” a todos los fragmentos de restricción.
• PCR con primers cuya secuencia es complementaria a
la de los sitios de restricción.
• Separación y visualización de los amplicones por
electroforesis.

RAPD
Randomly Amplified Polymorphic DNA

Una técnica que permite la amplificar

regiones anónimas de DNA mediante el
empleo de primers arbitrarios (random
primers).

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Organismo 1

Organismo 2

PCR multiplex

• Amplificación simultanea de diferentes

secuencias en una sola reacción.

Nested PCR

• PCR en el cual se utilizan 2 juegos de primers.

• Es muy especifico y garantiza la amplificación solo del fragmento
correcto.

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Mutagénesis con PCR

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 + MnCl2

Taza de mutación = 0.2 – 6%

Ecología microbiana molecular e

identificación de microorganismos

• Que microorganismos se encuentran

presentes.
• Cual es la dinámica de poblaciones en
tiempo/espacio.
• Que hacen los microorganismos
presentes y cuando lo hacen.

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El gene del 16S rRNA en bacterias

Ell gene que codifica para el 16S rRNA es altamente

conservado, con regiones conservadas e hipervariables que
permiten distinguir entre dominios, grupos, géneros y
especies, eventualmente.

La cantidad de rRNA 16S esta relacionada con la actividad

metabólica de la célula.

Clonación
> Genotecas de 16S

RFLP
Restricción Fragment Length
Polymorphism

DGGE

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PCR-DGGE profiles from a chromium contaminated
soil by depth.

ARDRA
Amplified ribosomal
DNA restriction analysis

Tetranucleotide cutters

T-RFLP
Terminal-restriction fragment length polymorphism

Como ARDRA, pero uno de los primers es marcado con un

fluoroforo

Solo se detectan los fragmentos

terminales

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 RISA – Bacterias

Secuenciación e
identificación
(500 pb)
Separación por tamaños
en geles de agarosa
Producto de PCR (600- 1,600 pb)

16S (1,500 pb) 23S (2,900 pb)

Región intergénica
de tamaño variable,
dependiendo de la especie PM XO TH Tl
(100 - 1,100 pb)

2,000
1,650
1,000
850
650

ITS – Hongos

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