ANÁLISIS DE ALIMENTOS

ALIG 1029

PRÁCTICA # 3

TÉCNICAS ESPECTROSCÓPICAS
INTRODUCCIÓN

Para determinar la concentración de proteínas de ciertas muestras, existen diversos

métodos entre esos se encuentra el de Bradford o método de unión por colorantes, el cual
se basa en la implementación de un colorante hidrofóbico, que en presencia del ácido
fosfórico, sus disoluciones tienen un color pardo y por encontrarse en el interior de la
proteína en medio del entorno hidrofóbico da como lugar a una coloración azul, cuando los
grupos amino del colorante interactúan con los grupos amino de la proteína (Bradford;
1976).
Las muestras después del cambio de coloración son leídas en un rango de 465 a 595 nm,
para después elaborar la curva de calibración con interpolación utilizando la albumina
bocina como la proteína protón, este es un método indirecto puesto a que mide la
absorbancia y a partir de eso se obtiene la concentración de proteínas (Fujimoto, Goeke,
Olson & Klank, 1985).
Cabe mencionar que dicho método es sensible a la presencia de ciertos agentes
contaminantes tales como: detergentes o compuestos orgánicos como el metanol, una de
las más fuertes ventajas a la hora de la elección de dicho método debido a la rapidez y
facilidad de este (Bradford; 1976).

Objetivo
Determinar la concentración de proteína de una muestra desconocida por el método
Bradford usando un espetrofotómetro de absorción UV-VIS (microplate reader)

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Materiales, equipos, reactivos, instrumentos, muestras y otros
usados en el laboratorio
 
Tabla 1. Materiales, equipos e instrumentos utilizados en el método BRADFORD.

muestras Equipo Instrumentos

 25 ml de  Micropipeta Software  
reactivo Contenedor lector Uv-Vis
Bradford de desecho
200 μl estándar de punta
BSA Depósito de
10 ml NF H2O reactivo de
10 ml de 25 ml
Placa de
muestras
titulación de
desconocidas 96 posillos
de proteínas Tubos de
centrifugdo
de 2 ml
Formulario de
llave de placa
 
 
Procedimiento
 
1. Se tiene 3 muestras, las cuales serán diluidas entre un rango de 1-15 y de 1-100, para de esta
manera dar un total de 6 muestras, en la parte de abajo habrá 8 muestras estándar, para dar
un total de 14 muestras.
2. Determinar el número de réplicas de las muestras standard, para esto habran 3 pozos
adjuntos a cada muestra con la misma medición.
3. Realiza los cálculos con precaución.
4. Llena el formula de placa para de esta manera organizar la matrix del plato y así evitar la
confusión, comienza desde la celda a1 y para no tener columnas vacías es recomendable
mejorar el diseño del plato.
5. Etiquetar los tubos desconocidos de muestras desconocida.
6. Añadir agua y muestras previamente determinadas.
7. Etiquetar los tubos standard desde o-120 gramos por microlitro.
8. Añadir agua y BSA, 2 gramos por mililitro.
9. Trasferir 150 microlitros de la muestra desconocida usando la micropeta hacia los tres pozos
adjuntos para cada muestra.
10. Depositar el reactivo de BRADFORD en el contenedor.
11. Asegurar los tips con la micropipeta.
12. Transferir 150 microlitros del reactivo BRADFORD en los pozos adjuntos.
13. Incubar a 595 nanómetros.
14. Después de este período cerrar todas las puertas.

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Ensayo de Bradford

RESULTADOS

Tabla 1.- Plantilla de muestras y solución patrón

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 1 1
0 1 2

CÀLCULO

1.- Curva de calibrado

2.- Concentraciones finales de las muestras desconocidas

Tabla 2.- Absorbancia y Concentración

Abs ug/ml

BIBLIOGRAFÍA 

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Fiñana, I. T. (2000). Espectrofometría: Espectros de absorción y cuantificación
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