Derechos de autor Blackwell Munksgaard, 2003

AJRI 2003; 50: 263–272

Revista estadounidense de inmunología reproductiva
ISSN 8755-8920

Identificación de posibles mediadores

de la mortalidad embrionaria causada por mastitis:
acciones de los lipopolisacáridos,
Prostaglandina F2a, y el generador de óxido
nítrico, nitroprusiato de sodio dihidrato,
sobre la maduración de ovocitos y embrionario
Desarrollo en ganado
Soto P, Natzke RP, Hansen PJ. Identificación de posibles mediadores de la P. Soto, RP Natzke, PJ Hansen
mortalidad embrionaria causada por mastitis: acciones de Departamento de Ciencias Animales, Universidad de Florida,
Lipopolisacárido, prostaglandina F2a, y el generador de óxido nítrico, Gainesville, FL, EE. UU.
nitroprusiato de sodio dihidrato, sobre la maduración de ovocitos y
Desarrollo embrionario en bovinos. AJRI 2003; 50: 263–272 Blackwell
Munksgaard, 2003

PROBLEMA: La mastitis y la inmunización contra componentes de organismos que

causan mastitis pueden reducir la fertilidad del ganado vacuno y ovino,
respectivamente. Para los experimentos actuales, se planteó la hipótesis de que
estos efectos están mediados a través de acciones de lipopolisacárido (LPS),
prostaglandina F2a (PGF2), y óxido nítrico sobre la maduración de los ovocitos y el
desarrollo embrionario.
MÉTODO DE ESTUDIO: Para evaluar los efectos sobre la maduración de los ovocitos,
Los ovocitos se maduraron con diversas concentraciones de LPS, PGF2a, o el
generador de óxido nítrico (NO), nitroprusiato de sodio (SNP).
Después de la maduración, los ovocitos se fertilizaron y cultivaron hasta el día 8 después de
la fertilización. Para probar los efectos sobre el crecimiento del embrión, los ovocitos se
maduraron, fertilizaron y cultivaron después de la fertilización con LPS.
PGF2a, o SNP.
RESULTADOS: Adición de 100 y 1000 ng / mL LPS y 50 y
100 ng / ml de PGF2a al medio de maduración de ovocitos redujo la
proporción de ovocitos que se convirtieron en blastocistos el día 8 después
fertilización. Cuando se agrega después de la fertilización, por el contrario, ninguno de los LPS
ni PGF2a desarrollo reducido a la etapa de blastocisto. A diferencia de
LPS y PGF2a, La adición de SNP durante la maduración de los ovocitos no tuvo
Palabras clave: embrión, lipopolisacárido, prostaglandina F
efecto sobre la proporción de ovocitos que se convirtieron en blastocistos en 2a, óxido nítrico, mastitis, vacas
día 8 después de la fertilización. Sin embargo, la adición de 10lmetro El SNP al medio
Dirija las solicitudes de reimpresión a PJ Hansen, Departamento de
de cultivo después de la fertilización impidió completamente el desarrollo a la etapa de
Ciencias Animales, Universidad de Florida, PO Box 110910,
blastocisto mientras que 0.1 y 1 lmetro SNP no afectó el desarrollo. CONCLUSIONES: Gainesville, FL 32611-0910, EE. UU.
Los resultados indican que el aumento de las concentraciones locales Correo electrónico: hansen@animal.ufl.edu

de LPS, PGF2a, y NO puede tener consecuencias deletéreas sobre los ovocitos

función (LPS, PGF2a) y desarrollo embrionario (NO). Por tanto, estas moléculas son Presentado el 24 de diciembre de 2002;
supuestos mediadores de los efectos de las enfermedades infecciosas o revisado el 14 de marzo de 2003;

Inflamación, incluida la mastitis, sobre la fertilidad del ganado. aceptado el 18 de marzo de 2003.

REVISTA AMERICANA DE INMUNOLOGÍA REPRODUCTIVA VOL. 50, 2003

264 / SOTO ET AL.
INTRODUCCIÓN
La mastitis, o infección de la glándula mamaria, causa una variedad de
cambios clínicos en el ganado que incluyen fiebre, aumento de la
permeabilidad vascular local, frecuencia cardíaca y frecuencia
respiratoria, y reducción de la producción de leche, consumo de
alimento y motilidad ruminal.1,2 Además, la mastitis está asociada con
la interrupción de los procesos reproductivos en el ganado lechero.
Las vacas diagnosticadas con mastitis clínica entre la primera
inseminación después del parto y el diagnóstico de gestación
requirieron más inseminaciones para lograr una gestación con fi
rmada y tuvieron un intervalo más largo entre el parto y la
inseminación que condujo a una gestación con fi rmada en
comparación con las vacas que tuvieron mastitis clínica después de la
gestación con fi rmada o con vacas sin antecedentes clínicos. mastitis.3
En otro estudio,4 las vacas con mastitis entre la primera inseminación y
el diagnóstico de gestación tuvieron un aumento en los días desde el
parto hasta la gestación subsiguiente y un aumento en el número de
inseminaciones requeridas para lograr la gestación en comparación
con las vacas que tuvieron mastitis después de la con fi rmación de
gestación o los animales no infectados. La pérdida temprana de la
gestación aumentó en las ovejas inmunizadas con complejos de
peptidoglicano-polisacárido aislado de
Streptococcus pyogenes o células estreptocócicas muertas.5
Por tanto, es probable que las respuestas inmunitarias o inflamatorias
asociadas con la provocación bacteriana comprometan el
establecimiento o el mantenimiento del embarazo.
Se desconocen los mecanismos por los cuales la mastitis se
asocia con una función reproductiva deficiente. Los animales
con mastitis tienen concentraciones elevadas de cortisol en
sangre.6,7 Se ha informado que la mastitis causa una
disminución en la secreción de la hormona liberadora de
gonadotropinas en ovejas,6 pero no se estableció una relación
entre la aparición de mastitis y los cambios en las
concentraciones circulantes de hormona luteinizante o
estradiol en las vacas.7 También es posible que la mastitis
interfiera con el mantenimiento del cuerpo lúteo durante el
embarazo porque la magnitud de la liberación de
prostaglandina uterina provocada por la inyección de
oxitocina fue mayor en las vacas con mastitis en comparación
con las vacas de control.7 El aumento de la temperatura
corporal que experimentan los animales con mastitis también
podría alterar directamente el ovocito o el embrión: la
temperatura elevada durante la maduración del ovocito o las
primeras etapas de escisión del desarrollo embrionario
reduce el desarrollo posterior.8
Una posibilidad es que los procesos de maduración de los
ovocitos, fertilización y desarrollo embrionario temprano
sean interrumpidos por productos de los microorganismos
que colonizan la glándula mamaria o por citocinas y otras
moléculas bioactivas producidas por la vaca en respuesta a la
infección. Entre las moléculas que podrían alterar la función
embrionaria y de los ovocitos se encuentran las endotoxinas
que consisten en lipopolisacáridos (LPS)
BLACKWELL MUNKSGAARD, 2003
presente en la pared celular de bacterias gramnegativas. No
se han aclarado los efectos del LPS sobre el ovocito y el
embrión. En algunos experimentos, LPS redujo el desarrollo
embrionario de embriones de ratón cultivados.9,10
En otro experimento, el LPS solo redujo el desarrollo si los
embriones de ratón también estaban expuestos al factor de
necrosis tumoral.a (TNF-a).11 Dumoulin y col.12 no encontraron
ningún efecto de la endotoxina sobre la viabilidad de los
ovocitos o cigotos de ratón cultivados. Además, la
contaminación de la albúmina de suero bovino (BSA) con
endotoxina no afectó el desarrollo embrionario, aunque
indujo poliespermia.13
Otras moléculas producidas durante la inflamación que
pueden comprometer la función de los ovocitos y embriones son
prostaglandina F2a (PGF2a) y óxido nítrico (NO). En varios
tejidos, incluido el endometrio, la síntesis de
PGF2a aumenta con LPS, citocinas inflamatorias como TNF-
a e interleucina-1B (IL-1B), y no.14-16
Cultivo de mórulas bovinas congeladas y descongeladas con
10 ng / ml de PGF2a desarrollo reducido a la etapa de
blastocisto expandido y eclosionado.17 NO hay síntesis
aumentado por LPS, TNF-a e interferónC en 2 celdas
embriones de ratón10 y por PGF2a en el oviducto de rata.18
Tratamiento de embriones bovinos cultivados en cocultivo con
las células de la granulosa con nitroprusiato de sodio dihidrato
(SNP), una molécula que libera NO durante el metabolismo,
disminuyó la proporción de embriones que se desarrollaron hasta
la etapa de blastocisto.19
Para el presente estudio, se planteó la hipótesis de que LPS,
PGF2a, y NO actúan durante la maduración de los ovocitos para
reducir la capacidad de los ovocitos para escindirse y desarrollarse
después de la fertilización. Además, se planteó la hipótesis de que
la adición de estas moléculas después de la fertilización también
inhibirá el desarrollo embrionario.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales
Escherichia coli El LPS, serotipo O55: B5, se adquirió de Sigma
Chemical (St Louis, MO, EE. UU.). La actividad del LPS se
verificó confirmando que estimulaba [3Incorporación de H]
-timidina en linfocitos de sangre periférica bovina según se
determina usando procedimientos descritos en otra parte.20
Las concentraciones de LPS de 0,1 ng / ml y superiores
estimularon [3H] -timida-
dine incorporación (resultados no mostrados). PGF2a se
obtuvo de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI,
EE.UU). SNP se adquirió de Sigma.
Las soluciones de Tyrode modificadas se obtuvieron de
Cell and Molecular Technologies (Lavallette, NJ, EE. UU.)
Para preparar la solución de piruvato de lactato de
albúmina de HEPES-Tyrode (TALP), in vitro fertilización
(FIV) -TALP y esperma-TALP (SP-TALP) como se describe en
otra parte.21 BSA esencialmente libre de ácidos grasos
 LPS, PGF2a, Y SIN EFECTOS EN OOCITOS Y EMBRIONES / 265
(EFAF-BSA) y BSA se adquirieron de Sigma. La hormona
estimulante del folículo (FSH) derivada de la hipófisis
(Folltropin-V) se obtuvo de Vetrepharm Canada, Inc.
(Londres, ON). Percoll era de Amersham Pharmacia
Biotech (Uppsala, Suecia). El semen congelado de varios
toros se obtuvo de Select Sires, Inc. (Rocky Mount, VA, EE.
UU.) Y Southeastern Semen Services (Wellborn, FL, EE.
UU.). El medio de recolección de ovocitos fue Tissue
Culture Medium (TCM) -199 con sales de Hank sin rojo
fenol (Sigma o Atlanta Biologicals, Norcross, GA, EE. UU.)
Con la adición de 2% (v / v) de suero bovino
0,04 U de heparina / ml, 100 U / ml de penicilina-G, 0,1
mg / ml de estreptomicina y 1 mmetro glutamina. El
medio de maduración de ovocitos fue TCM-199 con sales
de Earle (Cell and Molecular Technologies) suplementadas
con suero de novillos al 10% (v / v), 2lg / ml de estradiol 17-
B, 20 lg / ml de FSH, 22 lpiruvato de sodio g / mL, 50 lg /
mL de gentamicina y 1 m adicionalmetro glutamina. Se
prepararon dos modificaciones del medio optimizado de
potasio simplex (KSOM) llamado KSOM-Embrión bovino 1
(BE1) y KSOM-BE2, respectivamente, (Tabla I) utilizando
medio KSOM basal de Cell and Molecular Technologies y
soluciones de aminoácidos de Sigma.
Producción in vitro de embriones
Los ovarios se obtuvieron de un matadero local y se
transportaron a temperatura ambiente en una solución salina
[0,9% (p / v) NaCl] que contenía 100 U / mL de penicilina G y
100 lg / mL de estreptomicina. En el laboratorio, los ovarios se
lavaron con solución salina precalentada para eliminar los
desechos y la sangre. Los complejos de cúmulos de ovocitos
(AOC) se recolectaron cortando folículos de 2 a 10 mm en la
superficie de cada ovario en un vaso de precipitados que
contenía medio de recolección de ovocitos. Los AOC se
lavaron dos veces en medio de recolección de ovocitos y se
transfirieron en grupos de 10 a 50 preequilibrados.lL gotas de
medio de maduración de ovocitos cubiertos de aceite
mineral. Los AOC se maduraron durante 22 horas a
38.5 C en una atmósfera de 5% (v / v) CO2 en aire humedecido.
Después de la maduración, los AOC se lavaron una vez
en HEPES-TALP y transferido a 600 lL de IVFTALP en grupos de 30
por pocillo. Un grupo de espermatozoides congelados y
descongelados de tres toros se purificó mediante centrifugación
en gradiente de Percoll; se utilizó un grupo separado para cada
réplica. El sedimento se recogió, se transfirió a un tubo de
centrífuga de 15 ml que contenía 10 ml de SP-TALP y se
centrifugó. Se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el
sedimento de esperma en IVF-TALP para dar una concentración
aproximada de 25 millones de espermatozoides por mililitro. Los
ovocitos se fertilizaron agregando 25lL esperma suspensión y 25 l
L de una solución que contiene
0,5 mmetro penicilamina, 0,25 mmetro hipotaurina y 25 lmetro
epinefrina en NaCl al 0,9% (p / v) por cada 600 lBueno.
Después de 8 a 10 horas a 38,5 C y 5% (v / v) de CO2 en húmedo
REVISTA AMERICANA DE INMUNOLOGÍA REPRODUCTIVA VOL. 50, 2003
aire fresco, los supuestos cigotos fueron removidos de los
pozos de fertilización. Los cigotos se despojaron de las células
del cúmulo agitando en vórtex durante 5 min en un tubo de
microcentrífuga de 2 ml con 40lL de HEPES-TALP, se lavó dos
o tres veces en HEPES-TALP para eliminar las células restantes
del cúmulo y se cultivó en 50 lL gotas de KSOM-BE1 o KSOM-
BE2 modi fi cadas cubiertas con aceite mineral. Para todos los
experimentos, la tasa de escisión se determinó el día 3
después de la fertilización y la proporción de ovocitos y
embriones escindidos que se desarrollaron hasta la etapa de
blastocisto se registró el día 8 después de la fertilización.
Experimentos con ovocitos y embriones
Efectos de LPS. Para probar el efecto del LPS en la
maduración de los ovocitos, los AOC se maduraron en grupos
de 10 en un medio de maduración de ovocitos que contenía
0,01 a 1000 ng / ml de LPS o una cantidad equivalente de
solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)
[diluyente para LPS; utilizado al 1% (v / v) de concentración
final en medio de maduración de ovocitos]. Los AOC se
lavaron después de la maduración y se fertilizaron en medio
sin LPS. Después de la fertilización, los supuestos cigotos para
cada tratamiento se colocaron en uno o más grupos de hasta
30 de cada 50lL gotas de medio de cultivo de embriones
(KSOM-BE1) sin LPS. Para cada repetición, el número de
supuestos cigotos por gota se hizo lo más constante posible
para todos los tratamientos. La variación en el número de
embriones recuperados después de la fertilización dio como
resultado una variación intrarreplicada en la densidad de
embriones por gota. El experimento se repitió cuatro veces
utilizando 80-136 ovocitos por grupo.
En un segundo experimento, los ovocitos se maduraron y
fertilizaron en medio sin LPS. Después de la fertilización, se
cultivaron supuestos cigotos en uno o más grupos de hasta
30 de cada 50lL gotas de medio de cultivo de embriones
(KSOM-BE1) que contiene 0,01 a 1000 ng / ml de LPS o, para
los pocillos de control, una cantidad equivalente de vehículo
para LPS [1% (v / v) DPBS]. Para cada réplica, el número de
supuestos cigotos se distribuyó aproximadamente por igual
entre los tratamientos. El experimento se repitió 12 veces
utilizando entre 254 y 272 presuntos embriones por grupo.
Efectos de PGF2una. La acción de PGF2a sobre la maduración
de los ovocitos se determinó cultivando AOC en
microgotas de medio de maduración de ovocitos que contiene
0, 10, 50 o 100 ng / ml de PGF2a (10 AOC por gota). La
concentración de etanol en la maduración de los ovocitos.
medio, que se utilizó para preparar PGF2a soluciones madre,
fue de 0,1% (v / v) para todos los tratamientos. Después
maduración, los AOC se fertilizaron en medio sin
PGF2a y presuntos cigotos se cultivaron en grupos de
hasta 30 de cada 50 lL microgotas de KSOM-
BE2. Para cada réplica, el número de presuntos
266 / SOTO ET AL.

TABLA I.Formulaciones de KSOM-BE1 y

Componente KSOM-BE1a KSOM-BE2B
KSOM-BE2
Sales inorgánicas (mg / L)
CaCl2Æ2H2O 251,00 250,00
KCl 186,00 186,38
KH2 correos4 47,60 47,99
MgSO4 (anhidro.) 24.10 -
MgSO4Æ7H2O - 49.30
NaCl 5550,00 5551.80
NaHCO3 2100.00 2100.25
Otros componentes
BSA (mg / ml)C 1,00 1,00
BSA-EFAF (mg / ml)D 3,00 3,00
EDTA (mg / L)mi 3,00 3,72
D-glucosa (mg / L) 36,00 36.03
Lactato de sodio (mg / L) - 1121.00
Lactato de sodio 60% (mL / L) 1,86 -
Piruvato de sodio (mg / L) 22.00 22.00
Aminoácidos (mg / L)
L-Alanina 8,90 8,90
L-arginina - 63,20
L-argininaÆHCl 21.00 -
L-asparaginaÆH2O 15.00 15.00
L-ácido aspártico 13.30 13.20
L-cistina - 12.02
L-cistinaÆ2HCl 12.00 -
L-glutamina 73,10 146.15
L-ácido glutamico 14,70 14,71
Glicina 7,50 7,50
L-histidina 8.00 -
L-histidinaÆHClÆH2O - 20,96
L-isoleucina 26.00 26.23
L-leucina 26.00 26.24
L-lisinaÆHCl 37,00 36,52
L-metionina 7,50 7,46
L-fenilalanina 16,50 16.52
L-prolina 11,50 11.51
L-serina 10,50 10.51
L-treonina 24.00 23,82
L-triptófano 4,00 5.11
L-tirosina 18.00 18.12
L-valina 23,50 23.42
Antibióticos
Gentamicina (g / l) 2,50 2,50
Penicilina G, sal de Na (U / L) 100 000,00 100 000,00
Sulfato de estreptomicina (mg / L) 50,00 50,00
aPreparado añadiendo 100 lL aminoácidos esenciales (medio basal Eagle) y 50 lL
aminoácidos no esenciales (medio esencial mínimo) a 5 ml de KSOM (Cell and Molecular
Technologies, Lavalette, NJ, EE. UU.; Número de catálogo MR-020). El medio se modificó
aún más el día de uso mediante la adición de 3 mg / ml de EFAF-BSA y
2.5 lg / mL de gentamicina.
B Preparado añadiendo 25 lL aminoácidos no esenciales (medio esencial mínimo) a 5 mL
KSOM con 1/2 aminoácidos (número de catálogo MR-106). El medio se modificó aún más
el día de uso mediante la adición de 3 mg / ml de EFAF-BSA y 2,5lg / mL de gentamicina.
CAlbúmina de suero bovino.
DAlbúmina de suero bovino esencialmente libre de ácidos grasos.
miÁcido etilendiaminotetraacético.

BLACKWELL MUNKSGAARD, 2003

 LPS, PGF2a, Y SIN EFECTOS EN OOCITOS Y EMBRIONES / 267

los cigotos por grupo se hicieron lo más constantes posible RESULTADOS

para todos los tratamientos. El experimento se repitió cinco
veces utilizando 159-208 ovocitos por grupo.
Para probar el efecto de PGF2a durante el desarrollo
embrionario, los AOC se sometieron a maduración
y fertilización sin PGF2a y presuntos cigotos se cultivaron
en grupos de hasta 30 de cada 50 lL
microgotas de medio de cultivo de embriones (KSOM-BE2)
que contiene 0,1% (v / v) de etanol y 0, 10, 50 o 100 ng / ml
PGF2una. Para cada réplica, el número de supuestos cigotos
se distribuyó aproximadamente por igual en
tratos. El experimento se repitió seis veces utilizando
163-172 presuntos embriones por grupo.
Efectos de SNP. Los efectos de SNP sobre la maduración de los
ovocitos y el desarrollo embrionario se evaluaron en dos
experimentos utilizando procedimientos similares a los de des-
cuna para LPS y PGF2a excepto que SNP se disolvió
directamente en medio a concentraciones de 0,
0,1, 1 y 10 lmes decir, los embriones de control no recibieron un
vehículo). Para probar los efectos de SNP sobre la maduración de
los ovocitos, el experimento se replicó cinco veces utilizando un
total de 177-251 ovocitos por grupo. Para probar los efectos de
SNP en el desarrollo embrionario, el experimento se repitió cinco
veces utilizando 144-151 presuntos embriones por grupo.
Efectos de LPS en ovocitos y embriones
La adición de LPS al medio de maduración de ovocitos no tuvo
ningún efecto sobre la proporción de ovocitos que se escindieron
(Fig. 1, panel superior). Sin embargo, en comparación con los
ovocitos de control, la proporción de ovocitos que se
desarrollaron hasta la etapa de blastocisto en el día 8 se redujo (P
< 0.05) a las dos concentraciones más altas de LPS probadas (100
y 1000 ng / mL) (Fig.1, panel inferior). Se derivaron conclusiones
similares de la separación de la varianza del tratamiento por
contrastes ortogonales (control, 0.01 y
0,1 ng / ml frente a otras concentraciones, P < 0,05; 100 y 1000
ng / mL versus 1 y 10 ng / mL,PAG ¼ 0,07). Como se muestra en la
Fig.2 (panel superior), la adición de LPS después de la fertilización
en concentraciones de 10 y 1000 ng / mL causó una pequeña
pero significativa (P < 0,05) reducción en la tasa de escisión en
comparación con los controles cultivados sin LPS. Una conclusión
similar fue evidente a partir del análisis de los contrastes
ortogonales (0, 0,01 y 0,1 frente a otros;
P < 0,05; 1 ng / mL versus 10 ng / mL;PAG ¼ 0,09). Sin
embargo, no hubo una reducción consistente en la
100

80
Tasa de escisión (%)

Análisis estadístico
60
Se calculó el porcentaje de ovocitos que se escindieron y el porcentaje
de ovocitos y embriones escindidos que se desarrollaron hasta la
etapa de blastocito para todos los embriones tratados por igual 40

dentro de cada réplica. Los datos (con y sin transformación de

arcoseno) se analizaron mediante análisis de varianza de mínimos 20
cuadrados utilizando el procedimiento Modelos lineales generales del
Sistema de análisis estadístico.22 Los datos se informan como valores 0
de la media de mínimos cuadrados SEM del P < 0,05

datos no transformados, mientras que los valores de probabilidad

40
se derivan de análisis de datos transformados. Las diferencias
P = 0,07
entre varios niveles de un efecto principal se determinaron de dos
al blastocisto (día 8)

30
Ovocitos (%)

formas. Primero, las diferencias entre los ovocitos o embriones de

control y los embriones tratados con diversas concentraciones
traciones de LPS, PGF2a o SNP se determinaron mediante la 20 * *
prueba de separación media pdiff de SAS. Además, la varianza
asociado con los efectos del tratamiento se dividió en 10
contrastes ortogonales individuales. Por ejemplo, los
contrastes ortogonales para experimentos LPS fueron 0,
0
0,01 y 0,1 frente a otras concentraciones; 0 contra 0,0
0
0,0
1
0,1
0
1,0
0
10.
00 ,00 0,0
0
100 100
0,01 y 0,1 ng / ml; 0,01 ng / ml frente a 0,1 ng / ml; 100 y LPS (ng / ml)
1000 ng / mL versus 1 y 10 ng / mL; 1 ng / mL versus 10
ng / mL; y 10 ng / mL versus 100 ng / mL. Para Figura 1. Efecto del lipopolisacárido (LPS) durante la maduración de los ovocitos
PGF2a experimentos, los contrastes fueron 0 y 10 ng / mL sobre el porcentaje de ovocitos que se escindieron (panel superior) y se
desarrollaron en blastocistos el día 8 después de la inseminación (panel inferior).
versus 50 y 100 ng / mL, control versus 10 ng / mL,
Valores medios que difieren (P < 0,05) de los ovocitos de control (0 ng / ml) se
y 50 ng / mL versus 100 ng / mL. Para los experimentos SNP,
indican con asteriscos. Los contrastes ortogonales que son significativamente
los contrastes fueron 0 y 0.1lmetro contra 1 y 10 lmetro; diferentes o la importancia de la aproximación se indican mediante líneas
0 contra 0,1 lmetro; y 1.0 lmetro contra 10 lmetro. horizontales sobre las barras.

REVISTA AMERICANA DE INMUNOLOGÍA REPRODUCTIVA VOL. 50, 2003

268 / SOTO ET AL.

P < 0,05 100

100 P < 0,09

80
80 * *
Tasa de escisión (%)

Tasa de escisión (%)

60
60

40
40

20 20

0
0
P < 0,05
40 25
P < 0,05

20
al blastocisto (día 8)

al blastocisto (día 8)
30
Ovocitos (%)

Ovocitos (%)
15
20

10

10
5

0
0 1 0 0 0
0,0 0,0 0,1 1,0 00 00 0 0 10 50 100
10. 100
, 0,0
100
PGF2α (ng / mL)
LPS (ng / ml)

Figura 2. Efecto del lipopolisacárido (LPS) durante el cultivo de embriones sobre el Higo. 3. Efecto de la prostaglandina F2a (PGF2a) durante la maduración de los ovocitos

porcentaje de ovocitos que se escindieron (panel superior) y se desarrollaron en
blastocistos el día 8 después de la inseminación (panel inferior). Valores medios que
difieren (P < 0,05) de los ovocitos de control (0 ng / ml) se indican con asteriscos. Los
contrastes ortogonales que son estadísticamente diferentes o la importancia de la
aproximación se indican mediante líneas horizontales sobre las barras.
ación sobre el porcentaje de ovocitos que se escindieron (panel superior) y se
desarrollaron en blastocistos el día 8 después de la inseminación (panel inferior).
Los contrastes ortogonales que son estadísticamente diferentes o la importancia
de la aproximación se indican mediante líneas horizontales sobre las barras.

de 10 metro El SNP al medio de cultivo después de la

porcentaje de ovocitos que se desarrollan a la etapa de fertilización impidió completamente el desarrollo a la etapa
blastocisto el día 8 después de la fertilización. El único efecto de blastocisto (control versus 10 lmetro; P < 0.001) mientras
significativo fue el contraste ortogonal comparando 1 ng / mL que otras concentraciones de SNP no afectaron el desarrollo
versus 10 ng / mL (Fig. 2, panel inferior). (contrastes ortogonales: 0 y 0.1 lmetro SNP versus 1 y 10 l
metro SNP, P < 0,05).
Efectos de PGF2a sobre ovocitos y embriones
Adición de PGF2a a los ovocitos durante la maduración no alteró la
tasa de escisión (Fig.3, panel superior) pero desarrolló DISCUSIÓN
ment al blastocisto en el día 8 fue menor (P < 0.05) para
ovocitos cultivados durante la maduración con 50 y Los presentes resultados indican que la maduración de los ovocitos y
100 ng / ml de PGF2a que para los ovocitos cultivados sin el desarrollo embrionario en el ganado pueden verse comprometidos
PGF2a o con 10 ng / mL de PGF2a (Fig.3, abajo por diversas moléculas asociadas con la inflamación.
panel). Por el contrario, la adición de PGF2a después de la fertilización ción incluyendo LPS, PGF2a, y no. En particular,
no tuvo ningún efecto sobre la tasa de escisión o el porcentaje de LPS y PGF2a eventos interrumpidos durante la maduración
ovocitos que se desarrollaron a la etapa de blastocisto el día 8 después de los ovocitos mientras SNP, que se metaboliza a NO
de la fertilización (Fig. 4). en cultura,23 interrumpió el desarrollo embrionario después
de la fertilización. Por lo tanto, estas moléculas, que son
Efectos de SNP en ovocitos y embriones sintetizadas por bacterias (LPS) o producidas en respuesta
La adición de SNP durante la maduración de los ovocitos no tuvo a las citocinas inflamatorias (PGF2a y NO), puede mediar
algunos de los efectos nocivos de la mastitis,3,4
ningún efecto sobre la tasa de escisión o la proporción de ovocitos que
se desarrollaron hasta la etapa de blastocisto el día 8 después de la inmunización periférica,5 y otros procesos inflamatorios
fertilización (Fig. 5). Como se muestra en la Fig.6, la adición sobre la fertilidad.

BLACKWELL MUNKSGAARD, 2003

 LPS, PGF2a, Y SIN EFECTOS EN OOCITOS Y EMBRIONES
100
80
Tasa de escisión (%)
60
40
20
0 0
20
al blastocisto (día 8)
15
Ovocitos (%)
10
5
0 0
0 10 50 100
PGF2α (ng / mL)
Figura 4. Efecto de la prostaglandina F2a (PGF2a) durante el cultivo de embriones en
el porcentaje de ovocitos que se escindieron (panel superior) y se desarrollaron
en blastocistos el día 8 después de la inseminación (panel inferior).
El lipopolisacárido en concentraciones de 1 ng / mL o más
inhibió los eventos asociados con la maduración de los ovocitos
de una manera que comprometió la capacidad de los embriones
formados después de la fertilización para continuar su desarrollo
hasta la etapa de blastocisto. Se requirieron concentraciones
relativamente altas de LPS (1 ng / mL o más) para provocar un
efecto sobre la maduración de los ovocitos. Estas concentraciones
son más altas que las informadas en el plasma de vacas durante
la mastitis experimental inducida conE. coli (55-134 pg / mL)24 o
gangrenoso de origen natural
E. coli mastitis (85 pg / mL).25 Por lo tanto, aunque las concentraciones
de LPS pueden ser lo suficientemente altas como para interrumpir la
maduración de los ovocitos cuando la producción ovárica u oviductal
de LPS ocurre como resultado de una infección local, es dudoso que
las concentraciones de LPS lleguen a ser lo suficientemente altas en el
tracto reproductivo durante la mastitis para comprometer el ovocito.
Si bien el LPS afectó la función de los ovocitos, no hubo un
efecto inhibitorio constante del LPS durante el cultivo de
embriones. En otros estudios en ratones, la adición de LPS no
afectó el desarrollo de embriones cultivados.12 o solo
desarrollo reducido cuando TNF-a también estuvo presente.11
El efecto de los LPS sobre la maduración de los ovocitos podría
reflejar acciones directas de la molécula sobre el ovocito, sobre
las células del cúmulo asociadas con el ovocito o, ya que estas
REVISTA AMERICANA DE INMUNOLOGÍA REPRODUCTIVA VOL. 50, 2003
/ 269
100
80
Tasa de escisión (%)
60
40
20
25
al blastocisto (día 8)
20
Ovocitos (%)
15
10
5
0.0 0,1 1.0 10.0
SNP (µMETRO)
Higo. 5. Efecto del nitroprusiato de sodio dihidrato (SNP) durante
Maduración de ovocitos en el porcentaje de ovocitos que se escindieron (panel
superior) y se desarrollaron en blastocistos el día 8 después de la inseminación
(panel inferior).
han sido encontrados residentes en cúmulos,26 en células T o
macrófagos ubicados dentro del COC. La capa de cúmulos es
importante para que tenga lugar la maduración de los ovocitos.27
El lipopolisacárido puede unirse a las células de la granulosa-lútea
recuperadas de los aspirados foliculares humanos.28
El desafío inmunológico sistémico in vivo con LPS aumentó la
apoptosis en células de la granulosa de rata.29 Quizás el LPS actúa
para efectuar la maduración de los ovocitos indirectamente al
alterar la secreción de una o más citocinas del AOC. De hecho, LPS
puede aumentar TNF-a secreción de células de la granulosa-lútea
humana.28 Las acciones de LPS en sitios extraováricos también
podrían conducir a la producción de citocinas u otras moléculas
reguladoras que a su vez podrían inhibir la función de los ovocitos
o embrionarios.
Una molécula liberada que puede estar involucrada en la
interrupción de la maduración de los ovocitos durante la inflamación.
es PGF2una. Cuando se agrega durante la maduración de los ovocitos,
PGF2a a concentraciones de 50 o 100 ng / mL disminuyó la
proporción de ovocitos a blastocisto. La síntesis
de PGF2a aumenta por LPS en muchos tejidos, incluidas las
arterias uterinas,30 endometriodieciséis y placenta.31
Otras citocinas inflamatorias también pueden aumentar la PGF2a
secreción que incluye TNF-a e interleucina-1 (IL-1) en
endometrio14,32,33 e IL-1 en células de la granulosa.34
270 / SOTO ET AL.
100
80
Tasa de escisión (%)
60
40
20
0
P < 0,05
20
al blastocisto (día 8)
15
Ovocitos (%)
10
5
0
0.0 0,1
SNP (µMETRO)
Figura 6. Efecto del nitroprusiato de sodio dihidrato (SNP) agregado después de la
inseminación sobre el porcentaje de ovocitos que se escindieron (panel superior) y
se desarrollaron en blastocistos el día 8 después de la inseminación (panel
inferior). Valores medios que difieren (P < 0,05) de los ovocitos de control (0 ng /
ml) se indican con asteriscos. Los contrastes ortogonales que son
estadísticamente diferentes o la importancia de la aproximación se indican
mediante líneas horizontales sobre las barras.
Como para LPS, adición de PGF2a a los embriones
cultivados comenzando después de la fertilización no afectó
desarrollo a la etapa de blastocisto. La ausencia de un
efecto de PGF2a sobre el desarrollo de los embriones está en
en contraste con un informe que PGF2a Disminución del desarrollo
embrionario bovino cuando se agrega en la mórula.
etapa.17 Una posibilidad es que los embriones no adquieran
susceptibilidad a las acciones disruptivas de PGF2a hasta la
etapa de mórula y que, en los experimentos actuales,
el PGF2a añadido inmediatamente después de la fertilización perdió su
actividad biológica por la etapa de mórula. La vida media de
PGF2a en cultivos de células estromales deciduales se
informó como 15 8,2 h.35
El óxido nítrico no es un mediador de los efectos directos de LPS
sobre el ovocito, ya que la adición de SNP no tuvo ningún efecto sobre
la maduración de los ovocitos. Informes anteriores demostraron que
bajas concentraciones de SNP (10)7 metro) promovió la maduración de
ovocitos encerrados en cúmulos de ratón hasta la metafase II,
mientras que la adición de un inhibidor de la NO sintasa bloqueó la
maduración.36 Por el contrario, la adición de 10 lmetro El SNP después
de la fertilización fue catastrófico para el desarrollo embrionario.
Resultados similares con bovinos
BLACKWELL MUNKSGAARD, 2003
los embriones se vieron antes19 excepto que el desarrollo
fue inhibido por concentraciones de SNP tan bajas como
1,6 lmetro. En el presente estudio, no hubo efecto inhibidor
de 1 lmetro SNP. La discrepancia en la dosis efectiva de SNP
entre el presente estudio (efectos inhibidores a 10lmetro pero
no en 1 lmetro) y la de Lim y Hansel18
podría reflejar un mayor metabolismo de SNP a NO en el
estudio de Lim y Hansel18 ya que, en ese estudio, los
embriones se cultivaron conjuntamente con células de la
granulosa. En embriones de ratón, se observaron efectos
inhibidores de SNP sobre el desarrollo embrionario o
apoptosis a concentraciones de SNP que iban de 0,1 a 1000.l
metro.36 Un posible mecanismo por el cual el NO bloquea el
desarrollo embrionario es activando la muerte celular
P < 0,05
programada o la apoptosis. Chen y col. (2001) informaron que
SNP en concentraciones de 10lmetro o mayor aumento de la
apoptosis y expresión de p53 y Bax en embriones de ratón.37
Si bien SNP inhibió el desarrollo embrionario en este y
otros estudios,19,36 es probable que concentraciones bajas
de NO sean beneficiosas para el desarrollo embrionario.
Inhibición de la NO sintasa con
***
l-NAME redujo el desarrollo de embriones de ratón a la etapa de
blastocisto y este efecto podría revertirse mediante la adición de 0,1 l
1.0 10.0 metro SNP.37 Quizás las concentraciones bajas de NO regulan el
crecimiento embrionario a través de la regulación del desarrollo
embrionario mediada por receptores, mientras que las
concentraciones más altas ejercen un estrés oxidativo que
compromete el desarrollo. El peróxido de hidrógeno también puede
bloquear el desarrollo embrionario antes de la implantación.38
En conclusión, los resultados de este estudio indican que
aumento de las concentraciones locales de LPS, PGF2a, y el NO puede
tener consecuencias deletéreas sobre la función de los ovocitos
(LPS, PGF2a) y desarrollo embrionario (NO). Por lo tanto,
estas moléculas son supuestos mediadores de efectos.
de enfermedades infecciosas o in fl amación, incluida la mastitis,
sobre la fertilidad del ganado. La identificación del mecanismo a
través del cual las enfermedades infecciosas afectan la eficiencia
reproductiva puede conducir a nuevos enfoques farmacéuticos
para mejorar la fertilidad en animales que padecen
enfermedades infecciosas o inflamación.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Marshall Chernin y a los empleados
de Central Beef Packing Co. (Center Hill, FL, EE. UU.) Por
proporcionar los ovarios, a Willian Rembert por la recolección
de ovarios y a Scott A. Randell y Southeastern Semen Services
(Wellborn, FL, EE. UU.) Por la donación de semen. Este artículo
es la serie de revistas No. R-09266 de la Estación Experimental
Agrícola de Florida.
REFERENCIAS
1. Lohuis JACM, Van Leeuwen W, Verheijden JHM, Van Miert
ASJPAM, Brand A: efecto de la dexametasona en
 LPS, PGF2a, Y SIN EFECTOS EN OOCYTES Y EMBRIONES / 271
experimental Escherichia coli mastitis en la vaca. J Dairy Sci
1998; 71: 2782–2789.
2. Perkins KH, VandeHaar MJ, Burton JL, Liesman JS, Erskine RJ,
Elsasser TH: Respuestas clínicas a la infusión de endotoxina
intramamaria en vacas lecheras sometidas a restricción
alimenticia. J Dairy Sci 2002; 85: 1724-1731.
3. Barker AR, Schrick FN, Lewis MJ, Dowlen HH, Oliver SP:
Influencia de la mastitis clínica durante la lactancia temprana
en el rendimiento reproductivo de las vacas Jersey. J Dairy Sci
1998; 81: 1285-1290.
4. Schrick FN, Hockett ME, Saxton AM, Lewis MJ, Dowlen HH,
Oliver SP: Influencia de la mastitis subclínica durante la
lactancia temprana en los parámetros reproductivos. J Dairy
Sci 2001; 84: 1407-1412.
5. Holaskova I, Blemings KP, Dailey RA: Efecto del complejo
peptidoglicano-polisacárido (PG-PS) de la pared celular
estreptocócica sobre la eficiencia reproductiva y la mastitis
en ovejas. Am J Reprod Immunol 2002; 47: 361 (abstr).
6. Battaglia DF, Bowen JM, Krasa HK, Thrun LA, Viguié
C, Karsch FJ: la endotoxina inhibe el eje neuroendocrino
reproductivo mientras estimula los esteroides suprarrenales:
una vista simultánea desde el portal hipofisario y la sangre
periférica. Endocrinology 1997; 138: 4273–4281.
7. Hockett ME, Hopkins FM, Lewis MJ, Saxton AM, Dowlen HH,
Oliver SP, Schrick FN: Perfiles endocrinos de vacas lecheras
después de mastitis clínica inducida experimentalmente
durante la lactancia temprana. Anim Reprod Sci 2000; 58:
241-251.
8. Edwards JL, Hansen PJ: Respuestas diferenciales de ovocitos
bovinos y embriones de preimplantación al choque térmico. Mol
Reprod Dev 1997; 46: 138-145.
9. Dubin NH, Bornstein DR, Gong Y: uso de endotoxina como
control positivo (tóxico) en el ensayo de embriones de ratón. J
Assist Reprod Genet 1995; 12: 147-152.
10. Athanassakis I, Aifantis I, Baritakis S, Farmakiotis V,
Koumantakis E, Vassiliadis S: Producción de óxido nítrico por
embriones de preimplantación en respuesta a factores
embriotóxicos. Cell Physiol Biochem 2000; 10: 169-176.
11. Randall GW, O'Connor EF, Gantt PA: La sinergia entre el factor
de necrosis tumoral y la endotoxina disminuye el desarrollo
temprano in vitro. J In Vitro Fert Embryo Transf 1991; 8:
304-307.
12. Dumoulin JC, Menheere PP, Evers JL, Kleukers AP, Pieters MH,
Bras M, Geraedts JP: Los efectos de las endotoxinas en
gametos y embriones de preimplantación cultivados in vitro.
Hum Reprod 1991; 6: 730–734.
13. Madison V, Greve T, Avery B, Wamberg T: El efecto del medio
contaminado con endotoxinas en la fertilización in vitro y el
desarrollo de ovocitos bovinos maduros in vitro. Reprod Nutr
Dev 1991; 31: 159-165.
14. Davidson JA, Tiemann U, Betts JG, Hansen PJ: ADN
síntesis y secreción de prostaglandinas por las bovino
células endometriales reguladas por la Reprod
interleucina-1. Fertil Dev 1995; 7: 1037–1043.
15. Skarzynski DJ, Miyamoto Y, Okuda K: Producción de
prostaglandina F2a por células endometriales bovinas cultivadas en
respuesta al tumor factor de necrosis a: especificación del tipo de celda
e intracelular mecanismos. Biol Reprod 2000;
62: 1116-1120.
16. Leung ST, Cheng Z, Sheldrick EL, Derecka K, Flint Los
APF, Wathes DC: efectos del lipopolisacárido y -6 en la
interleucinas-1a, -2 expresión del receptor de oxitocina
producción de iones y prostaglandinas en el endometrio
bovino. J Endocrinol 2001; 168: 497–508.
REVISTA AMERICANA DE INMUNOLOGÍA REPRODUCTIVA VOL. 50, 2003
17. Fazio RA, Buuck MJ, Schrick FN: Desarrollo embrionario de
embriones bovinos congelados-descongelados cultivados in
vitro en respuesta a concentraciones elevadas de pros-
taglandin F2una. Biol Reprod 1997; 56 (1 Suppl): 187 (abstr).
18. Peres Martinez S, Franchi AM, Viggiano JM, Herrero
MB, Gimeno M: Efecto de la prostaglandina F2a (PGF2a) sobre la
actividad de la óxido nítrico sintasa (NOS) oviductal: posible
papel del NO endógeno en PGF2a-contracciones inducidas en
el oviducto de rata. Prostaglandins Other Lipid Mediat 1998;
56: 155-166.
19. Lim JM, Hansel W: Desarrollo mejorado de embriones bovinos
derivados in vitro mediante el uso de un eliminador de óxido
nítrico en un sistema de cocultivo de células de cúmulo-
granulosa. Mol Reprod Dev 1998; 50: 45–53.
20. Tekin S, Ealy AD, Wang SZ, Hansen PJ: diferencias en la
actividad reguladora de linfocitos entre variantes de IFN ovino
s. J Interferon Cytokine Res 2000; 20: 1001–
1005.
21. Parrish JJ, Susko-Parrish JL, Liebfried-Rutledge ML, Critser ES,
Eyestone WH, First NL: Fertilización bovina in vitro con semen
congelado-descongelado. Theriogenology 1986; 25: 591–600.
22. SAS / STAT: Guía del usuario, ver. 6, 4ª ed. Cary, Carolina del Norte,
SAS Institute, Inc., 1989.
23. Kowaluk EA, Seth P, Fung HL: Activación metabólica del
nitroprusiato de sodio a óxido nítrico en el músculo liso
vascular. J Pharmacol Exp Ther 1992; 262: 916–922.
24. Dosogne H, Meyer E, Sturk A, Van Loon J, MassartLeen AM,
Burvenich C: Efecto del tratamiento con enro fl oxacina sobre
la endotoxina plasmática durante bovinos Escherichia coli
mastitis. In fl amm Res 2002; 51: 201-205.
25. Hakogi E, Tamura H, Tanaka S, Kohata A, Shimada Y, Tabuchi
K: niveles de endotoxinas en la leche y el plasma de vacas
afectadas por mastitis medidos con la prueba de limulus
cromogénico. Vet Microbiol 1989; 20: 267-274.
26. Piccinni MP, Scaletti C, Mavilia C, Lazzeri E, Romagnani P,
Natali I, Pellegrini S, Livi C, Romagnani S, Maggi E: Producción
de IL-4 y factor inhibidor de la leucemia por células T del
cumulus oophorus: un microambiente favorable para el
desarrollo del embrión antes de la implantación. Eur J
Immunol 2001; 31: 2431–2437.
27. Su YQ, Su YQ, Wigglesworth K, Pendola FL, O'Brien, MJ, Eppig JJ: La
actividad de proteína quinasa activada por mitógenos en células
de cúmulos es esencial para la reanudación meiótica de ovocitos
inducida por gonadotropinas y la expansión de cúmulos en el
ratón. Endocrinology 2002; 143: 2221–2232.
28. Sancho-Tello M, Chen TY, Clinton TK, Lyles R, Moreno RF, Tilzer
L, Imakawa K, Terranova PF: Evidence for lipopolysaccharide
binding in human granulosa-luteal cells. J Endocrinol 1992;
135: 571–578.
29. Besnard N, Horne EAL, Whitehead SA: El tratamiento con
prolactina y lipopolisacárido aumentó la apoptosis y la atresia
en los folículos ováricos de rata. Acta Physiol Scand 2001;
172: 17-25.
30. Vagnoni KE, Magness RR: Estrógeno y estimulación de
lipopolisacáridos de la producción de prostaciclina y los
niveles de ciclooxigenasa y óxido nítrico sintasa en arterias
uterinas ovinos. Biol Reprod 1998; 59: 1008–1015.
31. Malek A, Sager R, Schneider H: efecto de la hipoxia, el estrés
oxidativo y el lipopolisacárido sobre la liberación de
prostaglandinas y citocinas de explantes de placenta de
término humano. Placenta 2001; 22 (Supl. A): S45 – S50.
32. Betts JG, Hansen PJ: Regulación de la secreción de
prostaglandinas de células epiteliales y estromales de bovinos
272 / SOTO ET AL.
endometrio por interleucina-1B, interleucina-2, factor
estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos y factor
de necrosis tumoral-una. Life Sci 1992; 51: 1171-1176.
33. Chen DB, Yang ZM, Hilsenrath R, Le SP, Harper MJ:
Estimulación de la liberación de prostaglandina (PG) F2 alfa y
PGE2 por el factor de necrosis tumoral alfa e interleucina 1
alfa en células endometriales de fase lútea humana
cultivadas. Hum Reprod 1995; 10: 2773–2780.
34. Narko K, Ritvos O, Ristimaki A: Induction of cyclo-
oxigenasa-2 y prostaglandina F2a expresión del receptor por
interleucina-1B en granulosa-lútea humana cultivada
células. Endocrinology 1997; 138: 3638–3644.
35. Ishihara O, Sullivan MH, Elder MG: Diferencias de
metabolismo de la prostaglandina E2 y F2a por decidual
BLACKWELL MUNKSGAARD, 2003
células estromales y macrófagos en cultivo. Eicosanoids
1991; 4: 203-207.
36. Sengoku K, Takuma N, Horikawa M, Tsuchiya K, Komori H,
Sharifa D, Tamate K, Ishikawa M: Requisito de óxido nítrico
para la maduración de ovocitos murinos, el desarrollo
embrionario y la excrecencia del trofoblasto in vitro. Mol
Reprod Dev 2001; 58: 262-268.
37. Chen HW, Jiang WS, Tzeng CR: El óxido nítrico como regulador
en el desarrollo de embriones antes de la implantación y la
apoptosis. Fertil Steril 2001; 75: 1163-1171.
38. Morales H, Tilquin P, Rees JF, Massip A, Dessy F, Van
Langendonckt A: El piruvato previene la lesión inducida por
peróxido de embriones bovinos de preimplantación in vitro.
Mol Reprod Dev 1999; 52: 149-157.